Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier beschrijven we een driedimensionale cultuur-methode voor het analyseren van de morfologie van primaire borstkankercellen, alsmede over de studie van hun directe/indirecte interacties met monocyten en de resultaten zoals de aantasting van het collageen, immuun cel aanwerving, cel invasie, en bevordering van kanker-gerelateerde ontsteking.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ingebed in de extracellulaire matrix (ECM), communiceren normale en neoplastisch epitheliale cellen intiem met hematopoietische en niet-hematopoietische cellen, dus sterk beïnvloeden van normale weefsel homeostase en ziekte resultaat. Bij borstkanker spelen tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) een cruciale rol in de progressie van de ziekte en metastase herhaling; inzicht in de mechanismen van de monocyte chemoattraction de tumor communicatie en hun interacties met tumorcellen is daarom belangrijk ter bestrijding van de ziekte. Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een driedimensionale (3D) mede cultuur systeem van menselijke (BrC) borstkankercellen en menselijke monocyten. BrC cellen geproduceerd gereglementeerde op-activering basale hoge, normale T-cel uitgedrukt en uitgescheiden (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (G-CSF), terwijl in co-cultuur met monocyten, pro-inflammatoire cytokines Interleukine (IL) -1 beta (IL-1β) en IL-8 werden verrijkt met matrix metalloproteinasen (MMP) -1, MMP-2 en MMP-10. Deze tumor stroma communicatie bevorderd weerstand tegen anoikis MCF-10A 3D acini-achtige structuren, chemoattraction van monocyten en invasie van agressieve BrC cellen. De hier gepresenteerde protocollen bieden een betaalbaar alternatief voor het bestuderen van de mededeling van de intra-tumor en zijn een voorbeeld van het grote potentieel door in vitro 3D cel-systeem is bedoeld om het ondervragen van de specifieke kenmerken van de tumor biologie aan de tumor gerelateerde agressie.

Introduction

Biologie van de tumor is veel ingewikkelder dan eerder gedacht. Montage van bewijsmateriaal blijkt dat tumorcellen meer dan een louter bulk van ongecontroleerde delende cellen zijn; verschillende neoplastische cellen lijken eerder, voor het uitvoeren van verschillende functies hoge organisatie en hiërarchie binnen de tumor-1weer te geven. Tumorcellen zijn ook in intieme communicatie met niet-getransformeerd cellen: macrofagen, lymfocyten, adipocytes, fibroblasten, endotheliale cellen, onder andere cellen zijn alle ondergedompeld in de steiger eiwitten en polysacchariden die de ECM vormen. Talrijke directe en indirecte interacties zijn gevestigd tussen getransformeerd en niet-getransformeerd cellen en met de ECM, die een krachtige invloed op de ziekte resultaat2,3oefent. In het specifieke geval van BrC is het met name belangrijk voor het ontleden van de mededeling van BrC cellen met TAMs, gezien het feit dat TAMs bleken te spelen een cruciale rol in de evolutie van de tumor, waardoor het risico van metastase en ziekte herhaling4 ,5.

Voor het analyseren van de intra-tumoral interacties en hun mogelijke uitkomsten, nieuwe 3D in vitro benaderingen zijn ontwikkeld op basis van het gebruik van ECM-extracten die een veel complexer communicatie bieden, dichter bij de realiteit van de biologie van de tumor, in vergelijking met de conventionele enkelgelaagde celculturen waarin de cellen groeien gekoppeld aan kunststof. Petersen en Bissell6 geleverd het eerste model van nonmalignant en kwaadaardige borstklier epitheliale cellen gekweekt op een laminin-rijke kelder membraan en waren de eerste om te beschrijven van de 3D organotypic-structuren die nonmalignant mens discrimineren borst epitheliale cellen uit hun kwaadaardige tegenhangers. Een decennium later, het model ontwikkeld door Debnath, Muthuswamy, en Brugge7,8,9 verstrekt een waardevol instrument voor het verhelderen van de biologische trajecten in gevaar komen tijdens de kwaadaardige omzetting van klierweefsel acini, dergelijke Als grote acini formatie als gevolg van de ongecontroleerde verspreiding, verplaatsing van strakke junction eiwitten als bewijs van verminderde cel polarisatie, en verlies van acini lumen als gevolg van cel weerstand tegen anoikis, een soort geprogrammeerde celdood optreedt die in Anchorage-afhankelijke cellen wanneer ze van de omliggende ECM losmaken. De modellen Sameni, Jedeszko en Sloane hebben gericht op imaging proteolytic activiteit door cellen, die nauw is aan invasiviteit, een ander essentieel karaktertrek van tumor maligniteit10,11,12 verwant. Deze modellen afhankelijk proteïne matrices gemengd met verschillende fluorescentie-uitgeblust eiwit substraten (DQ-gelatine, DQ-collageen I, en DQ-collageen IV), in welke TL signalen zijn indicatief voor de Proteolytische afbraak van collageen. 3D-modellen worden ook gebruikt voor het bestuderen van de stamcel eigenschappen van zowel niet-getransformeerd en tumorcellen, in welke cel aggregaten, ook wel genoemd spheroïden, kunnen worden gekweekt in suspensie of in ECM-achtige eiwitten voor mechanismen voor celdifferentiatie, asymmetrische ondervragen celdeling, naleving van de cel-naar-cel en cel motiliteit13,14. Invasie testen laten testen van de intrinsieke agressiviteit van de tumor en de identificatie van de moleculen die als chemoattractants tijdens de invasieve proces15 dienen. Algemene, 3D-modellen vertegenwoordigen een betaalbare diversificatie van in vitro cultuur van de cel die normaal en oncogene weefsel morfogenese nauwer te weerspiegelen.

We hebben een 3D co celcultuur op grond van de bovengenoemde modellen7,10,11, ontworpen met behulp van beide menselijke commerciële BrC cellijnen van bekende agressieve potentieel (luminal en triple-negatieve soorten) en primaire cellen transplanteren van BrC patiënten. We eerst een model ontwikkeld waar niet-agressieve (MCF-7) of agressieve (MDA-MB-231) BrC cellen waren mede gekweekte met U937 monocyten in een uittreksel van de extracellulaire matrix (ECME)-gebaseerde 3D systeem waardoor directe cel interacties. Deze co culturen werden gebruikt om te bepalen hoe de communicatie tussen deze twee cel lineages beïnvloed de transcriptie van een aantal genen aan agressief gedrag van kanker gerelateerde. Een aanzienlijke stijging van cyclooxygenase-2 (COX-2) afschrift werd waargenomen dat samenviel met een verhoogde productie van een van haar producten, prostaglandine E2 (PGE2), de vaststelling dat de rol van ontsteking in de progressie van kanker benadrukte. Verhoogde transcriptie van MMP werd ook waargenomen dat gecorreleerd met meer collageen proteolyse wanneer agressieve MDA-MB-231 cellen samen met U937 monocyten in DQ-collageen IV-bevattende culturen werden gekweekt. Van de nota, heeft onze mede culturen geen ondersteuning voor de veronderstelling dat cel-cel interactie mechanismen nodig zijn om aantasting van het collageen. Het eerder gesuggereerd dat de communicatie tussen de twee cel lineages was gemedieerd door secreted moleculen. Bovendien bevatte het supernatant geoogst van deze co cultuur assays oplosbare factoren die klieren acini gevormd door niet-getransformeerd MCF-10A cellen13ongeorganiseerd. Bleek dat agressieve en primaire BrC cellen uitgescheiden verhoogde niveaus van monocyt Chemotactische moleculen MCP-1, GM-CSF, en RANTES. Dus, we geschetst een 3D cultuur waarin cellen werden gescheiden in cel cultuur inzetstukken ter voorkoming van cel-cel interacties. Deze culturen werden gebruikt om aan te pakken van de indirecte communicatie tussen BrC cellen en monocyten. Voor deze tests, niet-agressieve en agressieve commerciële BrC cellijnen en primaire BrC cellen en drie verschillende soorten menselijke monocyten: commerciële U937 en THP-1 cellen en primaire monocyten (PMs) geïsoleerd uit perifeer bloed van gezonde donoren (alle monocyten werden gebruikt in een niet-geactiveerde staat) werden gebruikt. Verhoogde concentraties van inflammatoire cytokines IL-1β en IL-8 werden waargenomen worden verrijkt in co-cultuur. Ook bleek dat MMP-1 en MMP-2 MMP-10 werden eveneens verhoogd in het BrC cellen-monocyt co culturen, en daarmee versterken eerdere bevindingen14. In dit manuscript, wordt een punt-voor-punt workflow van primaire BrC cellen isolatie en testen in 3D culturen gepresenteerd samen met representatieve resultaten. Dit werk vormt een goed voorbeeld van het grote potentieel door in vitro 3D cel-systeem is bedoeld om specifieke aspecten van de biologie van de tumor te ondervragen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Monsters van BrC patiënten werden verkregen van de weefselbank van de Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, ziekenhuis Infantil de México Federico Gómez. Deze studie werd goedgekeurd door de wetenschappelijke, ethische en bioveiligheid Raadpleeg Raad van bestuur van het ziekenhuis Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética nl Investigación en Comité de Bioseguridad. Alle patiënten prospectief waren ingeschreven en werden geïnformeerd over de aard van de studie: die bereid zijn om deel te nemen een schriftelijke toestemming voor het specimen verzamelen ondertekend en werden behandeld volgens de ethische richtsnoeren en beste klinische praktijk van de instelling. De identiteit van de deelnemers was anoniem gemaakt voor de duur van de studie. Patiënten die opgenomen werden gediagnosticeerd invasief ductaal carcinoma, histologisch graad 2 en klinische fase II, met geen enkele eerdere neoadjuvante therapie voor resectie van het weefsel. Patiënten waren alle vrouwelijke leeftijd gemiddeld 56.8 jaar oud (bereik 42 tot en met 75)14.

1. 3D celculturen

  1. Zaad 0.1 x 106 MCF-10A cellen of primaire BrC cellen in 25 cm2 cultuur kolven met DMEM/F12 kweekmedium aangevuld met 5% paard serum 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, cholera-toxine 100 ng/mL, 0,5 µg/mL hydrocortison, 10 µg Mo/mL insuline en 20 ng/mL van de epidermale groeifactor (EGF). Zaad 0.1 x 106 commerciële BrC cellen, MCF-7 cellen en MDA-MB-231 cellen in 75 cm2 cultuur kolven met DMEM/F12 kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu.
  2. Na 48u, spoel de cel enkelgelaagde met 10 mL steriele 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Trypsinize van de cel enkelgelaagde met 3 mL 0,05% trypsine en 0,48 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C.) Voeg toe 200 µL van het overeenkomstige serum om te stoppen met trypsinebehandeling en 7 mL medium zonder supplementen. Resuspendeer de cellen door pipetteren en verwijderen van een aliquoot deel van 10 µL aan cellen in een kamer Neubauer tellen.
  3. In ieder putje van een 8-well kamer dia-systeem, verspreiden een 40 µL basis van zuivere ECME, gevolgd door een incubatie van 30 minuten bij 37 ° C.
  4. Plaats in elk putje, 800 cellen geresuspendeerde in 400 µL van DMEM/F12 (zonder fenol rood) aangevuld zoals in stap 1.1 maar met de volgende wijzigingen: Voeg 4 ng/mL EGF en 2% voor primaire BrC cellen en cellen MCF-10A, ECME; alleen toevoegen voor MCF-7 en MDA-MB-231, 2% ECME.
  5. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% culturen CO2 milieu. Vervang voedingsbodems elke 48 uur.
  6. Record morfologische veranderingen van cellen elke 24 h gedurende 15 dagen met een optische Microscoop. Voor het analyseren van de morfologie van primaire BrC cellen, MCF-10A en MDA-MB-231 cellen zijn goede referentie cellijnen voor voorbeelden van bestelde acinaire vorming en wanordelijke agressieve kanker-achtige structuren, respectievelijk.
  7. Verkrijgen van beelden van cellen in de heldere veld microscopie op 100 X en 200 X vergrotingsfactor en vergelijken van de morfologie van de cel met de verwijzing MCF-10A en MDA-MB-231 cellijnen (Figuur 1).

2. het verkrijgen van primaire kankercellen van de Tumor weefsel

Opmerking: Om op te halen gebruiken epitheliale cellen van de tumor weefsel van gereseceerd primaire tumoren van BrC patiënten met geen enkele eerdere neoadjuvante therapie; necrotische gebieden voorkomen en werken met een minimum van 0,5 cm3 van tumor weefsel.

  1. Spoel tumor weefsel met steriele 1 x PBS en mechanisch gedesag het met een scalpel in 1-2 mm fragmenten.
  2. Het verteren van het weefsel in een steriele 20 mL glazen ampul met dop gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) met 2 mL van de oplossing volgen: Meng 1 mg/mL collagenase type ik en 100 U/mL hyaluronidase in DMEM/F12 middellange met 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine , waarbij voortdurend wordt geroerd.
  3. De resulterende schorsing via gesteriliseerde stukken van tulle grote stukken onverteerd weefsel weg te filteren. Vervolgens filtert de celsuspensie door een gesteriliseerde 100 µm-porie-membraan.
  4. De cellen bij 430 x g gedurende 5 min op RT pellet en was ze tweemaal met steriele 1 x PBS. Cultuur primaire cellen in DMEM/F12 medium aangevuld met 5% paard serum, 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 100 ng/mL cholera-toxine, 0,5 µg/mL hydrocortison, 10 µg/mL insuline en 20 ng/mL van EFG. Vervangen van het medium elke 48 h. behouden bij 37 ° C in een bevochtigde 5 culturen % CO2 milieu.
  5. Ervoor zorgen dat de geïsoleerde cellen epitheliale cellen met een standaardprotocol van immunocytochemie14. Testen van drie epitheliale Markeringen: een panel van Cytokeratines (PanCK), mucin-1 (Muc-1) en epitheliale cel adhesie molecuul (EpCAM).

3. isoleren PM cellen uit perifeer bloed

  1. Extract ongeveer 40 mL van perifeer bloed van een gezonde vrijwilligers, verdunnen van het bloed in een verhouding van 1:3 met steriele endotoxine-gratis 1 x PBS en onderwerpen tot een dichtheid verlopende scheiding.
  2. Plaats in een conische buis, met een dichtheid van 1.077 g/mL 2 mL van een polysucrose en natrium diatrizoate medium. Zorgvuldig en langzaam overlay 8 mL van de verdunde bloed. Centrifugeer gedurende 30 min, 765 x g bij gebruik van de RT. de traagste versnelling-vertraging van de centrifuge.
    Opmerking: Na het centrifugeren, vier lagen zal worden gevormd van beneden naar boven: de rode bloedcellen pellet, de dichtheid kleurovergang middellange laag, de laag van de mononucleaire cellen (deze wordt weergegeven als een fijne witte ring) en de plasma laag.
  3. Zorgvuldig de mononucleaire cellaag ophalen uit het verloop met een steriele Pipet van Pasteur en spoel ze driemaal met 1 x PBS, telkens gevolgd door langzamer centrifugeren (430, 275 en 191 x g) gedurende 10 minuten op RT.
  4. Negatieve selectie protocollen gebruiken om te voorkomen dat activatie van cellen. Een voorbeeld van zo'n protocol is het volgende:
    1. Wassen van de mononucleaire cellen een keer met een wassen gebufferd oplossing (0,5% bovien serumalbumine, 2 mM EDTA in 1 x PBS). De cellen in een kamer Neubauer tellen en pas ze naar een dichtheid van 1 x 107 cellen/30 µL van een gebufferde oplossing.
    2. Voor elke 1 x 107 cellen, voegt u 10 µL van een FcR blokkeren reagens en 10 µL van een monocyt Biotine-antilichaam cocktail waarin anti-menselijke CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 en Glycophorin A (bij commerciële kits inbegrepen).
    3. Meng de cellen en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C. Voeg toe een extra 30 µL van het wassen gebufferd oplossing plus 20 µL van anti-Biotine microbeads (meegeleverd in de kit); Meng cellen en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C.
    4. Wash de cellen een keer met een gebufferde oplossing, centrifugeer bij 430 x g gedurende 5 min op RT, en resuspendeer in 1,5 mL gebufferd oplossing voor magnetische scheiding.
    5. Laden van de celsuspensie op een kolom vooraf gespoeld magnetische scheiding en voeg 7 mL gebufferd oplossing. Verzamelen van de monocyt-verrijkt breuk in een conische buis 15 mL, de cellen tellen en als niet onmiddellijk gekweekt, bevriezen monocyten bij een dichtheid van 2 x 106 cellen/1 mL van DMEM/F12 medium aangevuld met 50% FBS en 10% DMSO bij −80 ° C.
      Opmerking: Vermijd het gebruik van monocyten na meer dan 2 maanden te bevriezen, als hun levensvatbaarheid kan worden aangetast.
  5. Handhaven van culturen van PMs in DMEM/F12 medium aangevuld met 6% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine, bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu.
  6. Elke set van experimenten met behulp van PMs van ten minste twee verschillende donoren onafhankelijk, want bundeling monocyten van verschillende donoren leiden monocyt Activering tot kunnen uit te voeren.

4. invoering van 3D mede culturen

  1. 3D co culturen met indirecte interactie
    Opmerking:
    deze tests uitvoeren in 24-well forfaitaire-onder cultuur platen polycarbonaat cel cultuur inzetstukken met membranen van 0.4 µm poriegrootte. In deze test, kunnen zowel supernatant en cellen worden opgehaald aan het einde van het experiment.
    1. Cultiveren van 2 x 106 U937 en THP-1 monocyten in 10 mL van RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, 1% antibioticum/antimycotic, en het cultiveren van verse PMs in aangevuld DMEM/F12 medium (als aangegeven eerder in stap 3.5), bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu.
    2. 4 x 105 monocyten in 1 mL/goed van hun overeenkomstige medium plaat (aangevuld met 2 ECME en 2% FBS voor U937 en THP-1 monocyten, of 2% ECME en 6% FBS voor PMs).
    3. Plaats een invoegen in elk putje en Voeg 0,9 mL van de 4 x 10-5 BrC celsuspensie in het overeenkomstige medium (aangevuld met 2 ECME en 2% paard FBS voor commerciële cellijnen of 5% serum voor primaire BrC cellen). Vervang de helft van de totale media elke 48 uur.
    4. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 omgeving voor 5 dagen en het supernatant herstellen. Cellen met trypsinebehandeling ophalen als latere analyse wordt uitgevoerd.
    5. Besturingselementen van individuele celculturen met de respectieve media opnemen.
  2. 3D co culturen met directe interactie
    1. Label BrC cellen en monocyten met verschillende fluorescente kleurstoffen voordat de cultuur van de cel dat onafhankelijke sorteren van elke cel overdrachtslijn na cultuur voor analyse van mRNA en eiwit expressie. Gebruik verkrijgbare derivaten van cumarine en rhodamine die vrij de celmembraan van levende cellen doorheen. Een algemeen protocol voor labels is als volgt:
      1. Bereiden een monolayer van BrC cellen van belang (2 × 10-6 cellen in een maatkolf van 25 cm2 cultuur) en vervang het standaard medium met voldoende voorverwarmde werkoplossing van de fluorescente kleurstof (1:2, 000 van de fluorescente kleurstof in standaard basis medium zonder enige toeslag). Incubeer 30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu. De kleurstof-oplossing gecombineerd en spoel zachtjes met voldoende 1 x PBS. De PBS gecombineerd en voeg het standaard medium.
      2. Trypsinize van de cel enkelgelaagde met 2 mL van een oplossing van de trypsine en 0,48 mM EDTA 0,05% gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. Voeg 200 µL van FBS om te stoppen met trypsinebehandeling en 7 mL van de correspondent medium zonder supplementen. Resuspendeer de cellen door pipetteren. Neem een aliquoot deel van 10 µL aan cellen in een kamer Neubauer tellen. Ga verder met het protocol mede cultuur na het tellen van de cel.
      3. De cellen bij 430 x g gedurende 5 min op RT pellet (uitvoeren van dit eerste omdat monocyten in suspensie groeien). Verwijder supernatant en resuspendeer zachtjes cellen met 3 mL van een voorverwarmde werkoplossing van de fluorescente kleurstof (1:2, 000 van de fluorescerende kleurstof in een standaard basis medium zonder supplementen). Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu.
      4. De cellen opnieuw pellet, negeren de werkoplossing kleurstof en zachtjes resuspendeer met 5-7 mL 1 x PBS. Eens te meer pellet, negeren de PBS en resuspendeer de cellen in 5-7 mL van standaard medium. Neem een aliquoot deel van 10 µL celsuspensie aan cellen in een kamer Neubauer tellen. Ga verder met het protocol mede cultuur na het tellen van de cel.
    2. Stel de co cultuur als volgt:: verspreid genoeg ECME op de bodem van de put tot een gelijkmatige laag in ieder putje van een 4-well kamer dia systeem. Plaat 20 µL van een schorsing van de eencellige met 5 × 10-5 label BrC cellen per putje.
    3. Na 15-20 min van incubatie bij 37 ° C, voeg een suspensie van 2.5 x 105 label monocyten in 80 µL assay medium (aangevuld met 60% ECME).
    4. Toestaan van ECME te stollen gedurende 15-20 minuten bij 37 ° C.
    5. Voeg 1 mL van een 1:1 mix van BrC cellen en monocyt voedingsbodems.
    6. Incubeer co culturen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 omgeving voor 24u, 48 uur of 5 dagen voor het bijhouden van wijzigingen op verschillende tijdstippen.
    7. Degraderen ECM eiwitten om te herstellen van de cellen van de culturen. Gecombineerd en negeren van het medium, Voeg 0,5 mL 1 x PBS met 0,1% trypsine en 0,25% EDTA en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C. Na incubatie, Voeg 0,5 mL 1 x PBS met 10% FBS neutraliseren de trypsine en resuspendeer de cellen door krachtig pipetteren om te verkrijgen van een eencellige schorsing.
    8. Pellet cellen bij 765 x g gedurende 5 min op RT, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL 1 x PBS met 10% FBS. Herhaal deze stap eenmaal.
    9. De celsuspensie onverminderd fluorescentie-activated cell sorting (FACS) met het geschikte instrument. Ervoor zorgen dat de laatste populaties ten minste 95% zuiver).
    10. Na het sorteren, wassen van de cellen met steriele 1 x PBS, pellet (430 x g voor 5 min op RT) en resuspendeer in steriele 1 x PBS. Cellen kunnen worden verwerkt volgens specifieke protocollen voor isolatie van RNA of eiwit analyse.
    11. Herhaal elke assay driemaal, waaronder 3D culturen van elke afzonderlijke cel overdrachtslijn als besturingselementen.
  3. Directe interactie van 3D co culturen te beoordelen van de aantasting van het collageen
    1. 3D co celculturen vast zoals beschreven in stap 4.2, met de extra stap van het toevoegen van 32.5 µg/mL van type IV collageen aangeduid met fluoresceïne isothiocyanaat aan de ECME. De uiteindelijke concentratie van collageen IV in de ECME is 0,5%. Het groeien van de culturen in een 35-mm dekglaasje aan in een petrischalen geplaatst.
    2. Het verspreiden van een laag van 40 µL van ECME in de bodem van de petrischaal. Toestaan van ECME te stollen bij 37 ° C.
    3. Voeg 2.5 x 105 BrC cellen in 10 µL van het medium en laat van cellen te settelen.
    4. Voeg een suspensie van 1.25 x 105 U937 monocyten in 40 µL assay medium (aangevuld met 60% van de DQ-collageen IV label-ECME).
    5. Toestaan van ECME te stollen gedurende 15-20 minuten bij 37 ° C.
    6. Voeg toe 2 mL van een 1:1 mix van BrC cellen en monocyt voedingsbodems.
    7. Incubeer de co culturen voor 5 dagen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu. Vervang voedingsbodems elke 48 uur.
    8. De uitstoot van de fluorescentie in een confocale scanning microscoop analyseren en meten van de geïntegreerde optische dichtheid (IOD) per 50 µm2 van cultuur. IODs vergelijken van individuele culturen en de cultuur op moment nul (Figuur 2).

5. analyse van supernatant van 3D culturen samen met indirecte interactie

  1. Herstellen na 5 dagen van co cultuur, het supernatant van zowel de bovenste als de onderste compartimenten van de 3D co culturen en van de individuele cultuur van 3D-besturingselementen. Meng goed elke supernatant door pipetteren. Aliquot, en winkel het supernatant op −20 ° C tot gebruik (maximaal één maand).
    Opmerking: Supernatant bij −80 ° C houden als opslag langer dan een maand zullen.
  2. Analyseer het supernatant met multiplexing assay platformen, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) of kraal gebaseerde immunoassay na aanbevolen procedures van de fabrikant.
    Opmerking: Supernatant kunnen ook worden geanalyseerd door de westelijke vlek of geconcentreerd door specifieke porie filters te verkrijgen van grootte verrijkt eiwitfracties standaardinteracties16,17van de analyse van de zymography. Ook het supernatant als geconditioneerde media te gebruiken voor andere experimenten, zoals hieronder beschreven. Geconditioneerde media wordt meestal opgehaald uit een 5-daagse cultuur (Figuur 3).

6. de karakterisering van de effecten van supernatant van primaire BrC cellen op vorming van Acini en Acini structuur

  1. In ieder putje van een dia 8-well kamer systeem verspreid een 40 µL basis van ECME en laat het stollen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  2. Zaad 800 MCF-10A cellen per putje in 400 µL van aangevuld DMEM/F12-kweekmedium, zoals beschreven in stap 1,2.
  3. Voeg 400 µL van geconditioneerde media of aangevuld DMEM/F12 kweekmedium met 20 ng/mL menselijke recombinante IL-1β.
  4. Plaats de kamer dia in een glazen petrischaaltje met een 35 mm petrischaal gevuld met 2 mL PBS een vochtigheid omgeving te creëren.
  5. Vervang het media/supernatant elke 48 uur.
  6. Opnemen klierweefsel acini formatie elke 24u voor 14 dagen met een optische Microscoop.
  7. Na 14 dagen van cultuur, vlek acini met 100 µL van 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) met een concentratie van 100 nM in 1 x PBS te observeren celkernen. Incubeer gedurende 25 min op RT in constant roeren. Spoel driemaal met 1 x PBS voor 5 min, telkens in constant roeren op RT. Mount de voorbereidingen met een specifieke montage-medium voor fluorescerende vlekken. Zegel met transparante lak en onderhouden beschermd tegen licht bij 4 ° C.
  8. Het analyseren van de acini met een confocal microscoop opnamen van transversale stapels op verschillende diepten van de acini (Figuur 4A, B, C).
  9. Visualiseer verschillende cellulaire eiwitten in de acini met de juiste kleuring protocollen. Bijvoorbeeld, was E-cadherine om te beoordelen van cel naar cel adhesie, cel polariteit en/of lumen vorming18 (Figuur 4D) gekleurd.

7. migratie testen

Opmerking: Uitvoeren van de migratie testen van U937, THP-1 en verse PMs in 24-well forfaitaire-onder cultuur platen met polycarbonaat cel cultuur inzetstukken met membranen van 8 µm poriegrootte. Het werd eerder aangetoond dat de chemokines GM-CSF, MCP-1 en RANTES uitgescheiden bij hoge concentraties in individuele 3D culturen van de agressieve BrC-cellijnen werden gevonden. Het werd voorgesteld dat deze cytokines kritisch waren voor het aantrekken van monocyten op de site van de primaire tumor; Dit werd getest in migratie testen met behulp van de cytokines als chemoattractants.

  1. Cultuur U937, THP-1, of verse PMs zoals beschreven in stap 4.1.1.
  2. Spoel eenmaal elke toevoeging met 200 µL van RPMI 1640 zonder sera te hydrateren het membraan.
  3. Vul deze met 50 µL van koude ECME, plaats de inserts in een 24-well forfaitaire-onder cultuur-plaat en laat de ECME te polymeriseren gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  4. Voeg 180 µL van RPMI zonder FBS in de bovenste compartiment van de plaat. Voeg in de tweede kamer zonder borrelende 800 µL van RPMI aangevuld met ofwel 100 ng/mL van GM-CSF, MCP-1, of RANTES als chemoattractant. Gebruik medium zonder de cytokines als negatieve controle. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C om een chemokine verloop.
  5. Plaats 1.5 x 10,5 van elke soort monocyt in een steriele buis, twee keer wassen plaats met 1 mL 1 x PBS en centrifugeer bij 430 x g gedurende 5 min op RT. resuspendeer monocyten in 20 µL van RPMI zonder FBS, ze in de inserts , en meng zorgvuldig de celsuspensie (het eindvolume van het Hogerhuis is 200 µL).
  6. Toestaan dat de cel migratie naar vooruitgang gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu.
    Opmerking: Als monocyten niet-aanhanger zijn, zal trekkende cellen gewoonlijk in de media van de lagere afdeling.
  7. Verwijder de inserts, halen de media, en tellen van cellen op 2, 4, 6 en 24 h met gebruikmaking van een Neubauer-kamer of een stroom cytometer; Als alternatief, vooral als er geen cellen worden gevonden in de media, verwerven beelden van het onderste deel van de inserts met een digitale camera. De gemiddelde cel-graaf van 3 willekeurige velden (bij 100 X vergroting) wordt gebruikt voor de analyse (Figuur 5).

8. invasie Assays

Opmerking: Testen van de invasie van de BrC-cellen in 24-well forfaitaire-onder cultuur platen polycarbonaat cel cultuur inzetstukken met membranen van 8 µm poriegrootte uitvoeren. In onze oorspronkelijke studies was IL-8 een van de cytokines in het supernatant van de BrC cel/monocyt 3D co culturen verrijkt. Of deze cytokine nam deel aan de invasie van de cellijnen BrC werd getest.

  1. BrC cellen in 75 cm2 flacons uit te breiden. MCF-7, T47D, HS578T en MDA-MB-231 als beschreven in stap 1,2 (maar zonder ECME) en primaire BrC cellen zoals beschreven in stap 2.4.
  2. Zodra elke celcultuur polycarbonaat 8 µm-porie membraan invoegen met 200 µL van medium zonder sera (het medium gebruikt hangt af van de cellijn getest) wassen te hydrateren het membraan.
  3. Vul de invoegen met 50 µL van koude ECME (1:4 verdunning ECME:cold medium zonder FBS), plaatst u de inserts in een 24-well forfaitaire-onder cultuur-plaat en toestaan dat de ECME te polymeriseren gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  4. Zodra de ECME heeft polymeervorm, voeg 180 µL van de respectieve cel media zonder FBS. 800 µL media zonder FBS door de spleten van het donormateriaal toevoegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C om een verloop van IL-8.
    Opmerking: Vermijd het creëren van bubbels in de media. Gebruikte media is zonder FBS maar aangevuld met 100 ng/mL van IL-8, als chemoattractant of pure media zonder FBS, als negatieve controles.
  5. Verkrijgen van een totaal van 6 x 105 cellen van elke cel regel als volgt:
    1. Negeren van supernatant eens spoelen met 10 mL 1 x PBS en voeg 2 mL EDTA 0,05% trypsine/0,48 mM gedurende 2 minuten bij 37 ° C om de cellen los te maken. Voeg 4 mL aangevuld medium te stoppen met de reactie van de trypsine en resuspendeer krachtig door pipetteren.
  6. Neem een 10 µL aliquoot van de celsuspensie te tellen van de cellen in een Neubauer-kamer. Neem een hoeveelheid celsuspensie met 6 x 105 cellen. Centrifugeer bij 430 x g gedurende 5 min op RT, verwijder het supernatant en spoel cellen in 1 mL 1 x PBS. Herhaal de spoeling nogmaals.
  7. Resuspendeer de cellen in 20 µL van de respectieve media zonder FBS en plaats in de inzetstukken met 180 µL van de respectieve media zonder FBS. Meng zorgvuldig de celsuspensie door pipetteren.
  8. Toestaan dat de invasie van de cel aan de vooruitgang van 48 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 milieu.
  9. Na 48u, het inzetstuk verwijderen, verwijder het supernatant en spoel de bijsluiter eens grondig met 200 µL van 1 x PBS. Verwijder de overmaat van PBS met een katoen-tipped applicator.
    Opmerking: De invasieve cellen zijn meestal gekoppeld aan de andere kant van het invoegen zoals in dit geval waar cellen zijn aanhanger.
  10. De cellen herstellen door het plaatsen van het donormateriaal in een put van een 24-well forfaitaire-onder cultuur-plaat met 1 mL/goed voor 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten op RT. daarna, spoel de inserts eens met 1 x PBS.
  11. Vlekken van de cellen door het plaatsen van het donormateriaal in een put van een 24-well forfaitaire-onder cultuur-plaat met 1 mL/goed voor 1 x PBS met 0,2% kristalviolet voor 45 min op RT. zorgvuldig, met een katoen-tipped applicator verwijderen alle de ECME vanaf de bovenkant van het membraan , die bevat cellen die niet migreren, en spoelen nauwlettend met gedestilleerd water om te voorkomen dat de afschaffing van vaste invasieve cellen.
  12. De binnenvallende cellen tellen door het observeren van de onderkant van het donormateriaal onder de omgekeerde Microscoop. De gemiddelde cel-graaf van 3 willekeurige velden (bij 100 X vergroting) wordt gebruikt. In gevallen waarin de cellen als clusters zijn binnengedrongen en zijn moeilijk te tellen individueel, verwerven beelden met 3 willekeurige velden (op 100 X vergroting) met een digitale camera. Analyseren van de beelden met software voor beeldanalyse en gebruik de IOD te kwantificeren cel invasie (Figuur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologische analyse van BrC cellen in 3D culturen:

De morfologie van primaire BrC cellen groeien in 3D culturen op lage en hoge dichtheden werd bestudeerd over 5 dagen. Gedurende de eerste 48 uur, cellen voldoen aan de ECME en onderhouden van een lage dichtheid. Op dit punt van tijd, kan het duidelijk worden gewaardeerd dat cellen een langwerpige vorm van de spindel-achtige, sommige met twee of meer lang cytoplasmatische projecties en presenteren zonder duidelijk cel contactpersonen wordt weergegeven. Na 5 dagen van cultuur, cellen zich verspreid met behoud van hun aanvankelijke morfologie. Bovendien, zij vormden structuren die lijkt op netten zonder een specifieke structurele organisatie, en verschijnen opgestapelde omhoog met geen contact-remming. Een vergelijking met niet-getransformeerd MCF-10A cellen werd gemaakt, die bolvormig structuren die lijkt op klierweefsel acini vormen. Deze cellen geven een kenmerkende morfologie van afgeronde goed met scheidingstekens en georganiseerde structuren weer in homogene grootte (van ongeveer 50 µm). Integendeel, delen primaire BrC cellen een veel nauwere gelijkenis met agressieve BrC cellen MDA-MB-231 (Figuur 1).

Analyse van cel naar cel directe interacties en aantasting van de collageen:

We ontwierpen een 3D co cultuur model te beoordelen van het volgende: cel morfologie, aantasting van het collageen, cel migratie, en of er een directe interactie tussen BrC cellen en monocyten in de co cultuur. Na 5 dagen, zowel MCF-7 en MDA-MB-231 commerciële BrC cellen vormen ongeorganiseerd aggregaten in 3D culturen, maar ze verschillen in hun morfologie. Agressieve cellen MDA-MB-231 formulier aggregaten met langwerpige vormen met sommige cellen de neiging te scheiden van de rest, terwijl niet-agressieve MCF-7 cellen aggregaten waar cellen behouden afgeronde vormen en ze lijken vormen te zijn meer dichtbevolkte gecomprimeerde (Figuur 2 A, B). DQ collageen IV werd opgericht om te visualiseren Proteolytische afbraak (groen), met beide culturen van de BrC fluorescerende activiteit vertonen. Om te beoordelen kwantitatief proteolytic activiteit, werd groene fluorescentie gemeten als IOD van zes 50 µm2 velden. Een vergelijking werd gemaakt tussen individuele 3D culturen van MDA-MB-231 cellen en co culturen met U937 monocyten. Statistisch significante toename van proteolyse in de co cultuur (Figuur 2C) werd waargenomen. Ook een analyse van de confocal microscopie van seriële transversal stacks elke 10 µm van de MDA-MB-231 en U937 monocyten co cultuur werd uitgevoerd (Figuur 2D). Deze analyse kwam naar voren dat U937 monocyten gemigreerd naar agressieve cellen MDA-MB-231 met een paar monocyten bereiken van de laag van BrC cellen. Het was echter duidelijk dat cel directe interactie sites niet noodzakelijkerwijs met gebieden van hogere proteolytic activiteit samenvalt waren: in plaats daarvan gebieden van collageen afbraak werden gelijkmatig verspreid in de cultuur, wat leidt tot de gevolgtrekking dat collageen afbraak was het gevolg van indirecte communicatie gemedieerd door secreted factoren. Daarom was het model 3D co cultuur aangepast plaatst u de cellen in verschillende compartimenten gescheiden door een poreuze membraan voor de cel-cel communicatie op basis van secreted factoren en voorkomen mobiele labeling en sorteren na cultuur.

Analyse van IL-1β in supernatant van 3D culturen:

Werken met de indirecte interactie 3D culturen, het supernatant van individuele primaire BrC zijn culturen en hun culturen 5 dagen mede met PM geoogst. Deze supernatant werden onderworpen aan de gelijktijdige analyse van 18 cytokines en 5 MMP met behulp van commerciële kits en een instrument dat speciaal voor deze analyse. Van alle analyten getest, werden aanzienlijk verhoogde niveaus van IL-1β en IL-8 waargenomen in de primaire BrC cel-monocyt co culturen, beide cruciale inflammatoire cytokines die eerder geassocieerd met maligne progressie15, zijn 18 , 19 , 20 (Figuur 3; resultaten voor IL-1β). In het volgende voorbeeld is een ander soort analyse dat 3D culturen toestaan om na te bootsen het communicatienetwerk dat de tumor communicatie vormen.

Karakterisering van supernatant en Acini structuur:

Op basis van de 3D experimenteel systeem ontwikkeld door Debnath, Muthuswamy en Brugge7, waar MCF-10A werden opgericht als een model van de mechanismen die zijn gekoppeld aan oncogenese, evaluatie van of de secreted factoren uit de primaire BrC-cel supernatant beïnvloed de vorming van de MCF-10A 3D acini-achtige structuren, vergelijkbaar met de activiteit waargenomen na transductie van virale of cellulaire oncogenen7,21 werd uitgevoerd. MCF-10A cellen werden verbouwd met twee verschillende supernatant van twee primaire BrC cellijnen te observeren lumen vorming (als een zekere mate van weerstand tegen anoikis). De spheroïden werden beoordeeld door confocale microscopie transversale bezuinigingen op 0, 25, 50, 75 en 100% diepte op dag 14, en in beide gevallen werd geconstateerd dat MCF-10A cellen ontdoken anoikis (gemeten door het tellen van het aantal centrale (luminal) cellen in de acini (Figuur 4 B, C)). Daardoor, MCF-10A cel acini die worden gevormd met de geconditioneerde media van BrC cellen, niet een well-formed holle lumen, in tegenstelling tot MCF-10A die worden geteeld met zijn standaard kweekmedium (zoals beschreven in stap 1,2) (Figuur 4A). In de 3D-co cultuur systeem, was de IL-1β zeer uitgescheiden; Daarom waren de MCF-10A-cellen ook geteeld met menselijke recombinante IL-1β-18. Figuur 4 D toont een confocale microscopie transversale knippen op 50% diepte van de acini in aanwezigheid van IL-1β (lagere panelen), en blijkt dat deze cytokine verleent eveneens de resistentie tegen anoikis. Dus, oplosbare factoren uitgescheiden door primaire BrC-cellen, zoals IL-1β, bevordering van het voortbestaan van niet-getransformeerd MCF-10A cellen die verliezen van ECM interacties, een kenmerk van invasieve kankers.

3D co culturen bevorderen een ontstekingsreactie die samenhangen met migratie van monocyten en invasie van kankercellen:

Wij eerder aangetoond dat primaire BrC cellen in 3D cultuur hoog basale niveau van pro-inflammatoire chemokines bekend voor het aantrekken van monocyten14afscheiden. Dus, we de migratiestromen capaciteiten van monocyten in reactie op de chemokines gevonden verrijkt in de geconditioneerde media van de BrC-cellen geanalyseerd. De trekkende capaciteit van commerciële monocyten U937 en THP-1 en verse PMs werd geëvalueerd in reactie op drie verschillende chemokines: GM-CSF, MCP-1 en RANTES. U937 en THP-1 monocyten konden migreren naar aanleiding van GM-CSF en MCP-1, met U937 als de meest responsieve, terwijl beide monocyten had een leeg antwoord op RANTES. Bovenal toonde PMs een basale trekkende hoogactieve en de meest krachtige reactie op MCP-1 (Figuur 5). IL-8 werd ook verrijkt na de 3D co cultuur van primaire BrC cellen en monocyten. Dus, we geanalyseerd of IL-8 de capaciteit van de invasie van commerciële en primaire BrC cellijnen wijzigt. De commerciële agressieve BrC cellijnen (HS578T en MDA-MB-231) binnengevallen in reactie op IL-8, terwijl de niet-agressieve (MCF-7 en T47D) deed niet binnenvallen. Verrassend, waren de primaire BrC cellen meer invasief dan commerciële agressieve BrC cellijnen in reactie op IL-8 (Figuur 6A, juiste panelen). In sommige gevallen, binnenvallen cellen als clusters en daarom IOD analyse was noodzakelijk (Figuur 6B).

Figure 1
Figuur 1 : Representatief beelden van BrC cellen in 3D culturen. Van links naar rechts: controle op niet-getransformeerd MCF-10A cellen met vorming van karakteristieke klierweefsel acini, morfologie, goed met scheidingstekens cel contacten, afgerond en georganiseerd structuren van homogene grootte (ongeveer 50 µm op gemiddelde, optische vergroting van 200 X). Middelste panelen tonen primaire BrC cellen gekweekt op lage dichtheid (2 dagen) en hoge dichtheid (5 dagen). Cellen voldoen aan de ECME en onderhouden van een lage dichtheid bij vroege tijd punten. Het is duidelijk dat de cellen een langwerpige vorm van de spindel-achtige, sommige met twee of meer lang cytoplasmatische projecties, en geen duidelijk cel-cel adhesie presenteren. Aan de andere kant, high-density cellen op latere tijdstippen gevormd structuren die lijkt op netten zonder een specifieke structurele organisatie. Deze cellen verscheen opgestapelde omhoog het tonen geen contact-remming. Een besturingselement voor commerciële MDA-MB-231 cellen na 5 dagen in 3D cultuur wordt weergegeven; deze agressieve BrC cellen delen een veel nauwere gelijkenis met primaire BrC culturen (optische vergroting 100 X). Schaal bar vertegenwoordigt 50 µm. 800 cellen waren bezaaid aan het begin van het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Analyse van de aantasting van het ECM. Niet-agressieve MCF-7 cellen gekleurd met een gele fluorescerende (A) en agressieve MDA-MB-231 cellen gekleurd met een rode fluorescerende (B) gekweekt voor 5 dagen in 3D voorwaarden; 0,5% van het groene fluorescentie-geëtiketteerden collageen IV werd opgericht om te visualiseren ECM afbraak. In A en B, de bovenste linker foto's vertegenwoordigen de niveaus van de aantasting van het collageen, de bovenste rechts panelen vertegenwoordigen de optische foto's, de linker benedenhoek vertegenwoordigen de BrC-cellen en de onderste juiste panelen tonen de fusie van fluorescerende en optische beelden. Voor A en B, worden de optische vergroting van 200 X en schaal staaf-van-100 µm gepresenteerd. (C) representatieve beelden van ECM proteolyse (groen) in 3D cultuur van afzonderlijke MDA-MB-231 cellen als besturingselement, in vergelijking met ECM proteolyse van 3D co cultuur van MDA-MB-231 met U937 monocyten. Schaal staven 10 µm. De IOD (geïntegreerde optische dichtheid) van zes 50 µm2 velden uit elke voorwaarde werd gemeten. Het gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) van de ondermeer worden gepresenteerd; twee sterretjes vertegenwoordigen een statistisch significant verschil met p < 0,01 (Mann-Whitney-test). (D) directe interactie van MDA-MB-231 cellen (grijze schaduw massa) met fluorescently gekleurd U937 monocyten (oranje); groene fluorescentie komt overeen met proteolyse. Seriële segmenten werden gegenereerd elke 10 µm door confocale microscopie de lokalisatie en directe interacties tussen beide cellijnen aan te pakken. Optische vergroting van 200 X; schaal staven 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: IL-1β-concentratie wordt verhoogd in 3D co culturen. Een representatief resultaat voor IL-1β levels (pg/mL) in supernatant van acht (PC1-8) primaire BrC cellen, individueel gekweekt in 3D (3D) en vergeleken met hun 3D co culturen met PM (CC). Een controle van PM in individuele 3D cultuur was opgenomen voor vergelijking (PM). Resultaten werden gehaald uit een grotere multiplexing analyse, waar verschillende cytokines in elk monster gelijktijdig werden gedetecteerd door middel van een immunodetection gebaseerde techniek beschikbaar als een commerciële kit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Secreted factoren uit primaire BrC cellen induceren weerstand tegen anoikis in niet-getransformeerd MCF-10A cellen. MCF-10A cellen werden gekweekt in 3D voorwaarden met standaard voedingsbodems (kolom A en de bovenste panelen van D), waarin kan worden geconstateerd dat de acini presenteren typische holle lumen (25-75% diepte gemarkeerd met een rood vierkantje); toen MCF-10A cellen waren gegroeid met twee verschillende supernatant uit twee primaire BrC culturen (kolom B en C), zijn lumen niet hol maar gevuld met cellen ter aanduiding van de weerstand tegen anoikis. Evenzo, wanneer MCF-10A cellen werden gekweekt in 3D voorwaarden toevoegen van menselijke recombinante IL-1β (20 ng/mL), geen holle lumen kan worden gewaardeerd op 50% diepte confocale microscopie secties van de acini (lagere panelen van D). De juiste ovale karikatuur vertegenwoordigt de confocal microscopie secties die zijn aangebracht op 0, 25, 50, 75 en 100% diepte van de acini. Beelden tonen kernen gekleurd met DAPI (blauw) en E-cadherine in het groen. Optische vergroting van 200 X, schaal staven 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Trekkende capaciteit van monocyten. Representatieve beelden van de trekkende capaciteit van U937, THP-1 en PM in reactie op de GM-CSF, MCP-1 en RANTES. Besturingselementen zonder chemokine zijn opgenomen (eerste kolom van links naar rechts). De nummers onder de foto's geven het aantal migrerende cellen in elke voorwaarde; U937 en THP-1 monocyten waren vooral inspelen op de GM-CSF en MCP-1, terwijl PM een hoge migratiedruk capaciteit per se toonde, en de meest responsieve cellen aan MCP-1 waren. Optische vergroting 100 X; schaal bars vertegenwoordigt 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Agressief en primaire BrC cellen binnen te vallen naar aanleiding van IL-8. A. invasie testen met twee niet-agressieve (MCF-7 en T47D), twee zeer agressief (HS578T en MDA-MB-231) BrC cellijnen en één primaire BrC cultuur in reactie op IL-8 gebruikt als chemoattractant. Bovenste panelen komen overeen met besturingselementen zonder chemokine tonen geen invasie, lagere panelen tonen de reactie op IL-8, met zeer agressieve BrC cellen en primaire BrC cellen invasie door de membraan van de cel cultuur invoegen. B. voorbeeld van cellen die in clusters binnenvallen; in deze gevallen, meting van invasie gebeurt met een programma van de analyse van het beeld om te bepalen van de invasie in termen van IOD (geïntegreerde optische dichtheid) per gebied. De nummers onder de foto's staan voor het aantal binnenvallende cellen in elke conditie. Optische vergroting 100 X; schaal staven 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitheliale cellen groeien in een 3D ruimtelijke bevleesdheid en hun interactie met de ECM-eiwitten is cruciaal voor de weefsel homeostase. Veel kanker studies zijn gebaseerd op cellen gekweekt in monolayers (2D) en hoewel ze kritische geweest tot begrip van vele aspecten van tumor ontstaan en progressie, monolayers doen niet recapituleren de kenmerken die de ECM oplegt aan cellen, voor aanleg: beperken van de proliferatie, overleving van de cel adhesie-afhankelijke apicale-basolaterale polariteit, ECM remodelleren, celdifferentiatie, enz. Nog belangrijker is, niet alleen de interactie tussen de tumorcellen en ECM zijn essentieel voor de progressie van kanker, maar ook de communicatie tot stand gebracht tussen tumor en niet-tumorcellen, zoals immuuncellen. De protocollen die hier geboden vergemakkelijken het begrip van de interacties tussen de immuun cellen en kankercellen binnen de omgeving door de ECM, bevorderd de ontstekingsreactie door deze interacties en hoe deze ontstekingstoestand maken een positieve lus chemoattraction van monocyten en meer invasie van kankercellen bevorderen.

Een groot voordeel van het gebruik van ECME is dat het biedt een biologische steiger, geschikt om te vervullen, een verscheidenheid van experimentele 3D modellen22. Het is verrijkt met ECM eiwitten zoals laminin, collageen IV, entactin, heparan sulfaat Proteoglycaan en groeifactoren, die in vivo te maken met epitheliale cellen krijgen zouden. Een nadeel is dat omdat het komt uit lysates van lymfkliertest sarcomen, de concentratie van hun onderdelen tussen verschillende partijen varieert. Dus, is het vaak nodig om te karakteriseren van verschillende percelen om meer homogene gegevens te verkrijgen. In het laboratorium, elke nieuwe partij wordt getest op twee manieren: 1) door de vorming van de juiste acini van MCF-10A cellen te evalueren, en 2) bij de beoordeling van de invasiviteit van BrC cellijnen van gevestigde invasieve capaciteit. Een andere optie is om te werken met andere producten, steigers, zoals Hydrogel, die een synthetische nanofiber peptide steiger is. De stijfheid van de 3D cultuur kan worden gecontroleerd door de concentratie van Hydrogel23,24passen. Nog belangrijker is, is dit systeem kan worden toegepast om te bestuderen de interactie tussen elk type van neoplastische cel en hematopoietische of niet-hematopoietische cellen. Het zou zelfs mogelijk zijn om te ontwerpen meer complexe systemen met behulp van meer dan twee verschillende cel lineages. Een belangrijk voordeel van de 3D-modellen is dat ze onderzoek naar de morfologie van de cel en de cel organisatie gevormd door ECM interacties, die worden veranderd tijdens oncogene transformatie toestaan. Ook een oncogene functies zoals de aantasting van het Proteolytische, kan studeren en of cellen in eerste instantie in verschillende lagen van het signaal van de cultuur met elkaar geplaatst ter bevordering van directe interactie/communicatie. Andere cel lineages kunnen bovendien worden aangeduid met verschillende fluorochromes, zodat zij geïsoleerd na het experiment om specifieke vragen te stellen aan elk afzonderlijke celtype worden kunnen, bijvoorbeeld met behulp van, RNA en/of eiwit expressie analyse13. Hier, wordt de secretie van de IL-1β aan het medium in primaire BrC cellen/PM co culturen getoond, ondersteuning van een mogelijke sleutelrol van deze cytokine in de indirecte communicatie tussen tumorcellen en monocyten die als trigger fungeert kwaadaardige progressie.

Een ander essentieel experimentele protocol in het laboratorium is de analyse van de acini formatie in 3D culturen van niet-getransformeerd MCF-10A cellen. Deze bepaling werd gebruikt om te testen voor virale en cellulaire oncogen activiteit, en om te testen hoe de tumor-communicatie functie aan agressieve kanker gerelateerde invloeden. Bijvoorbeeld, tijdens de normale ontwikkeling van de acini, luminal centrale cellen verliezen contact met de basale membraaneiwitten (geleverd door ECME) triggering mechanismen van celdood, bekend als anoikis. Het werd waargenomen dat zowel het supernatant van primaire BrC cellen of recombinante IL-1β MCF-10A cellen te anoikis resistentiebevorderende. Omdat een hoge concentratie van IL-1β wordt gepromoveerd op BrC cel-monocyt interactie, ondersteunt deze constatering dat de stroma tumor een integraal onderdeel van de tumor progressie naar zeer agressieve stadia is.

De protocollen van het migratie en invasie hier beschreven vormen nuttige 3D aanvullende tests waarin wij de mogelijkheid om cellen te migreren of bij binnenvallen in reactie op prikkels afgeleid van het stroma tumor kunnen steunen. Het bleek dat chemokines (GM-CSF en MCP-1) gevonden in verhoogde concentraties in 3D culturen van primaire cellen van BrC migratie van U937, kan bevorderen THP-1 en PMs, ter ondersteuning van de mogelijkheid van agressieve tumorcellen ter bevordering van een pro-inflammatoire communicatie. Bovendien, IL-8, dat wordt ook gevonden in verhoogde concentratie in het supernatant uit co culturen van BrC cellen/monocyten, bevorderd grotere invasie van zowel commerciële agressieve BrC-cellen (HS578T en MDA-MB-231) en primaire BrC cellen.

Met betrekking tot de toestand van cellen is het belangrijk om te werken met primaire BrC cellen voordat ze tien passages om te profiteren van de piek van hun verspreiding en voorkomen van potentiële na isolatie genetische en epigenetische veranderingen ten gevolge van in vitro bereiken cultuur. Een ander essentieel aspect bij het werken met primaire cellen is ter bevestiging van hun identiteit na isolatie. We een paneel van biomarkers gebruikt om te bepalen hun identiteit epitheliale bloedlijn, waaronder PanCK, Muc-1 en EpCAM (opgegeven in stap 2.5). Ook is het beter gebruikt verse PMs, waarvan elke partij wordt getest verzekeren dat ze het dezelfde stadium van differentiatie zijn. Elke nieuwe partij gebruikt presenteerde het fenotype CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68neg CD16neg, hetgeen overeenkomt met niet-geactiveerde onvolwassen monocyten. Nog belangrijker is, vermengen wij niet monocyten van verschillende donoren, als de resultaten in monocyt activering mengen. In plaats daarvan we onafhankelijk getest BrC mede culturen met monocyten van ten minste twee verschillende donoren.

3D cultuur systemen nog de beperking dat slechts enkele elementen van de tumor biologie op betrouwbare wijze kunnen worden gemodelleerd. Een nieuw alternatief is de meer complexe 3D-modellen van organoids, die gebaseerd zijn op de uitbreiding en differentiatie van stamcellen in vitro. Organoids ook ontwikkelen zeer georganiseerde epitheliale structuren. Voorbeelden zijn de maag 25,26, lever 27en nier organoids28. Toch blijven de organoid modellen voor elke menselijke orgel te bereiken; Bovendien vereisen ze veel meer complexe en dure experimentele omstandigheden.

Kortom, hier we beschrijven in detail een werkstroom van tests: vanaf van de isolatie van tumorcellen van BrC patiënten, hun inflammatoire vermogen testen in een ECME-gebaseerde 3D cultuur model, testen hoe dat inflammatoire communicatie dient hen te werven extra ontstekingscellen, zoals monocyten, om ten slotte de communicatie tussen zowel soorten cellen, en hoe deze mededeling verder bevordert een inflammatoire communicatie die progressie naar meer agressieve kanker stadia bevordert te analyseren. Daarnaast beschrijven we de morfologie en het fenotype van primaire BrC cellen. In de toekomst studies, op zal zitten interessant voor testen van andere ontstekingscellen of zelfs het testen van de communicatie tussen de cellen van de BrC en meerdere cellen, vaak gevonden in het stroma tumor. Deze 3D culturen van meerdere cellen zorgt voor een groter beeld van wat er biologisch in vivo tijdens progressie van kanker gebeurt. Vergelijkingen tussen in vitro gegevens en de patiënt klinische uitkomst zal het identificeren van mogelijke mechanismen die een hogere impact op kanker agressiviteit hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE Project nr. 233061 naar Ezequiel M. Fuentes-Pananá en door Fondo de Apoyo a la Investigación, ziekenhuis Infantil de México Federico Gómez (projectnummer HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez nb is een promovendus from Programa de Doctorado nl Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM) en ontvangen fellowship 231663 van CONACYT. E-S NA, ook erkennen dat de financiële steun van het Mexicaanse Instituut voor sociale zekerheid (IMSS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95, (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8, (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18, (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3, (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2, (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11, (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65, (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16, (1), 118-126 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics