Análisis de la comunicación entre monocitos y las células de cáncer de mama primario en una matriz extracelular extracto (ECME)-sistema tridimensional basado en

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Cancer Research

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Summary

Aquí, describimos un método de cultivo tridimensional para analizar la morfología de primario de mama las células cancerosas, así como para estudiar sus interacciones directa e indirecta con los monocitos y los resultados tales como la degradación de colágeno, reclutamiento de células inmunes de la célula invasión y la promoción de la inflamación relacionada con el cáncer.

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Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

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Abstract

Incrustado en la matriz extracelular (MEC), células epiteliales normales y neoplásicas comunican íntimamente con las células hematopoyéticas y no hematopoyéticas, así influir en gran medida resultado de homeostasis y enfermedad de tejido normal. En el cáncer de mama, los macrófagos asociados a tumor (TAMs) juegan un papel crítico en la progresión de la enfermedad, metástasis y recurrencia; por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de monocito chemoattraction el microambiente del tumor y sus interacciones con las células del tumor es importante para controlar la enfermedad. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de un sistema tridimensional (3D) de cocultivo de células de mama cancerosas (BrC) y monocitos humanos. BrC células producen altos niveles basales de la regulada en la activación, célula T normal expresado y secretado (RANTES), monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (G-CSF), mientras que en co-cultivo con monocitos, citoquinas proinflamatorias interleucina (IL) -1 beta (IL-1β) y IL-8 se enriquecieron con metaloproteinasas de matriz (MMP) -1, MMP-2 y MMP-10. Este microambiente del tejido conectador tumoral promovido resistencia a anoikis en MCF-10A 3D acinos-como las estructuras, chemoattraction de monocitos y la invasión de células agresivas de BrC. Los protocolos aquí presentados proporcionan una alternativa asequible para estudiar la comunicación intra-tumor y son un ejemplo del gran potencial que ofrecen sistemas 3D de la célula in vitro para interrogar a características específicas de la biología del tumor relacionado con tumor agresión.

Introduction

Biología del tumor es mucho más intrincado que pensó previamente. Creciente evidencia muestra que las células tumorales son más que un simple bulto de células proliferación incontroladas; por el contrario, diferentes células neoplásicas parecen realizar diferentes funciones mostrando la alta organización y jerarquía en el tumor1. Las células del tumor están también en íntima comunicación con las células no transformadas: macrófagos, fibroblastos, linfocitos, adipocitos, células endoteliales, entre otras células están todos inmersos en el andamio proteínas y polisacáridos que constituyen el ECM. Numerosas interacciones directas e indirectas se establecen entre las células transformadas y no transformadas y con el ECM, que ejerce una poderosa influencia sobre la enfermedad resultado2,3. En el caso específico de BrC, es particularmente importante disecar la comunicación de las células de BrC con TAMs, teniendo en cuenta que se ha encontrado TAMs que juegan un papel crítico en la evolución del tumor, aumentando el riesgo de metástasis y recidiva de la enfermedad4 ,5.

Para analizar las interacciones intra tumoral y sus posibles resultados, nuevo 3D en vitro se han desarrollado en base a la utilización de extractos de ECM que proporcionan un microambiente mucho más complejo, más cercano a la realidad de la biología del tumor, en comparación a las culturas de célula monocapa convencional en el cual las células crecen pegadas al plástico. Petersen y Bissell6 proporciona el primer modelo de no malignas y células epiteliales mamarias malignas cultivan sobre una membrana basal de rico en laminina y fueron los primeros en describir las estructuras 3D organotypic que discriminan no malignas humanos células epiteliales de la mama de sus homólogos malignos. Una década más tarde, el modelo desarrollado por el Debnath, Muthuswamy, y Brujas7,8,9 proporciona una herramienta valiosa para aclarar las vías biológicas durante la transformación maligna de los acinos glandulares, tal como formación de acinos grande debido a la proliferación incontrolada, deslocalización de las proteínas de la ensambladura apretada como evidencia de la polarización celular deteriorada y la pérdida del lumen de los acinos como resultado de la resistencia celular a la anoikis, un tipo de muerte celular programada ocurre en células dependientes de anclaje cuando se separan del ECM circundante. Los modelos de Sameni, Jedeszko y Sloane se han centrado en imágenes actividad proteolítica por células, que está estrechamente relacionada con la invasividad, otro rasgo fundamental de la malignidad de tumor10,11,12. Estos modelos se basan en las matrices de proteína mezclados con los substratos de la proteína de fluorescencia apaga diferentes (gelatina de DQ, DQ-colágeno I y DQ-colágeno IV), en que las señales fluorescentes son indicativos de la degradación proteolítica de colágeno. Modelos 3D se utilizan también para estudiar propiedades de la célula de vástago de ambos no transformado y las células del tumor, en que celda agregados, también llamados esferoides, pueden ser cultivados en suspensión o en proteínas ECM como interrogando por mecanismos de diferenciación celular, asimétrica división celular, adhesión de célula a célula y célula motilidad13,14. Ensayos de invasión que la prueba de la agresividad intrínseca del tumor y la identificación de las moléculas que sirven como atrayentes durante el proceso invasor15. En generales, 3D modelos representan una diversificación asequible de en vitro cultivo celular que reflejan más de cerca la morfogénesis normal y oncogénicos de los tejidos.

Hemos diseñado un sistema de cocultivo celular 3D basado en los modelos antes mencionados7,10,11, utilizando ambos humanas líneas celulares BrC comerciales de conocido potencial agresivo (tipos luminales y triple negativo) y primaria células explantadas de pacientes de BrC. En primer lugar se desarrolló un modelo donde no agresivos (MCF-7) o agresivos (MDA-MB-231) BrC las células fueron cultivadas conjuntamente con U937 monocitos en un extracto de la matriz extracelular (ECME)-sistema basado en 3D que permite las interacciones célula-célula directa. Estas culturas Co fueron utilizadas para determinar cómo la comunicación entre estos linajes dos celulares influyó en la transcripción de un conjunto de genes relacionados con la conducta agresiva de cáncer. Se observó un aumento significativo de ciclooxigenasa-2 (COX-2) transcripción que coincidió con un aumento de la producción de uno de sus productos, prostaglandina E2 (PGE2), un hallazgo que puso de relieve el papel de la inflamación en la progresión del cáncer. Mayor transcripción de MMP también observó que correlaciona con una mayor proteólisis de colágeno cuando agresivo células MDA-MB-231 fueron cultivadas conjuntamente con U937 monocitos en culturas que contiene DQ-colágeno IV. De nota, nuestros co-cultivos no apoya el supuesto de que los mecanismos de interacción célula-célula son necesarias para la degradación de colágeno. Más bien, sugirió que la comunicación entre los linajes de dos células fue mediada por moléculas segregadas. Además, los sobrenadantes de estos ensayos de co-cultivo contienen factores solubles que desorganizan acinos glandulares formados por las células no transformadas MCF-10A13. Se constató que de agresivo y las células primarias de BrC secretadas niveles elevan de moléculas quimiotáctica de monocitos MCP-1, GM-CSF y RANTES. Por lo tanto, delineamos una cultura 3D en el que las células fueron separadas en célula cultura insertos para evitar las interacciones célula-célula. Estas culturas fueron utilizadas para abordar la comunicación indirecta entre monocitos y las células de la BrC. Para estos ensayos, no agresivos y agresivas comercial BrC las líneas celulares y las células primarias de BrC y tres tipos diferentes de monocitos humanos: las células U937 y THP-1 comerciales y primarios monocitos (PMs) aisladas de sangre periférica de donantes sanos (todos monocitos se utilizaron en un estado desactivado) fueron utilizados. Aumento de las concentraciones de citoquinas inflamatorias IL-1β y IL-8 fueron observado para ser enriquecido en co-cultivo. Asimismo, se encontró que MMP-1, MMP-2 y MMP-10 también se incrementaron en el BrC co-cultivos de células monocitos y así refuerzo anterior resultados14. En este manuscrito, se presenta un flujo de trabajo punto por punto de aislamiento primario de las células de BrC y pruebas en 3D culturas junto con resultados representativos. Este trabajo constituye un buen ejemplo del gran potencial que ofrecen sistemas 3D de la célula in vitro para interrogar aspectos específicos de la biología del tumor.

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Protocol

Se obtuvieron muestras de pacientes de BrC desde el Banco de tejidos de la Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Este estudio fue aprobado por la científica, ética y bioseguridad revisan tablas del Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, en Comité de Ética Investigación y Comité de Bioseguridad. Todos los pacientes se incluyeron prospectivamente y fueron informados sobre la naturaleza del estudio: aquellos que estén dispuestos a participar firmaron un consentimiento informado antes de la recogida de la muestra y fueron tratados según las pautas éticas y la mejor clínica de la institución. La identidad de los participantes fue anonimizada para la duración del estudio. Pacientes incluidos fueron diagnosticados con carcinoma ductal infiltrante, grado histológico 2 y etapa clínica II, con no anterior neoadyuvante antes de la resección de tejido. Pacientes eran toda la hembra edad media 56,8 años (rango 42 a 75)14.

1. cultivos celulares 3D

  1. Semilla 0.1 x 106 MCF-10A las células o las células primarias de BrC en frascos de cultivo 25 cm2 con medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 5% caballo suero, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, toxina del cólera 100 ng/mL, hidrocortisona 0.5 μg/mL, 10 μg/mL la insulina y 20 ng/mL de Factor de crecimiento epidérmico (EGF). Semilla 0.1 x 106 comercial BrC células, las células MCF-7 y MDA-MB-231 células en 75 cm2 cultura matraces con medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL. Incubar a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  2. Después de 48 h, lavar la monocapa de células con 10 mL de estéril 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Trypsinize la monocapa de células con 3 mL de solución de 0.05% tripsina y 0,48 mM ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 5-10 min a 37 ° C. Añadir 200 μL de suero correspondiente para parar la tripsinización y 7 mL de medio sin suplementos. Resuspender las células mediante pipeteo y sacar una alícuota de 10 μL para contar las células en una cámara de Neubauer.
  3. En cada pocillo de un sistema de diapositivas cámara de 8 pozos, difundir una base de 40 μl de ECME puro, seguido de una incubación de 30 min a 37 ° C.
  4. En cada pocillo, lugar 800 células suspendidas en 400 μL de DMEM/F12 (sin rojo de fenol) suplió como en el paso 1.1 pero con los siguientes cambios: las células primarias de BrC y células de MCF-10A, añadir 4 ng/mL de EGF y 2% ECME; para MCF-7 y MDA-MB-231, añadir sólo 2% ECME.
  5. Incubar los cultivos a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente. Reemplazar el medio de cultivo cada 48 h.
  6. Registro morfológico cambios de células cada 24 h durante 15 días con un microscopio óptico. Para analizar la morfología de BrC primario las células MCF-10A y las células MDA-MB-231 son buena referencia líneas celulares para ejemplos de formación acinar ordenada y desordenadas agresivo cáncer-como las estructuras, respectivamente.
  7. Obtención de imágenes de células en microscopia de campo claro en 100 X y 200 X de magnificación y comparar la morfología celular con referencia MCF-10A y líneas de células MDA-MB-231 (figura 1).

2. obtención de células de cáncer primario del tejido tumoral

Nota: Para obtener las células epiteliales del tumor utilizan tejido resecados tumores primarios de los pacientes de BrC no terapia neoadyuvante previo; evitar áreas necróticas y trabajar con un mínimo de 0,5 cm3 del tejido del tumor.

  1. Enjuague el tejido del tumor con PBS 1 x estéril y mecánicamente la desagregación con un bisturí en fragmentos de 1-2 mm.
  2. Digerir el tejido en un frasco de vidrio estéril de 20 mL con tapa por 2 h a temperatura ambiente (RT) con 2 mL de la solución siguiente: mezclar 1 mg/mL colagenasa tipo I y 100 hialuronidasa U/mL de DMEM/F12 medio contiene 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina , con agitación constante.
  3. Filtrar la suspensión resultante a través de piezas estériles de tul para eliminar grandes trozos de tejido sin digerir. Luego filtrar la suspensión de células a través de una membrana de poro μm 100 esterilizada.
  4. Sedimenten las células a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente y lavar dos veces con PBS 1 x estéril. Células en cultivo primario en medio DMEM/F12 suplementado con 5% de suero de caballo, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, toxina del cólera de 100 ng/mL, 0,5 de μg/mL hidrocortisona, insulina μg/mL 10 y 20 ng/mL de EGF. Cambiar el medio cada 48 h. mantener cultivos a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  5. Asegúrese de que las células aisladas son células epiteliales con un protocolo estándar de immunocytochemistry14. Prueba tres marcadores epiteliales: un panel de citoqueratinas (PanCK), 1 de mucina (Muc-1) y molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM).

3. aislando las PM células de sangre periférica

  1. Extracto de aproximadamente 40 mL de sangre periférica de un sano voluntario, diluir la sangre en una proporción de 1:3 con PBS estéril libre de endotoxinas 1 x y someterlo a una separación del gradiente de densidad.
  2. En un tubo cónico, Coloque 2 mL de un medio de polysucrose y sodio Diatrizoato con una densidad de 1,077 g/mL. Lenta y cuidadosamente el recubrimiento 8 mL de sangre diluida. Centrifugar por 30 min, 765 g de x en el uso de RT. la menor velocidad de aceleración-desaceleración de la centrifugadora.
    Nota: Después de la centrifugación, se formará cuatro capas de abajo hacia arriba: el sedimento de células de sangre rojas, la capa media gradiente de densidad, la capa de células mononucleares (aparece como un fino anillo blanco) y la capa de plasma.
  3. Recuperar la capa de células mononucleares de la pendiente con una pipeta Pasteur estéril y lavar tres veces con PBS 1 x, cada vez seguida por centrifugación lenta (430, 275 y 191 x g) durante 10 min a TA.
  4. Utilizar protocolos de selección negativa para evitar la activación de las células. Un ejemplo de dicho protocolo es el siguiente:
    1. Lavar las células mononucleares una vez con una solución de tampón de lavado (0.5% albúmina de suero bovino, 2 mM EDTA en PBS 1 x). Contar las células en una cámara de Neubauer y ajustarlos a una densidad de 1 x 107 células/30 μl de una solución.
    2. Para cada 1 x 107 células, añadir 10 μl de un FcR bloqueo reactivo y 10 μl de un cóctel de biotina anticuerpo de monocitos que contiene anti-humanos CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 y glicoforina A (incluido en los kits comerciales).
    3. Mezclar las células e incubar por 15 min a 4 ° C. Agregar un adicional de 30 μl de la solución tampón de lavado más 20 μl de anti-biotina microbeads (incluido en el kit); mezclar las células e incubar por 20 min a 4 ° C.
    4. Lavado las células una vez con una solución tamponada, centrifugar a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente y resuspender en 1,5 mL de tampón de solución para la separación magnética.
    5. Carga de la suspensión de células en una columna de separación magnética previamente enjuagada y añadir 7 mL de solución tamponada. Recoger la fracción enriquecida de monocitos en un tubo cónico de 15 mL, contar las células y si no se cultiva inmediatamente, congelar monocitos con una densidad de 2 x 106 células/1 mL de DMEM/F12 suplementado con 50% FBS y 10% DMSO a −80 ° C.
      Nota: Evitar el uso de monocitos después de más de 2 meses de congelación, ya que puede verse comprometida su viabilidad.
  5. Mantener culturas de PMs en medio DMEM/F12 suplementado con 6% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL, a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  6. Realizar cada serie de experimentos utilizando a PMs de al menos dos diferentes donantes independientemente, como agrupación monocitos de donantes diferentes pueden resultar en la activación de monocitos.

4. establecer 3D culturas Co

  1. Co-cultivos 3D con interacción indirecta
    Nota:
    realizar estos ensayos en placas de 24 pocillos fondo plano cultura mediante policarbonato celular cultura insertos con membranas de 0.4 μm tamaño de poro. En este ensayo, sobrenadante y las células se pueden recuperar al final del experimento.
    1. Cultivar 2 x 106 U937 y THP-1 monocitos en 10 mL de Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 1% antibiótico/antimicótico y cultivar PMs frescos en medio DMEM/F12 suplementado (como indicado anteriormente en paso 3.5), a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 medio ambiente.
    2. Placa 4 x 105 monocitos en 1 mL/pozo de su medio correspondiente (suplementado con 2% ECME y 2% FBS para monocitos U937 y THP-1, o 2% ECME y 6% FBS para PMs).
    3. Coloque una en cada pozo y añadir 0,9 mL de 4 x 105 suspensión de células de BrC en el medio correspondiente (complementado con 2% ECME y 2% FBS para líneas celulares comerciales o 5% caballo suero de las células primarias de BrC). Vuelva a colocar la mitad de medios total cada 48 h.
    4. Incubar a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente por 5 días y recuperar el sobrenadante. Para recuperar las células tripsinización si se realiza el análisis subsecuente.
    5. Incluyen controles de culturas de célula individual con los medios respectivos.
  2. Co-cultivos 3D con interacción directa
    1. Etiqueta las células BrC y monocitos con diferentes tintes fluorescentes antes de cultivo celular para permitir la clasificación independiente de cada linaje de la célula después de la cultura para el análisis de la expresión de mRNA y proteína. Utilizar comercialmente disponibles derivados de la cumarina y rodamina que pasan libremente a través de la membrana celular de las células vivas. Un protocolo general para el etiquetado es la siguiente:
      1. Preparar una monocapa de células de BrC de interés (2 × 106 células en un frasco de cultivo de 25 cm2 ) y reemplazar el estándar medio con suficiente con solución de trabajo del tinte fluorescente (1:2, 000 de colorante fluorescente en el medio de base estándar sin ningún suplemento). Incubar 30 min a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente. Aspirar la solución de colorante y lavar suavemente con suficiente PBS 1 x. Aspire el PBS y añadir el estándar medio.
      2. Trypsinize la monocapa de células con 2 mL de una solución de 0.05% tripsina y 0,48 mM EDTA durante 5-10 min a 37 ° C. Añadir 200 μL de FBS para parar la tripsinización y 7 mL de medio correspondiente sin suplementos. Resuspender las células mediante pipeteo. Tomar una alícuota de 10 μL para contar las células en una cámara de Neubauer. Continuar con el protocolo de cooperación cultura después de recuento celular.
      3. Sedimenten las células a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente (realizar esto primero desde monocitos crecen en suspensión). Deseche el sobrenadante y resuspender suavemente las células con 3 mL de una solución de trabajo de precalentado del tinte fluorescente (1:2, 000 de colorante fluorescente en un medio base estándar sin suplementos). Incubar durante 30 min a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
      4. Sedimenten las células otra vez, deseche la solución colorante y resuspender suavemente con 5-7 mL de PBS 1 x. Una vez más de la pelotilla, descartar el PBS y resuspender las células en 5-7 mL de medio estándar. Tomar una alícuota de 10 μl de suspensión celular para contar las células en una cámara de Neubauer. Continuar con el protocolo de cooperación cultura después de recuento celular.
    2. Establecidas en la cultura Co:: extensión suficiente ECME en el fondo del pozo para formar una capa uniforme en cada pocillo de un sistema de diapositivas cámara de 4 pozos. 20 μl de una suspensión unicelular que contiene 5 × 105 etiquetado BrC células por pocillo de la placa.
    3. Después de 15-20 min de incubación a 37 ° C, agregar una suspensión de 2.5 x 105 etiquetado monocitos en 80 μl de medio de ensayo (con 60% ECME).
    4. Permiten ECME solidificar durante 15-20 min a 37 ° C.
    5. Añadir 1 mL de una mezcla 1:1 de las células de la BrC y medios de cultivo de monocitos.
    6. Incubar los co-cultivos a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente por 24 h, 48 h o 5 días para seguimiento de los cambios en diferentes puntos temporales.
    7. Degradan las proteínas de la ECM para recuperar las células de las culturas. Aspirar y descartar el medio añada 0,5 mL de PBS 1 x con tripsina 0.1% y 0.25% EDTA e incubar durante 3 h a 37 ° C. Después de la incubación, Añadir 0,5 mL de PBS 1 x con 10% FBS para neutralizar la tripsina y resuspender las células mediante pipeteo vigorosamente para obtener una suspensión unicelular.
    8. Pelotilla células a 765 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de PBS 1 x con 10% FBS. Repita este paso una vez.
    9. Someter la suspensión celular a celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación con el instrumento adecuado. Asegúrese de que las poblaciones finales son por lo menos 95% de pureza).
    10. Después de clasificar, lavar las células con PBS estéril 1 x, diábolo (430 x g durante 5 min a temperatura ambiente) y resuspender en estéril de 1 x PBS. Las células pueden ser procesadas según los protocolos específicos para aislamiento de RNA o proteína análisis.
    11. Repetir cada ensayo tres veces, incluyendo culturas 3D de cada linaje de la célula individual como controles.
  3. Interacción directa de co-cultivos 3D para evaluar la degradación del colágeno
    1. Establecer cultivos Co celulares 3D como se describe en el paso 4.2, con el paso adicional de agregar 32,5 μg/mL de colágeno de tipo IV marcado con isotiocianato de fluoresceína para la ECME. La concentración final de colágeno IV en la ECME es 0.5%. Crecer los cultivos en un cubreobjetos de 35 mm en un platos de Petri.
    2. Extender una capa de 40 μl de ECME en la parte inferior de la caja Petri. Permiten ECME solidificar a 37 ° C.
    3. Añadir 2,5 x 105 células de BrC en 10 μl del medio y permiten a las células a establecerse.
    4. Agregar una suspensión de 1,25 x 105 U937 monocitos en 40 μl de medio de ensayo (complementado con 60% de DQ-colágeno IV etiquetado-ECME).
    5. Permiten ECME solidificar durante 15-20 min a 37 ° C.
    6. Añadir 2 mL de una mezcla 1:1 de las células de la BrC y medios de cultivo de monocitos.
    7. Incubar los cultivos Co 5 días a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente. Reemplazar el medio de cultivo cada 48 h.
    8. Analizar la emisión de fluorescencia en un microscopio de barrido confocal y medir la densidad óptica integrada (IOD) por 50 μm2 de cultura. Comparar IODs contra culturas individuales y la cultura en el tiempo cero (figura 2).

5. Análisis de sobrenadantes de 3D culturas conjuntamente con interacción indirecta

  1. Después de 5 días de cocultivo, recuperar los sobrenadantes de la parte superior y los compartimentos inferiores de los co-cultivos 3D y de los controles individuales cultura 3D. Mezclar bien cada sobrenadante mediante pipeteo. Alícuota y guarde el sobrenadante a −20 ° C hasta su uso (hasta un mes).
    Nota: Mantenga sobrenadantes en el ° C −80 si almacenamiento será más de un mes.
  2. Analizar los sobrenadantes con multiplexación plataformas de ensayo, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) o inmunoensayos basados en grano siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante.
    Nota: Sobrenadantes pueden ser también analizadas por Western blot o concentradas a través de filtros de poro determinado para obtener fracciones de proteína de tamaño enriquecido para realizar zymography análisis16,17. Alternativamente, use los sobrenadantes como medio acondicionado para otros experimentos, como se describe a continuación. Medio condicionado se obtiene generalmente de un cultivo de 5 días (figura 3).

6. Caracterización de los efectos de sobrenadantes de células BrC primario en formación de acinos y estructura de los acinos

  1. En cada pozo de una diapositiva 8-pozo cámara sistema extensión base 40 μl de ECME y deja solidificar por 30 min a 37 ° C.
  2. MCF-10A, semilla 800 células/pozo en 400 μL de medio de cultivo suplementado DMEM/F12, tal como se describe en el paso 1.2.
  3. Añadir 400 μL de medio condicionado o medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 20 ng/mL de IL-1β recombinante humana.
  4. Coloque el portaobjetos de la cámara en un plato de petri de vidrio que contiene un plato de petri de 35 mm con 2 mL de PBS para crear un ambiente de humedad.
  5. Sustituir lo medios de comunicación/sobrenadante cada 48 h.
  6. Registro formación de acinos glandulares cada 24 h durante 14 días con un microscopio óptico.
  7. Después de 14 días de cultivo, tinción acinos con 100 μl de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a una concentración de 100 nM de 1 x PBS para observar los núcleos de célula. Incubar durante 25 min a temperatura ambiente en agitación constante. Enjuague tres veces con 1 x PBS durante 5 minutos, cada vez que en constante agitación en RT. Monte los preparativos con un medio de montaje específico para la tinción fluorescente. Selle con esmalte transparente y mantener protegido de la luz a 4 ° C.
  8. Los acinos a analizar con un microscopio confocal de tomar imágenes de las pilas transversales a diferentes profundidades de los acinos (figura 4A, B, C).
  9. Visualizar diferentes proteínas celulares de los acinos con adecuados protocolos de tinción. Por ejemplo, E-cadherina fue manchado para evaluar adherencia de célula a célula, polaridad celular y formación de luz18 (figura 4D).

7. ensayos de migración

Nota: Realizar ensayos de migración de U937, PMs THP-1 y frescos en placas de 24 pocillos fondo plano cultura con policarbonato celular cultura insertos con membranas de tamaño de poro de 8 μm. Previamente se demostró que las quimiocinas GM-CSF, MCP-1 y RANTES se encontraron secretada en altas concentraciones en culturas individuales 3D de las líneas de células agresivas de BrC. Se propuso que estas citoquinas fueron fundamentales para la atracción de monocitos al sitio del tumor primario; Esto fue probado en ensayos de migración mediante las citoquinas como atrayentes.

  1. Cultura U937, PMs THP-1, o frescos como se describe en el paso 4.1.1.
  2. Enjuague una vez cada parte movible con 200 μL de RPMI 1640 sin sueros para hidratación de la membrana.
  3. Llenarlo con 50 μl de ECME frío, colocar los insertos en una placa de 24 pocillos fondo plano cultura y permitir la ECME polimerizar durante 1 h a 37 ° C.
  4. Añadir 180 μl de RPMI sin SFB en el compartimiento superior de la placa. Añadir en la cámara baja sin burbujas 800 μl de RPMI suplementado con cualquiera 100 ng/mL de GM-CSF, MCP-1 y RANTES como chemoattractant. Medio de uso sin las citoquinas como control negativo. Incubar durante 30 min a 37 ° C para establecer un gradiente de chemokine.
  5. Lugar 1.5 x 105 de cada tipo de monocitos en un tubo estéril, Lave dos veces con 1 mL de 1 x PBS y centrifugue a 430 x g durante 5 minutos a monocitos RT. resuspender en 20 μl de RPMI sin SFB, colocarlos en los insertos de y con mucho cuidado homogeneizar la suspensión de células (el volumen final de la sala superior es 200 μL).
  6. Permitir la migración de celulares al progreso durante 24 h a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
    Nota: Como los monocitos son no adherentes, las células migratorias será generalmente en los medios de comunicación del compartimento inferior.
  7. Quitar los insertos, recuperar los medios de comunicación y contar las células en 2, 4, 6 y 24 h con una cámara de Neubauer o un citómetro de flujo; como alternativa, especialmente si no hay células se encuentran en los medios de comunicación, adquisición de imágenes de la parte inferior de los rellenos con una cámara digital. La cuenta media de la célula de 3 campos al azar (con 100 aumentos) se utiliza para el análisis (figura 5).

8. invasión de ensayos

Nota: Realizar ensayos de invasión de las células de BrC en placas de 24 pocillos fondo plano cultura mediante policarbonato celular cultura insertos con membranas de tamaño de poro de 8 μm. En nuestros estudios originales, IL-8 fue una de las citoquinas enriquecidas en los sobrenadantes de las BrC/monocito célula 3D co-cultivos. Estaba probado si esta citoquina fue participar en la invasión de las líneas celulares de BrC.

  1. Expandir las células BrC en frascos de 75 cm2 . MCF-7, T47D, HS578T y MDA-MB-231 como describen en el paso 1.2 (pero sin ECME) y las células primarias de BrC como se describe en el paso 2.4.
  2. Lavar una vez cada cultivo de células de membrana de policarbonato 8 μm de poro Inserte con 200 μL de medio sin suero (el medio utilizado depende de la línea de celular probada) para hidratar la membrana.
  3. Llene el inserto con 50 μl de ECME frío (medio de dilución 1:4 ECME:cold sin SFB), colocar los insertos en una placa de 24 pocillos fondo plano cultura y permitir la ECME polimerizar durante 1 h a 37 ° C.
  4. Una vez que ha polimerizado la ECME, añadir 180 μl de los medios respectivos de la célula sin SFB. Añadir 800 μl los medios de comunicación sin SFB a través de las ranuras de la estufa. Incubar durante 30 min a 37 ° C para establecer un gradiente de IL-8.
    Nota: Evitar la creación de burbujas en los medios de comunicación. Los medios utilizados es sin SFB pero suplementados con 100 ng/mL de IL-8 como un chemoattractant, o puro medio sin SFB, como controles negativos.
  5. Obtener un total de 6 x 105 células de cada línea celular como sigue:
    1. Deseche el sobrenadante de enjuague una vez con 10 mL de PBS 1 x y añadir 2 mL de EDTA 0.05% tripsina/0.48 mM por 2 min a 37 ° C para separar las células. Añadir 4 mL de medio suplementado para detener la reacción de tripsina y agite vigorosamente por pipeteo.
  6. Tomar 10 μl alícuota de la suspensión celular para contar las células en una cámara de Neubauer. Tomar un volumen de suspensión celular que contiene 6 x 105 células. Centrifugue a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y lave las células en 1 mL de PBS 1 x. Repita el enjuague una vez más.
  7. Resuspender las células en 20 μl de los respectivos medios de comunicación sin SFB y lugar en los insertos que contiene 180 μl de los respectivos medios de comunicación sin SFB. Homogeneizar cuidadosamente la suspensión de células mediante pipeteo.
  8. Permite la invasión de la célula al progreso durante 48 h a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  9. Después de 48 h, quitar el relleno, deseche el sobrenadante y lavar el inserto una vez muy cuidadosamente con 200 μL de PBS 1 x. Con un aplicador con punta de algodón, retirar el exceso de PBS.
    Nota: Las células invasoras se unen generalmente al otro lado de la estufa como en este caso donde las células adherentes.
  10. Fijar las células por colocar en un pocillo de una placa de 24 pocillos fondo plano cultura que contiene 1 mL/pozo de paraformaldehído al 4% durante 15 min a TA. después, enjuague los insertos una vez con PBS 1 x.
  11. Las células de la mancha por colocar en un pocillo de una placa de 24 pocillos fondo plano cultura que contiene 1 mL/pozo de 1 x PBS con 0.2% de cristal violeta durante 45 min a RT. con cuidado, con un Quite de aplicador con punta de algodón todos lo ECME desde la parte superior de la membrana , que contiene las células que no migran y enjuague cuidadosamente con agua destilada para evitar eliminar fija las células invasoras.
  12. Contar las células invasoras mediante la observación de la parte inferior de la pieza de inserción bajo el microscopio invertido. Se utiliza la cuenta de la célula media de 3 campos al azar (con 100 aumentos). En casos donde las células han invadido como racimos y son difíciles de contar individualmente, adquirir imágenes de 3 campos al azar (con 100 aumentos) con una cámara digital. Analizar las imágenes con software para análisis de imágenes y la IOD para cuantificar la invasión celular (figura 6).

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Representative Results

Análisis morfológico de las células de BrC en culturas 3D:

La morfología de las células primarias de BrC en culturas 3D en altas y bajas densidades fue estudiada durante 5 días. Durante las primeras 48 h, las células se adhieren a la ECME y mantienen una baja densidad. En este momento, se puede claramente apreciar que las células presentan una forma alargada del huso-como, algunos con dos o más proyecciones citoplásmicas largo y sin mostrar contactos célula-célula aparente. Después de 5 días de cultivo, las células proliferaron manteniendo su morfología inicial. Por otra parte, se forman estructuras que se asemejan a las redes sin una organización estructural específica y aparecen amontonadas con ninguna inhibición de contacto. Se realizó una comparación con las células de MCF-10A no transformado, que forman estructuras esféricas que se asemejan a los acinos glandulares. Estas células muestran una morfología característica de estructuras redondeadas de bien delimitadas y organizadas en tamaños homogéneos (de aproximadamente 50 μm). Por el contrario, las células primarias de BrC comparten un parecido mucho más agresivo BrC las células MDA-MB-231 (figura 1).

Análisis de las interacciones directas célula a célula y la degradación del colágeno:

Hemos diseñado un modelo de cultura Co 3D para evaluar lo siguiente: morfología, la degradación del colágeno, migración celular, la célula y si existe una interacción directa entre las células de la BrC y monocitos en el cocultivo. Después de 5 días, tanto MCF-7 y MDA-MB-231 comercial BrC las células forman agregados desorganizados en culturas 3D, sin embargo, difieren en su morfología. Forma de agresivo células MDA-MB-231 agregados con formas alargadas con algunas células tiende a separarse del resto, mientras no sea agresivo células MCF-7 forman agregados donde las células mantienen formas redondeadas y que parecen ser más densamente compactadas (figura 2 A, B). DQ colágeno IV fue incorporado para visualizar la degradación proteolítica (verde), con ambas culturas BrC actividad fluorescente. Evaluar cuantitativamente la actividad proteolítica, se midió la fluorescencia verde como IOD de seis 50 μm2 campos. Se realizó una comparación entre culturas individuales 3D de las células MDA-MB-231 y co-cultivos con U937 monocitos. Se observó un aumento estadísticamente significativo de la proteólisis en la cultura Co (figura 2C). También, un análisis de la microscopia confocal de serie transversal acumula cada 10 μm de la MDA-MB-231 y U937 monocitos co-cultivo fue realizaron (figura 2D). Este análisis reveló que U937 monocitos migran hacia las agresivas células MDA-MB-231 con algunos monocitos llegando a la capa de células de BrC. Sin embargo, era evidente que sitios de célula interacción directa no fueron necesariamente coincidiendo con áreas de mayor actividad proteolítica: en cambio, las áreas de degradación de colágeno fueron separadas uniformemente en la cultura, conduce a la inferencia que el colágeno degradación fue el resultado de la comunicación indirecta mediada por factores secretados. Por lo tanto, el modelo 3D de co-cultivo fue cambiado para colocar las células en diferentes compartimentos separados por una membrana porosa para permitir la comunicación de la célula basada en factores secretados y evitar el etiquetado y clasificación después de la cultura de la célula.

Análisis de IL-1β en sobrenadantes de cultivos 3D:

Trabajando con las culturas 3D interacción indirecta, los sobrenadantes de BrC primario individual se cosecharon cultivos y sus 5 días co-cultivos con PM. Estos sobrenadantes fueron sometidos al análisis simultáneo de 18 citoquinas y 5 MMP usando kits comerciales y un instrumento diseñado específicamente para este análisis. De todos los analitos probados, se observaron niveles significativamente elevados de IL-1β y IL-8 en los BrC monocito célula co cultivos primarios, ambas citoquinas inflamatorias cruciales que han sido previamente asociados con la progresión maligna15, 18 , 19 , 20 (figura 3; resultados para IL-1β). Este ejemplo es otro tipo de análisis que culturas 3D permiten para simular la red de comunicación que el microambiente del tumor.

Caracterización de la estructura de los acinos y sobrenadantes:

Sobre la base del sistema experimental 3D desarrollado por Debnath Muthuswamy y Brujas7, donde MCF-10A fueron establecidos como un modelo de los mecanismos asociados con la oncogénesis, evaluación de si los factores secretados desde la célula primaria de la BrC sobrenadantes influenciado la formación de las MCF-10A 3D acinos-como las estructuras, similares a la actividad observada después de que se llevó a cabo la transducción de oncogenes virales y celulares7,21 . Células de MCF-10A fueron cultivadas con dos diversos sobrenadantes de dos líneas de celulares BrC primarias observar formación de luz (como una medida de la resistencia a la anoikis). En el día 14, los esferoides fueron evaluados por cortes transversales de microscopia confocal en 0, 25, 50, 75 y 100% de profundidad, y en ambos casos, se encontró anoikis evadida de las células MCF-10A (medido por el número de células (luminales) central de los acinos (figura 4 B, C)). Por lo tanto, acinos células de MCF-10A que se forman con los medios condicionados de las células de BrC, carecen un lumen hueco bien formado, a diferencia de MCF-10A que se cultivan con su medio de cultivo estándar (como se describe en el paso 1.2) (figura 4A). En el sistema de co-cultivo 3D, IL-1β fue altamente segregada; por lo tanto, las células de MCF-10A también fueron cultivadas con humana recombinante de IL-1β18. Figura 4 D muestra un microscopio confocal transversal corte en 50% de profundidad de los acinos en presencia de IL-1β (paneles inferiores) y revela que esta citoquina también confiere resistencia a la anoikis. Por lo tanto, factores solubles secretados por las células primarias de BrC, como IL-1β, promoción la supervivencia de células de MCF-10A no transformado que pierden las interacciones de la ECM, una característica de los canceres invasores.

3D co-cultivos promoción una respuesta inflamatoria asociada con la migración de monocitos y la invasión de las células cancerosas:

Previamente demostramos que las células primarias de BrC en 3D cultura secretan altos niveles basales de quimiocinas proinflamatorias que atraen monocitos14. Así, analizamos la capacidad migratoria de los monocitos en respuesta a quimioquinas encontrado enriquecido en los medios condicionados de las células de BrC. Se evaluó la capacidad migratoria de monocitos comerciales U937 y THP-1 y PMs frescos en respuesta a tres diferentes quimiocinas: GM-CSF, MCP-1 y RANTES. U937 y THP-1 monocitos fueron capaces de migrar en respuesta a GM-CSF y MCP-1, con U937 como el más sensible, mientras que tanto monocitos tuvieron una respuesta nula a RANTES. Lo importante, PMs demostraron una alta actividad migratoria basal y la respuesta más potente a la MCP-1 (figura 5). IL-8 también se enriqueció después el 3D cocultivo de las células primarias de BrC y monocitos. Así, hemos analizado si IL-8 modifica la capacidad de invasión de líneas de celulares BrC primarias y comerciales. El comercial agresivo BrC líneas celulares (HS578T y MDA-MB-231) invadieron en respuesta a IL-8, mientras que los no agresivos (MCF-7 y T47D) no invadiese. Sorprendentemente, las células primarias de BrC fueron más invasivas que la comercial agresivo BrC las líneas celulares en respuesta a IL-8 (figura 6A, paneles de la derecha). En algunos casos, las células invaden como racimos y por lo tanto era necesario análisis IOD (figura 6B).

Figure 1
Figura 1 : Imágenes representativas de BrC células en culturas 3D. De izquierda a derecha: control de no-transformado células de MCF-10A formando acinos glandulares característicos, con redondeado morfología, contactos de celular bien delimitada y organizado estructuras de tamaños homogéneos (aproximadamente 50 μm en aumento promedio, óptica de 200 X). Mediados paneles muestran las células primarias de BrC cultivadas a baja densidad (2 días) y alta densidad (5 días). Las células se adhieren a la ECME y mantienen una baja densidad en primeros puntos del tiempo. Es evidente que las células presentan una forma alargada del huso-como, algunos con dos o más proyecciones citoplásmicas largo y con la no adherencia de célula aparente. Por otro lado, alta densidad células en puntos posteriores forman estructuras que se asemejan a las redes sin una organización estructural específica. Estas células se parecía llenadas para arriba no mostrando ninguna inhibición de contacto. Se muestra un control de comerciales células MDA-MB-231 después de 5 días en cultivo 3D; Estas células agresivas de BrC comparten un parecido mucho más cerca con cultivos primarios de BrC (aumento óptico de 100 X). Escala de la barra representa 50 μm. 800 células fueron sembradas al principio del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análisis de la degradación de la ECM de. No agresivos MCF-7 células teñidas con un fluorocromo amarillo (A) y agresivo MDA-MB-231 células teñidas con un fluorocromo rojo (B) cultivado por 5 días en condiciones de 3D; 0.5% de colágeno marcados con fluorescencia verde IV fue incorporado para visualizar la degradación de la ECM. En A y B, los cuadros izquierdos superiores representan los niveles de degradación del colágeno, los paneles superiores derecha representan las imágenes ópticas, la parte inferior izquierda representa las células BrC y los paneles de parte inferior derecha muestran la combinación de fluorescentes y óptica imágenes. Para A y B, se presentan el aumento óptico 200 X y escala bar de 100 μm. (C) imágenes representativas de la proteólisis de la ECM (verde) en la cultura 3D de las células MDA-MB-231 individuales como control, en comparación con proteólisis de ECM de co-cultivo 3D de MDA-MB-231 con U937 monocitos. Barras de escala representan 10 μm. Se midió el IOD (densidad óptica integrada) de seis 50 μm2 campos de cada condición. Se presentan la media y el error estándar de la media (SEM) de las cuantificaciones; dos asteriscos representan una diferencia estadísticamente significativa con p < 0.01 (prueba de Mann-Whitney). (D) la interacción directa de las células MDA-MB-231 (gris sombra total) con tinción fluorescente U937 monocitos (naranja); fluorescencia verde corresponde a la proteolisis. Rebanadas de serie se generaron cada 10 μm por microscopia confocal para abordar la localización y la interacción directa entre ambas líneas celulares. Aumento óptico 200 X; barras de escala representan 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: se incrementa la concentración de IL-1β en co-cultivos 3D. Un resultado representativo de los niveles de IL-1β (pg/mL) en sobrenadantes de ocho (PC1-8) BrC las células primarias, cultivadas individualmente en 3D (3D) y compararon sus 3D co-cultivos con PM (CC). Un control de la PM en cultura 3D individual fue incluido para la comparación (PM). Resultados se obtuvieron de un análisis multiplexado más grande, donde varias citocinas al mismo tiempo fueron detectados en cada muestra por medio de una técnica basada en la inmunodetección disponible como un kit comercial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Factores secretados de las células primarias de BrC inducen resistencia a la anoikis en no-transformado células de MCF-10A. Células de MCF-10A fueron cultivadas en condiciones 3D con cultura medios estándar (columna A y los paneles superiores de la D), en el que se puede observar que los acinos presentan lúmenes típicos huecos (25-75% de profundidad resaltado con un cuadrado rojo); Cuando las células MCF-10A fueron cultivadas con dos diversos sobrenadantes de dos cultivos primarios de BrC (columnas B y C), lúmenes no son huecos pero lleno con las células que denotan resistencia a anoikis. Del mismo modo, cuando las células MCF-10A fueron cultivadas en condiciones 3D añadiendo recombinante humano IL-1β (20 ng/mL), lumen hueco no se puede apreciar en las secciones de la microscopia confocal de profundidad 50% de los acinos (paneles inferiores de D). La caricatura oval derecha representa las secciones de microscopía confocal que se hicieron en la profundidad de 0, 25, 50, 75 y 100% de los acinos. Las imágenes muestran núcleos teñidos con DAPI (azul) y E-cadherina en verde. Aumento óptico 200 X, barras de escala representan 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Capacidad migratoria de los monocitos del. Imágenes representativas de la capacidad migratoria de U937, THP-1 y PM en respuesta a GM-CSF, MCP-1 y RANTES. Controles sin quimiocina están incluido (primera columna de izquierda a derecha). Los números debajo de las imágenes indican el número de células migratorias en cada Estado; U937 y THP-1 monocitos fueron principalmente sensibles a GM-CSF y MCP-1, mientras que mostró una alta capacidad migratoria por síy eran las células más sensibles a la MCP-1. Aumento óptico de 100 X; barras de escala representa 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Agresivo y primarias BrC células invaden en respuesta a IL-8. A. líneas de celulares de BrC de invasión ensayos con dos no-agresivo (MCF-7 y T47D), dos altamente agresivos (HS578T y MDA-MB-231) y un cultivo primario de BrC en respuesta a IL-8, utilizado como chemoattractant. Paneles superiores corresponden a controles sin chemokine no mostrando ninguna invasión, paneles inferiores muestran la respuesta a IL-8, con células de BrC altamente agresivo y primaria BrC invadiendo a través de la membrana de la célula cultura insertar. B. ejemplo de células que invaden en racimos; en estos casos, medición de la invasión se realiza con un programa de análisis de imagen para determinar la invasión en términos de IOD (densidad óptica integrada) por área. Los números debajo de las imágenes representan el número de células invasoras en cada condición. Aumento óptico de 100 X; barras de escala representan 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Discussion

Las células epiteliales crecen en una conformación espacial 3D y su interacción con las proteínas de la ECM es fundamental para la homeostasis del tejido. Se han basado muchos estudios de cáncer en las células cultivadas en monocapas (2D) y aunque han sido fundamentales para entender muchos aspectos de la formación del tumor y la progresión, monocapas no recapitular las características que impone el ECM en las células, para ejemplo: limitación de la proliferación, supervivencia dependiente de la adhesión celular, la polaridad apical basolateral, ECM remodelación, diferenciación celular, etc. Lo importante, no sólo la interacción entre las células del tumor y ECM son esenciales para la progresión del cáncer, sino también la comunicación establecida entre el tumor y no tumor células, como las células inmunes. Los protocolos incluyen facilitan la comprensión de las interacciones entre las células inmunes y células cancerosas dentro del entorno del ECM, la respuesta inflamatoria promovida por estas interacciones, y cómo crear este estado inflamatorio un bucle positivo fomentar chemoattraction de monocitos y mayor invasión de las células cancerosas.

Una gran ventaja de usar ECME es que proporciona un andamio biológico adecuado para llevar a cabo una variedad de 3D experimental modelos22. Está enriquecido con proteínas de la ECM como laminina, colágeno IV, entactin, proteoglicano de heparan sulfato y factores de crecimiento, que en vivo interactuando con las células epiteliales. Una desventaja es que porque viene de lisados de sarcomas murinos, la concentración de sus componentes varía entre distintos lotes. Por lo tanto, a menudo es necesario caracterizar varios lotes para obtener datos más homogéneos. En el laboratorio, cada lote es probado de dos maneras: 1) mediante la evaluación de la formación de acinos correcto de células MCF-10A y 2) mediante la evaluación de la invasión de BrC de células de capacidad invasiva bien establecida. Otra opción es trabajar con otros productos de andamios, como el hidrogel, que es un andamio de péptido sintético nanofibras. La rigidez de la cultura 3D puede controlarse ajustando la concentración de hidrogel23,24. Lo importante, este sistema puede aplicarse para estudiar la interacción entre cualquier tipo de célula neoplástica y hematopoyéticas o células no hematopoyéticas. Incluso podría ser posible diseñar sistemas más complejos, utilizando más de dos linajes diferentes de la célula. Una ventaja importante de los modelos 3D es que permiten el estudio de la morfología de la célula y organización de la célula formado por interacciones de ECM, que se alteran durante la transformación oncogénica. Además, uno puede estudiar características oncogénicas como degradación proteolítica, y si las células inicialmente colocan en distintas capas de la señal de cultura mutuamente para promover la interacción/comunicación directa. Por otra parte, linajes celulares diferentes pueden etiquetarse con fluorocromos diferentes, por lo que puede ser aisladas después de la experiencia para responder preguntas específicas a cada tipo de célula individual, usando, por ejemplo de análisis de expresión de RNA o proteína13. Aquí, se muestra la secreción de IL-1β al medio en co-cultivos de células/PM BrC primarios, apoyando un posible papel fundamental de esta citoquina en la comunicación indirecta entre células tumorales y los monocitos que desencadena la progresión maligna.

Otro esencial protocolo experimental en el laboratorio es el análisis de la formación de acinos en 3D culturas de células MCF-10A no transformado. Este análisis fue utilizado para probar la actividad del oncogén viral y celular y para comprobar cómo influye en el microambiente tumoral característica relacionada con cánceres agresivos. Por ejemplo, durante el normal desarrollo de los acinos, células luminales central pierden contacto con las proteínas de la membrana basal (proporcionadas por ECME) desencadenando mecanismos de muerte celular, conocida como anoikis. Se observó que tanto los sobrenadantes de las células primarias de BrC o recombinante de IL-1β promoción la resistencia de las células MCF-10A a anoikis. Porque una alta concentración de IL-1β se promovido sobre interacción monocito célula de BrC, esta observación apoya que el estroma del tumor es un componente integral de la progresión de tumor a etapas muy agresivas.

Las migración y la invasión protocolos descritos aquí constituyen útiles ensayos complementarios 3D en el que podemos apoyar la capacidad de las células para migrar o invadir en respuesta a los estímulos derivados del estroma del tumor. Fue demostrado que quimiocinas (GM-CSF y MCP-1) en concentraciones elevadas en las culturas 3D de las células primarias de BrC pueden promover la migración de U937, THP-1 y PMs, apoyando la capacidad de las células tumorales agresivas para promover un microambiente pro-inflamatoria. Además, IL-8 que también se encuentra en mayor concentración en los sobrenadantes de co-cultivos de células de BrC/monocitos, promovió mayor invasión comercial agresivo células de BrC (HS578T y MDA-MB-231) y las células primarias de BrC.

Con respecto a la condición de las células, es importante trabajar con las células primarias de BrC antes de llegar a diez pasos para tomar ventaja de su pico de proliferación y evitar el post-aislamiento genéticos y epigenéticos cambios potenciales resultantes en vitro cultura. Otro aspecto esencial al trabajar con células primarias es para confirmar su identidad después de aislamiento. Utilizamos un panel de biomarcadores para determinar su identidad de estirpe epitelial, que incluye PanCK y Muc-1 EpCAM (especificado en el paso 2.5). Del mismo modo, es preferible usar a PMs frescos, de que cada lote es probado asegurando que están en la misma etapa de la diferenciación. Cada nuevo lote utilizado presenta el fenotipo CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68neg CD16neg, que corresponde a monocitos inmaduros no activado. Lo importante es no mezclar monocitos de diferentes donantes, como resultados en la activación de monocitos que se mezcla. En cambio, hemos probado independientemente BrC Co culturas utilizando monocitos de al menos dos diferentes donantes.

Sistemas de cultivo 3D todavía tienen la limitación que se pueden modelar confiablemente solamente algunos elementos de la biología del tumor. Una nueva alternativa es los modelos 3D más complejos de organoides, que se basan en la expansión y diferenciación de células madre en vitro. Organoides también desarrollan estructuras epiteliales altamente organizadas. Los ejemplos incluyen gástrico 25,26, hígado 27y riñón organitas28. Sin embargo, organoide modelos para cada órgano humano permanecen para ser alcanzados; Además, requieren condiciones experimentales mucho más complejas y costosas.

En conclusión, aquí se describe detalladamente un flujo de trabajo de análisis: a partir del aislamiento de las células tumorales de pacientes de BrC, prueba su capacidad inflamatoria en un modelo de cultura 3D ECME, prueba de cómo ese microambiente inflamatorio les sirve para reclutar células inflamatorias adicionales, tales como monocitos, para finalmente analizar la comunicación entre ambos tipos de células, y cómo esa comunicación más fomenta un microambiente inflamatorio que promueve la progresión a etapas más agresivas del cáncer. Además, describimos la morfología y el fenotipo de las células primarias de BrC. En el futuro los estudios, sería interesante probar otras células inflamatorias o incluso probar la comunicación entre las células de la BrC y múltiples células a menudo se encuentran en el estroma del tumor. Estas culturas de célula múltiple 3D ofrecerá un panorama más amplio de lo que sucede biológicamente en vivo durante la progresión del cáncer. Las comparaciones entre datos en vitro y el resultado clínico del paciente permitirá identificar los mecanismos potenciales que tienen un mayor impacto en la agresividad del cáncer.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE proyecto Nº 233061 a Ezequiel M. Fuentes-etorno y Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (proyecto número HIM-2014-053). NA de Espinoza Sánchez es estudiante de doctorado del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y recibió beca 231663 de CONACYT. E S NA, también reconoce el apoyo financiero proporcionado por el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

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References

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