Analysera kommunikationen mellan monocyter och primär bröstcancerceller i en extracellulär Matrix extrakt (ECME)-baserat tredimensionella System

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här, beskriver vi en tredimensionell kultur metod för att analysera morfologi av primär bröstcancerceller, samt att studera deras indirekt interaktion med monocyter och utfall såsom kollagen nedbrytning, immunceller rekrytering, cell invasionen, och främjande av cancer-relaterade inflammation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Inbäddad i den extracellulära matrixen (ECM), kommunicera normal och neoplastiska epitelial celler intimt med hematopoetiska och icke-hematopoetiska celler, således kraftigt påverka normal vävnad homeostas och sjukdom resultatet. I bröstcancer spelar tumör-associerad makrofager (TAMs) en avgörande roll i sjukdomsprogression, metastaser och upprepning, förstå mekanismerna av monocyt kemoattraktion till den tumör närmiljön och deras interaktioner med tumörceller därför viktigt att kontrollera sjukdomen. Här ger vi en detaljerad beskrivning av ett tredimensionellt (3D) samtidig kultur mänskliga bröstcancer cancerceller (BrC) och humana monocyter. BrC celler producerade höga basala nivåer av reglerade på-aktivering, normala T-celler uttrycks och utsöndras (RANTES), monocyt korrektiv protein-1 (MCP-1 och andra) och granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), medan i samtidig kultur med monocyter, Pro-inflammatoriska cytokiner Interleukin (IL) -1 beta (IL-1β) och IL-8 berikades tillsammans med matrix metalloproteinaser (MMP) -1, MMP-2 och MMP-10. Denna tumör stroma mikromiljö främjas motstånd mot anoikis i MCF-10A 3D acini-liknande strukturer, kemoattraktion av monocyter, och invasionen av aggressiva BrC celler. De protokoll som presenteras här ger ett prisvärt alternativ för att studera intra-tumör kommunikation och är ett exempel på den stora potential som in vitro- 3D cellsystem tillhandahåller för att förhöra särdragen i tumörbiologi relaterade till tumör aggression.

Introduction

Tumörbiologi är långt mer komplicerad än man tidigare trott. Montering av bevis visar att tumörceller är mer än bara en bulk av okontrollerad prolifererande celler; snarare verkar olika neoplastiska celler utför olika funktioner som visar hög organisation och hierarki inom tumör1. Tumörceller är också i intim kommunikation med icke-omvandlad celler: fibroblaster, adipocyter, lymfocyter, makrofager, endotelceller, bland andra celler är alla nedsänkt i byggnadsställning proteiner och polysackarider som utgör ECM. Många direkta och indirekta interaktioner är etablerade mellan cellerna omvandlas och icke-omvandlad och med ECM, som utövar ett kraftfullt inflytande över sjukdom resultatet2,3. I det specifika fallet med BrC är det särskilt viktigt att dissekera meddelandet av BrC celler med TAMs, med tanke på att TAMs har visat sig spela en avgörande roll i utvecklingen av tumören, ökar risken för metastasering och sjukdomen återkommer4 ,5.

För att analysera intra-tumoral interaktioner och deras möjliga utfall, nya 3D in vitro- metoder har utvecklats baserat på användning av ECM-extrakt som ger en mycket mer komplex mikromiljö, närmare verkligheten i tumörbiologi, i jämförelse med konventionella enskiktslager cellkulturer där cellerna växa bifogas plast. Petersen och Bissell6 första modellerar av godartad och elakartad bröst epitelceller odlade på en laminin-rika basalmembranet och var de första att beskriva den 3D organotypic strukturer som diskriminerar godartad mänskliga bröst epitelceller från maligna motsvarigheterna. Ett decennium senare, modellen utvecklades av har, Timmy, och Brugge7,8,9 som ett värdefullt verktyg för att belysa de biologiska spridningsvägar äventyras under elakartad omformning av glandular acini, sådana som stora acini bildande på grund av okontrollerad spridning, omlokaliseringar av åtsittande föreningspunkt proteiner som bevis på försämrad cell polarisering, och förlust av acini lumen till följd av cell resistens mot anoikis, en typ av programmerad celldöd som uppstår i Anchorage-beroende celler när de lossnar från omgivande ECM. Modeller av Sameni, Jedeszko och Sloane har fokuserat på imaging proteolytiska aktivitet av celler, som är nära besläktade invasivitet, ett annat avgörande drag av tumör malignitet10,11,12. Dessa modeller förlitar sig på protein matriser blandat med olika fluorescens-kylda protein substrat (DQ-gelatin, DQ-kollagen I, och DQ-kollagen IV), i vilken fluorescerande signaler är vägledande för den proteolytisk nedbrytningen av kollagen. 3D-modeller används också för att studera stamceller egenskaper av både icke-omvandlad och tumörceller, i vilken cell aggregat, även benämnda spheroids, kan vara odlade i suspension eller ECM-liknande proteiner förhör för mekanismer för celldifferentiering, asymmetrisk celldelning, efterlevnad av cell-till-cell och cell motilitet13,14. Invasionen-analyser möjliggör testning av den inneboende aggressiviteten av tumören och identifiering av de molekyler som fungerar som chemoattractants under de invasiva process15. Övergripande, 3D modeller representerar en prisvärd diversifiering av in vitro- cellkultur som nära återspeglar normal och onkogena vävnad morfogenes.

Vi har utformat en 3D samtidig cellodlingssystem baserat på ovan nämnda modeller7,10,11, använder både mänskliga kommersiella BrC cellinjer av känd aggressiva potential (luminala och triple-negativa typer) och primär celler explanterad från BrC patienter. Vi först utvecklades en modell där antingen icke-aggressiv (MCF-7) eller aggressiv (MDA-MB-231) BrC celler var samtidig odlade med U937 monocyter i ett extracellulärmatrix extrakt (ECME)-baserat 3D-system som får direkta cell-cell interaktioner. Dessa samtidig kulturer användes för att bestämma hur kommunikationen mellan dessa två cell härstamningar påverkat transkriptionen av en uppsättning gener besläktade med cancer aggressivt beteende. En betydande ökning av cyklooxygenas-2 (COX-2) Avskrift observerades som sammanföll med en ökad produktion av en av dess produkter, prostaglandin E2 (PGE2), ett konstaterande som markerat rollen av inflammation i cancer progression. Ökad transkription av MMP sågs också som korrelerade med större kollagen proteolys när aggressiva MDA-MB-231 celler odlades Co med U937 monocyter i DQ-kollagen IV-innehållande kulturer. Notera stödde våra samtidig kulturer inte antagandet att cell-cell interaktioner mekanismer behövs för kollagen nedbrytning. Det föreslog snarare att kommunikationen mellan de två cell linjerna var medieras av utsöndrade molekyler. Dessutom innehöll supernatanterna skördas från dessa samtidig kultur analyser lösliga faktorer som oorganiserad glandular acini bildas av icke-omvandlad MCF-10A celler13. Det konstaterades att aggressiva och primära BrC celler utsöndras förhöjda nivåer av monocyt kemotaktisk molekyler MCP-1, GM-CSF och RANTES. Således skisserat vi en 3D kultur där skildes celler i cell kultur skär att förhindra cell-cell interaktioner. Dessa kulturer användes för att ta itu med indirekta kommunikationen mellan BrC celler och monocyter. För dessa analyser, icke-aggressiv och aggressiva kommersiella BrC cellinjer och primära BrC celler och tre olika typer av humana monocyter: kommersiella U937 och THP-1 celler och primära monocyter (PMs) isolerade perifert blod från friska donatorer (alla monocyter användes i ett icke-aktiverade tillstånd) användes. Ökade koncentrationer av inflammatoriska cytokiner IL-1β och IL-8 observerades för att berikas i samtidig kultur. Dessutom konstaterades det att MMP-1, MMP-2 och MMP-10 var också ökat i BrC celler-monocyt samtidig kulturer och därmed stärka tidigare fynd14. I detta manuskript presenteras en punkt för punkt arbetsflödet av primära BrC celler isolering och provning i 3D kulturer tillsammans med representativa resultat. Detta arbete utgör ett bra exempel på den stora potential som in vitro- 3D cellsystem tillhandahåller för att förhöra specifika aspekter av tumörbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prover från BrC patienter erhölls från vävnadsbanken av de Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Denna studie godkändes av den vetenskapliga, etiska och biosäkerhet etikprövningsnämnder i de Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética sv Investigación och Comité de Bioseguridad. Alla patienter inkluderades prospektivt och informerades om studien natur: de som är villiga att delta undertecknat ett skriftligt informerat samtycke före provtagning och behandlades enligt de etiska riktlinjer och bästa kliniska praxis av institutionen. Identiteten på deltagarna var anonymiseras under hela studien. Patienter som ingick var diagnosen invasiv duktal cancer, histologisk grad 2 och kliniska steg II, med ingen tidigare neoadjuvant terapi innan vävnad resektion. Patienter var alla kvinnliga åldern i genomsnitt 56,8 år (intervall 42-75)14.

1. 3D cellkulturer

  1. Utsäde 0,1 x 106 MCF-10A celler eller primära BrC celler i 25 cm2 kultur kolvar med DMEM/F12 odlingsmedium kompletteras med 5% häst serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 100 ng/mL kolera toxin, 0,5 µg/mL hydrokortison, 10 µg/mL insulin och 20 ng/mL av Epidermal Growth Factor (EGF). Utsäde 0,1 x 106 kommersiella BrC celler, MCF-7 celler och MDA-MB-231 celler i 75 cm2 kultur kolvar med DMEM/F12 odlingsmedium kompletteras med 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön.
  2. Efter 48 h, skölj den cell enskiktslager med 10 mL steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Trypsinize den cell enskiktslager med 3 mL lösning av 0,05% trypsin och 0,48 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) för 5-10 min vid 37 ° C. Tillsätt 200 µL av motsvarande serum att stoppa trypsinization och 7 mL medium utan kosttillskott. Omsuspendera cellerna genom pipettering och ta bort en alikvot av 10 µL till räkna celler i en Neubauer kammare.
  3. I varje brunn av en 8-väl kammaresystem slide, sprida en 40 µL bas av ren ECME, följt av en inkubation av 30 minuter vid 37 ° C.
  4. I varje brunn, placera 800 celler resuspended i 400 µL DMEM/F12 (utan fenolrött) kompletteras liksom steg 1.1 men med följande ändringar: för primära BrC och MCF-10A celler, lägga till 4 ng/mL EGF och 2% ECME; för MCF-7 och MDA-MB-231, bara lägga till 2% ECME.
  5. Inkubera kulturer vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön. Ersätta kultur media varje 48 h.
  6. Posten morfologiska förändringar av celler varje 24 h för 15 dagar med ett optiskt mikroskop. För att analysera morfologi av primära BrC är, MCF-10A och MDA-MB-231 celler bra referens cellinjer för exempel på beställda acinar bildandet och oordnade aggressiv cancer-liknande strukturer, respektive.
  7. Få bilder av celler i ljusa fält mikroskopi vid 100 X och 200 X förstoring och jämför cellmorfologi med hänvisning MCF-10A och MDA-MB-231 cellinjer (figur 1).

2. att erhålla primära cancerceller från tumörvävnad

Obs: För att få använda epiteliala tumörceller vävnad från opererande primära tumörer från BrC patienter med ingen tidigare neoadjuvant terapi; undvika nekrotiska områden och arbetar med minst 0,5 cm3 av tumörvävnad.

  1. Skölj tumörvävnad med steril 1 x PBS och dela upp det mekaniskt med en skalpell i 1-2 mm fragment.
  2. Smälta vävnaden i en steril 20 mL injektionsflaska av glas med lock för 2 h i rumstemperatur (RT) med 2 mL Följ lösningen: Blanda 1 mg/mL kollagenas typ jag och 100 U/mL hyaluronidas i DMEM/F12 medium innehållande 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin , med ständig omrörning.
  3. Filtrera den resulterande suspensionen genom steriliserade bitar av tyll att eliminera stora bitar av osmält vävnad. Filtrera sedan cellsuspensionen genom en steriliserad 100 µm-pore membran.
  4. Pellet cellerna vid 430 x g i 5 min på RT och tvätta dem två gånger med steril 1 x PBS. Kultur primärceller DMEM/F12 medellång kompletteras med 5% häst serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 100 ng/mL kolera toxin, 0,5 µg/mL hydrokortison, 10 µg/mL insulin och 20 ng/mL EGF. Ersätta mediet varje 48 h. upprätthålla kulturer vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön.
  5. Se till att de isolera cellerna epitelceller med ett standardprotokoll immuncytokemi14. Testa tre epiteliala markörer: en panel av typen (PanCK), mucin-1 (Muc-1) och epitelial cell adhesion molekyl (EpCAM).

3. isolera PM celler från perifert blod

  1. Extrakt ca 40 mL av perifert blod från en hälsosam volontär, späda ut blodet i en 1:3 andel med sterila endotoxinfria 1 x PBS och underkasta den en täthet lutning separation.
  2. Ett koniskt rör, placera 2 mL av en polysucrose och natrium diatrizoate medium med en densitet på 1.077 g/mL. Försiktigt och långsamt overlay 8 mL av det utspädda blodet. Centrifugera i 30 min, 765 x g på RT. användning den långsammaste acceleration-retardation hastigheten av centrifugen.
    Obs: Efter centrifugeringen, fyra lager bildas från botten till toppen: röda blodkroppar pelleten, lagrets täthet lutning medium, mononukleära celler lagret (den visas som en fin vit ring) och plasma lagret.
  3. Noggrant hämta det mononukleära celllagrar från övertoningen med en steril Pasteur-pipett och tvätta dem tre gånger med 1 x PBS, varje gång följt av långsammare centrifugering (430, 275 och 191 x g) i 10 min på RT.
  4. Använd negativa urval protokoll för att undvika aktivering av celler. Ett exempel på sådant protokoll är följande:
    1. Tvätta mononukleära cellerna en gång med en tvätt buffrad lösning (0,5% bovint serumalbumin, 2 mM EDTA i 1 x PBS). Räkna cellerna i en Neubauer kammare och anpassa dem till en densitet på 1 x 107 celler/30 µL av en buffrad lösning.
    2. För varje 1 x 107 celler, tillsätt 10 µL av en FcR blockera reagens och 10 µL av en cocktail av monocyt-biotin-antikropp som innehåller anti-humant CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 och Glycophorin A (ingår i kommersiella Kit).
    3. Blanda cellerna och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C. Lägga till en ytterligare 30 µL av buffrad tvättlösningen plus 20 µL anti biotin mikrokulor (ingår i satsen); blanda celler och inkubera i 20 min vid 4 ° C.
    4. Tvätta cellerna en gång med en buffrad lösning, Centrifugera 430 x g för 5 min på RT och återsuspendera i 1,5 mL buffrad lösning för magnetisk separering.
    5. Ladda cellsuspension på en pre sköljda magnetisk separering och tillsätt 7 mL buffrad lösning. Samla den monocyt-berikad fraktionen i en 15 mL koniska rör, räkna cellerna och om inte odlade omedelbart, frysa monocyter på en densitet på 2 x 106 celler/1 mL DMEM/F12 medium kompletteras med 50% FBS och 10% DMSO vid −80 ° C.
      Obs: Undvik att använda monocyter efter mer än 2 månaders frysning, eftersom deras livskraft kan äventyras.
  5. Upprätthålla kulturer av PMs i DMEM/F12 medium kompletteras med 6% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin, vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön.
  6. Utför varje uppsättning experiment utnyttja PMs från minst två olika givare självständigt, eftersom anslutningspoolen monocyter från olika givare kan resultera i monocyt aktivering.

4. upprätta 3D Co kulturer

  1. 3D samtidig kulturer med indirekt interaktion
    Obs:
    utföra dessa analyser i 24-väl platt-botten kultur plattor med polykarbonat cell kultur skär med membran av 0,4 µm porstorlek. I denna analys, kan både supernatanterna och celler hämtas i slutet av experimentet.
    1. Odla 2 x 106 U937 och THP-1 monocyter i 10 mL RPMI 1640 medium kompletteras med 10% FBS, 1% antibiotika/antimycotic, och odla färska PMs i kompletterade DMEM/F12 medium (som anges tidigare i steg 3.5), vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 miljö.
    2. Plåt 4 x 105 monocyter i 1 mL/väl av deras motsvarande medium (kompletteras med 2 ECME och 2% FBS för U937 och THP-1 monocyter, eller 2% ECME och 6% FBS för PMs).
    3. Placera en insats i varje brunn och tillsätt 0,9 mL av 4 x 105 BrC cellsuspension motsvarande medium (kompletteras med 2 ECME och 2% FBS för kommersiella cellinjer eller 5% häst serum för primära BrC-celler). Byt ut hälften av totala media varje 48 h.
    4. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 miljö för 5 dagar och återställa supernatanterna. Hämta celler av trypsinization om efterföljande analys utförs.
    5. Inkludera kontroller av enskilda cellkulturer med respektive media.
  2. 3D samtidig kulturer med direkt interaktion
    1. Etiketten BrC celler och monocyter med olika fluorescerande färgämnen innan cellkultur att tillåta oberoende sortering av varje cell härstamning efter kultur för analys av mRNA och protein uttryck. Använda kommersiellt tillgängliga derivat av kumarin och rodamin som fritt passerar genom cellmembranet av levande celler. Ett allmänt protokoll för märkning är följande:
      1. Förbereda en enskiktslager av BrC celler av intresse (2 × 106 celler i en 25 cm2 kultur kolv) och ersätta standard medium med tillräcklig pre värmde fungerande lösning av den fluorescerande färgämnen (1:2, 000 den fluorescerande färgämne i standard bas medium utan tillägg). Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön. Aspirera dye lösningen och skölj försiktigt med tillräcklig 1 x PBS. Aspirera PBS och lägga till standard medium.
      2. Trypsinize den cell enskiktslager med 2 mL av en lösning av 0,05% trypsin och 0,48 mM EDTA för 5-10 min vid 37 ° C. Tillsätt 200 µL av FBS att stoppa trypsinization och 7 mL korrespondent medium utan tillägg. Att resuspendera cellerna genom pipettering. Ta en alikvot av 10 µL till räkna celler i en Neubauer kammare. Fortsätta med protokollet samtidig kultur efter cell räknar.
      3. Pellet cellerna vid 430 x g i 5 min på RT (utföra detta första eftersom monocyter växer i suspension). Kassera supernatanten och försiktigt Omsuspendera cellerna med 3 mL en pre värmde fungerande lösning av den fluorescerande färgämnen (1:2, 000 den fluorescerande färgämne i en standard bas medium utan tillägg). Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön.
      4. Pellet cellerna igen, kasta dye arbetslösning och försiktigt blandas med 5-7 mL 1 x PBS. Pellet gång, kasta PBS och resuspendera cellerna i 5-7 mL standard medium. Ta en alikvot av 10 µL cellsuspension att räkna celler i en Neubauer kammare. Fortsätta med protokollet samtidig kultur efter cell räknar.
    2. Ange samtidig kulturen enligt följande:: sprida tillräckligt ECME på botten av brunnen för att bilda ett jämnt lager i varje brunn av en 4-bra bild kammaresystem. Tallrik 20 µL av en enda cellsuspension innehållande 5 × 10-5 märkt BrC celler per brunn.
    3. Efter 15-20 min för inkubation vid 37 ° C, Lägg till en suspension av 2,5 x 105 märkt monocyter i 80 µL analyssubstratet (kompletteras med 60% ECME).
    4. Tillåta ECME att stelna under 15-20 minuter vid 37 ° C.
    5. Tillsätt 1 mL av en 1:1 blandning av BrC cellerna och monocyt kulturmassmedia.
    6. Inkubera samtidig kulturer vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 miljö för 24 h, 48 h, eller 5 dagar att spåra ändringar vid olika tidpunkter.
    7. Försämra ECM proteiner för att återvinna cellerna från kulturer. Aspirera och kasta mediet, tillsätt 0,5 mL av 1 x PBS med 0,1% trypsin och 0,25% EDTA och inkubera i 3 timmar vid 37 ° C. Efter inkubation, tillsätt 0,5 mL 1 x PBS med 10% FBS att neutralisera trypsin och resuspendera cellerna genom pipettering kraftigt för att erhålla en encellig suspension.
    8. Pellet celler vid 765 x g i 5 min på RT, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 mL 1 x PBS med 10% FBS. Upprepa detta en gång.
    9. Fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) med ett lämpligt instrument som omfattas av cellsuspensionen. Se till att de slutliga populationerna är minst 95% ren).
    10. Efter sortering, tvätta cellerna med steril 1 x PBS, pellet (430 x g för 5 min på RT) och återsuspendera i sterila 1 x PBS. Celler kan behandlas enligt särskilda protokoll för RNA isolering eller proteinanalys.
    11. Upprepa varje assay tre gånger, inklusive 3D kulturer av varje enskild cell härstamning som kontroller.
  3. Direkt interaktion av 3D samtidig kulturer att bedöma kollagen nedbrytning
    1. Etablera 3D samtidig cellkulturer som beskrivs i steg 4,2, med ytterligare steg för att lägga till 32,5 µg/mL typ IV kollagen märkt med fluorescein isotiocyanat till ECME. Den slutliga koncentrationen av kollagen IV i ECME är 0,5%. Växa kulturerna i ett 35 mm täckglas placeras i en petriskålar.
    2. Sprida ett lager av 40 µL av ECME i botten av petriskål. Tillåta ECME att stelna vid 37 ° C.
    3. Tillsätt 2,5 x 105 BrC celler i 10 µL av medium och celler att slå sig ner.
    4. Lägga till en suspension av 1,25 x 105 U937 monocyter i 40 µL analyssubstratet (kompletteras med 60% av märkt DQ-kollagen IV-ECME).
    5. Tillåta ECME att stelna under 15-20 minuter vid 37 ° C.
    6. Tillsätt 2 mL av en 1:1 blandning av BrC celler och monocyt kulturmassmedia.
    7. Inkubera samtidig kulturerna i 5 dagar vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön. Ersätta kultur media varje 48 h.
    8. Analysera fluorescens utsläpp i en confocal skanning Mikroskop och mäta integrerade optiska densitet (IOD) per 50 µm2 av kultur. Jämföra ioder mot enskilda kulturer och kulturen som helst noll (figur 2).

5. analys av supernatanterna från 3D kulturer tillsammans med indirekt interaktion

  1. Efter 5 dagar av samtidig kultur, återställa supernatanterna från både övre och de nedre fack av 3D samtidig kulturerna och från enskilda 3D kultur kontrollerna. Blanda väl varje supernatanten genom pipettering. Delprov och lagra supernatanten vid −20 ° C fram till användning (upp till en månad).
    Obs: Hålla supernatanterna −80 ° C om lagring kommer att vara längre än en månad.
  2. Analysera supernatanterna med multiplex assay plattformar, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) eller pärla-baserade immunanalyser efter tillverkarens rekommenderade rutiner.
    Obs: Supernatanterna kan också analyseras genom Western blot eller koncentrerad genom specifika pore filter att erhålla berikad protein storleksfraktioner för att utföra zymography analys16,17. Alternativt använda supernatanterna som luftkonditionerade medier för andra experiment, som beskrivs nedan. Konditionerat media hämtas vanligtvis från en 5-dagars kultur (figur 3).

6. karakterisering av effekter av supernatanterna från primära BrC celler Acini bildandet och Acini struktur

  1. I varje brunn för en 8-väl kammaren bild system sprida en 40 µL bas av ECME och låt den stelna under 30 minuter vid 37 ° C.
  2. Utsäde 800 MCF-10A celler per brunn i 400 µL kompletterade DMEM/F12 odlingsmedium, som beskrivs i steg 1.2.
  3. Tillsätt 400 µL av konditionerat media eller kompletterade DMEM/F12 odlingsmedium med 20 ng/mL humant rekombinant IL-1β.
  4. Plats i kammaren bilden i en petriskål av glas som innehåller en 35 mm petriskål fylld med 2 mL PBS att skapa en luftfuktighet.
  5. Ersätta media/supernatanten varje 48 h.
  6. Spela in glandular acini bildandet varje 24 h i 14 dagar med ett optiskt mikroskop.
  7. Efter 14 dagar av kultur, fläcken acini med 100 µL av 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) vid en koncentration på 100 nM i 1 x PBS att iaktta cellkärnor. Inkubera i 25 min på RT i ständig omrörning. Skölj tre gånger med 1 x PBS för 5 min, varje gång i konstant omrörning på RT. Mount förberedelserna med en specifik monteringsmedium för fluorescerande färgning. Försegla med transparent lack och underhålla skyddas från ljus vid 4 ° C.
  8. Analysera acini med en confocal Mikroskop som tar bilder av övergripande stackar på olika djup av acini (figur 4A, B, C).
  9. Visualisera olika cellulära proteiner i acini med ordentlig färgprotokollen. Exempelvis var E-cadherin målat för att bedöma cell till cell adhesion, cell polaritet eller lumen bildandet18 (figur 4D).

7. migration analyser

Obs: Utföra migrering analyser av U937, THP-1 och färska PMs i 24-väl platt-botten kultur plattor använder polykarbonat cell kultur skär med membran av 8 µm porstorlek. Det visades tidigare att kemokinerna GM-CSF, MCP-1 och RANTES hittades utsöndras vid höga koncentrationer i enskilda 3D kulturer av aggressiva BrC cellinjer. Det föreslogs att dessa cytokiner var kritiska till att locka monocyter till platsen för den primära tumören; Detta testades i migration analyser med hjälp av cytokiner som chemoattractants.

  1. Kultur U937, THP-1 eller färska PMs som beskrivs i steg 4.1.1.
  2. Skölj en gång varje insats med 200 µL RPMI 1640 utan sera att återfukta membranet.
  3. Fyll den med 50 µL av kalla ECME, placera skären i en 24-väl platt-botten kultur plattan, och ge ECME att polymerisera för 1 h vid 37 ° C.
  4. Tillsätt 180 µL av RPMI utan FBS i övre facket av plattan. Lägg till i den nedre kammaren utan bubblande 800 µL av RPMI kompletteras med antingen 100 ng/mL GM-CSF, MCP-1 eller RANTES som korrektiv. Använda medium utan cytokiner som en negativ kontroll. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C att upprätta en chemokine övertoning.
  5. Plats 1,5 x 105 av varje typ av monocyt i ett sterilt rör, tvätta två gånger placera med 1 mL 1 x PBS och centrifugera vid 430 x g i 5 min på RT. Omsuspendera monocyter i 20 µL i RPMI utan FBS, dem i skären , och mycket noggrant homogenisera cellsuspensionen (den avslutande volymen i den övre kammaren är 200 µL).
  6. Tillåta cellmigration till framsteg för 24 h vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön.
    Obs: Monocyter är icke-anhängare, blir oftast flyttande celler i massmedia av det nedre facket.
  7. Ta bort skären, Hämta media och räkna celler på 2, 4, 6 och 24 h med en Neubauer kammare eller en flödescytometer; Alternativt, särskilt om inga celler finns i media, förvärva bilder av den nedre delen av skären med en digitalkamera. Det genomsnittliga celltalet från 3 slumpmässiga fält (på 100 X förstoring) används för analysen (figur 5).

8. invasion analyser

Obs: Utföra invasionen analyser av BrC cellerna i 24-väl platt-botten kultur plattor med polykarbonat cell kultur skär med membran av 8 µm porstorlek. I vår ursprungliga studierna var IL-8 en av de cytokiner som berikad i supernatanterna BrC cell/monocyt 3D samtidig kulturer. Huruvida denna cytokin deltog i invasionen av BrC cellinjer testades.

  1. Expandera BrC celler i 75 cm2 kolvar. MCF-7, T47D, HS578T och MDA-MB-231 som beskrivs i steg 1.2 (men utan ECME) och primära BrC celler som beskrivs i steg 2,4.
  2. Tvätta när varje polykarbonat 8 µm-pore membran cellkultur infoga med 200 µL medium utan sera (det medium som används beror på den cellinje som testat) att återfukta membranet.
  3. Fyll skäret med 50 µL av kalla ECME (1:4 utspädning ECME:cold medium utan FBS), placera skären i en 24-väl platt-botten kultur plattan, och ge ECME att polymerisera för 1 h vid 37 ° C.
  4. När ECME har polymeriserat, lägga till 180 µL av respektive cell medierna utan FBS. Lägga till 800 µL media utan FBS genom snitten av skäret. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C att upprätta en IL-8 övertoning.
    Obs: Undvik att skapa bubblor i media. Media som används är utan FBS men kompletteras med 100 ng/mL av IL-8 som ett korrektiv, eller ren medier utan FBS, som negativa kontroller.
  5. Erhålla totalt 6 x 105 celler i varje cell fodrar enligt följande:
    1. Kassera supernatanterna, skölj en gång med 10 mL 1 x PBS och tillsätt 2 mL 0,05% trypsin/0,48 mM EDTA för 2 min vid 37 ° C att lossa cellerna. Tillsätt 4 mL kompletterade medium att stoppa trypsin reaktionen och resuspendera kraftigt genom pipettering.
  6. Ta en 10 µL delmängd av cellsuspensionen räkna cellerna i en Neubauer kammare. Ta en volym av cellsuspensionen som innehåller 6 x 105 celler. Centrifugera vid 430 x g för 5 min på RT, avlägsna supernatanten och skölj celler i 1 mL 1 x PBS. Upprepa skölj en gång till.
  7. Att resuspendera cellerna i 20 µL av respektive media utan FBS och plats i skären som innehåller 180 µL av respektive media utan FBS. Noggrant homogenisera cellsuspensionen genom pipettering.
  8. Tillåta en cell invasion till framsteg för 48 h vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 -miljön.
  9. Efter 48 h, ta bort insatsen, avlägsna supernatanten och skölj insatsen en gång mycket noga med 200 µL 1 x PBS. Ta bort överskottet av PBS med bomull spets applikator.
    Obs: Invasiva cellerna oftast är kopplade till andra sidan av skäret som i detta fall där cellerna är anhängare.
  10. Fixa cellerna genom att placera insatsen i en väl 24-väl platt-botten kultur platta innehållande 1 mL/väl av 4% PARAFORMALDEHYD i 15 min på RT. därefter, skölj skären en gång med 1 x PBS.
  11. Färga celler genom att placera insatsen i en väl 24-väl platt-botten kultur platta innehållande 1 mL/väl av 1 x PBS med 0,2% kristallviolett för 45 min på RT. noggrant, med en bomull spets applikator ta bort alla ECME från toppen av membranet , som innehåller celler som inte migrera, och skölj noggrant med destillerat vatten för att undvika att eliminera fast invasiva celler.
  12. Räkna de invaderande cellerna genom att observera den nedre sidan av insatsen i inverterade Mikroskop. Det genomsnittliga celltalet från 3 slumpmässiga fält (på 100 X förstoring) används. I fall där cellerna har invaderat som kluster och är svåra att räkna individuellt, förvärva bilder från 3 slumpmässiga fält (på 100 X förstoring) med en digital kamera. Analysera bilderna med programvara för bildanalys och använda IOD för att kvantifiera cell invasion (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologisk analys av BrC celler i 3D kulturer:

Morfologi av primära BrC-celler som växer i 3D kulturer vid låga och höga tätheter studerades under 5 dagar. Under de första 48 h, celler följer ECME och upprätthålla en låg densitet. Vid denna tidpunkt, kan det klart uppskattas att celler presentera en avlång spindel-liknande form, några med två eller flera långa cytoplasmiska prognoser och utan visar uppenbara cell-cell kontakter. Efter 5 dagar av kultur frodats celler samtidigt som deras inledande morfologi. Dessutom de bildade strukturer som liknar nät utan en viss strukturell organisation och visas staplade upp med ingen kontakt-hämning. En jämförelse med icke-omvandlad MCF-10A celler gjordes, som bildar sfäriska strukturer som liknar glandular acini. Dessa celler visar en karakteristisk morfologi av rundade väl avgränsad och organiserade strukturer i homogen storlekar (av cirka 50 µm). Primära BrC celler delar tvärtom en mycket närmare likhet med aggressiva BrC celler MDA-MB-231 (figur 1).

Analys av Cell-till-cell direkt interaktioner och kollagen nedbrytning:

Vi designade en 3D samtidig kultur-modell för att bedöma följande: cell morfologi, kollagen nedbrytning, cellmigration, och om det finns en direkt interaktion mellan BrC celler och monocyter i samtidig kultur. Efter 5 dagar, både MCF-7 och MDA-MB-231 kommersiella BrC celler bildar oorganiserad aggregat i 3D kulturer, men de skiljer sig i deras morfologi. Aggressiva cellerna MDA-MB-231 bildar aggregat med avlånga former med vissa celler tenderar att skilja från resten, medan icke-aggressiv MCF-7 celler bildar aggregat där celler upprätthålla rundade former och de verkar vara mer tätt packad (figur 2 A, B). DQ kollagen IV införlivades för att visualisera proteolytisk nedbrytning (grön), med både BrC kulturer uppvisar fluorescerande aktivitet. Att kvantitativt bedöma proteolytiska aktivitet, mättes grön fluorescens som IOD av sex 50 µm2 fält. En jämförelse gjordes mellan enskilda 3D kulturer av MDA-MB-231 celler och samtidig kulturer med U937 monocyter. Observerades en statistiskt signifikant ökning av proteolys i samtidig kultur (figur 2C). Även en konfokalmikroskopi analys av seriell transversala travar varje 10 µm av MDA-MB-231 och U937 monocyter samtidig kultur var utfört (figur 2D). Denna analys visade att U937 monocyter migrerats mot aggressiva cellerna MDA-MB-231 med några monocyter når lagret av BrC celler. Det var dock uppenbart att cell-cell direkt interaktion platser inte nödvändigtvis sammanfaller med områden av högre proteolytiska aktivitet: istället områden av kollagen nedbrytning var jämnt fördelade i kulturen, vilket leder till slutsatsen att kollagen nedbrytning var resultatet av indirekt kommunikation medieras av utsöndrade faktorer. Därför bytte 3D samtidig kultur modellen för att placera cellerna i olika fack avgränsade med ett poröst membran att tillåta cell-cell kommunikation baserat på utsöndrade faktorer, och undvika cell märkning och sortering efter kultur.

Analys av IL-1β i supernatanterna från 3D kulturer:

Arbetar med indirekt interaktion 3D kulturer, supernatanterna från enskilda primära BrC skördades kulturer och deras 5 dagar samtidig kulturer med PM. Dessa supernatanterna utsattes för samtidig analys av 18 cytokiner och 5 MMP använder kommersiella kit och ett instrument som utformats speciellt för denna analys. Av alla analyter testade, observerades signifikant ökade nivåer av IL-1β och IL-8 i primära BrC cell-monocyt samtidig kulturer, båda avgörande inflammatoriska cytokiner som tidigare associerats med malign progression15, 18 , 19 , 20 (figur 3, resultat för IL-1β). Detta exempel är en annan typ av analys att 3D kulturer tillåter för att efterlikna kommunikationsnätet som formar den tumör mikromiljö.

Karakterisering av supernatanterna och Acini struktur:

På grundval av 3D experimentella systemet har utvecklats av har, Timmy och Brugge7, där MCF-10A fastställdes som en modell av de mekanismer som är associerad med Onkogenes, utvärdering av huruvida de utsöndrade faktorerna från den primära BrC-cellen supernatanterna påverkade bildandet av MCF-10A 3D acini-liknande strukturer, liknande till aktivitet observerades efter transduktion viral och cellulära onkogener7,21 utfördes. MCF-10A celler odlades med två olika supernatanterna från två primära BrC cellinjer att iaktta lumen bildandet (som ett mått på resistens mot anoikis). Dag 14, spheroids utvärderades av konfokalmikroskopi övergripande nedskärningar på 0, 25, 50, 75 och 100% djup, och i båda fallen konstaterades det att MCF-10A celler kringgås anoikis (mätt genom att räkna antalet centrala (luminala) celler i acini (figur 4 B, C)). Således saknar MCF-10A cell acini som bildas med luftkonditionerade media från BrC celler, en välformad ihåliga lumen, till skillnad från MCF-10A som odlas med dess standard odlingsmedium (som beskrivs i steg 1.2) (figur 4A). IL-1β var mycket utsöndras i 3D samtidig kultur-systemet; MCF-10A cellerna odlades därför också med humant rekombinant IL-1β18. Figur 4 D visar ett konfokalmikroskopi övergripande skär på 50% djup av acini i närvaro av IL-1β (lägre paneler) och avslöjar att denna cytokin också ger resistens mot anoikis. Således, lösliga faktorer utsöndras av primära BrC celler, till exempel IL-1β, främja överlevnad icke-omvandlad MCF-10A celler som förlorar ECM interaktioner, ett kännetecken av invasiv cancer.

3D samtidig kulturer främja en inflammatorisk reaktion som är associerad med Migration av monocyter och Invasion av cancerceller:

Vi har tidigare visat att primära BrC celler i 3D kultur utsöndrar höga basala nivåer av proinflammatoriska chemokiner känt att locka monocyter14. Således analyserat vi flyttande kapacitetarna av monocyter i svar till kemokinerna hittade berikad i konditionerat media BrC celler. Kommersiella monocyter U937 och THP-1 och färska PMs flyttande kapacitet utvärderades svar på tre olika chemokiner: GM-CSF, MCP-1 och RANTES. U937 och THP-1 monocyter var kapabla att migrera svar på GM-CSF och MCP-1, med U937 som den mest följsamma, medan båda monocyter hade ett null-svar till RANTES. Ännu viktigare, visade PMs en hög basal flyttande aktivitet och mest potenta svar på MCP-1 (figur 5). IL-8 var också berikad efter primära BrC celler och monocyter 3D samtidig kultur. Således analyserat vi om IL-8 ändrar kapaciteten för invasionen av kommersiella och primära BrC cellinjer. De kommersiella aggressiva BrC cellinjer (HS578T och MDA-MB-231) invaderade svar på IL-8, medan de icke-aggressiv (MCF-7 och T47D) inte invadera. Överraskande, var primära BrC cellerna mer invasiv än kommersiella aggressiva BrC cellinjer som svar på IL-8 (figur 6A, rätt panelerna). I vissa fall kan invadera cellerna som kluster och IOD analys var därför nödvändigt (figur 6B).

Figure 1
Figur 1 : Representativa bilder av BrC celler i 3D kulturer. Från vänster till höger: kontroll av icke-omvandlad MCF-10A celler bildar karakteristiska glandular acini, med rundade morfologi, väl avgränsad Cellkontakter, och organiserade strukturer av homogen storlekar (cirka 50 µm på genomsnittliga, optisk förstoring 200 X). Mellersta paneler visar primära BrC celler odlade på låg densitet (2 dagar) och hög densitet (5 dagar). Celler följer ECME och upprätthålla en låg densitet vid tidig tidpunkter. Det är uppenbart att celler presentera en avlång spindel-liknande form, några med två eller flera långa cytoplasmiska prognoser och med inga uppenbara cell-cell adhesion. Däremot, bildas högdensitets celler vid senare tidpunkter strukturer som liknar nät utan en viss strukturell organisation. Dessa celler verkade staplade upp visar ingen kontakt-hämning. En kontroll av kommersiella MDA-MB-231 celler efter 5 dagar i 3D kultur visas; dessa aggressiva BrC-celler dela en mycket närmare likhet med primära BrC kulturer (optisk förstoring på 100 X). Skala bar representerar 50 µm. 800 celler var seedad i början av experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Analys av ECM nedbrytning. Icke-aggressiv MCF-7 färgas med en gul fluorokrom (A) och aggressiv MDA-MB-231 celler färgas med en röd fluorokrom (B) odlas under 5 dagar i 3D villkor; 0,5% av grön fluorescens-märkt kollagen IV införlivades för att visualisera ECM nedbrytning. I A och B, övre vänstra bilderna representerar nivåerna av kollagen nedbrytning, de övre högra panelerna representerar de optiska bilderna, längst ner till vänster representerar BrC cellerna och botten rätt panelerna visar kopplingen av fluorescerande och optisk bilder. För A och Bpresenteras optisk förstoring på 200 X och skalstapeln 100 µm. (C) representativa bilder av ECM proteolys (grön) i 3D kultur av enskilda MDA-MB-231 celler som kontroll, jämfört med ECM proteolys av 3D samtidig kultur av MDA-MB-231 med U937 monocyter. Skala staplarna representerar 10 µm. IOD (integrerad optisk densitet) sex 50 µm2 fält från varje villkor mättes. Medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) från kvantifieringar presenteras; två asterisker representerar en statistiskt signifikant skillnad p < 0,01 (Mann-Whitney test). (D) direkt interaktion av MDA-MB-231 celler (grå nyans massa) med fluorescently färgade U937 monocyter (orange); grön fluorescens motsvarar proteolys. Seriell skivor genererades varje 10 µm av konfokalmikroskopi vända lokalisering och direkta samspelet mellan både cellinjer. Optisk förstoring på 200 X; skala staplarna representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: IL-1β koncentrationen ökas i 3D samtidig kulturer. Ett representativt resultat av IL-1β nivåer (pg/mL) i supernatanterna från åtta (PC1-8) primära BrC celler, odlade individuellt i 3D (3D), och jämfört mot deras 3D samtidig kulturer med PM (CC). En kontroll av PM i enskilda 3D kultur ingick för jämförelse (PM). Resultaten var ur en större multiplexering analys, flera cytokiner upptäcktes där samtidigt i varje prov med hjälp av en immunodetection-baserad teknik tillgänglig som kommersiella kit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Utsöndrade faktorer från primära BrC celler inducerar motstånd mot anoikis i icke-omvandlad MCF-10A celler. MCF-10A celler odlades i 3D förhållanden med standard kultur media (kolumn A och övre paneler av D), där det kan konstateras att acini presentera typiska ihåliga lumen (25-75% djup markeras med en röd fyrkant); När MCF-10A celler odlades med två olika supernatanterna från två primära BrC kulturer (kolumnerna B och C), är lumen inte ihåliga men fylld med celler som betecknar motstånd mot anoikis. Likaså när MCF-10A celler odlades i 3D villkor lägga till humant rekombinant IL-1β (20 ng/mL), ingen ihåliga lumen kan uppskattas på 50% djup konfokalmikroskopi delarna av acini (lägre paneler av D). Rätt oval karikatyren representerar avsnitten konfokalmikroskopi som gjorts på 0, 25, 50, 75 och 100% djup av acini. Bilderna visar atomkärnor fläckade DAPI (blå) och E-cadherin i grönt. Optisk förstoring på 200 X, skala staplarna representerar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Flyttande kapacitet av monocyter. Representativa bilder av flyttande kapacitet U937, THP-1 och PM svar på GM-CSF, MCP-1 och RANTES. Kontroller utan chemokine är inkluderade (första kolumnen från vänster till höger). Siffrorna nedanför bilderna anger antalet flyttfåglar celler i varje skick. U937 och THP-1 monocyter var främst lyhörda för GM-CSF och MCP-1, medan PM visade en hög flyttande kapacitet i sig, och var mest lyhörda cellerna till MCP-1. Optisk förstoring på 100 X; skala barer representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Aggressiva och primära BrC celler invadera svar till IL-8. A. Invasion analyser med två icke-aggressiv (MCF-7 och T47D), två mycket-aggressiv (HS578T och MDA-MB-231) BrC cellinjer och en primär BrC kultur svar till IL-8 används som korrektiv. Övre paneler motsvarar kontroller utan chemokine visar ingen invasion, lägre paneler Visa svar till IL-8, med mycket aggressiva BrC och primära BrC celler invaderar genom membranet i cellen kultur skäret. B. exempel på celler som invaderar i kluster. i dessa fall görs mätning av invasion med en bild analysprogram för att bestämma invasion när det gäller IOD (integrerad optisk densitet) per område. Siffrorna nedanför bilderna representerar antalet invaderande celler i varje skick. Optisk förstoring på 100 X; skala staplarna representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitelceller växer i en 3D rumsliga konformation och deras interaktion med ECM proteiner är avgörande för vävnad homeostas. Många cancer studier baserats på celler odlade i enskiktslager (2D) och även om de har varit avgörande för att förstå många aspekter av tumörbildning och progression, enskiktslager recapitulate inte egenskaper som ECM ålägger celler, för instans: begränsa spridning, vidhäftning-beroende cellöverlevnad, apikala-basolateral polaritet, ECM remodeling, celldifferentiering, m.m. Viktigt, inte bara samverkan mellan tumörceller och ECM är väsentliga för utvecklingen av cancer, men också kommunikationen upprättas mellan tumör och icke-tumör celler, såsom immunceller. De protokoll som anges här underlätta förståelsen av samspelet mellan immunceller och cancerceller inom miljön förutsatt av ECM, främjas den inflammatoriska responsen av dessa interaktioner och hur detta inflammatoriska tillstånd skapa en positiv loop främja kemoattraktion av monocyter och mer invasion av cancerceller.

En stor fördel med att använda ECME är att det ger en biologisk byggnadsställning som är lämplig att utföra en mängd experimentella 3D modeller22. Den är berikad med ECM proteiner såsom laminin, kollagen IV, entactin, heparansulfat sulfat proteoglykan och tillväxtfaktorer, som i vivo skulle interagerar med epitelceller. En nackdel är att eftersom det kommer från lysates av murina sarkom, koncentrationen av deras komponenter varierar mellan olika partier. Så, är det ofta nödvändigt att karakterisera flera partier för att få mer homogen data. I laboratoriet, varje nytt parti testas på två sätt: (1) genom att utvärdera rätt acini bildandet av MCF-10A celler, och 2) av bedömning av invasivitet av BrC cellinjer av väletablerade invasiv kapacitet. Ett annat alternativ är att arbeta med andra produkter, byggnadsställningar, såsom Hydrogel, som är en syntetisk nanofiber peptid byggnadsställning. Styvheten i 3D kulturen kan styras genom justering av koncentrationen av Hydrogel23,24. Allt skulle detta system kunna tillämpas för att studera interaktionen mellan någon typ av neoplastiska cellen och hematopoetiska eller icke-hematopoetiska celler. Det kunde även vara möjligt att utforma mer komplexa system med fler än två olika cell härstamningar. En viktig fördel med 3D-modeller är att de tillåter studie av cellmorfologi och cell organisation formas av ECM interaktioner, som förändras under Onkogen transformation. Likaså kan man studera onkogena funktioner såsom proteolytisk nedbrytning, och huruvida celler först placerade i olika lager av kultur signalera till varandra att främja direkt interaktion/kommunikation. Annan cell härstamningar kan dessutom märkas med olika fluorokromer så att de kan hållas isolerade efter experimentet att hantera specifika frågor till varje enskild celltyp, med till exempel RNA och/eller protein uttryck analys13. Här visas IL-1β utsöndring till medium i primära BrC celler/PM samtidig kulturer, stödja en möjligt nyckelroll denna cytokin i indirekta kommunikationen mellan tumörceller och monocyter som utlöser malign progression.

En annan viktig experimentellt protokoll i laboratoriet är analysen av acini bildandet i 3D kulturer av icke-omvandlad MCF-10A celler. Denna analys användes för provning av viral och cellulära onkogen aktivitet, och att testa hur den tumör närmiljön påverkar funktionen relaterade till aggressiva cancerformer. Exempelvis under den normala utvecklingen av acini, luminala central celler förlorar kontakten med de basala membranproteiner (tillhandahålls av ECME) utlösande mekanismer för celldöd, känd som anoikis. Det observerades att båda supernatanterna från primära BrC celler eller rekombinant IL-1β främja MCF-10A celler motstånd mot anoikis. Eftersom en hög koncentration av IL-1β främjas på BrC cell-monocyt interaktion, stöder denna observation att tumör stroma är en integrerad del av tumör progression till mycket aggressiva stadier.

Migration och invasion protokollen beskrivs här utgöra användbara 3D kompletterande analyser där vi kan stödja funktioner för celler att migrera eller invadera som svar på stimuli som härrör från tumör stroma. Det visades att chemokiner (GM-CSF och MCP-1) Funna i förhöjda halter i 3D kulturer av primära BrC celler kan främja migration av U937, THP-1 och PMs, stödja aggressiva tumörceller förmåga att främja en pro-inflammatoriska mikromiljö. Dessutom främjas IL-8 som också finns i ökad koncentration i supernatanterna från samtidig kulturer av BrC celler/monocyter, ökad invasion av både kommersiella aggressiva BrC (HS578T och MDA-MB-231) och primära BrC celler.

Beträffande villkoret för celler är det viktigt att arbeta med primära BrC celler innan de når tio passager för att dra nytta av deras spridning peak och undvika potentiella efter isolering genetiska och epigenetiska förändringar som härrör från in vitro- kultur. En annan viktig aspekt när du arbetar med primära celler är att bekräfta sin identitet efter isolering. Vi används en panel av biomarkörer för att bestämma deras epitelial härstamning identitet, som inkluderar PanCK, Muc-1 och EpCAM (som anges i steg 2.5). Likaså är det bättre att använda färska PMs, som varje parti testas försäkrar att de är i samma skede av differentiering. Varje ny batch används presenteras fenotyp CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68neg CD16neg, vilket motsvarar icke-aktiverade omogna monocyter. Allt blanda vi inte monocyter från olika givare, som blandning resultat monocyt-aktivering. I stället testade vi självständigt BrC Co kulturer använder monocyter från minst två olika givare.

3D kultur system fortfarande har den begränsningen att endast några delar av tumörbiologi kan modelleras på ett tillförlitligt sätt. Ett nytt alternativ är de mer komplexa 3D-modellerna av organoids, som bygger på expansion och differentiering av stamceller in vitro-. Organoids utvecklar också mycket organiserade epiteliala strukturer. Exempel den gastric 25,26, lever 27och njure organoids28. Organoid modeller för varje mänskliga organ återstår dock uppnås. Dessutom kräver de mycket mer komplexa och dyra försöksbetingelser.

Sammanfattningsvis här beskriver vi i detalj ett arbetsflöde av analyser: Start från isolering av tumörceller från BrC patienter, testa deras inflammatoriska förmåga i en ECME-baserat 3D kultur modell, testa hur det inflammatoriska mikromiljö serverar dem att rekrytera ytterligare inflammatoriska celler, såsom monocyter, till slutligen analysera kommunikationen mellan båda typer av celler, och hur detta meddelande ytterligare främjar en inflammatorisk närmiljön som främjar progression till mer aggressiva cancer etapper. Dessutom beskriver vi de morfologi och fenotyp av primära BrC celler. I framtida studier, det ska bli intressant att testa andra inflammatoriska celler eller ens testa kommunikationen mellan BrC och flera celler återfinns ofta i tumör stroma. Dessa 3D multipel-cellkulturer kommer att ge en större bild av vad som händer biologiskt i vivo under cancer progression. Jämförelser mellan in vitro- data och patientens kliniska resultatet kommer att identifiera potentiella mekanismer som har en högre inverkan på cancer aggressivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete var stöds av CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE projekt nr 233061 till Ezequiel M. Fuentes-Pananá och Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (projektnummer HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez NA är doktorand från Programa de Doctorado sv Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) och mottagna gemenskap 231663 från CONACYT. E-S NA, bekräftar också det finansiella stöd som tillhandahålls av mexikanska Institutet för Social trygghet (IMSS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95, (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8, (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18, (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3, (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2, (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11, (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65, (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16, (1), 118-126 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics