Kombinera mitotiska Cell synkronisering och hög upplösning konfokalmikroskopi att studera rollen av multifunktionella cellcykelns proteiner under Mitos

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterar ett protokoll för dubbel tymidin synkronisering av HeLa cells följt av analys med hög upplösning konfokalmikroskopi. Denna metod är nyckeln till att få stort antal celler som fortsätter synkront från S fas till Mitos, möjliggör studier på mitotiska roller av multifunktionella proteiner som också äger interphase funktioner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studie av de olika reglerande händelserna av cellcykeln i ett fas-beroende sätt ger en klar uppfattning om celltillväxt och delning. Synkroniseringen av cellpopulationer på specifika faser av cellcykeln har visat sig vara mycket användbar i sådana experimentella strävanden. Synkronisering av celler genom behandling med kemikalier som är relativt mindre giftiga kan vara fördelaktiga över användning av farmakologiska hämmande läkemedel för studiet av åtföljande cellcykeln händelser och att få viss anrikning av valda mitotiska stadier. Här beskriver vi protokollet för synkronisering mänskliga celler i olika stadier av cellen, inbegripet både i S och M fas med en dubbel tymidin block och släppa förfarande för att studera funktionaliteten i mitotiska proteiner i kromosom justering och segregation. Detta protokoll har varit mycket användbart för att studera de mitotiska rollerna av multifunktionella proteiner som äger etablerade interphase funktioner. I vårt fall, kan Cdt1, ett protein som är kritiska för replikering ursprung licensiering i G1-fasen, mitotiska roll studeras effektivt endast när G2/M-specifika Cdt1 kan vara uttömda. Vi beskriver det detaljerade protokollet för utarmning av G2/M-specifika Cdt1 med dubbel tymidin synkronisering. Vi också förklara protokollet av cell fixering, och lever cellen avbildning med hög upplösning konfokalmikroskopi efter tymidin release. Metoden är också användbar för att analysera funktionen av mitotiska proteiner under både fysiologiska och perturbed tillstånd såsom för Hec1, en komponent i Ndc80 komplex, eftersom det gör det möjligt för en att få stora urvalsstorlekar mitotiska cellernas för fasta och levande cell analys som vi visar här.

Introduction

I cellcykeln genomgår celler en rad starkt reglerade och temporally kontrollerade händelserna för korrekt dubblering av sin arvsmassa och spridning. Hos däggdjur består cellcykeln av interphase och M-fas. I interphasen, som består av tre stadier - G1, S, och G2, cellen dubbletter dess arvsmassa och genomgår tillväxt som krävs för normala cellcykelns förlopp1,2. I den M-fasen, som består av Mitos (profas, metafasen, metafas, Anaphasen och Telophasen) och cytokines, producerar en Föräldrakontroll cell två genetiskt identiska dotterceller. I Mitos, Syster kromatiderna av duplicerade genomet är kondenserad (profas) och fångas på deras kinetochores av mikrotubuli av monterade mitotiska spindeln (metafasen), som driver deras justering på metafas plattan (metafas) följt av deras lika segregation när syster kromatiderna är split mot och transporteras till motsatt spindeln stolpar (anaphase). De två dottercellerna är fysiskt åtskilda av aktiviteten av en aktin-baserade kontraktila ring (Telophasen och cytokines). Kinetochor är en specialiserad proteinhaltiga struktur som monterar på regionen centromeric i kromatiderna och tjäna som bifogad fil platser för spindeln mikrotubuli. Dess huvudsakliga funktion är att köra kromosom fånga, justering, och stöd i korrigera felaktig spindeln mikrotubulära fastsättning, medan medla spindel montering checkpoint för att bibehålla trohet av kromosom segregation3,4.

Tekniken med cell synkronisering fungerar som ett idealiskt verktyg för att förstå händelserna molekylär och strukturell inblandade i cellcykelns förlopp. Detta tillvägagångssätt har använts för att berika cellpopulationer på specifika faser av olika typer av analyser, inbegripet profilering av genuttryck, analyser av cellulära biokemiska processer och detektion av subcellulär lokalisering av proteiner. Synkroniserade däggdjursceller kan användas inte bara för studier av enskilda genen produkter, men också för metoder som omfattar analys av hela genomet inklusive microarray analys av gene expression5, miRNA uttryck mönster6, translationell förordning7och proteomiska analys av protein ändringar8. Synkronisering kan också användas för att studera effekterna av genuttryck eller protein knock-down eller knock-out eller kemikalier på cellcykelns förlopp.

Celler kan synkroniseras vid de olika stadierna av cellcykeln. Både fysiska och kemiska metoder används allmänt för cell synkronisering. De viktigaste kriterierna för cell synkronisering är att synkroniseringen ska vara noncytotoxic och reversibla. På grund av de potentiella negativa cellulära konsekvenserna av synkronisera celler av farmakologiska agenter, kan kemisk-beroende metoder vara fördelaktiga för att studera viktiga cellcykeln händelser. Till exempel, hydroxyurea, amphidicolin, mimosine och lovastatin, kan användas för cell synkronisering på G1/S fas men, på grund av deras effekt på de biokemiska vägar de hämmar, de aktivera cellcykeln checkpoint mekanismer och döda en viktig bråkdel av celler9,10. Däremot, kan feedback hämning av DNA-replikering genom att lägga till tymidin tillväxtmassmedia, känd som ”tymidin block”, arresterar cellcykeln på vissa punkter11,12,13. Cellerna kan också synkroniseras på G2/M fas genom att behandla med nocodazole och RO-33069,14. Nocodazole, som förhindrar mikrotubulära församling, har en relativt hög cytotoxicitet. Dessutom kan nocodazole-arresterade celler återgå till interphase precociously av mitotiska slirning. Dubbla tymidin block gripandet celler på G1/S fas och efter frisläppandet från blocket, celler finns för att fortsätta synkront genom G2 och in Mitos. Den normala progressionen av cellcykeln för celler frigörs från tymidin block kan observeras under hög upplösning konfokalmikroskopi genom cell fixering eller levande imaging. Effekten av störning av mitotiska proteiner kan studeras specifikt när celler anger och vidare genom Mitos efter frisläppandet från dubbel tymidin block. Cdt1, ett multifunktionellt protein, är involverad i DNA replication ursprung licensiering i fasen G1 och krävs också för Kinetochor mikrotubulära bilagor under Mitos15. För att studera funktionen av Cdt1 under Mitos, måste man införa en metod som undviker effekten av dess utarmning på replikering licensiering under G1-fasen, medan samtidigt verkställer dess utarmning bestämt under den G2/M-fasen bara. Här presenterar vi detaljerade protokoll baserat på dubbel tymidin blocket att studera proteiner som utför flera funktioner under olika faser av cellcykeln mitotiska roll av både fasta och live-cell imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dubbel tymidin Block och Release: reagens preparat

  1. Gör 500 mL Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) medium kompletteras med 10% FBS, penicillin, streptomycin.
  2. Gör 100 mM lager av tymidin i sterilt vatten och store i alikvoter vid-80 ° C.

2. protokoll för fasta Cell avbildning av mitotiska Progression (figur 1A)

  1. Dag 1, utsäde ~ 2 x 105 HeLa cells i brunnar 6-well platta med ett täckglas (steriliserad med 70% etanol och UV-strålning) och 2 mL DMEM medium. Odla cellerna i en fuktad inkubator för 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. 1st tymidin kvarter: dag 2, grundligt blanda volymen som krävs av tymidin i färska DMEM media (100 mM lager, 2 mM slutlig koncentration).
  3. Tillsätt 2 mL av tymidin-innehållande media till celler i varje brunn för 6-well platta och inkubera 18 h.
  4. Dag 3, sug ut mediet och tvätta cellerna två gånger med 2 mL 1 x PBS och en gång med färska förvärmd DMEM; odla cellerna i färska förvärmd DMEM medium för 9 h att släppa celler från block.
  5. 2nd tymidin block: igen och tillsätt 2 mL av tymidin-innehållande media (2 mM slutlig koncentration) till celler i varje brunn av 6-väl plattan.
  6. Inkubera i en annan 18 h.
  7. På dag 4, sug ut mediet och tvätta cellerna två gånger med 2 mL 1 x PBS och en gång med färska förvärmd DMEM.
  8. Späd siRNAs (kontroll och Cdt1) och transfection reagens i serum gratis odlingsmedium separat för 10 min. blanda dem tillsammans och inkubera i 20 min på RT. Den slutliga koncentrationen av siRNA används i varje transfection var 100 nM. Lägg till reaktionsblandningen att de celler som har tvättats ur tymidin.
  9. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 9-10 h att släppa från blockering och fixa cellerna på täckglas med 4% PFA i 20 min på RT.
    Försiktighet: PFA är giftiga, bära lämpligt skydd.
  10. Immunostain celler, efter permeabilizing med 0,5% (v/v) rengöringsmedel för 10 min vid RT och tvätta cellerna två gånger med 1 x PBS för 5 min varje.
    1. Blockera celler med 1% BSA (w/v) i 1 x PBS för 1 h på RT följt av behandling av celler med 50 µL av primära antikroppar (musen anti-α-tubulin antikropp utspädd 1:1, 000, kanin-anti-Zwint1 antikropp utspätt till 1: 400 och musen anti-phospho-ɣ H2AX utspätt till 1:300) i 1% (w/v) BSA i 1 x PBS för 1 h på 37 oC.
    2. Efter tvättningen ute cellerna med 1 x PBS trefalt, behandla celler med 50 µL av sekundära antikroppar för varje skyddsglaset (Alexa 488 och rodamin röd 1: 250 utspädningar i 1% (w/v) BSA i 1 x PBS) för 1 h på RT.
    3. Efter tvättning cellerna med 1 x PBS två gånger för 5 min varje, behandla celler med DAPI (0.1µg / mL i 1 x PBS) för 5 min på RT.
    4. Efter tvättning cellerna med 1 x PBS två gånger för 5 min varje, placera den täckglas inför celler till passande fästmaterial media på en tydlig mikroskopisk bild.
  11. Bild cellerna för de immunostained proteinerna med 60 X eller 100 X 1.4 NA Plan-apokromatiska DIC oljeimmersionsobjektivet monterad på en inverterad högupplösta confocal Mikroskop utrustad med en lämplig kamera som behövs för kvaliteten på bilder som krävs.
  12. Få bilder i rumstemperatur som z-högar av 0,2 µm tjocklek med hjälp av programvara är lämpligt för mikroskopet.

3. protokoll för levande Cell avbildning av mitotiska Progression (figur 3A)

  1. Dag 1, frö cirka 0,5-1 x 105 HeLa cells stabilt uttrycker mCherry-H2B och GFP-α-tubulin (något variabel utifrån celltyp och de proteiner som de uttrycker) till 35 mm glas botten rätter med 1,5 mL DMEM medium och odla dem i en fuktad inkubator för 24 h vid 37 oC och 5% CO2.
  2. 1st tymidin kvarter: dag 2, tillsätt 1,5 mL Tymidinanalog-innehållande media till celler i skålen (100 mM tymidin, 2 mM slutlig koncentration,).
  3. Inkubera i 18 h.
  4. Dag 3, sug ut mediet som innehåller tymidin och tvätta cellerna tre gånger, två gånger med 2 mL 1 x PBS och en gång med färska förvärmd DMEM.
  5. Späd siRNAs (kontroll och Hec1) och transfection reagens med serum gratis odlingsmedium separat för 10 min. blanda dem tillsammans och inkubera i 20 min på RT. Den slutliga koncentrationen av siRNA används i varje transfection var 100 nM. Lägg till reaktionsblandningen att de celler som har tvättats ur tymidin.
  6. Odla cellerna i 1,5 mL färsk förvärmd DMEM medium för 8 h att släppa celler från block.
  7. 2nd tymidin block: Tillsätt 1,5 mL Tymidinanalog-innehållande media (2 mM slutlig koncentration) till celler i skålen.
  8. Inkubera i en annan 18 h.
  9. På dag 4, aspirera på medellång och tvätta cellerna tre gånger, två gånger med 2 mL 1 x PBS och en gång med färska förvärmd DMEM. Sedan odla cellerna färska förvärmd Leibovitz är (l-15) medium kompletteras med 10% FBS och 20 mM HEPES vid pH 7.0 för 8 h att släppa celler från blocket.
  10. Placera skålen i temperatur kontroll kammaren i hög upplösning confocal mikroskopet som redan har övergått på minst 30 min innan början av imaging för att stabilisera de på scenen och experimentell temperaturerna.
  11. Fokus i ljusa fält med 60 x mål tills cellerna är synliga, sedan manuellt sålla de på scenen i regionen val.
  12. Ställa in ljuset och laser power/exponering, bild förvärv parametrar och varaktigheten av experimentet med programvaran Mikroskop bild förvärv av val. Använd filter för god Jordbrukarsed (488 magnetisering; 385 nm utsläpp) och mCherry (561 nm excitation och 385 nm utsläpp) för att förvärva bilder.
  13. Utföra time-lapse experimentet genom att separat förvärva pulsad genomlysning och fluorescens bilder varje 10 min för en period upp till 16 h.
  14. Få bilder som tolv 1,0 µm-separerad z-plan på 9 h efter frisläppandet från dubbel tymidin blocket använder programvara lämpligt att mikroskopet.
  15. Analysera bilderna spåra enskilda celler för mitotiska progression och slutligen montera motsvarande filmen med källkod Fiji/ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Studie av mitotiska progression och mikrotubuli stabilitet i celler fast efter frisläppandet från dubbel tymidin block
Cdt1 är involverad i licensiering av DNA-replikering ursprung i den G1-fasen. Det bryts under S-fasen men åter ackumuleras i G2/M fas. För att studera dess roll i Mitos, behöver den endogena Cdt1 vara uttömda specifikt på fasen G/M använda den lämpligaste cell synkronisering tekniken, de dubbla tymidin block15. Cellerna var transfekterade med siRNAs omedelbart efter frisläppandet från 2nd tymidin blocket, när cellerna är i S fas och då licensiering av replikering ursprung i G1, som också kräver Cdt1 funktion, har länge avslutats. Utarmning av Cdt1 efter 9 h siCdt1 transfection och dubbel tymidin Spärra frisläppning validerades av Western blotting (figur 1B). Fixering av celler 9 h efter frigöraren från dubbel tymidin blocket visar att de flesta celler i metafas skede i både kontroll och Cdt1 siRNA transfekterade celler. Men fixering av celler 10 h efter frisläppandet från dubbel tymidin blocket visar att de flesta Cdt1 siRNA-behandlade celler fortfarande grips i metafasen sent medan kontroll celler in Anaphasen och normalt segregera deras kromosomer som förväntade (figur 1 c ). För att förstå effekten av Cdt1 utarmning på Kinetochor-mikrotubulära (kMT) stabilitet, fastställdes celler till 9 h efter frisläppandet från dubbel tymidin block följt av kylbehandling, som endast behåller stabil Kinetochor-mikrotubuli (kMTs). KMTs Cdt1-utarmat celler är relativt mindre robusta efter kall behandling jämfört med control Cells (figur 1 d). Således kan använder denna metod, utvecklingen av normala mitotiska celler efter störning av funktionen mitotiska proteinernas sevärdheter studeras effektivt, även utan användning av levande cell imaging.

Figur 2 visar att licensiering av DNA-replikering ursprung inte är orolig när celler är utfiskade av Cdt1 under G2/M-fasen med våra protokoll, som observerades också i kontroll celler. Celler som utarmat av Cdt1 under G2/M fas inducerade inte ansamling av fosforylerade ɣH2AX, en markör för DNA-skador, under den efterföljande G2-fasen; medan siRNA transfection av asynkrona kulturer att tömma Cdt1 inducerad ansamling av phospho-ɣH2AX-positiva foci, möjligen på grund av DNA-skador orsakade av felaktig DNA replication licensiering.

Studie av mitotiska progression i celler efter frisläppandet från dubbel tymidin block av levande cell imaging
Efter kärn kuvert nedbrytningen (NEB), normala celler (i frånvaro av störning av en funktionell mitotiska protein) ange Mitos och genomgå Anaphasen debut att avsluta från Mitos inom ca 30-60 min (figur 3B). Men RNAi-medierad Nedslagning av Hec1, en nyckel Kinetochor protein som krävs för robust kMT fastsättning bildandet, återfinns fördröja normala mitotiska utvecklingen. I det här fallet de flesta celler ange Mitos efter NEB, men inte genomgå Anaphasen uppkomsten eller utgång från Mitos även efter flera timmar av fördröjningen i Mitos (figur 3 c). Likaså kan därmed effekten av RNAi-medierad Nedslagning av alla andra protein som lokaliserar kinetochores eller ha en funktion under Mitos observeras effektivt med hjälp av levande cell imaging efter frisläppandet från dubbel tymidin block. Förutom att studera beskaffenhet mitotiska progression, dröjsmål och gripande, några av de andra viktiga mitotiska fenomen som kan analyseras med den här metoden inkluderar kromosom justering, mitotiska spindeln bildandet, och positionering aktiveringen och Tystande av den spindel montering checkpoint.

Figure 1
Figur 1: analys av mitotiska progression och stabiliteten i Kinetochor mikrotubuli i fasta celler efter dubbel tymidin synkroniseringen. (A) A Schematisk bild av cell synkronisering, fixering och immunofluorescens. (B) Western blot för Nedslagning av Cdt1 efter 9 h om övergång från 2nd tymidin block. (C) immunofluorescens micrographs att Visa mitotiska cellerna fast 9 och 10 h efter frisläppandet från dubbel tymidin block och behandling med kontroll (överst) eller Cdt1 siRNA (nederst). Α-tubulin färgning är i rött, DNA i grönt som celler uttrycker GFP-histonglykoprotein H2B. Skalstapeln = 10 µm. Prometaphase och metafas celler anges med gula och vita pilspetsar respektive. (D) HeLa celler efter behandling med kontroll siRNA (övre panelen) och efter Cdt1 utarmning (undersidan) för 9 h efter frisläppandet från dubbel tymidin block följt av behandling med iskall Leibovitz's (l-15) medium och fixering. Cellerna var immun-färgas för spindeln MT (grön) och en Kinetochor markör, Zwint1 (röd) och DAPI för DNA i svart och vitt. Skalstapeln = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Cdt1-utarmning under G2/M-fasen inte stör replikering licensiering. Asynkron HeLa celler behandlas med kontroll luciferas (övre panelen) eller cdt1 siRNAs (mellersta panelen) eller dubbel tymidin synkroniseras HeLa celler behandlas med cdt1 siRNA under 2nd tymidin wash-out följt av fixering vid 10 h efter release (nedre panelen) var fläckade DAPI (pseudo färgade grön) och anti-phospho-ɣH2AX antikropp (röd). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: analys av mitotiska progression av levande cell imaging i synkroniseras celler. (A) A Schematisk framställning av cell synkronisering och levande cell imaging. HeLa cells stabilt uttrycker mCherry-histonglykoprotein H2B och GFP-α-tubulin släpptes från dubbel tymidin block för 8 h att låta dem fortsätta att G2/M fas från S fas gripandet. Levande imaging genomfördes med hög upplösning confocal Mikroskop start 8 h efter släppa celler från tymidin block och fortsätta i upp till 16 h från den punkten. Här visas stillbilder från video fångas varje 10 min för kontroll celler utan störning av något mitotiska protein (B) eller celler utarmat av den Hec1 subuniten av de komplexa Ndc80 (C). Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mest kritiska fördelen av dubbla tymidin synkronisering är att det ger en ökad provstorlek av mitotiska celler i en kort tidsfönster med många av dessa celler att ange Mitos unisont, vilket också möjliggör analyser av kromosom justering, bipolär spindel bildandet och kromosomsegregering med mycket högre effektivitet.

Många reglerande proteinkomplex och signalvägar ägnas åt att säkerställa normala progression genom Mitos och avregleringen av denna process kan lett till tumourigenesis. Levande cellen avbildning av HeLa cells stabilt uttrycker mCherry-H2B och GFP-tubulin och frigörs från de dubbla tymidin block visar att de flesta kontroll celler segregera deras kromosomer på Anaphasen inom cirka 60 min efter NEB (figur 3B). Däremot, levande cell avbildning av HeLa cells perturbed med Hec1 funktion visar att de allra flesta bor i den mitotiska fasen för en lång period med feljusterade kromosomer följt av Anaphasen debut eller apoptos (figur 3 c).

Överskjutande tymidin hämmar DNA-syntes under S-fasen vilket blockerar cellerna G1/S fas11. Även om dubbel tymidin blockera synkronisering är den vanligaste metoden i studien av cellcykeln och mitotiska progression, måste man vara kritisk till vissa av begränsningarna med denna metod. Viktigast av allt, måste det säkerställas att kemikalien har tvättats ordentligt (för 7-8 h) så att effekten är helt reversibla och celler kan fortsätta normalt genom resten av cellcykeln. Celler kan annars inte ange den andra cykeln som orsakar felaktig progression men Mitos. Andelen av synkroniserade celler kanske inte tillräckligt hög med ett enda tymidin block och en dubbel Tymidinanalog-block kan vara nödvändigt att öka antalet synkroniserade celler, särskilt om man är intresserad av studerar ett visst skede av Mitos. Varaktigheten av tymidin behandling måste optimeras på grund av olika känslighet bland celltyper beroende på generationstid. Till exempel hamster celler har 16 h generation tid och behandlas med tymidin för 11 h för optimal synkronisering17. I denna studie behandlas vi HeLa cells för 16-18 h med tymidin. Dessutom kan den överskjutande tymidin inte bara förhindrar DNA-syntes men också döda viktigt fraktioner av celler11,12,18 och nära uppmärksamhet behöver ägnas övervaka denna förlust. Tymidin stamlösningen används i denna studie bör förberedas i sterilt destillerat vatten och blandas grundligt i cell kultur media att undvika dess nederbörd efter att lägga till media av siRNA transfekterade celler och även att säkerställa dess homogen distribution runt de odlade cellerna.

För att studera funktionen av ett målprotein mitotiska under mitotiska progression, cellerna skulle helst vara behandlade med siRNA till knockdown nivåerna av proteinet av intresse antingen under 1st tymidin blocket eller under frigöraren från 1st tymidin block, beroende på den tid som krävs för att erhålla effektiv protein knockdown19,20,21. Däremot, för att studera rollen av multifunktionella proteiner såsom Cdt1 under Mitos, är det nödvändigt att behandla cellerna med siCdt1 under frigöraren från 2nd tymidin blocket att erhålla G2/M särskilda utarmning. Cdt1 är en kritisk aktör inom licensiering av DNA-replikering ursprung15. För att förstå dess specialiserade roll under Mitos utan att störa dess roll i licensiering, måste Cdt1 vara uttömda specifikt på G2/M fas, som kan uppnås effektivt genom dubbel tymidin synkronisering, så att man undviker att behöva tillgripa andra Mitos-specifik störning metoder som är svåra att utföra. Utarmning av Cdt1 i asynkron kulturer inducera DNA skador svar på grund av avbrottet på licensiering av DNA-replikering ursprung, som i sin tur skulle ha förvirrat analysen av möjliga funktion för detta protein under Mitos. Således erbjuder den dubbla tymidin synkronisering tekniken en unik experimentell metod för att generera celler som genomgick en normal G1 och S-fas men saknade Cdt1 funktion under G2 och M. Våra synkroniseringen protokollet särskilda betydelse ligger i dess hämning av multifunktionella proteiner på specifika fasen (G2/M) för att studera deras nya funktioner under Mitos. Denna metod kommer således användbar inte bara för att studera proteiner som har flera funktioner under olika cellcykelns faser utan också av det av något mitotiska protein håller på kromosom justering, kMT bilagor och kromosomsegregering roll.

För levande cell imaging, efter frigöraren från dubbel tymidin blocket, celler bör inkuberas i förväg värmde Leibovitz's (l-15) medium kompletteras med 10-20% FBS fram till början av imaging. Cellerna ange Mitos vid varierande tidpunkter efter frisläppandet från tymidin block beroende på cellen. Starttiden för bild fånga eller fixering måste optimeras beroende på cellen. För levande cell imaging, kan utilizationen av konventionella konfokalmikroskopi orsaka fotoblekning under långsiktig imaging. Däremot, ger den högupplösta confocal microcopy en klar och högupplöst bild med minst omfattningen av fotoblekning effekter.

De kritiska steg i detta protokoll är tymidin behandlingstiden, ordentlig bortspolning av tymidin, tidpunkten för siRNA transfection och start tidpunkten för bildframställning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Vi är tacksamma till Dr Kozo Tanaka Tohoku University i Japan för att dela HeLa cells stabilt uttrycker mCherry-histonglykoprotein H2B och GFP-α-tubulin. Detta arbete stöddes av en NCI grant till DV (R00CA178188) och av nystartade fonder från Northwestern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6, (1), E5 (2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21, (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42, (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52, (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285, (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8, (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72, (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60, (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13, (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14, (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116, (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68, (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12, (4), e0174819 (2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196, (5), 563-571 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics