Analysere kommunikationen mellem monocytter og primær brystkræftceller i en ekstracellulære Matrix ekstrakt (ECME)-baseret tre-dimensionelle System

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en tre-dimensionel kultur metode til at analysere morfologi af primær brystkræftceller, samt at studere deres direkte/indirekte interaktioner med monocytter og resultater som kollagen nedbrydning, immun celle rekruttering, celle invasion, og fremme af cancer-relaterede inflammation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Indlejret i den ekstracellulære matrix (ECM), kommunikere normale og neoplastiske epitelceller nøje med hæmatopoietisk og ikke-hæmatopoietisk celler, således betydeligt påvirke normale væv homøostase og sygdom resultat. I brystkræft spiller tumor-associerede makrofager (TAMs) en afgørende rolle i sygdomsprogression, metastaser og gentagelse; derfor forstå mekanismer af monocyt chemoattraction tumor mikromiljø og deres interaktioner med tumorceller er vigtige til bekæmpelse af sygdommen. Her, giver vi en detaljeret beskrivelse af en tredimensional (3D) fælles kultur system af menneskelig brystkræft (BrC) celler og humane monocytter. BrC celler produceret høj basal niveauer af regulerede på aktivering, normal T-celle udtrykt og udskilles (RANTES), monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) og granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (G-CSF), mens der i fælles kultur med monocytter, pro-inflammatoriske cytokiner Interleukin (IL) -1 beta (IL-1β) og IL-8 blev beriget med matrix metalloproteinases (MMP) -1, MMP-2 og MMP-10. Denne tumor stroma mikromiljø forfremmet modstand mod anoikis i MCF-10A 3D acini-lignende strukturer, chemoattraction af monocytter og invasion af aggressive BrC celler. Protokollerne præsenteres her giver en overkommelig alternativ til at studere intra-tumor kommunikation og er et eksempel på det store potentiale, som in vitro- 3D celle systemer giver for at afhøre specifikke funktioner for tumor biology relateret til tumor aggression.

Introduction

Tumor biologi er langt mere indviklet end hidtil antaget. Montering beviser viser, at tumorceller er mere end en simpel bulk af ukontrolleret prolifererende celler; Tværtimod synes forskellige neoplastiske celler til at udføre forskellige funktioner viser høj organisation og hierarki inden for tumor1. Tumorceller er også i intime kommunikation med ikke-transformeret celler: makrofager, fibroblaster, lymfocytter, adipocytter, endotelceller, blandt andre celler er alle nedsænket i stillads proteiner og polysaccharider, der udgør ECM. Mange direkte og indirekte vekselvirkninger er etableret mellem transformeret og ikke-transformeret celler og med ECM, som udøver en kraftig indflydelse på sygdommen resultatet2,3. I det konkrete tilfælde med BrC er det særlig vigtigt at dissekere meddelelse af BrC celler med TAMs, overvejer at TAMs har vist sig for at spille en afgørende rolle i udviklingen af tumor, øge risikoen for metastaser og for sygdom tilbagefald4 ,5.

For at analysere samhandel tumorsygdomme interaktioner og deres mulige udfald, nye 3D in vitro- metoder er blevet udviklet baseret på brugen af ECM ekstrakter, der giver en langt mere kompleks mikromiljø, tættere på virkeligheden af tumor biology, i sammenligning med de konventionelle éncellelag cellekulturer som celler vokse fastgjort til plastik. Petersen og Bissell6 leveret den første model af nonmalignant, og ondartet brystkirtler epitelceller kulturperler på en laminin-rige basalmembranen og var de første til at beskrive de 3D organotypic strukturer, der diskriminerer nonmalignant menneskelige bryst epitelceller fra deres maligne modstykker. Et årti senere, modellen udviklet af Debnath, Muthuswamy, og Brugge7,8,9 leveret et værdifuldt redskab for at belyse den biologiske veje i fare under maligne transformation af glandulær acini, sådan som store acini dannelse på grund af ukontrolleret spredning, virksomhedsflytninger af stram vejkryds proteiner som bevis for nedsat celle polarisering, og tab af acini lumen som følge af celle modstand mod anoikis, en type af programmeret celledød, der opstår i forankring-afhængige celler når de løsne sig fra de omkringliggende ECM. Modeller af Sameni, Jedeszko og Sloane har fokuseret på imaging proteolytiske aktivitet af celler, som er nært beslægtet med invasiv, en anden afgørende træk af tumor malignitet10,11,12. Disse modeller er afhængige af protein matricer blandet med forskellige fluorescens-bratkølet protein substrater (DQ-gelatine, DQ-kollagen I, og DQ-kollagen IV), i hvilke fluorescerende signaler er vejledende for den proteolytisk nedbrydning af kollagen. 3D-modeller er også bruges til at undersøge stamceller egenskaber af både ikke-transformeret og tumorceller, i hvilken celle aggregater, også kaldt spheroids, kan blive kulturperler i suspension eller i ECM-lignende proteiner spørgekriterierne for mekanismer af Celledifferentiering, asymmetrisk celledeling, celle til celle overholdelse og celle motilitet13,14. Invasion assays giver mulighed for prøvning af den iboende aggressivitet af tumor og identifikation af de molekyler, der tjener som chemoattractants under invasive proces15. Samlede, 3D modeller repræsenterer en overkommelig diversificering af in vitro- cellekultur, der mere nøje afspejler normale og muterede væv morfogenese.

Vi har designet en 3D celle Co kultur system baseret på ovennævnte modeller7,10,11ved hjælp af både menneskelige kommercielle BrC cellelinjer kendte aggressive potentiale (luminale og triple-negativ typer) og primære celler eksplanterede fra BrC patienter. Vi først udviklet en model hvor enten ikke-aggressive (MCF-7) eller aggressive (MDA-MB-231) BrC celler var Co kulturperler med U937 monocytter i en ekstracellulære matrix ekstrakt (ECME)-baseret 3D system, der tillod direkte celle-celle interaktioner. Disse fælles kulturer blev brugt til at bestemme, hvordan kommunikationen mellem disse to celle lineages påvirket transskription af et sæt af gener relateret til kræft aggressiv adfærd. En væsentlig forøgelse af cyclooxygenase-2 (COX-2) udskrift konstateredes, faldt sammen med en øget produktion af en af sine produkter, prostaglandin E2 (PGE2), en konstatering af, at fremhævet rollen betændelse i kræft progression. Øget transkription af MMP blev også observeret der korreleret med større kollagen proteolyse når aggressive MDA-MB-231 celler var Co kulturperler med U937 monocytter i DQ-kollagen IV-holdige kulturer. Bemærk, vores co kulturer ikke understøtter den antagelse, at celle-celle interaktion mekanismer er nødvendig for kollagen nedbrydning. Det foreslog snarere, at kommunikation mellem to celle lineages blev formidlet af udskilles molekyler. Derudover indeholdt analysere høstet fra disse fælles kultur assays opløselige faktorer, der uorganiseret glandulær acini dannet af ikke-transformeret MCF-10A celler13. Det blev fundet, aggressive og primære BrC celler udskilles forhøjede niveauer af monocyt kemotaktisk molekyler MCP-1, GM-CSF og RANTES. Dermed, vi skitseret en 3D kultur hvor celler var adskilt i celle kultur skær at forhindre celle-celle interaktioner. Disse kulturer blev brugt til at behandle den indirekte kommunikation mellem BrC celler og monocytter. For disse assays, ikke-aggressiv og pågående kommercielle BrC cellelinjer og primære BrC celler og tre forskellige typer af humane monocytter: kommercielle U937 og THP-1 celler og primære monocytter (PMs) isoleret fra perifert blod af raske donorer, (alle monocytter blev brugt i en ikke-aktiveret tilstand) blev brugt. Øgede koncentrationer af inflammatoriske cytokiner IL-1β og IL-8 blev observeret at være beriget med fælles kultur. Ligeledes blev det konstateret at MMP-1, MMP-2 og MMP-10 var også øget i BrC celler-monocyt Co kulturer og således styrke tidligere resultater14. I dette manuskript præsenteres en punkt for punkt arbejdsproces af primære BrC celler isolation og test i 3D kulturer sammen med repræsentative resultater. Dette arbejde udgør et godt eksempel på det store potentiale, som in vitro- 3D celle systemer giver for at afhøre specifikke aspekter af tumor biology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prøver fra BrC patienter blev indhentet fra vævsbank Unidad de Investigación eget Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Denne undersøgelse blev godkendt af den videnskabelige, etiske, og biosikkerhedsforanstaltninger review bestyrelserne for Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética da Investigación og Comité de Bioseguridad. Alle patienter blev prospektivt indskrevet og blev informeret om karakteren af undersøgelsen: der er villige til at deltage underskrevet en skriftlig informeret samtykke før prøvetagning og blev behandlet i overensstemmelse med de etiske retningslinjer og bedste kliniske praksis af institution. Identiteten af deltagerne var anonymiseret for varigheden af undersøgelsen. Patienter inkluderet blev diagnosticeret med invasive duktalt carcinom, histologisk grad 2 og klinisk fase II, med ingen tidligere neoadjuverende behandling før væv resektion. Patienter var alle kvindelige alderen i gennemsnit 56.8 år (range 42 til 75)14.

1. 3D cellekulturer

  1. Frø 0,1 x 106 MCF-10A celler eller primære BrC celler i 25 cm2 kultur kolber med DMEM/F12 næringssubstratet suppleret med 5% hest serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 100 ng/mL kolera toksin, 0,5 µg/mL hydrocortison, 10 µg/mL insulin, og 20 ng/mL for Epidermal vækstfaktor (EGF). Frø 0,1 x 106 kommercielle BrC celler, MCF-7 celler og MDA-MB-231 celler i 75 cm2 kultur kolber med DMEM/F12 næringssubstratet suppleret med 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø.
  2. Efter 48 h, skyl den celle éncellelag med 10 mL sterilt 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Trypsinize celle éncellelag med 3 mL opløsning af 0,05% trypsin og 0,48 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) i 5-10 min. ved 37 ° C. Tilføje 200 µL af den tilsvarende serum til at stoppe trypsinization og 7 mL medium uden tillæg. Resuspend cellerne af pipettering og fjerne en alikvot af 10 µL tælle celler i et Neubauer kammer.
  3. I hvert hul i en 8-godt kammer slide system, sprede en 40 µL base af ren ECME, efterfulgt af en inkubation i 30 minutter ved 37 ° C.
  4. I hver brønd sted 800 celler genopslemmes i 400 µL af DMEM/F12 (uden phenol rød) suppleres som i trin 1.1 men med følgende ændringer: primære BrC celler og MCF-10A celler, tilføje 4 ng/mL af EGF og 2% ECME; MCF-7 og MDA-MB-231, kun tilføje 2% ECME.
  5. Inkuber kulturer ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø. Erstatte kultur medier hver 48 timer.
  6. Post morfologiske ændringer af celler hver 24 h til 15 dage med et optisk mikroskop. For at analysere morfologi af primære BrC er celler, MCF-10A og MDA-MB-231 celler god reference cellelinjer til eksempler på bestilte acinar dannelse og uordnede aggressiv kræft-lignende strukturer, henholdsvis.
  7. Få billeder af celler i lysfelt mikroskopi på 100 X og 200 X Forstørrelse og sammenligne celle morfologi med reference MCF-10A og MDA-MB-231 cellelinjer (figur 1).

2. opnåelse primær kræftceller fra Tumor væv

Bemærk: For at opnå bruger tumor epitelceller væv fra resektion primære tumorer fra BrC patienter med ingen tidligere neoadjuverende behandling; undgå nekrotisk områder og arbejde med et minimum af 0,5 cm3 af tumor væv.

  1. Skyl tumor væv med steril 1 x PBS og mekanisk disaggregate det med en skalpel i 1-2 mm fragmenter.
  2. Fordøje væv i en steril 20 mL hætteglas med hætte i 2 timer ved stuetemperatur (RT) med 2 mL af opløsningen, Følg: Bland 1 mg/mL collagenase type jeg og 100 U/mL hyaluronidase i DMEM/F12 medium indeholdende 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin , under konstant omrøring.
  3. Filtrere den resulterende suspension gennem steriliseret stykker af tyl til at fjerne store stykker af ufordøjet væv. Derefter filtrere cellesuspension gennem en steriliseret 100 µm-pore membran.
  4. Sammenpresse cellerne på 430 x g i 5 min på RT og vaske dem to gange med steril 1 x PBS. Kultur primærelementer i DMEM/F12 medium suppleret med 5% hest serum, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 100 ng/mL kolera toksin, 0,5 µg/mL hydrocortison, 10 µg/mL insulin og 20 ng/mL af EGF. Udskift mediet hver 48 h. Bevar kulturer ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø.
  5. Sikre, at de isolerede celler epitelceller med en standardprotokol immuncytokemi14. Teste tre epitelial markører: et panel af cytokeratins (PanCK), mucin-1 (Muc-1) og epitelcelle vedhæftning molekyle (EpCAM).

3. isolere PM celler fra perifert blod

  1. Ekstrakt ca. 40 mL af perifert blod fra en sund frivillige, fortynde blodet i en 1:3 del med steril endotoxin-gratis 1 x PBS og udsætte den for en tæthed gradient adskillelse.
  2. I en konisk røret, placere 2 mL af en polysucrose og natrium diatrizoate medium med en massefylde på 1.077 g/mL. Forsigtigt og langsomt overlay 8 mL af det fortyndede blod. Der centrifugeres i 30 min, 765 x g på RT. Brug den langsomste acceleration-deceleration hastighed i centrifugen.
    Bemærk: Efter centrifugering, fire lag vil blive dannet fra bund til top: røde blodlegemer pellet, tæthed gradient medium lag, det mononukleære celler lag (det vises som en fin hvid ring) og plasma lag.
  3. Omhyggeligt hente laget mononukleære celler fra forløb med en steril pipette overføres Pasteur og vask dem tre gange med 1 x PBS, hver gang, efterfulgt af langsommere centrifugering (430, 275 og 191 x g) til 10 min på RT.
  4. Brug negative valg protokoller til at undgå aktivering af celler. Et eksempel på sådan en protokol er følgende:
    1. Vask af mononukleære celler en gang med en vask buffered løsning (0,5% bovint serumalbumin, 2 mM EDTA i 1 x PBS). Tælle celler i et Neubauer kammer og justere dem til en tæthed af 1 x 107 celler/30 µL af en bufferopløsning.
    2. For hver 1 x 107 celler, tilføje 10 µL af en FcR blokering reagens og 10 µL af en monocyt biotin-antistof cocktail, der indeholder antihumant CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 og Glycophorin A (inkluderet i kommercielle kits).
    3. Bland cellerne og Inkuber i 15 min. ved 4 ° C. Tilføje en ekstra 30 µL af opløsningen vask buffered plus 20 µL af anti-biotin microbeads (medfølger i sættet); Bland celler og Ruger i 20 min. ved 4 ° C.
    4. Vaske cellerne en gang med en bufferopløsning, der centrifugeres ved 430 x g i 5 min på RT og resuspend i 1,5 mL "buffered" løsning for magnetisk separation.
    5. Indlæse cellesuspension for en kolonne i pre skylles magnetisk separation og tilføje 7 mL af bufferopløsning. Indsamle de monocyt-beriget brøk i en 15 mL konisk slange, tælle cellerne, og hvis ikke kulturperler straks, fryse monocytter med en tæthed på 2 x 106 celler/1 mL DMEM/F12 medium suppleret med 50% FBS og 10% DMSO på −80 ° C.
      Bemærk: Undgå at bruge monocytter efter mere end 2 måneder efter frysning, da deres levedygtighed kan være kompromitteret.
  5. Opretholde for PMs kulturer i DMEM/F12 medium suppleret med 6% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin, ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø.
  6. Udføre hvert sæt af forsøg udnytte PMs fra mindst to forskellige donorer uafhængigt, da pooling monocytter fra forskellige donorer kan resultere i monocyt aktivering.

4. oprettelse af 3D Co kulturer

  1. 3D Co kulturer med indirekte interaktion
    Bemærk:
    udføre disse assays i 24-godt flad bund kultur plader ved hjælp af polycarbonat celle kultur skær med membraner af 0,4 µm porestørrelse. I denne analyse, kan analysere og celler hentes i slutningen af forsøget.
    1. Dyrke 2 x 106 U937 og THP-1 monocytter i 10 mL af RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS, 1% antibiotikum/antimykotikum, og dyrke friske PMs i suppleres med DMEM/F12 medium (som nævnt tidligere i skridt 3.5), ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø.
    2. Plade 4 x 105 monocytter i 1 mL/godt for deres tilsvarende medium (suppleret med 2 ECME og 2% FBS for U937 og THP-1 monocytter, eller 2% ECME og 6% FBS for PMs).
    3. Placere et indstik i hver brønd og tilsættes 0,9 mL 4 x 105 BrC cellesuspension i den tilsvarende medium (suppleret med 2 ECME og 2% FBS for kommercielle cellelinjer eller 5% hest serum for primære BrC celler). Erstat halvdelen af total media hver 48 timer.
    4. Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø i 5 dage og genoprette analysere. Hente celler ved trypsinization, hvis der efterfølgende analyse udføres.
    5. Omfatte kontrol af individuelle cellekulturer med de respektive medier.
  2. 3D Co kulturer med direkte interaktion
    1. Label BrC celler og monocytter med forskellige fluorescerende farvestoffer før cellekultur til at tillade uafhængige sortering af hver celle afstamning efter kultur for analyse af mRNA og protein udtryk. Bruge kommercielt tilgængelige derivater af cumarin og rhodaminfilteret, der frit passerer gennem cellemembranen af levende celler. En generel protokol for mærkning er følgende:
      1. Forberede en éncellelag af BrC celler af interesse (2 × 106 celler i en 25 cm2 kultur kolbe) og erstatte den standard medium med tilstrækkelig pre varmede brugsopløsning af de fluorescerende farvestof (1:2, 000 af de fluorescerende farvestof i standard base medium uden eventuelle tillæg). Inkubér 30 minutter ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø. Opsug farvestof løsning og skylles forsigtigt med tilstrækkelig 1 x PBS. Opsug PBS og tilføje den standard medium.
      2. Trypsinize celle éncellelag med 2 mL af opløsning af 0,05% trypsin og 0,48 mM EDTA i 5-10 min. ved 37 ° C. Tilføje 200 µL af FBS at stoppe trypsinization og 7 mL af korrespondent medium uden tillæg. Resuspend cellerne af pipettering. Tage en alikvot af 10 µL tælle celler i et Neubauer kammer. Fortsætte med co kultur protokol efter celle optælling.
      3. Sammenpresse cellerne på 430 x g i 5 min på RT (udføre dette første da monocytter vokse i suspension). Kassér supernatanten og forsigtigt resuspend celler med 3 mL af en pre varmede brugsopløsning af de fluorescerende farvestof (1:2, 000 af de fluorescerende farvestof i en standard base medium uden tillæg). Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø.
      4. Sammenpresse cellerne igen, kassere farvestof brugsopløsning og forsigtigt resuspend med 5-7 mL 1 x PBS. Pellet endnu engang og kassér PBS resuspend celler i 5-7 mL af standard medium. Tage en alikvot af 10 µL af cellesuspension tælle celler i et Neubauer kammer. Fortsætte med co kultur protokol efter celle optælling.
    2. Angiv fælles kultur som følger:: spredt nok ECME i bunden af brønden for at danne et jævnt lag i hver brønd af et 4-godt kammer slide system. Plade 20 µL af en enkelt celle opslaemning indeholdende 5 × 105 mærket BrC celler pr. brønd.
    3. Efter 15-20 min inkubation ved 37 ° C, tilføje en suspension af 2,5 x 105 mærket monocytter i 80 µL assay medium (suppleret med 60% ECME).
    4. Tillade ECME at størkne i 15-20 min. ved 37 ° C.
    5. Der tilsættes 1 mL af en 1:1 blanding af BrC celler og monocyt Kulturmedier.
    6. Inkuber Co kulturer ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø for 24 h, 48 h eller 5 dage til at spore ændringer på forskellige tidspunkter.
    7. Forringe ECM proteiner for at genoprette cellerne fra kulturer. Opsug og kassere mediet, der tilsættes 0,5 mL 1 x PBS med 0,1% trypsin og 0,25% EDTA og Inkuber i 3 timer ved 37 ° C. Efter inkubering tilsættes 0,5 mL 1 x PBS med 10% FBS at neutralisere trypsin, og pelleten cellerne af pipettering energisk for at få en enkelt celle suspension.
    8. Pellet celler på 765 x g i 5 min på RT, supernatanten fjernes, og resuspend celler i 5 mL 1 x PBS med 10% FBS. Gentag dette trin en gang.
    9. Underlagt cellesuspension fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) med et passende instrument. Sikre, at de endelige populationer er mindst 95% ren).
    10. Efter sortering, cellerne vaskes med steril 1 x PBS, pellet (430 x g i 5 min på RT), og pelleten i sterile 1 x PBS. Celler kan blive behandlet efter særlige protokoller for RNA isolering eller proteinanalyse.
    11. Gentag hvert assay tre gange, herunder 3D kulturer af hver enkelt celle afstamning som kontrol.
  3. Direkte interaktion af 3D Co kulturer at vurdere kollagen nedbrydning
    1. Etablere 3D Co cellekulturer som beskrevet i trin 4.2, med den yderligere trin for at tilføje 32,5 µg/mL af type IV kollagen mærket med fluorescein isothiocyanat til ECME. Den endelige koncentration af kollagen IV i ECME er 0,5%. Vokse kulturer i en 35-mm coverslip anbringes i en petriskåle.
    2. Spredes et lag af 40 µL af ECME i bunden af petriskålen. Tillade ECME at størkne ved 37 ° C.
    3. Der tilsættes 2,5 x 105 BrC celler i 10 µL af medium og celler til at slå sig ned.
    4. Tilføje en suspension af 1,25 x 105 U937 monocytter i 40 µL assay medium (suppleret med 60% af DQ-kollagen IV mærket-ECME).
    5. Tillade ECME at størkne i 15-20 min. ved 37 ° C.
    6. Der tilsættes 2 mL af en 1:1 blanding af BrC celler og monocyt Kulturmedier.
    7. Inkuber Co kulturer til 5 dage ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø. Erstatte kultur medier hver 48 timer.
    8. Analysere fluorescens emission i en Konfokal scanning mikroskop og måle integrerede ekstinktionen (IOD) pr. 50 µm2 af kultur. Sammenligne IODs med enkelte kulturer og kultur på tidspunktet nul (figur 2).

5. analyse af supernatanter fra 3D kulturer Co med indirekte interaktion

  1. Efter 5 dage af fælles kultur, genoprette analysere fra både øverst og de nederste rum 3D Co kulturer, og fra de enkelte 3D kultur kontrolelementer. Bland godt hver supernatanten af pipettering. Alikvot, og butikken supernatanten ved −20 ° C indtil brug (op til en måned).
    Bemærk: Holde analysere ved −80 ° C, hvis opbevaring vil være længere end én måned.
  2. Analysere supernatanter med multiplexing assay platforme, enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA) eller perle-baserede immunassays efter producentens anbefalede procedurer.
    Bemærk: Supernatanter kan også analyseres af vestlige skamplet eller koncentreret gennem specifikke pore filtre til at hente størrelse beriget protein brøker for at udføre zymography analyse16,17. Alternativt, brug analysere som konditioneret medier til andre eksperimenter, som beskrevet nedenfor. Konditioneret media er normalt fremstillet af en 5-dages kultur (figur 3).

6. karakterisering af effekter analysere fra primære BrC celler på Acini dannelse og Acini struktur

  1. I hvert hul i en 8-godt kammer slide system spredt en 40 µL base af ECME og lad den størkne i 30 minutter ved 37 ° C.
  2. Frø 800 MCF-10A celler/brønd i 400 µL af suppleres med DMEM/F12 næringssubstrat, som beskrevet i trin 1.2.
  3. Tilføj 400 µL af konditioneret medier eller suppleres med DMEM/F12 næringssubstratet med 20 ng/mL af human rekombinant IL-1β.
  4. Sted kammer diasset i et glas petriskål indeholdende en 35 mm petriskål fyldt med 2 mL PBS til at oprette en luftfugtighed.
  5. Erstatte medier/supernatanten hver 48 timer.
  6. Optage glandulær acini dannelse hver 24 h i 14 dage med et optisk mikroskop.
  7. Efter 14 dage af kultur, pletten acini med 100 µL af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ved en koncentration på 100 nM i 1 x PBS at observere cellekerner. Inkuber i 25 min. ved RT i konstant omrøring. Skylles tre gange med 1 x PBS i 5 min, hver gang i konstant omrøring på RT. Mount præparater med en montering medium specifikke for fluorescerende farvning. Forsegle med gennemsigtig polsk og vedligeholde beskyttet mod lys ved 4 ° C.
  8. Analysere acini med en Konfokal mikroskop at tage billeder af tværgående stakke på forskellige dybder i acini (figur 4A, B, C).
  9. Visualisere forskellige cellulære proteiner i acini med ordentlig farvningsprotokoller. For eksempel, var E-cadherin plettet for at vurdere celle til celle vedhæftning, celle polaritet og/eller lumen dannelse18 (figur 4D).

7. migration Assays

Bemærk: Udføre migration assays af U937, THP-1, og fersk PMs i 24-godt flad bund kultur plader ved hjælp af polycarbonat celle kultur skær med membraner af 8 µm porestørrelse. Tidligere blev det påvist, at kemokiner GM-CSF, MCP-1 og RANTES fandtes udskilles i høje koncentrationer i individuelle 3D kulturer på de aggressive BrC cellelinjer. Det blev foreslået, at disse cytokiner var afgørende for at tiltrække monocytter til webstedet af den primære tumor; Dette blev testet i migration assays ved hjælp af cytokiner som chemoattractants.

  1. Kultur U937, THP-1, eller frisk PMs som beskrevet i trin 4.1.1.
  2. Skyl en gang hver Indsæt med 200 µL af RPMI 1640 uden sera at fugte membranen.
  3. Fyld den med 50 µL af kolde ECME, placere indsætter i en 24-godt flad bund kultur plade og tillade ECME at polymerisere i 1 timer ved 37 ° C.
  4. Tilføj 180 µL af RPMI uden FBS i det øverste rum af pladen. Tilføj i den nedre kammer uden boblende 800 µL af RPMI suppleret med enten 100 ng/mL af GM-CSF, MCP-1 eller RANTES som chemoattractant. Brug medium uden cytokiner som en negativ kontrol. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C at etablere en chemokine gradient.
  5. Sted 1,5 x 105 af hver type af monocyt i sterile rør, vaskes to gange placere med 1 mL af 1 x PBS, og der centrifugeres ved 430 x g i 5 min på RT. Resuspend monocytter i 20 µL af RPMI uden FBS, dem i skærene , og meget omhyggeligt homogeniseres cellesuspension (den endelige mængden af det øverste kammer er 200 µL).
  6. Tillad celle migration til fremskridt i 24 timer ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø.
    Bemærk: Som monocytter ikke-tilhænger, vil vandrende celler normalt være i medierne i det nedre rum.
  7. Fjern indsætter, hente medier og tælle celler på 2, 4, 6 og 24 h ved hjælp af en Neubauer kammer eller en flow forskellige; Alternativt, især hvis ingen celler findes i medierne, erhverve billeder af den nederste del af skærene med et digitalt kamera. Den gennemsnitlige celletal fra 3 tilfældige felter (ved 100 X forstørrelse) bruges til analyse (figur 5).

8. invasion Assays

Bemærk: Udføre invasion assays af BrC celler i 24-godt flad bund kultur plader ved hjælp af polycarbonat celle kultur skær med membraner af 8 µm porestørrelse. I vores oprindelige studier var IL-8 en af de cytokiner, beriget med analysere BrC celle/monocyt 3D Co kulturer. Om denne cytokin deltog i invasionen af BrC cellelinjer blev testet.

  1. Udvid BrC celler i 75 cm2 kolber. MCF-7, T47D, HS578T og MDA-MB-231 som beskrevet i trin 1.2 (men uden ECME) og primære BrC celler som beskrevet i trin 2.4.
  2. Vaske når hver polycarbonat 8 µm-pore membran cellekultur indsætte med 200 µL af medium uden sera (den anvendte medium afhænger cellelinie testet) til at fugte membranen.
  3. Fyld indsatsen med 50 µL af kolde ECME (1:4 fortynding ECME:cold medium uden FBS), placere indsætter i en 24-godt flad bund kultur plade og tillade ECME at polymerisere i 1 timer ved 37 ° C.
  4. Når ECME har polymeriserede, tilføje 180 µL af de respektive celle medier uden FBS. Tilføje 800 µL medier uden FBS gennem spalter af indsatsen. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C at etablere en IL-8 gradient.
    Bemærk: Undgå at skabe bobler i medierne. Medier anvendt uden FBS men suppleret med 100 ng/mL af IL-8 som en chemoattractant, eller ren medier uden FBS, som negative kontroller.
  5. Få en i alt 6 x 105 celler af hver cellelinje som følger:
    1. Kassere analysere, skylles en gang med 10 mL PBS, 1 x, og der tilsættes 2 mL 0,05% trypsin/0,48 mm EDTA i 2 min. ved 37 ° C til at frigøre cellerne. Der tilsættes 4 mL suppleres med medium til at stoppe trypsin reaktion og resuspend kraftigt af pipettering.
  6. Tag en 10 µL alikvot af cellesuspension til at tælle cellerne i et Neubauer kammer. Tage et bind af cellesuspension 6 x 105 celler. Der centrifugeres ved 430 x g i 5 min på RT, supernatanten fjernes, og skyl celler i 1 mL PBS, 1 x. Gentag skylles en gang mere.
  7. Resuspend celler i 20 µL af de respektive medier uden FBS og sted i indsætter indeholdende 180 µL af de respektive medier uden FBS. Omhyggeligt homogeniseres cellesuspension af pipettering.
  8. Tillad celle invasion til fremskridt i 48 timer ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 miljø.
  9. Efter 48 h, fjerne indsætte, supernatanten og skyl Indsæt en gang meget omhyggeligt med 200 µL 1 x PBS. En bomuld tippes applikator til at fjerne overskydende af PBS.
    Bemærk: De invasive celler normalt er knyttet til anden siden af skæret, som i dette tilfælde hvor celler er tilhænger.
  10. Fix cellerne ved at placere indsatsen i et godt af en 24-godt flad bund kultur plade indeholdende 1 mL/godt af 4% PARAFORMALDEHYD for 15 min på RT. bagefter, skyl skær en gang med 1 x PBS.
  11. Pletten cellerne ved at placere indsatsen i et godt af en 24-godt flad bund kultur plade indeholdende 1 mL/godt af 1 x PBS med 0,2% krystalviolet for 45 min på RT. omhyggeligt med en bomuld tippes applikator fjerne alle ECME fra toppen af membranen , som indeholder celler, der ikke blev overflyttet, og skyl meget omhyggeligt med destilleret vand for at undgå at fjerne fast invasive celler.
  12. Tælle de invaderende celler ved at observere den nedre side af Indsæt inverteret mikroskopet. Den gennemsnitlige celletal fra 3 tilfældige felter (ved 100 X forstørrelse) bruges. I tilfælde, hvor cellerne har invaderet som klynger og er vanskeligt at tælle individuelt, erhverve billeder fra 3 tilfældige felter (ved 100 X forstørrelse) med et digitalt kamera. Analysere billeder med software til billedanalyse og bruge IOD for at kvantificere celle invasion (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologisk analyse af BrC celler i 3D kulturer:

Morfologi af primære BrC celler vokser i 3D kulturer ved lave og høje tætheder blev studeret over 5 dage. Under de første 48 timer, celler overholder ECME og fastholde en lav befolkningstæthed. På dette tidspunkt, kan det klart være værdsat, at celler præsentere et aflangt spindel-lignende form, nogle med to eller flere lange cytoplasmatisk fremskrivninger og uden at vise åbenbare celle-celle kontakter. Efter 5 dage i kultur tilvækst cellerne samtidig bevare deres oprindelige morfologi. Desuden, de dannede strukturer der ligner net uden en bestemt strukturelle organisation, og synes stablet op med ingen kontakt hæmning. Blev foretaget en sammenligning med ikke-transformeret MCF-10A celler, der danner sfæriske strukturer der ligner glandulær acini. Disse celler vises en karakteristisk morfologi af afrundede strukturer, godt afgrænset og organiseret i homogene størrelser (af ca. 50 µm). Tværtimod deler primære BrC celler en meget tættere lighed med aggressive BrC celler MDA-MB-231 (figur 1).

Analyse af celle til celle direkte interaktioner og kollagen nedbrydning:

Vi har designet en 3D Co kultur model til at vurdere følgende: celle morfologi, kollagen nedbrydning, celle migration, og om der er en direkte interaktion mellem BrC celler og monocytter i fælles kultur. Efter 5 dage, både MCF-7 og MDA-MB-231 kommercielle BrC celler danner uorganiseret aggregater i 3D kulturer, men de adskiller sig i deres morfologi. Aggressive celler MDA-MB-231 form aggregater med aflange former med nogle celler tendens til at adskille fra resten, mens ikke-aggressive MCF-7 celler danner aggregater hvor celler opretholde afrundede former og de synes at være mere tæt komprimerede (figur 2 A, B). DQ kollagen IV var indarbejdet til at visualisere proteolytisk nedbrydning (grøn), med begge BrC kulturer udstiller fluorescerende aktivitet. For at vurdere kvantitativt proteolytiske aktivitet, blev grønne fluorescens målt som IOD af seks 50 µm2 felter. Blev foretaget en sammenligning mellem individuelle 3D kulturer i MDA-MB-231 celler og co kulturer med U937 monocytter. Statistisk signifikant stigning i proteolyse i fælles kultur (figur 2C) blev observeret. Også, en Konfokal mikroskopi analyse af serielle transversal stakke hver 10 µm i MDA-MB-231 og U937 monocytter Co kultur blev udført (figur 2D). Denne analyse afslørede, at U937 monocytter migreret mod aggressive celler MDA-MB-231 med et par monocytter nåede lag af celler, BrC. Det var dog indlysende, at celle-celle direkte interaktion websteder nødvendigvis ikke sammenfaldende med områder af højere proteolytiske aktivitet: områder af kollagen nedbrydning ensartet i stedet blev spredt kultur, fører til slutning at kollagen nedbrydning var resultatet af indirekte meddelelse medieret af udskilles faktorer. Derfor, 3D Co kultur modellen blev ændret for at placere cellerne i forskellige rum adskilt af en porøse membran tillade celle-celle kommunikation baseret på udskilles faktorer, og undgå celle mærkning og sortering efter kultur.

Analyse af IL-1β i supernatanter fra 3D kulturer:

Arbejder med indirekte interaktion 3D kulturer, analysere fra enkelte primære BrC er kulturer og deres 5 dage Co kulturer med PM høstet. Disse supernatanter blev udsat for en simultan analyse af 18 cytokiner og 5 MMPs ved hjælp af kommercielle kits og et instrument udviklet specielt til denne analyse. Af alle analysander testet, blev væsentligt forhøjede niveauer af IL-1β og IL-8 observeret i de primære BrC celle-monocyt Co kulturer, både afgørende inflammatoriske cytokiner, der har været tidligere forbundet med maligne progression15, 18 , 19 , 20 (figur 3; resultater for IL-1β). I dette eksempel er en anden type analyse at 3D kulturer gør det muligt for at efterligne det kommunikationsnetværk, der former tumor mikromiljø.

Karakterisering af supernatanter og Acini struktur:

På grundlag af den 3D eksperimentel system udviklet af Debnath, Muthuswamy og Brugge-7, hvor MCF-10A blev etableret som en model af de mekanismer, der er tilknyttet oncogenesis, vurdering af hvorvidt de udskilles faktorer fra den primære BrC celle analysere påvirket dannelsen af MCF-10A 3D acini-lignende strukturer, svarer til den aktivitet, der er observeret efter transduktion af viral og cellulær onkogener7,21 blev udført. MCF-10A celler blev dyrket med to forskellige supernatanter fra to primære BrC cellelinjer til at observere lumen dannelse (som et mål for modstand mod anoikis). På dag 14, spheroids blev evalueret af konfokalmikroskopi tværgående nedskæringer på 0, 25, 50, 75 og 100% dybde, og i begge tilfælde blev det konstateret at MCF-10A celler unddragne anoikis (målt ved at tælle antallet af centrale (luminale) celler i acini (figur 4 B, C)). Således mangler MCF-10A celle acini, der er dannet med konditioneret medierne fra BrC celler, en velformet hule lumen, i modsætning til MCF-10A, der er vokset med sin standard næringssubstratet (som beskrevet i trin 1.2) (figur 4A). I 3D Co kultur-systemet, var IL-1β meget udskilles; Derfor blev MCF-10A celler også dyrket med humane rekombinante IL-1β18. Figur 4 D viser en Konfokal mikroskopi tværgående skåret på 50% dybde af acini i overværelse af IL-1β (nedre paneler), og afslører, at denne cytokin også giver resistens over for anoikis. Således fremme opløselige faktorer udskilles af primære BrC celler, såsom IL-1β, overlevelse af ikke-transformeret MCF-10A celler, der mister ECM interaktioner, karakteristisk for invasive kræft.

3D Co kulturer fremme en inflammatorisk reaktion forbundet med Migration af monocytter og Invasion af kræftceller:

Vi viste tidligere, at primære BrC celler i 3D kultur udskiller høj basal niveauer af pro-inflammatoriske kemokiner kendt for at tiltrække monocytter14. Dermed, vi analyseret de vandrende kapacitet af monocytter i svar til kemokiner fundet beriget med konditioneret medierne BrC celler. Den vandrende kapacitet af kommercielle monocytter U937 og THP-1 og frisk PMs blev evalueret som reaktion på tre forskellige kemokiner: GM-CSF, MCP-1 og RANTES. U937 og THP-1 monocytter var i stand til at migrere i svar til GM-CSF og MCP-1, med U937 som det mest lydhøre, mens begge monocytter havde en null svar på RANTES. Vigtigere, viste PMs en høj basal vandrende aktivitet og den mest potente svar på MCP-1 (figur 5). IL-8 blev også beriget efter primære BrC celler og monocytter 3D Co kultur. Dermed, vi analyseret om IL-8 ændrer kapacitet af invasionen af kommercielle og primære BrC cellelinjer. De kommercielle aggressive BrC cellelinjer (HS578T og MDA-MB-231) invaderet svar på IL-8, mens de ikke-aggressive (MCF-7 og T47D) ikke invadere. Overraskende, blev primære BrC celler mere indgribende end kommercielle aggressive BrC cellelinjer svar på IL-8 (figur 6A, højre paneler). I nogle tilfælde kan invadere celler som klynger og derfor IOD analyse var nødvendigt (fig. 6B).

Figure 1
Figur 1 : Repræsentant billeder af BrC celler i 3D kulturer. Fra venstre mod højre: kontrol af ikke-transformeret MCF-10A celler danner karakteristiske glandulær acini, med afrundet morfologi, godt afgrænset celle kontakter, og organiserede strukturer af homogene størrelser (ca 50 µm på gennemsnittet, optisk forstørrelse 200 X). Midterste paneler Vis primære BrC celler dyrkes på lav (2 dage) og høj massefylde (5 dage). Celler overholder ECME og fastholde en lav massefylde ved tidlig tid point. Det er indlysende, at celler præsentere et aflangt spindel-lignende form, nogle med to eller flere lange cytoplasmatisk fremskrivninger, og ingen tilsyneladende celle-celle vedhæftning. På den anden side dannet high-density celler på senere tidspunkter strukturer der ligner net uden en specifik strukturel organisation. Disse celler syntes stablet op viser ingen kontakt hæmning. En kontrol af kommercielle MDA-MB-231 celler efter 5 dage i 3D kultur er vist; disse aggressive BrC celler deler en meget tættere lighed med primære BrC kulturer (optisk forstørrelse på 100 X). Skala bar repræsenterer 50 µm. 800 celler var seedede i begyndelsen af eksperimentet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Analyse af ECM nedbrydning. Ikke-aggressive MCF-7 celler farves med en gul fluorokrom (A) og aggressive MDA-MB-231 celler farves med en rød fluorokrom (B) dyrkes i 5 dage i 3D betingelser; 0,5% af grønne fluorescens-mærket kollagen IV var indarbejdet til at visualisere ECM nedbrydning. I A og B, de øverste venstre billeder repræsenterer niveauer af kollagen nedbrydning, de øverste højre paneler repræsenterer de optiske billeder, nederst til venstre repræsenterer BrC celler, og panelerne nederste højre Vis fletningen af fluorescerende og optisk billeder. For A og Bpræsenteres optisk forstørrelse af 200 X og skalalinjen af 100 µm. (C) repræsentative billeder af ECM proteolyse (grøn) i 3D kultur af individuelle MDA-MB-231 celler som kontrol, sammenlignet med ECM proteolyse af 3D Co kultur af MDA-MB-231 med U937 monocytter. Skala søjler repræsenterer 10 µm. IOD (integreret optisk densitet) af seks 50 µm2 felter fra hver betingelse blev målt. Middelværdien og standardafvigelsen på middelværdien (SEM) fra kvantificeringer præsenteres; to stjerner repræsenterer en statistisk signifikant forskel med p < 0,01 (Mann-Whitney test). (D) direkte interaktion i MDA-MB-231 celler (grå skygge masse) med fluorescently farvede U937 monocytter (orange); grøn fluorescens svarer til proteolyse. Seriel skiver blev genereret hver 10 µm af konfokalmikroskopi vedrører lokalisering og direkte interaktion mellem begge cellelinjer. Optisk forstørrelse af 200 X; skala søjler repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: IL-1β koncentrationen er øget i 3D Co kulturer. Et repræsentativt resultat af IL-1β niveauer (pg/mL) i supernatanter fra otte (PC1-8) primære BrC celler, kulturperler individuelt i 3D (3D), og sammenlignede imod deres 3D Co kulturer med PM (CC). En kontrol af PM i individuelle 3D kultur blev medtaget til sammenligning (PM). Resultaterne blev udvundet fra en større multiplexing analyse, hvor flere cytokiner samtidig blev opdaget i hver prøve ved hjælp af en immunodetection-baseret teknik tilgængelig som en kommerciel kit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Udskilles faktorer fra primære BrC celler inducere modstand mod anoikis i ikke-transformeret MCF-10A celler. MCF-10A celler blev dyrket i 3D betingelser med standard kultur medier (kolonne A og øvre paneler af D), hvori kan det bemærkes, at acini præsentere typisk hule lumen (25-75% dybde fremhævet med en rød firkant); Når MCF-10A celler blev dyrket med to forskellige supernatanter fra to primære BrC kulturer (kolonne B og C), er lumen ikke hult, men fyldt med celler betegner modstand mod anoikis. På samme måde, når MCF-10A celler blev kulturperler i 3D betingelser tilføje humane rekombinante IL-1β (20 ng/mL), ingen hule lumen kan blive værdsat på 50% dybde konfokalmikroskopi sektioner af acini (lavere paneler af D). Til højre ovalt karikatur repræsenterer afsnittene Konfokal mikroskopi, der blev foretaget ved 0, 25, 50, 75 og 100% dybde på acini. Billederne viser cellekerner farves med DAPI (blå) og E-cadherin i grøn. Optisk forstørrelse af 200 X, skala søjler repræsenterer 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Vandrende kapacitet af monocytter. Repræsentative billeder af den migrerende kapacitet af U937, THP-1 og PM i svar til GM-CSF, MCP-1 og RANTES. Kontrolelementer uden chemokine er inkluderet (første kolonne fra venstre til højre). Tallene under billederne angiver antallet migrerende celler i hver tilstand; U937 og THP-1 monocytter blev hovedsagelig lydhør over for GM-CSF og MCP-1, mens PM viste en høj vandrende kapacitet i sig selv, og var de mest lydhør celler til MCP-1. Optisk forstørrelse på 100 X; skala barer repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Aggressive og primære BrC celler invadere svar på IL-8. A. Invasion assays med to ikke-aggressive (MCF-7 og T47D), to meget aggressive (HS578T og MDA-MB-231) BrC cellelinjer og én primær BrC kultur som svar på IL-8 bruges som chemoattractant. Øvre paneler svarer til kontrolelementer uden chemokine viser ingen invasion, lavere paneler Vis svar på IL-8, med stærkt pågående BrC celler og primære BrC celler invaderer gennem membranen af celle kultur Indsæt. B. eksempel på celler, der invaderer i klynger; i disse tilfælde sker måling af invasion med et image analysis program til at bestemme invasion i form af IOD (integreret optisk densitet) pr. område. Numre under billederne repræsenterer antallet af invaderende celler i hver tilstand. Optisk forstørrelse på 100 X; skala søjler repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitelceller vokser i en 3D fysisk kropsbygning og deres interaktion med ECM proteiner er afgørende for væv homøostase. Mange kræft undersøgelser har været baseret på celler dyrkes i encellelag (2D) og selv om de har været afgørende for at forstå mange aspekter af tumordannelse og progression, encellelag sammenfatte ikke de karakteristika, der ECM pålægger celler, for forekomst: begrænse spredning, vedhæftning-afhængige celle overlevelse, apikale basolateral polaritet, ECM remodeling, Celledifferentiering, osv. Vigtigere, ikke kun samspillet mellem tumorceller og ECM er afgørende for udviklingen af kræft, men også kommunikationen etableret mellem tumor og ikke-tumor celler, såsom immunceller. De protokoller findes her lette forståelse af samspillet mellem immun celler og kræftceller i miljøet, forudsat af ECM, det inflammatoriske respons fremmes af disse interaktioner, og hvordan denne betændelsestilstand opretter en positive loop fremme chemoattraction af monocytter og flere invasion af kræftceller.

En stor fordel ved at bruge ECME er, at det giver en biologisk stillads egnet til at udføre en række eksperimentelle 3D modeller22. Det er beriget med ECM proteiner som laminin, kollagen IV, entactin, heparan-sulfat proteoglycan og vækstfaktorer, som i vivo ønsker interagerer med epitelceller. En ulempe er, at fordi det kommer fra lysates af murine sarkomer, koncentrationen af deres komponenter varierer mellem forskellige masser. Så er det ofte nødvendigt at karakterisere flere partier for at opnå mere ensartede data. I laboratoriet, hvert nyt parti er testet på to måder: 1) ved at evaluere den korrekte acini dannelsen af MCF-10A celler og 2) ved vurderingen af invasiv af BrC cellelinjer veletablerede invasive kapacitet. En anden mulighed er at arbejde med andre stilladser produkter, såsom Hydrogel, som er et syntetisk nanofiber peptid stillads. Stivhed af 3D kultur kan styres ved at justere koncentrationen af Hydrogel23,24. Vigtigere, kunne dette system anvendes til at studere samspillet mellem alle typer af neoplastiske celler og hæmatopoietisk eller ikke-hæmatopoietisk celler. Det kunne endda være muligt at designe mere komplekse systemer ved hjælp af mere end to forskellige celle lineages. En vigtig fordel af 3D-modeller er, at de tillader undersøgelse af celle morfologi og celle organisation formet af ECM interaktioner, som er ændret i løbet af muterede transformation. På samme måde, man kan studere muterede funktioner såsom proteolytisk nedbrydning, og om cellerne oprindeligt placeret i forskellige lag af kultur signal til hinanden at fremme direkte interaktion/kommunikation. Desuden kan forskellige celle lineages navngives med forskellige fluorokromer, således at de kan være isoleret efter eksperiment at behandle specifikke spørgsmål til hver enkelt celletype, bruger, for eksempel RNA og/eller protein udtryk analyse13. Her, er IL-1β sekretion til medium i primære BrC celler/PM Co kulturer vist, understøtter en mulig afgørende rolle af dette cytokine i den indirekte kommunikation mellem tumorceller og monocytter der udløser maligne progression.

En anden væsentlig forsøgsplan i laboratoriet er analysen af acini dannelse i 3D kulturer af ikke-transformeret MCF-10A celler. Denne analyse blev brugt til at teste for viral og cellulær onkogen aktivitet, og til at teste, hvordan tumor mikromiljø påvirker funktion relateret til aggressive kræftformer. For eksempel, under den normale udvikling af acini luminale centrale celler miste kontakten med de basale Membranproteiner (fra ECME) udløser mekanismer for celledød, kendt som anoikis. Det blev observeret, at begge supernatanter fra primære BrC celler eller rekombinant IL-1β fremme MCF-10A celler modstand mod anoikis. Fordi en høj koncentration af IL-1β er forfremmet efter BrC celle-monocyt interaktion, understøtter denne observation, at tumor stroma er en integreret del af tumor progression til stærkt pågående faser.

De migration og invasion protokoller er beskrevet her udgør nyttige 3D supplerende assays hvor vi kan støtte evnen til cellerne til at migrere eller invadere som svar på stimuli afledt af tumor stroma. Det var vist at kemokiner (GM-CSF og MCP-1) fundet i forhøjede koncentrationer i 3D kulturer af primære BrC celler kan fremme migration af U937, THP-1 og PMs, støtte aggressive tumorceller evne til at fremme en pro-inflammatoriske mikromiljø. Desuden, IL-8, der også findes i øgede koncentration i supernatanter fra Co kulturer af BrC celler/monocytter, forfremmet øget invasion af både kommercielle aggressive BrC celler (HS578T og MDA-MB-231) og primære BrC celler.

Vedrørende betingelsen om celler er det vigtigt at arbejde med primære BrC celler, før de når ti passager for at drage fordel af deres spredning peak og undgå potentielle efter isolation genetiske og epigenetiske ændringer som følge af in vitro- kultur. Et andet vigtigt aspekt når man arbejder med primærelementer er at bekræfte deres identitet efter isolation. Vi brugte et panel af markører til at bestemme deres epitelial lineage identitet, som omfatter PanCK, Muc-1 og EpCAM (angivet i trin 2.5). Ligeledes er det at foretrække at bruge friske PMs, hvoraf hvert parti er testet sikre, at de er på den samme fase af differentiering. Hver ny batch bruges præsenteret fænotype CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68neg CD16neg, hvilket svarer til ikke-aktiveret umodne monocytter. Vigtigere, blande vi ikke monocytter fra forskellige donorer, som blande resultater i monocyt aktivering. I stedet, vi uafhængigt testet BrC Co kulturer ved hjælp af monocytter fra mindst to forskellige donorer.

3D kultur systemer har stadig den begrænsning, at kun nogle få elementer af tumor biology kan modelleres pålideligt. Et nyt alternativ er mere komplekse 3D-modeller af organoids, som er baseret på ekspansion og differentieringen af stamceller in vitro-. Organoids også udvikle velorganiseret epitelial strukturer. Eksempler omfatter gastrisk 25,26, leveren 27og nyre organoids28. Organoid modeller for alle menneskelige orgel er dog stadig for at være opnået; Desuden kræver de meget mere komplekse og dyre forsøgsbetingelser.

Afslutningsvis, her vi beskriver i detaljer en arbejdsproces af assays: start fra isolation af tumorceller fra BrC patienter, teste deres inflammatorisk kapacitet i en ECME-baseret 3D kultur model, teste, hvordan den inflammatoriske mikromiljø serverer dem at rekruttere yderligere inflammatoriske celler som monocytter, til endelig analysere kommunikationen mellem begge typer af celler, og hvordan denne meddelelse yderligere fremmer en inflammatorisk mikromiljø, der fremmer progression til mere aggressiv kræft faser. Derudover beskrive morfologi og fænotype af primære BrC celler. I fremtidige undersøgelser, det vil være interessant at afprøve andre inflammatoriske celler eller endda teste kommunikationen mellem BrC celler og flere celler ofte fundet i tumor stroma. Disse 3D multiple-cellekulturer vil give et større billede af, hvad der sker biologisk i vivo under kræft progression. Sammenligninger mellem in vitro- data og patientens kliniske resultatet vil identificere potentielle mekanismer, der har en større effekt på kræft aggressivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE projekt nr. 233061 til Ezequiel M. Fuentes-Pananá og af Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (projektnummer HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez NA er en ph.d.-studerende fra Programa de Doctorado da Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og modtaget stipendium 231663 fra CONACYT. E-S NA, også anerkende den finansielle støtte fra det mexicanske Institut for socialsikring (IMSS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95, (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8, (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18, (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3, (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2, (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11, (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65, (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16, (1), 118-126 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics