Analysere kommunikasjonen mellom monocytter og primære brystkreft celler i en ekstracellulær Matrix ekstrakt (ECME)-basert tredimensjonale System

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en tredimensjonal kultur metode for å analysere morfologi av primære brystkreft celler, så vel som å studere deres direkte/indirekte interaksjon med monocytter og resultatene som kollagen fornedrelse, immun celle rekruttering, celle invasjon, og fremme av kreft relatert betennelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Innebygd i den ekstracellulære matrisen (EFM), kommunisere normal og neoplastic epitelceller nært med blodkreft og ikke-blodkreft cellene, dermed sterkt påvirke normalt vev homeostase og sykdom utfallet. Brystkreft spille tumor-assosiert makrofager (TAMs) en avgjørende rolle i sykdomsprogresjon og metastasering regelmessighet; Det er derfor viktig å kontrollere sykdommen å forstå mekanismene av monocyte chemoattraction svulst microenvironment og deres samhandling med kreftceller. Her gir vi en detaljert beskrivelse av et tredimensjonalt (3D) co kultur system av menneskelige brystkreft (BrC) celler og menneskelige monocytter. BrC celler produsert høye basale nivåer av regulert på-aktivisering, normal T-celle uttrykt og utskilles (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) og granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (G-CSF), mens i co kultur med monocytter, Pro-inflammatoriske cytokiner Interleukin (IL) -1 beta (IL-1β) og IL-8 var beriket med matrise metalloproteinases (MMP) -1, MMP-2 og MMP-10. Dette svulst stroma microenvironment fremmet motstand mot anoikis i MCF-10A 3D acini-lignende strukturer, chemoattraction av monocytter og invasjonen av aggressiv BrC celler. Protokollene presenteres her gir et rimelig alternativ for å studere intra-svulst kommunikasjon og er et eksempel på det store potensialet som in vitro 3D celle-systemer for å avhøre funksjoner i svulst biologi relatert til tumor aggresjon.

Introduction

Svulst biologi er langt mer intrikate enn tidligere antatt. Montering bevis viser at kreftceller er mer enn bare bulk av ukontrollert voksende celler. Snarere, forskjellige neoplastic celler synes å utføre forskjellige funksjoner viser høy organisasjon og hierarki innenfor svulst1. Kreftceller er også i intime kommunikasjon med ikke-transformert cellene: makrofager, fibroblaster, lymfocytter, adipocytter, endotelceller, blant andre celler er alle midt i stillaset proteiner og polysakkarider som utgjør ECM. Mange direkte og indirekte samhandling er etablert mellom transformert og ikke-transformert celler og ECM, som utøver en mektig innflytelse over sykdom utfallet2,3. I det konkrete tilfellet av BrC er det spesielt viktig å analysere kommunikasjonen av BrC celler med TAMs, vurderer at TAMs har blitt funnet for å spille en avgjørende rolle i utviklingen av svulsten, øker risikoen for metastasering og for sykdommen tilbakefall4 ,5.

Analysere intra-tumoral vekselsvirkningene og deres mulige utfall, nye 3D i vitro tilnærminger har blitt utviklet basert på bruk av ECM ekstrakter som gir en mye mer komplisert microenvironment, nærmere virkeligheten av svulst biologi, i forhold til de konvensjonelle monolayer cellekulturer der cellene vokse knyttet til plast. Petersen og Bissell6 gitt den første modellen av nonmalignant og ondartet mammary epitelceller kultivert på en laminin-rik kjelleren membran og var først til å beskrive 3D organotypic strukturer som diskriminerer nonmalignant menneske bryst epitelceller fra sine ondartet kolleger. Et tiår senere, modellen utviklet av Debnath, Muthuswamy, og Brugge7,8,9 gitt et verdifullt verktøy for å belyse de biologiske banene kompromittert under malign transformasjon av kjertel acini, slik som store acini formasjon på grunn av ukontrollerte spredningen, delocalization av tett krysset proteiner som bevis av nedsatt celle polarisering, og tap av acini lumen som følge av cellen motstand mot anoikis, en type programmert celledød som oppstår i Anchorage-avhengige celler når de koble fra omkringliggende ECM. Modeller av Sameni, Jedeszko og Sloane har fokusert på tenkelig proteolytiske av celler, som er nært knyttet til invasiveness, en annen viktig egenskap svulst malignitet10,11,12. Disse modellene er avhengige av protein matriser blandet med annet fluorescens-slukket protein underlag (DQ-gelatin, DQ-kollagen I, og DQ-kollagen IV), hvilke fluorescerende signaler er indikativ av proteolytisk degradering av kollagen. 3D modeller brukes også stamcelleforskningen egenskaper av både ikke-transformert og kreftceller, i hvilken celle aggregat, også kalt spheroids, kan kultivert i suspensjon eller ECM-lignende proteiner forhører for mekanismer av celledifferensiering, asymmetrisk celledeling, overholdelse av celle til celle, og cellen motilitet13,14. Invasjonen analyser at testing av iboende aggressivitet av svulsten og identifikasjon av molekylene som tjener som chemoattractants under invasiv prosessen15. Samlet, 3D modeller representerer en rimelig diversifisering i vitro celle kultur som nærmere gjenspeile normal og kreftfremkallende vev morphogenesis.

Vi har designet en 3D celle co kultur-systemet basert på de nevnte modeller7,10,11, med både menneskelige kommersielle BrC cellelinjer med kjente aggressiv potensial (luminal og trippel-negativ typer) og primær celler explanted fra BrC pasienter. Vi utviklet en modell der ingen-aggressiv (MCF-7) eller aggressiv (MDA-MB-231) BrC celler var co kulturperler med U937 monocytter i en ekstracellulær matrix ekstrakt (ECME)-basert 3D-system som tillater direkte celle-celle interaksjoner. Disse co kulturer ble brukt til å bestemme hvordan kommunikasjonen mellom disse to cellen overleveringslinjer påvirket transkripsjon av et sett av gener som er knyttet til kreft aggressiv atferd. En betydelig økning av cyclooxygenase-2 (COX-2) avskrift ble observert som falt sammen med en økt produksjon av en av sine produkter, prostaglandin E2 (PGE2), et funn som valgte betennelse i kreft progresjon. Økt transkripsjon av MMP ble også observert som korrelert med større kollagen proteolyse når aggressiv MDA-MB-231 celler var co kultivert med U937 monocytter i DQ-kollagen IV inneholder kulturer. Av notatet støtter våre co kulturer ikke antakelsen om at celle-celle samhandling mekanismer er nødvendig til kollagen fornedrelse. Det foreslo heller at kommunikasjon mellom to cellen linjen ble formidlet av utskilles molekyler. Videre inneholdt supernatants høstet fra disse co kultur analyser løselig faktorer som uorganisert kjertel acini dannet av ikke-transformert MCF-10A celler13. Det ble funnet at aggressiv og primære BrC celler utskilles forhøyede nivåer av monocyte chemotactic molekyler MCP-1, GM-CSF og RANTES. Derfor skissert vi en 3D kultur der celler ble skilt i celle kultur setter å hindre celle-celle interaksjoner. Disse kulturene ble brukt til å løse indirekte kommunikasjonen mellom BrC celler og monocytter. For disse analyser, ingen-aggressiv og aggressiv reklamen BrC cellelinjer og primære BrC celler og tre typer menneskelig monocytter: kommersielle U937 og THP-1 celler og primære monocytter (PMs) isolert fra perifert blod sunn givere (alle monocytter ble brukt i en ingen-aktivert begrunne) ble brukt. Økte konsentrasjoner av inflammatoriske cytokiner IL 1β og IL-8 ble observert å være beriket i co kultur. På samme måte ble det funnet at MMP-1, MMP-2 og MMP-10 også økt i BrC celler-monocytt co kulturer og dermed forsterkende tidligere funn14. I dette manuskriptet er en punkt-til-punkt arbeidsflyt primære BrC celler isolasjon og testing i 3D kulturer presentert sammen med representant resultater. Dette arbeidet er et godt eksempel på det store potensialet som in vitro 3D celle-systemer for å avhøre bestemte aspekter av svulst biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prøver fra BrC pasienter ble innhentet fra vev bank of the Unidad de Investigación no Virología y Cáncer, sykehuset Infantil de México Federico Gómez. Denne studien ble godkjent av den vitenskapelige, etiske og biosikkerhet gjennomgå styrene i sykehuset Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética no Investigación og Comité de Bioseguridad. Alle pasienter prospektivt innskrevet og ble informert om innholdet av studien: de vil delta signert en skriftlig samtykke før prøvetaking og ble behandlet i henhold til etiske retningslinjer og beste praksis for institusjonen. Identiteten til deltakerne var anonymiseres for varigheten av studien. Pasienter inkludert ble diagnostisert med invasiv ductal karsinom, histologiske klasse 2 og kliniske fase II, med ingen tidligere neoadjuvant terapi før vev resection. Pasientene var alle kvinnelige alderen i gjennomsnitt 56.8 år (range 42 til 75)14.

1. 3D cellekulturer

  1. Frø 0,1 x 106 MCF-10A celler eller primære BrC celler i 25 cm2 kultur flasker med DMEM/F12 kultur medium med 5% hest serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 100 ng/mL kolera gift, 0,5 µg/mL hydrocortisone, 10 µg/mL insulin og 20 ng/mL av Epidermal vekstfaktor (EGF). Frø 0,1 x 106 kommersielle BrC celler, MCF-7 celler og MDA-MB-231 celler i 75 cm2 kultur flasker med DMEM/F12 kultur medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Ruge på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø.
  2. Etter 48 timer, skyll celle monolayer med 10 mL steril 1 x fosfat bufret saltvann (PBS). Trypsinize i celle monolayer med 3 mL løsning på 0,05% trypsin og 0,48 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i 5-10 min på 37 ° C. Legge til 200 µL av tilsvarende serum å stoppe trypsinization og 7 mL av medium uten kosttilskudd. Resuspend cellene av pipettering og fjerne en aliquot av 10 µL telle celler i en Neubauer kammer.
  3. I hver brønn av et 8-vel kammer lysbildet system, spre en 40 µL base av ren ECME, etterfulgt av en inkubasjonstiden for 30 min på 37 ° C.
  4. I hver brønn, sted 800 celler resuspended i 400 µL av DMEM/F12 (uten fenol rød) supplert som i trinn 1.1, men med følgende endringer: primære BrC cellene og MCF-10A, legge 4 ng/mL EGF og 2% ECME; MCF-7 og MDA-MB-231, bare legge til 2% ECME.
  5. Inkuber kulturer på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø. Erstatte kultur medier hver 48 timer.
  6. Post morfologiske endrer celleområdet hver 24 timer for 15 dager med en optisk mikroskop. Analysere morfologi av primære BrC er cellene, MCF-10A og MDA-MB-231 god referanse cellelinjer eksempler på bestilte acinar dannelse og uordnede aggressiv kreft-lignende strukturer, henholdsvis.
  7. Få bilder av celler i lyse feltet mikroskopi på 100 X og 200 X forstørrelse og sammenligne celle morfologi med referanse MCF-10A og MDA-MB-231 linjer (figur 1).

2. få primære kreftceller fra Tumor vev

Merk: For å få bruker svulst epitelceller vev fra resected primære svulster fra BrC pasienter med ingen tidligere neoadjuvant terapi; unngå nekrotisk områder og arbeide med minst 0,5 cm3 av tumor vev.

  1. Skyll tumor vev med sterilt 1 x PBS og mekanisk disaggregate det med en skalpell i 1-2 mm fragmenter.
  2. Fordøye vevet i et sterilt 20 mL hetteglass med cap for 2 timer ved romtemperatur (RT) med 2 mL løsningen følger: Bland 1 mg/mL collagenase type jeg og 100 U/mL hyaluronidase i DMEM/F12 medium som inneholder 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin , med konstant omrøring.
  3. Filtrere resulterende suspensjon gjennom sterilisert stykker av tyll å eliminere store biter av ufordøyd vev. Deretter Filtrer celle suspensjon gjennom en sterilisert 100 µm-pore membran.
  4. Pellets cellene på 430 x g i 5 min på RT og vask dem to ganger med sterilt 1 x PBS. Kultur primære cellene i DMEM/F12 middels med 5% hest serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 100 ng/mL kolera gift, 0,5 µg/mL hydrocortisone, 10 µg/mL insulin og 20 ng/mL EGF. Erstatt medium hver 48 h. vedlikeholde kulturer på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø.
  5. Kontroller at isolert cellene er epitelceller med en standardprotokoll immunocytochemistry14. Teste tre epithelial markører: et panel av cytokeratins (PanCK), mucin-1 (Muc-1) og epithelial celle vedheft molekyl (EpCAM).

3. isolere PM celler fra perifert blod

  1. Ekstra ca 40 mL perifert blod fra en sunn frivillig, fortynne blodet i en 1:3 andel med sterilt endotoxin-gratis 1 x PBS og utsett den for en tetthet gradert separasjon.
  2. I en konisk tube, sted 2 mL av en polysucrose og natrium diatrizoate medium med en tetthet av 1.077 g/mL. Sakte og forsiktig overlegg 8 mL utvannet blod. Sentrifuger i 30 min, 765 x g ved RT. Bruk tregeste akselerasjon-retardasjon hastighet sentrifuge.
    Merk: Etter sentrifugering, fire lag blir dannet fra bunn til topp: den røde blodlegemer pellet, tetthet gradert middels laget, mononukleære celler laget (det vises som en fin hvit ring) og plasma laget.
  3. Nøye hente mononukleære celle laget fra gradient med en bakteriefri Pasteur pipette og vask dem tre ganger med 1 x PBS, hver gang etterfulgt av tregere sentrifugering (430, 275 og 191 x g) i 10 min på RT.
  4. Bruk negative utvalg protokoller for å unngå aktivering av celler. Et eksempel på slike en protokoll er følgende:
    1. Vask de mononukleære cellene når med en vask bufret løsning (0,5% bovin serum albumin, 2 mM EDTA i 1 x PBS). Telle celler i en Neubauer kammer og tilpasse dem til en tetthet av 1 x 107 celler/30 µL av en bufferløsning.
    2. For hver 1 x 107 celler, legge 10 µL av en FcR blokkerer reagens og 10 µL av en monocytt biotin-antistoff cocktail som inneholder anti-menneskelige CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 og Glycophorin A (inkludert i kommersielle kits).
    3. Bland cellene og ruge i 15 min på 4 ° C. Legge en ytterligere 30 µL av vask bufret løsningen pluss 20 µL av anti-biotin microbeads (inkludert i pakken). Bland celler og ruge etter 20 min på 4 ° C.
    4. Vask cellene gang med en bufferløsning sentrifuge 430 x g i 5 min på RT og resuspend i 1,5 mL bufret løsning for magnetisk separasjon.
    5. Last celle suspensjon på en pre skylles magnetiske separasjon kolonne og legge til 7 mL av bufferløsning. Samle monocytt-beriket brøken i et 15-mL konisk rør telle celler og hvis ikke kulturperler umiddelbart, fryse monocytter på en tetthet 2 x 106 celler/1 ml av DMEM/F12 medium med 50% FBS og 10% DMSO på −80 ° C.
      Merk: Unngå å bruke monocytter etter mer enn 2 måneder med frysing, som deres levedyktighet kan bli svekket.
  5. Opprettholde kulturer av PMs i DMEM/F12 medium med 6% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin, på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø.
  6. Utfør hvert sett av eksperimenter utnytte PMs fra minst to ulike givere uavhengig, da pooling monocytter fra ulike givere kan føre monocytt aktivisering.

4. etablere 3D co kulturer

  1. 3D co kulturer med indirekte interaksjon
    Merk:
    utføre disse analyser i 24-vel flat bunn kultur plater med polykarbonat celle kultur setter membraner av 0,4 µm porestørrelse. I denne analysen, kan både supernatants og celler hentes på slutten av eksperimentet.
    1. Dyrke 2 x 106 U937 og THP-1 monocytter i 10 mL av RPMI 1640 medium med 10% FBS, 1% antibiotika/antimycotic, og dyrke frisk PMs i supplert DMEM/F12 medium (som angitt tidligere i trinn 3,5) på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø.
    2. Plate 4 x 105 monocytter i 1 mL/vel av deres tilsvarende medium (med 2% ECME og 2% FBS U937 og THP-1 monocytter, eller 2% ECME og 6% FBS for PMs).
    3. Plassere et innstikk i hver brønn og legge 0.9 mL av 4 x 105 BrC celle suspensjon i tilsvarende medium (supplert med 2% ECME og 2% FBS for kommersielle linjer eller 5% hest serum for primære BrC celler). Erstatte halvparten av totalt medier hver 48 timer.
    4. Ruge på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø for 5 dager og gjenopprette supernatants. Hente celler ved trypsinization hvis påfølgende analyse er utført.
    5. Ta med kontroller av personlige cellekulturer med respektive media.
  2. 3D co kulturer med direkte interaksjon
    1. Etiketten BrC celler og monocytter med forskjellige fluorescerende fargestoffer før cellekultur tillate uavhengig sortering av hver celle avstamning etter kultur for analyse av mRNA og protein uttrykk. Bruke kommersielt tilgjengelige derivater kumarin og rhodamine som fritt passerer gjennom cellemembranen levende celler. En generell protokoll for merking er følgende:
      1. Forberede en monolayer av BrC celler av interesse (2 × 106 celler i en 25 cm2 kultur kolbe) og erstatte den standard mediet med tilstrekkelig forvarmes fungerende løsning av fluorescerende fargestoffet (1:2, 000 av fluorescerende fargestoff i standard base medium uten noen tillegg). Inkuber 30 min på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø. Sug opp fargestoff løsningen og skyll forsiktig med tilstrekkelig 1 x PBS. Sug opp PBS og legge til standard medium.
      2. Trypsinize i celle monolayer med 2 mL i en løsning av 0,05% trypsin og 0,48 mM EDTA i 5-10 min på 37 ° C. Legge til 200 µL av FBS å stoppe trypsinization og 7 mL av korrespondent medium uten kosttilskudd. Resuspend cellene av pipettering. Ta en aliquot av 10 µL telle celler i en Neubauer kammer. Fortsette med co kultur protokollen etter celle teller.
      3. Pellets cellene på 430 x g i 5 min på RT (utføre dette første siden monocytter vokse i suspensjon). Forkast nedbryting og forsiktig resuspend celler med 3 mL en forvarmes fungerende løsning av fluorescerende fargestoffet (1:2, 000 av fluorescerende fargestoff i en standard base medium uten kosttilskudd). Inkuber i 30 min på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø.
      4. Pellets cellene igjen, forkaste fargestoff fungerende løsning og forsiktig resuspend med 5-7 mL 1 x PBS. Pellets igjen, forkaste PBS og resuspend celler i 5-7 mL av standard medium. Ta en aliquot av 10 µL av cellen suspensjon telle celler i en Neubauer kammer. Fortsette med co kultur protokollen etter celle teller.
    2. Angi co kulturen som følger:: spre nok ECME på bunnen av brønnen for å danne et jevnt lag i hver brønn av et 4-vel kammer lysbildet system. Plate 20 µL av en enkelt celle suspensjon som inneholder 5 × 105 merket BrC celler per brønn.
    3. Etter 15-20 min med inkubering ved 37 ° C, legge til en suspensjon av 2.5 x 105 merket monocytter i 80 µL analysen medium (med 60% ECME).
    4. Tillate ECME å stivne i 15-20 min på 37 ° C.
    5. Legg 1 mL av en 1:1 blanding av BrC celler og monocytt kultur medier.
    6. Inkuber co kulturer på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø for 24 timer, 48 timer eller 5 dager å spore endringer på ulike tidspunkt.
    7. Redusere ECM proteiner for å gjenopprette cellene fra kulturer. Sug opp og forkaste medium, Legg til 0,5 mL 1 x PBS med 0,1% trypsin og 0,25% EDTA og ruge for 3t på 37 ° C. Etter inkubasjon legge 0,5 mL 1 x PBS med 10% FBS å nøytralisere trypsin og resuspend celler av pipettering kraftig for å få en enkeltcelle suspensjon.
    8. Pellets celler 765 x g i 5 min på RT forkaste nedbryting og resuspend cellene i 5 mL 1 x PBS med 10% FBS. Gjenta dette trinnet når.
    9. Underlagt celle suspensjon fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) med riktige instrumentet. Kontroller at de endelige populasjonene er minst 95% ren).
    10. Etter sortering, vaske cellene med sterilt 1 x PBS, pellet (430 x g i 5 min på RT) og resuspend i sterilt 1 x PBS. Cellene kan behandles i henhold til bestemte protokoller for RNA isolasjon eller protein analyse.
    11. Gjenta hver analysen tre ganger, inkludert 3D kulturer av hver enkelt celle avstamning som kontroller.
  3. Direkte samspill 3D co kulturer å vurdere kollagen degradering
    1. Opprette 3D co cellekulturer som beskrevet i trinn 4.2 med ekstra trinn å legge 32,5 µg/mL av type IV kollagen merket med fluorescein isothiocyanate til ECME. Siste konsentrasjonen av kollagen IV i ECME er 0,5%. Vokse kulturer i en 35 mm dekkglassvæske plassert i en Petri retter.
    2. Spre et lag av 40 µL av ECME i bunnen av Petriskål. Tillate ECME å størkne på 37 ° C.
    3. Legge til 2,5 x 105 BrC celler i 10 µL av mediet og la celler å slå seg ned.
    4. Legge til en suspensjon av 1,25 x 105 U937 monocytter i 40 µL analysen medium (supplert med 60% av DQ-kollagen IV merket-ECME).
    5. Tillate ECME å stivne i 15-20 min på 37 ° C.
    6. Legg 2 mL av en 1:1 blanding av BrC celler og monocytt kultur medier.
    7. Inkuber co kulturer i 5 dager på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø. Erstatte kultur medier hver 48 timer.
    8. Analysere fluorescens utslipp i en AC confocal skanning mikroskop og måle integrerte optisk densitet (IOD) per 50 µm2 av kultur. Sammenligne IODs med individuelle og kulturer og kultur ved tidspunkt null (figur 2).

5. analyse av Supernatants fra 3D kulturer co med indirekte interaksjon

  1. Etter 5 dager med co kultur, gjenopprette supernatants fra både øvre og nedre deler av 3D co kulturer og personlige 3D kultur kontrollene. Bland godt hver nedbryting av pipettering. Aliquot, og lager nedbryting på −20 ° C før bruk (opptil en måned).
    Merk: Hold supernatants på −80 ° C om lagring blir lengre enn en måned.
  2. Analysere supernatants med multipleksing analysen plattformer, enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA) eller perle-baserte immunanalyser etter produsentens anbefalte prosedyrer.
    Merk: Supernatants kan også analyseres ved Western blot eller konsentrert gjennom bestemte pore filtre for å få størrelse beriket protein fraksjoner for å utføre zymography analyse16,17. Eventuelt bruke supernatants som betinget media for andre eksperimenter, som beskrevet nedenfor. Betinget medier hentes vanligvis fra en 5 dagers kultur (Figur 3).

6. karakterisering av effekter av Supernatants fra primære BrC celler Acini formasjon og Acini struktur

  1. I hver brønn av et 8-vel kammer lysbilde spre 40 µL base for ECME og la det stivne i 30 min på 37 ° C.
  2. Frø 800 MCF-10A celler/godt i 400 µL av supplert DMEM/F12 kultur medium, som beskrevet i trinn 1.2.
  3. Legge til 400 µL av betinget media eller supplert DMEM/F12 kultur medium med 20 ng/mL menneskelige rekombinant IL-1β.
  4. Stedet kammer lysbildet i et glass Petriskål inneholder en 35 mm Petriskål fylt med 2 mL PBS skal opprette en fuktighet omgivelsene.
  5. Erstatte media/nedbryting hver 48 timer.
  6. Registrere kjertel acini formasjon hver 24 h 14 dager med en optisk mikroskop.
  7. Etter 14 dager av kultur, flekk acini med 100 µL av 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i en konsentrasjon av 100 nM i 1 x PBS å observere celle kjerner. Inkuber for 25 min på RT i konstant omrøring. Skyll tre ganger med 1 x PBS i 5 min, hver gang i konstant omrøring på RT. Mount forberedelser med en montering medium bestemt for fluorescerende flekker. Forsegle med gjennomsiktig polsk og vedlikeholde beskyttet mot lys i 4 ° C.
  8. Analyser av acini med AC confocal mikroskop tar bilder av tverrgående stabler på forskjellige dyp acini (Figur 4A, B, C).
  9. Visualisere ulike mobilnettet proteiner i acini med riktig flekker protokoller. For eksempel var E-cadherin farget for å vurdere celle til celle vedheft, celle polaritet eller lumen formasjon18 (Figur 4D).

7. overføring analyser

Merk: Utføre migrering analyser av U937, THP-1, og frisk PMs i 24-vel flat bunn kultur plater med polykarbonat celle kultur setter inn med membraner av 8 µm porestørrelse. Det ble tidligere vist at chemokines GM-CSF, MCP-1 og RANTES fant utskilles i høy konsentrasjoner i individuelle 3D kulturer aggressiv BrC cellen linjer. Det ble foreslått at disse cytokiner var kritisk til tiltrekke monocytter til området av den primære svulsten; Dette ble testet i migrasjon analyser bruker cytokiner som chemoattractants.

  1. Kultur U937, THP-1 eller frisk PMs som beskrevet i trinn 4.1.1.
  2. Skyll når hvert sett inn med 200 µL av RPMI 1640 uten sera å hydrat membranen.
  3. Fyll den med 50 µL av kaldt ECME, plasser som setter inn i en 24-vel flat bunn kultur plate, og tillater ECME å danner 1t på 37 ° C.
  4. Legg til 180 µL av RPMI uten FBS i øvre rommet av platen. Legge til i nedre kammeret uten boblende 800 µL av RPMI med enten 100 ng/mL GM-CSF, MCP-1 eller RANTES som chemoattractant. Bruk medium uten cytokiner som en negativ kontroll. Inkuber i 30 min på 37 ° C å etablere chemokine gradering.
  5. Sted 1,5 x 105 av hver type monocytt i et sterilt rør, vask to ganger plassere med 1 mL 1 x PBS og sentrifuge 430 x g for 5 min på RT. Resuspend monocytter i 20 µL av RPMI uten FBS, dem i skivene , og nøye homogenize celle suspensjon (siste bind i det øvre kammeret er 200 µL).
  6. Tillate celle migrasjon til fremgang for 24 h på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø.
    Merk: Monocytter er ikke-tilhenger, vil vandrende celler vanligvis være i media av lavere kupé.
  7. Fjerne skivene, hente media og telle celler på 2, 4, 6 og 24 h bruker en Neubauer kammer eller en flyt cytometer; Alternativt, spesielt hvis ingen celler er funnet i media, hente bilder av den nedre delen av skivene med et digitalkamera. Det betyr celletall fra 3 tilfeldig felt (på 100 X forstørrelse) brukes for analyse (figur 5).

8. invasjonen analyser

Merk: Utføre invasjonen analyser av BrC cellene i 24-vel flat bunn kultur plater med polykarbonat celle kultur setter membraner av 8 µm porestørrelse. I vår opprinnelige studier var IL-8 en av cytokiner beriket i supernatants av BrC cellen/monocytt 3D co kulturer. Om denne cytokin deltar i invasjonen av BrC cellelinjer ble testet.

  1. Utvid BrC celler i 75 cm2 flasker. MCF-7, T47D, HS578T og MDA-MB-231 som beskrevet i trinn 1.2 (men uten ECME) og primære BrC celler som beskrevet i trinn 2.4.
  2. Vask når hver polykarbonat 8 µm-pore membran cellekultur sett med 200 µL av medium uten sera (mediet som brukes, avhenger av den celle linjen testet) til hydrat membranen.
  3. Fylle innsatsen med 50 µL av kalde ECME (1:4 fortynning ECME:cold medium uten FBS) plasser som setter inn i en 24-vel flat bunn kultur plate og tillate ECME å danner 1t på 37 ° C.
  4. Når ECME har polymerized, legger du til 180 µL av respektive cellen media uten FBS. Legge til 800 µL medier uten FBS gjennom spaltene i innsatsen. Inkuber i 30 min på 37 ° C å etablere en IL-8 gradering.
    Merk: Unngå å skape bobler i media. Medier brukt uten FBS men supplert med 100 ng/mL av IL-8 som chemoattractant eller ren media uten FBS, som negative kontroller.
  5. Få totalt 6 x 105 cellene i hver celle linje som følger:
    1. Forkaste supernatants, skyll når med 10 mL 1 x PBS og legge 2 mL 0,05% trypsin/0.48 mM EDTA i 2 minutter på 37 ° C koble cellene. Legge til 4 mL supplert medium for å stoppe reaksjonen trypsin og resuspend kraftig av pipettering.
  6. Ta en 10 µL aliquot av cellen suspensjon telle celler i en Neubauer kammer. Ta et volum på cellen suspensjon som inneholder 6 x 105 celler. Sentrifuge 430 x g i 5 min på RT, forkaste nedbryting og skyll celler i 1 mL 1 x PBS. Gjenta skylling igjen.
  7. Resuspend cellene i 20 µL av respektive media uten FBS og plass i skivene som inneholder 180 µL av respektive media uten FBS. Nøye homogenize celle suspensjon av pipettering.
  8. Tillate celle invasjonen til fremgang for 48 timer på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 miljø.
  9. Etter 48 timer, fjerne sette, forkaste nedbryting og skyll innsatsen når nøye med 200 µL av 1 x PBS. Fjerne overflødig på PBS med en bomull-tipped applikator.
    Merk: Invasiv cellene vanligvis er knyttet til den andre siden av sette som i dette tilfellet der celler er tilhenger.
  10. Fastsette cellene ved å plassere innsatsen i et godt av en 24-vel flat bunn kultur plate inneholder 1 mL/vel av 4% paraformaldehyde i 15 min på rett etterpå, skyll som setter inn én gang med 1 x PBS.
  11. Stain cellene ved å plassere innsatsen i en godt av en 24-vel flat bunn kultur plate inneholder 1 mL/vel 1 x PBS med 0,2% crystal violet for 45 min på RT. nøye, med en bomull-tipped applikatoren fjerne alle ECME fra toppen av membranen , som inneholder celler som ikke migrerte, og skyll nøye med destillert vann å unngå eliminere fast invasiv celler.
  12. Telle invadere celler ved å observere nedre side av sette under invertert mikroskop. Det betyr celletall fra 3 tilfeldig felt (på 100 X forstørrelse) brukes. I tilfeller der cellene har invadert som klynger og er vanskelig å telle individuelt hente bilder fra 3 tilfeldig felt (på 100 X forstørrelse) med et digitalkamera. Analysere bildene med programvare for bildeanalyse og bruke IOD til å kvantifisere celle invasjonen (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologisk analyse av BrC celler i 3D kulturer:

Morfologi av primære BrC cellene vokser i 3D kulturer på lave og høye tettheter ble studert over 5 dager. Under den første 48t, celler overholder ECME og opprettholde lav tetthet. På dette tidspunkt, kan det tydelig være verdsatt at celler presentere en langstrakt spindel-lignende figur, noen med to eller flere lenge cytoplasmatiske anslag og uten viser tydelig celle-celle kontakter. Etter 5 dager med kultur proliferated celler samtidig opprettholde sitt opprinnelige morfologi. Videre de dannet strukturer som ligner garn uten en bestemt strukturelle organisasjon, og vises stablet opp med ingen kontakt hemming. En sammenligning med ikke-transformert MCF-10A celler ble gjort, som danner sfærisk strukturer som ligner kjertel acini. Disse cellene viser en karakteristisk morfologi av avrundet godt avgrenset og organisert strukturer i homogene størrelser (på ca. 50 µm). Tvert imot, dele primære BrC celler en mye nærmere likhet med aggressiv BrC celler MDA-MB-231 (figur 1).

Analyse av celle-til-celle direkte vekselsvirkningene og kollagen fornedrelse:

Vi laget en 3D co kultur modell å vurdere følgende: celle morfologi, kollagen fornedrelse, celle migrasjon, og om det er en direkte samspill mellom BrC celler og monocytter i co kultur. Etter 5 dager, både MCF-7 og MDA-MB-231 kommersielle BrC cellene danner uorganisert aggregater i 3D kulturer, men de varierer i deres morfologi. Aggressiv celler MDA-MB-231 skjemaet samler med langstrakt skjemaer med noen celler tending å skille fra resten, mens ikke-aggressive MCF-7 cellene danner aggregater der celler vedlikeholde avrundede former og de synes å være mer tett komprimert (figur 2 A, B). DQ kollagen IV ble innlemmet for å visualisere proteolytisk nedbrytning (grønn), med begge BrC kulturer viser fluorescerende aktivitet. Å kvantitativt vurdere proteolytiske, ble grønne fluorescens målt som IOD seks 50 µm2 felt. En sammenligning ble laget mellom individuelle 3D kulturer MDA-MB-231 celler og co kulturer med U937 monocytter. Statistisk signifikant økning av proteolyse i co kultur (figur 2C) ble observert. Også en AC confocal mikroskopi analyse av føljetong tverrgående stabler hver 10 µm av MDA-MB-231 og U937 monocytter co kultur ble utført (figur 2D). Analysen avdekket at U937 monocytter overføres mot aggressive celler MDA-MB-231 med noen monocytter nå laget av BrC celler. Men det var tydelig at celle-celle direkte samspill nettsteder ikke var nødvendigvis samtidig med områder av høyere proteolytisk aktivitet: i stedet områder av kollagen fornedrelse jevnt spredte seg i kultur, fører til slutning at kollagen fornedrelse var resultatet av indirekte kommunikasjon formidlet av utskilles faktorer. Derfor ble 3D co kultur modellen endret for å plassere cellene i forskjellige rom med en porøs membran tillate celle-celle kommunikasjon basert på utskilles faktorer, og unngå merking og sortering etter kultur.

Analyse av IL-1β i Supernatants fra 3D kulturer:

Arbeide med indirekte samhandling 3D kulturer, supernatants fra enkelte primære BrC ble kulturer og deres 5 dager co kulturer med PM høstet. Disse supernatants ble utsatt for samtidige analyse av 18 cytokiner og 5 MMPs kommersielle kits og et instrument som er spesielt utformet for denne analysen. Av alle analytter testet, ble betydelig økte nivåer av IL 1β og IL-8 observert i primære BrC celle-monocytt co kulturer, både avgjørende inflammatoriske cytokiner som er tilknyttet tidligere av ondartet progresjon15, 18 , 19 , 20 (Figur 3, resultater for IL-1β). Dette eksemplet er en annen type analyse at 3D kulturer tillater for å etterligne kommunikasjonsnettverk som figurer svulst microenvironment.

Karakterisering av Supernatants og Acini struktur:

På grunnlag av 3D eksperimentelle systemet utviklet av Debnath, Muthuswamy og Brugge7, hvor MCF-10A ble etablert som en modell av mekanismer knyttet til oncogenesis, evaluering av om secreted faktorene primære BrC cellen supernatants påvirket dannelsen av MCF-10A 3D acini-lignende strukturer, ligner på aktiviteten observert etter signaltransduksjon viral og cellulær oncogenes7,21 ble utført. MCF-10A celler ble dyrket med to forskjellige supernatants fra to primære BrC cellelinjer å observere lumen dannelse (som et mål på motstand mot anoikis). På dag 14, spheroids ble vurdert av AC confocal mikroskopi tverrgående kutt på 0, 25, 50, 75 og 100% dybde, og i begge tilfeller ble det funnet at MCF-10A celler unngikk anoikis (målt ved å telle antall sentrale (luminal) celler i acini (Figur 4 B, C)). Dermed mangler MCF-10A celle acini som er dannet med betinget media fra BrC celler, en velformet hul lumen, i motsetning til MCF-10A som dyrkes med sin standard kultur medium (som beskrevet i trinn 1.2) (Figur 4A). I 3D co kultur systemet, var IL-1β svært utskilles; Derfor ble MCF-10A cellene også dyrket med menneskelige rekombinant IL-1β18. Figur 4 Viser en AC confocal mikroskopi tverrgående kutt på 50% dybdeskarphet acini i nærvær av IL-1β (nedre paneler), og avslører at denne cytokin også gir motstand mot anoikis. Dermed fremme løselig faktorer utskilles av primære BrC celler, for eksempel IL-1β, overlevelse av ikke-transformert MCF-10A celler som mister ECM interaksjoner, karakteristisk for invasiv kreft.

3D co kulturer fremme en betennelsesreaksjon forbundet med overføring av monocytter og invasjonen av kreftceller:

Vi viste tidligere at primære BrC celler i 3D kultur skiller høye basale nivåer av pro-inflammatoriske chemokines kjent for å tiltrekke monocytter14. Derfor analyserte vi vandrende kapasiteten av monocytter svar på chemokines fant beriket i betinget media BrC cellene. Vandrende kapasiteten til kommersielle monocytter U937 og THP-1 og frisk PMs ble evaluert svar på tre ulike chemokines: GM-CSF, MCP-1 og RANTES. U937 og THP-1 monocytter var i stand til å migrere svar til GM-CSF og MCP-1, med U937 som den mest responsive, mens både monocytter hadde et null-svar til RANTES. Viktigere, viste PMs en høy basale vandrende aktivitet og mest potente svaret MCP-1 (figur 5). IL-8 var også beriket etter 3D co kultur primære BrC celler og monocytter. Derfor analyserte vi om IL-8 endrer kapasiteten på invasjonen av kommersielle og primære BrC linjer. De kommersielle aggressive BrC cellen linjene (HS578T og MDA-MB-231) invaderte svar på IL-8, mens den ikke-aggressive (MCF-7 og T47D) ikke invadere. Overraskende, var primære BrC celler mer krenkende enn kommersielle aggressiv BrC cellelinjer svar på IL-8 (figur 6A, høyre panel). I noen tilfeller invadere celler som klynger og derfor IOD analyse var nødvendig (figur 6B).

Figure 1
Figur 1 : Representant bilder av BrC celler i 3D kulturer. Fra venstre til høyre: kontroll av ikke-transformert MCF-10A cellene danner karakteristiske kjertel acini, med avrundet morfologi, godt avgrenset celle kontakter og organisert av homogene størrelser (ca 50 µm på gjennomsnittlig, optisk forstørrelse 200 X). Middels paneler viser primære BrC celler kultivert på lav tetthet (2 dager) og høy tetthet (5 dager). Celler overholder ECME og opprettholde lav tetthet på tidlig tidspunkt. Det er tydelig at celler presentere en langstrakt spindel-lignende figur, noen med to eller flere lenge cytoplasmatiske anslag, og med ingen åpenbare celle-celle adhesjon. På den annen side, dannet høy tetthet cellene på senere poeng strukturer som ligner garn uten en bestemt strukturelle organisasjon. Disse cellene dukket stablet opp viser ingen kontakt hemming. En kontroll av kommersielle MDA-MB-231 celler etter 5 dager i 3D kultur er vist; disse aggressiv BrC celler dele en mye nærmere likhet med primære BrC kulturer (optisk forstørrelse på 100 X). Skalere bar representerer 50 µm. 800 celler ble sådd i begynnelsen av eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Analyse av ECM fornedrelse. Ikke-aggressive MCF-7 celler med en gul fluorochrome (A) og aggressiv MDA-MB-231 celler med en rød fluorochrome (B) dyrket i 5 dager i 3D forhold; 0,5% av grønne fluorescens-merket kollagen IV ble innlemmet for å visualisere ECM degradering. I A og B, øvre venstre bildene representerer nivåene av kollagen fornedrelse, den øvre høyre panelene representerer de optiske bildene, nederst til venstre representerer BrC cellene og bunnen rett panelene Vis flettingen av fluorescerende og optisk bilder. For A og Bpresenteres optisk forstørrelsen av 200 X og skala bar 100 µm. (C) representant bilder av ECM proteolyse (grønn) i 3D kultur MDA-MB-231 enkeltceller som kontroll, sammenlignet med ECM proteolyse 3D co kultur av MDA-MB-231 med U937 monocytter. Skala barer representerer 10 µm. IOD (integrert optisk tetthet) av seks 50 µm2 felt fra hver betingelse ble målt. Gjennomsnittet og standard feil av gjsnitt (SEM) fra quantifications presenteres; to stjerner representerer en statistisk signifikant forskjell med p < 0,01 (Mann-Whitney test). (D) direkte interaksjon med MDA-MB-231 celler (grå skygge masse) med fluorescently farget U937 monocytter (oransje); grønne fluorescens tilsvarer proteolyse. Seriell stykker ble generert hver 10 µm ved AC confocal mikroskopi til adressen lokalisering og direkte vekselsvirkningene mellom begge linjer. Optisk forstørrelsen av 200 X; skala stolper representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: IL-1β konsentrasjon er økt i 3D co kulturer. En representant resultatet av IL-1β nivåer (pg/mL) i supernatants fra åtte (PC1-8) primære BrC celler, kultivert individuelt i 3D (3D), og sammenlignet mot deres 3D co kultur med PM (CC). En kontroll av PM i individuelle 3D kultur ble for sammenligning (PM). Resultatene ble Hentet fra en større multipleksing analyse, der flere cytokiner samtidig oppdaget i hver prøve med en immunodetection-basert teknikk tilgjengelig som en kommersiell kit. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Utskilles faktorer fra primære BrC celler indusere motstand mot anoikis i ikke-transformert MCF-10A celler. MCF-10A celler ble dyrket i 3D forhold med standard kultur medier (kolonne A og øvre paneler av D), der kan det være observert at acini presentere typisk hul lumen (25-75% dybde er markert med en rød firkant); Når MCF-10A celler var vokst med to forskjellige supernatants fra to primære BrC kulturer (kolonne B og C), er lumen ikke hule men fylt med celler som viser motstand mot anoikis. Tilsvarende når MCF-10A celler ble kultivert 3D forhold legge menneskelige rekombinant IL-1β (20 ng/mL), ingen hul lumen kan nytes på 50% dybde AC confocal mikroskopi deler av acini (nedre paneler til D). Den høyre ovale karikatur representerer AC confocal mikroskopi delene som ble gjort på 0, 25, 50, 75 og 100% dybden av acini. Bildene viser kjerner farget med DAPI (blå) og E-cadherin i grønt. Optisk forstørrelse av 200 X, skala stolper representerer 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Vandrende kapasitet av monocytter. Representant bilder av trekkfugler kapasitet på U937, THP-1 og PM svar til GM-CSF, MCP-1 og RANTES. Kontroller uten chemokine er inkludert (første kolonne fra venstre til høyre). Tallene nedenfor bildene angir antallet vandrende celler i hver tilstand; U937 og THP-1 monocytter var hovedsakelig lydhør overfor GM-CSF og MCP-1, mens PM viste en vandrende høykapasitets per se, og var mest responsive cellene MCP-1. Optisk forstørrelsen av 100 X; skala barer representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Aggressive og primære BrC celler invadere svar på IL-8. A. invasjonen analyser med to ikke-aggressive (MCF-7 og T47D), to svært aggressive (HS578T og MDA-MB-231) BrC linjer og en primær BrC kultur svar på IL-8 som chemoattractant. Øvre panelene tilsvarer kontroller uten chemokine viser ingen invasjon, nedre paneler Vis svaret IL-8, med svært aggressive BrC cellene og primære BrC invadere gjennom membran av cellen kultur sette. B. eksempel celleområdene invaderer i klynger; i disse tilfellene er måling av invasjonen gjort med et bilde analyseprogram å bestemme invasjonen i IOD (integrert optisk tetthet) per område. Tall under bildene representerer antall invadere celler i hver betingelse. Optisk forstørrelsen av 100 X; skala stolper representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitelceller vokse i en 3D romlige konformasjon og deres samspill med ECM proteiner er avgjørende for vev homeostase. Mange kreft studier har vært basert på celler dyrket i monolayers (2D) og selv om de har vært avgjørende for å forstå mange aspekter av tumor formasjon og progresjon, monolayers er recapitulate ikke kjennetegnene som ECM pålegger celler, for forekomst: begrense spredning, vedheft-avhengig celle overlevelse, apikale-basolateral polaritet, ECM remodeling, celledifferensiering, osv. Viktigere, ikke bare samspillet mellom kreftceller og ECM er avgjørende for utviklingen av kreft, men også kommunikasjonen etablert mellom svulst og ikke-tumor celler, som immunceller. Protokollene her lette forståelsen av samspillet mellom immun celler og kreftceller i miljøet gitt av ECM, inflammatorisk respons fremmes av disse interaksjoner, og hvordan denne betennelsestilstand opprette en positiv løkke fremme chemoattraction av monocytter og mer invasjonen av kreftceller.

En stor fordel med å bruke ECME er at det gir en biologisk stillaset egnet til å utføre en rekke eksperimentelle 3D modeller22. Det er beriket med ECM proteiner som laminin, kollagen IV, entactin, heparan sulfat proteoglycan og vekstfaktorer, som i vivo ville være i samspill med epitelceller. En ulempe er at fordi det kommer fra lysates av murine sarkomer, konsentrasjonen av sine komponenter varierer mellom forskjellige partier. Så, er det ofte nødvendig å karakterisere flere tomter for å få mer homogen data. I laboratoriet, hver nye mye er testet på to måter: 1) ved å evaluere riktig acini dannelsen av MCF-10A celler og 2) ved å vurdere invasiveness av BrC cellelinjer veletablerte invasiv kapasitet. Et annet alternativ er å arbeide med andre stillas produkter som Hydrogel, som er en syntetisk nanofiber peptid stillaset. Stivhet av 3D kultur kan kontrolleres ved å justere konsentrasjonen av Hydrogel23,24. Viktigere, kan dette systemet brukes for å studere samspillet mellom en type neoplastic cellen og blodkreft eller ikke-blodkreft cellene. Det kan også være mulig å utforme mer komplekse systemer med mer enn to ulike celle overleveringslinjer. En viktig fordel med 3D-modellene er at de tillater studie av celle morfologi og celle organisasjon formet av ECM samspill, som endres under kreftfremkallende transformasjon. Likeledes, en kan studere kreftfremkallende funksjoner som proteolytisk fornedrelse, og om celler plassert i ulike lag av kultur hverandre å fremme direkte samspill/kommunikasjon. Videre kan ulike celle linjene merkes med forskjellige fluorochromes slik at de kan være isolerte etter å adresse spørsmål til hver enkelt celle type, med for eksempel RNA og/eller protein uttrykk analyse13. Her, vises IL-1β sekresjon til medium i primære BrC celler/PM co kulturer, støtter en mulig avgjørende rolle i denne cytokin i indirekte kommunikasjonen mellom tumorceller og monocytter som utløser ondartet progresjon.

En annen viktig eksperimentelle protokoll i laboratoriet er analysen av acini formasjon i 3D kulturer av ikke-transformert MCF-10A celler. Denne analysen ble brukt til å teste viral og cellulær oncogene aktivitet, og å teste hvordan svulst microenvironment påvirker funksjonen gjelder aggressiv kreft. For eksempel under normal utvikling av acini, luminal sentrale celler miste kontakten med basal membran proteiner (fra ECME) utløser mekanismer for celledød, kjent som anoikis. Det ble observert at begge supernatants fra primære BrC celler eller rekombinante IL-1β fremme MCF-10A celler mot anoikis. Fordi en høy konsentrasjon av IL-1β er fremmet på BrC celle-monocytt samhandling, støtter denne observasjonen at svulsten stroma er en integrert komponent i svulst progresjon til svært aggressive stadier.

Migrasjon og invasjonen protokollene beskrevet her utgjør nyttig 3D komplementære analyser der vi kan støtte evnen til celler eller invadere i respons på stimuli fra det svulst stroma. Det ble vist at chemokines (GM-CSF og MCP-1) funnet i forhøyede konsentrasjoner i 3D kulturer av primære BrC celler kan fremme migrering av U937, THP-1 og PMs, støtter muligheten for aggressiv kreftceller å fremme en pro-inflammatoriske microenvironment. Videre forfremmet IL-8 som finnes i økt konsentrasjon i supernatants fra co kulturer av BrC celler/monocytter, økt invasjonen av både kommersielle aggressiv BrC celler (HS578T og MDA-MB-231) og primære BrC celler.

Om tilstanden av celler er det viktig å arbeide med primære BrC celler før de når ti passasjer for å dra nytte av deres spredning topp og unngå mulige etter isolasjon genetiske og epigenetic endringer skyldes i vitro kultur. Et annet viktig aspekt når du arbeider med primær celler er å bekrefte sin identitet etter isolasjon. Vi brukte et panel av biomarkers for å bestemme sin epithelial avstamning identitet, som inkluderer PanCK og Muc-1 EpCAM (angitt i trinn 2.5). Tilsvarende er det best å bruke fersk PMs, hvorav hver batch er testet sikre at de er på samme scene av differensiering. Hver ny gruppe brukes presentert i fenotypen CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68neg CD16neg., som tilsvarer ingen-aktivert umodne monocytter. Viktigere, bland vi ikke monocytter fra ulike givere, som blander resultater i monocytt aktivisering. I stedet vi uavhengig testet BrC co kulturer ved hjelp av monocytter fra minst to ulike givere.

3D kultur systemer har fortsatt begrensningen at bare noen elementer av svulst biologi kan modelleres pålitelig. Et nytt alternativ er på mer komplekse 3D-modeller av organoids, som er basert på ekspansjon og differensiering av stamceller i vitro. Organoids også utvikle svært organiserte epithelial strukturer. Eksempler inkluderer mage 25,26, lever 27og nyre organoids28. Organoid modeller for alle menneskelige organer beholdes imidlertid oppnås; Videre krever de mye mer komplekse og dyre eksperimentelle forhold.

I konklusjonen, her vi beskrive i detalj en arbeidsflyt for analyser: fra isolering av kreftceller fra BrC pasienter, teste sin provoserende kapasitet i en ECME-basert 3D kultur modell, teste hvordan den inflammatoriske microenvironment serverer dem å rekruttere ekstra inflammatoriske celler, som monocytter, å endelig analysere kommunikasjonen mellom begge typer celler, og hvordan den kommunikasjonen ytterligere fremmer en inflammatorisk microenvironment som fremmer progresjon til mer aggressive kreften stadier. I tillegg beskriver vi morfologi og fenotypen av primære BrC celler. I fremtidige studier, vil det være interessant å teste andre inflammatoriske celler eller selv teste kommunikasjonen mellom BrC cellene og flere ofte funnet i svulst stroma. Disse 3D flere-cellekulturer gir et større bilde av hva skjer biologisk i vivo under kreft progresjon. Sammenligninger mellom i vitro data og pasientens kliniske utfallet vil identifisere potensielle mekanismer som har høyere påvirkning på kreft aggressivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE prosjektet nr. 233061 til Ezequiel M. Fuentes-Pananá og Fondo de Apoyo a la Investigación, sykehuset Infantil de México Federico Gómez (prosjektnummeret HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez NA er en doktorgrad student fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og mottatt fellesskap 231663 fra CONACYT. E-S NA, erkjenner også økonomisk støtte fra den meksikanske Institute for Social Security (IMSS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95, (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8, (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18, (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3, (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2, (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11, (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65, (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16, (1), 118-126 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics