Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, doğrudan/dolaylı ilişkileri monosit ve kollajen bozulması, bağışıklık hücre işe alım, hücre gibi sonuçlar ile çalışma olarak birincil meme kanser hücrelerinin de Morfoloji çözümlenecek bir üç boyutlu kültür yöntemi açıklamak işgali ve promosyon inflamasyon kanserle ilgili.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre dışı Matriks (ECM) gömülü, normal ve neoplastik epitel hücreleri hematopoetik ve sigara hematopoetik hücreler ile böylece büyük ölçüde etkileyen normal doku homeostazı ve hastalık sonucu yakından iletişim kurmak. Meme Kanserinde tümör ilişkili makrofajlar (TAMs) hastalık ilerlemesi, metastaz ve yineleme kritik bir rol oynamaktadır; Bu nedenle, monosit chemoattraction tümör microenvironment ve tümör hücreleri ile onların etkileşim mekanizmaları anlama hastalık kontrol etmek önemlidir. Burada, insan meme kanseri (BrC) hücreleri ve insan monosit üç boyutlu (3D) ortak kültür sistemi ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. BrC hücreler üretilen düzenlenmiş etkinleştirme üzerinde Bazal düzeyi yüksek, normal T hücreli ifade ve (RANTES) salgılanan, monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (G-CSF), monosit ile ortak kültür iken Pro-inflamatuar sitokinlerin İnterlökin (Il) -1 beta (IL-1β) ve Il-8 matriks metalloproteinazların (MMP) -1, MMP-2 ve MMP-10 ile birlikte zenginleştirilmiş. Bu tümör stroma microenvironment direnci anoikis MCF-10A 3D acini benzeri yapıları, monosit chemoattraction ve agresif BrC hücreleri işgali için terfi. Burada sunulan protokollerini Intra-tümör iletişim çalışmaya uygun fiyatlı alternatif sunmak ve tümör biyolojisi tümör için ilgili belirli özellikleri sorgulamaya vitro 3D hücre sistemleri sağlar büyük potansiyel bir örnektir saldırganlık.

Introduction

Tümör biyolojisi önceden tahmin ettiğimden çok daha karmaşık. Montaj kanıt tümör hücreleri daha fazla sadece bir kontrolsüz Proliferasyona hücrelerinin daha toplu gösterir; Bunun yerine, farklı neoplastik hücreler yüksek organizasyon ve hiyerarşi içinde tümör1görüntüleme farklı işlevleri yerine görünmektedir. Tümör hücreleri dönüştürülmüş olmayan hücreleri ile samimi iletişim de bulunmaktadır: makrofajlar, fibroblastlar, lenfositler, adipositler, endotel hücreleri, diğer hücreler arasında tüm iskele proteinler ve ECM teşkil polisakkaritler daldırılır. Çok sayıda doğrudan ve dolaylı etkileşimleri dönüştürülmüş ve sigara dönüştürülmüş hücreler arasında ve hastalık sonucu2,3üzerinde güçlü bir etkisi giderek artan ECM ile kurulur. BrC belirli olması durumunda, bu TAMs TAMs tümör gelişiminde önemli bir rol oynamaya metastaz ve4 hastalık Rekürrens riski artan bulunmuştur ki göz önünde bulundurarak, BrC hücrelerle iletişim incelemek özellikle önemlidir ,5.

İçi tumoral etkileşimleri ve onların olası sonuçlarını çözümlemek için yeni 3D vitro yaklaşımlar temel alınarak çok daha karmaşık bir microenvironment sağlamak ECM özleri kullanımı geliştirilmiştir tümör biyolojisi, karşılaştırma için gerçeğe daha yakın hangi hücrelerin büyümesine geleneksel monolayer hücre kültürleri için plastik bağlı. Petersen ve Bissell6 nonmalignant ilk modeli sağlanan ve malign meme epitel hücreleri kültürlenir laminin zengini bir membran üzerinde ve nonmalignant insan ayırımcılık 3D organotypic yapılarını açıklamak için ilk idi meme Malign karşılıklarından epitel hücreleri. On yıl sonra model Debnath, Muthuswamy, geliştirilen ve Brugge7,8,9 sağlanan glandüler acini, malign transformasyon sırasında tehlikeye biyolojik yollar aydınlatmak için değerli bir araç gibi büyük acini oluşumu nedeniyle kontrolsüz çoğalması, Engelli hücre polarizasyon kanıtı ve acini Lümen sonucu olarak anoikis, hücre direnç kaybı olarak sıkı kavşak proteinlerin delocalization olarak programlanmış hücre ölümü bir tür içinde oluşur Onlar çevreleyen ECM ayırdığınızda anchorage bağımlı hücreleri. Sameni, Jedeszko ve Sloane modellerinin invasiveness, tümör habis10,11,12başka bir önemli özelliği olan NBD'ye çok görüntüleme proteolitik aktivite hücreler tarafından üzerinde odaklanmıştır. Protein matrisler farklı floresan söndürülür protein yüzeyler ile karışık bu modeller itimat (DQ-jelatin, DQ-kollajen ı ve DQ-kollajen IV), hangi floresan sinyallerini kollajen proteolitik bozulması işaret etmektedir. 3D modelleri Ayrıca kök hücre özellikleri her iki sigara dönüştürdü ve tümör hücreleri, hangi hücreye toplamları, ayrıca olarak adlandırdığı pulcuklarının incelemek için kullanılır, süspansiyon veya ECM gibi proteinler hücre farklılaşması, asimetrik mekanizmaları için sorguya kültürlü olabilir hücre bölünmesi, hücre hücre bağlılık ve hücre hareketliliği13,14. İstila deneyleri sırasında invaziv işlem15chemoattractants hizmet molekülleri tanımlaması ve tümör içsel saldırganlık test izin. Genel olarak, 3D modeller daha yakından normal ve oncogenic doku morfogenez yansıtmak vitro hücre kültürü uygun fiyatlı bir çeşitlendirilmesi temsil eder.

Biz-si olmak ressam anılan modelleri7,10,11, temel 3D cep ortak kültür sistemi her iki insan ticari BrC hücre hatları bilinen agresif potansiyeli (luminal ve triple negatif türleri) ve ilköğretim kullanarak BrC hastalardan explanted hücreleri. Biz ilk geliştirilen bir model saldırgan olmayan (MCF-7) veya agresif (MDA-MB-231) BrC hücreleri U937 monosit bir hücre dışı matriks özü (ECME) ile işbirliği kültürlü neredeydin-tabanlı doğrudan hücre-hücre etkileşimleri izin 3D sistemi. Bu ortak kültürler nasıl etkiledi bu iki hücre soy arasındaki iletişimi genler kanseri saldırgan davranış ile ilgili bir dizi transkripsiyon belirlemek için kullanılmıştır. Bu bir artan üretim ürünlerinden birini, prostaglandin E2 (PGE2), iltihap kanser ilerleme rolü vurgulanacak bir bulgu olan çakıştı Siklooksijenaz-2 (COX-2) transkript önemli bir artış gözlenmiştir. MMP, artan transkripsiyon da bu agresif MDA-MB-231 hücre U937 monosit DQ-kollajen IV içeren kültürde ile birlikte kültürlü ne zaman daha fazla kolajen proteolizis ile korelasyon gözlendi. Belirtmek gerekirse eş kültürlerimiz hücre-hücre etkileşim mekanizmaları kollajen yıkımı için gerekli olan varsayım desteklememektedir. Daha doğrusu iki hücre soy arasındaki iletişimi tarafından salgılanan moleküller aracılı önerdi. Ayrıca, bu ortak kültür deneyleri hasat supernatants glandüler acini sigara dönüştürülmüş MCF-10A hücreleri13tarafından kurulan dağınık çözünür faktörler içeriyordu. Agresif bulundu ve salgılanan birincil BrC hücreleri monosit kemotaktik molekülleri MCP-1, GM-CSF ve RANTES düzeyde yüksek. Böylece, bir 3D kültür hücreleri hücre-hücre etkileşimleri önlemek için hücre kültür ekler ayrı kaldık sıraladı. Bu kültürler BrC hücreleri ve monosit arasında dolaylı iletişim adresine kullanılmıştır. Bu deneyleri, saldırgan olmayan ve agresif ticari BrC hücre hatları ve birincil BrC hücreleri ve üç çeşit insan monosit: ticari U937 ve THP-1 hücreleri ve birincil monosit (PMs) sağlıklı bağış (tüm periferik kandan izole monosit etkin olmayan bir durumda kullanılmıştır) kullanılmıştır. İnflamatuar sitokinlerin IL-1β ve Il-8 artan konsantrasyonları ortak kültür zenginleştirilmiş tespit edildi. Benzer şekilde, bu MMP-1, MMP-2 ve MMP-10 de BrC hücreleri-monosit ortak kültürler ve güçlendiren önceki bulgular14böylece arttı bulundu. Bu makale, birincil BrC hücreleri yalıtım ve 3D kültürlerde test noktası noktası iş akışı temsilcisi sonuçları ile birlikte sunulur. Bu eser belirli yönleri ile tümör biyolojisi sorgulamaya vitro 3D hücre sistemleri sağlar büyük potansiyeli iyi bir örnek teşkil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BrC hasta örnekleri Unidad de Investigación tr Virología y kanser, hastane Infantil de México Federico Gómez doku bankasından elde edilmiştir. Bu çalışma bilimsel tarafından kabul edildi, etik ve Biyogüvenlik inceleme kurulları hastane Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética tr Investigación ve Comite de Bioseguridad. Tüm hastalar prospektif alındı ve çalışma doğası hakkında bilgi verilmiştir: Bu katılmak isteyen yazılı Onam numune toplama önce imzalanmış ve etik kuralları ve en iyi klinik uygulama göre tedavi edildi kurum. Katılımcılar kimliğini çalışma süresince anonimleştirilir. Hastalar dahil invaziv duktal Karsinom, histolojik grade 2 ve klinik evre II, doku rezeksiyon önce hiçbir önceki neoadjuvan tedavi ile tanısı konuldu. Hastalar ortalama 56.8 yaşında (Aralık 42-75) tüm kadın yaşlı olduğunu14.

1. 3D hücre kültürleri

  1. Tohum 0.1 x 106 MCF-10A hücreleri veya 25 cm2 kültür şişeler DMEM/F12 kültür %5 ile desteklenmiş orta ile birincil BrC hücrelerde at serum, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 100 ng/mL kolera toksini, 0,5 µg/mL hidrokortizon, 10 µg/mL insülin ve 20 ng/mL, Epidermal büyüme faktörü (EGF). Tohum 0.1 x 106 ticari BrC hücreleri, MCF-7 hücreleri ve MDA-MB-231 hücre 75 cm2 ' deki DMEM/F12 kültür %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş orta ile şişeler kültür. Oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya CO2 çevre.
  2. 48 saat sonra hücre monolayer steril 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 10 mL ile yıkayın. Hücre monolayer asitin % 0.05 tripsin ve 0,48 mM ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 5-10 dk 37 ° C'de 3 mL solüsyon ile trypsinize Trypsinization durdurmak için karşılık gelen bir serum 200 µL ve takviyeleri olmadan Orta 7 mL ekleyin. Hücreleri pipetting tarafından resuspend ve bir aliquot bir Neubauer odasında hücreleri saymak için 10 µL kaldırın.
  3. 8-şey odası slayt sistemin her kuyuya, saf ECME, bir kuluçka 37 ° C'de 30 dk ardından 40 µL tabanının yaymak
  4. Her kuyuya 800 hücreleri (olmadan fenol red) DMEM/F12 adım 1.1 ancak aşağıdaki değişiklikleri takıma 400 µL resuspended yer: birincil BrC hücreleri ve MCF-10A hücreler için 4 ng/mL EGF ve % 2 eklemek ECME; MCF-7 ve MDA-MB-231 için sadece % 2 eklemek ECME.
  5. Kültürler % oksijen 5 37 ° C'de kuluçkaya CO2 çevre. Kültür ortamı her 48 h değiştirin.
  6. Kayıt morfolojik hücrelerin her 24 h 15 gün boyunca bir optik mikroskobu ile değiştirir. Birincil BrC morfolojisi çözümlenecek hücreleri, MCF-10A ve MDA-MB-231 hücreleri iyi referans hücre sıralı acinar oluşumu ve düzensiz agresif kanser benzeri yapıları, örnekleri için sırasıyla çizgilerdir.
  7. Görüntü 100 X ve 200 X büyütme parlak alan mikroskobu hücrelerinin elde ve hücre morfolojisi başvuru MCF-10A ve MDA-MB-231 hücre hatları (şekil 1) ile karşılaştırın.

2. alma birincil kanser hücrelerinin tümör dokudan

Not: Tümör epitel hücreleri elde etmek için hiçbir önceki neoadjuvan tedavi ile BrC hastaların rezeke birincil tümörleri dokudan kullanın; nekrotik alanları önlemek ve en az 0.5 cm3 tümör dokusu ile çalışır.

  1. Tümör doku steril 1 x PBS ile durulayın ve mekanik olarak 1-2 mm parçalara neşterle disaggregate.
  2. Steril 20 mL cam şişe kapağı için 2 h (RT) oda sıcaklığında 2 mL takip çözeltisi ile dokusunda sindirmek: Ben ve 100 U/mL hyaluronidase DMEM/F12 orta içeren 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin mix 1 mg/mL collagenase türü , sürekli karıştırarak ile.
  3. Sterilize tül büyük parça sindirilmemiş doku ortadan kaldırmak için parçaları aracılığıyla elde edilen süspansiyon filtre. Daha sonra hücre süspansiyon ile sterilize edilmiş 100 µm gözenek membran filtre uygulayın.
  4. Hücreleri 430 x g RT, 5 min için de cips ve iki kez steril 1 x PBS ile yıkayın. Kültür Primer hücre DMEM/F12 orta % 5 at serum, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 100 ng/mL kolera toksini, 0,5 µg/mL hidrokortizon, 10 µg/mL insülin ve EGF 20 ng/mL ile desteklenmiştir. Her 48 h. koru kültürlerin bir oksijen %5 37 ° C'de orta yerine CO2 çevre.
  5. İzole hücreleri epitel hücreleri ile immunocytochemistry14standart bir protokol olduğundan emin olun. Üç epitel işaretleri test: cytokeratins (PanCK), bir panel müsin-1 (Muc-1) ve epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM).

3. ikincil kan hücrelerinden PM yalıtma

  1. Özü yaklaşık 40 mL periferik kan gelen sağlıklı bir gönüllü, bir 1:3 oran steril endotoksin Ücretsiz 1 x PBS ile kanda sulandırmak ve yoğunluk gradient ayırma konu.
  2. Konik bir tüp içinde bir polysucrose ve sodyum diatrizoate orta 2 mL 1.077 g/mL yoğunluğu ile yerleştirin. Dikkatli ve yavaş 8 mL sulandırılmış kan yerleşimi. Santrifüj 30 dk, RT. kullanım santrifüj yavaş hızlandırma-yavaşlama hızı de 765 x g için.
    Not: Santrifüjü sonra dört kat alttan üste kurdu: kırmızı kan hücreleri Pelet, yoğunluk gradient orta katman, mononükleer hücre Katmanı (ince beyaz yüzük görüntülenir) ve plazma katmanı.
  3. Dikkatli bir şekilde steril bir Pasteur pipet degradeyle mononükleer hücre katmanı almak ve her zaman daha yavaş Santrifüjü tarafından takip 1 x PBS ile üç kez yıkayın (430, 275 ve 191 x g) RT., 10 dk
  4. Hücre aktivasyonu önlemek için negatif seçim iletişim kurallarını kullanır. Böyle bir protokol örneği aşağıdadır:
    1. Mononükleer hücreler bir kez yıkama arabelleğe alınmış çözüm (% 0.5 sığır serum albümin, 2 mM EDTA içinde 1 x PBS) ile yıkayın. Neubauer odasında hücreleri saymak ve onları 1 x 107 hücreler/30 µL tamponlu bir çözümün bir yoğunluk için ayarlayın.
    2. Her 1 x 107 hücreler için reaktif ve anti-insan CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 ve Glycophorin A (ticari kitleri dahil) içeren bir monosit biotin-antikor kokteyl 10 µL engelleme FcR 10 µL ekleyin.
    3. Hücreleri mix ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Ekle ek bir 30 µL çamaşır arabelleğe alınmış çözüm artı 20 µL Anti-biotin lastikteki (kit ile birlikte); hücreleri mix ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
    4. Hücreleri bir kez tamponlu bir çözüm, RT, 5 min için 430 x g, santrifüj kapasitesi ile 1.5 mL resuspend yıkama çözüm manyetik ayırma için arabelleğe alınmış.
    5. Hücre süspansiyon önceden durulanır manyetik ayırma sütun üzerinde yük ve 7 mL tampon çözeltisi ekleyin. Monosit zenginleştirilmiş kesir 15 mL konik tüp içinde toplamak, hücreleri saymak ve hemen kültürlü değil, monosit 2 x 106 hücreler/1 mL % 50 FBS ve % 10 DMSO −80 ° C. ile takıma DMEM/F12 Orta yoğunluk, dondurma
      Not: Canlılığı tehlikeye girebilir gibi fazla 2 ay sonra dondurma, monosit kullanmaktan kaçının.
  5. %6 FBS, 100 U/mL penisilin ve oksijen %5 37 ° C'de 100 µg/mL streptomisin ile takıma DMEM/F12 ortamda PMs kültürleri korumak CO2 çevre.
  6. En az iki farklı bağışçılardan PMs kullanan bağımsız olarak, farklı bağışçılardan havuzu monosit monosit harekete geçirmek içinde neden olabileceğinden deneyler her kümesi gerçekleştirin.

4. 3D kurulması ortak kültürler

  1. Dolaylı etkileşim ile 3D ortak kültürleri
    Not:
    24-şey düz-alt kültür plakaları polikarbonat hücre kültür ekler 0.4 µm gözenek boyutu membranlar ile kullanarak bu testleri gerçekleştirmek. Bu tahlil, hem supernatants hem de hücreleri deneme sonunda alınabilir.
    1. 2 x 106 U937 ve THP-1 monosit 10 ml % 10 ile desteklenmiş RPMI 1640 orta yetiştirmek FBS, % 1 antibiyotik/antimycotic ve taze PMs desteklenmiştir (daha önce belirtilen adım olarak 3.5), bir oksijen %5 37 ° C'de orta DMEM/F12 yetiştirmek CO2 çevre.
    2. 4 x 105 monosit 1 ml/de onların karşılık gelen orta plaka (%2 ECME ve % 2 ile desteklenmiş FBS monosit, U937 ve THP-1 ya da %2 ECME ve % 6 FBS PMs için).
    3. Bir ekleme her kuyuya yerleştirin ve karşılık gelen ortamda 4 x 105 BrC hücre süspansiyon 0.9 mL ekleyin (takıma %2 ECME ve % 2 ile birincil BrC hücreler için serum FBS ticari hücre çizgi veya % 5 at). Toplam medya yarısı her 48 h değiştirin.
    4. Oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya CO2 çevre 5 gün ve supernatants kurtarmak. Daha sonraki analiz gerçekleştirilirse hücreleri tarafından trypsinization almak.
    5. Tek tek hücre kültürleri ile ilgili kitle iletişim araçları denetimler içerir.
  2. 3D ortak kültürleri ile doğrudan etkileşim
    1. Etiket BrC hücreleri ve hücre kültürü kültür mRNA ve protein ifade çözümlenmesi için sonra bağımsız her hücre soyundan sıralamaya izin vermek için önce farklı floresan boyalar ile monosit. Serbestçe canlı hücreler hücre membran geçmek piyasada bulunan türevleri coumarin ve rodamine kullanın. Etiketleme için genel bir iletişim kuralı şudur:
      1. BrC hücre (2 × 106 25 cm2 kültür şişesi hücreleri) ilgi monolayer hazırlamak ve yeterli Önceden ısıtılmış çalışma çözümü floresan boyalar (1:2, 000 standart temel orta floresan boya standart orta yerine herhangi bir ek). Oksijen %5 37 ° C'de 30 dk kuluçkaya CO2 çevre. Boya çözüm Aspire edin ve yavaşça ile yeterli durulama 1 x PBS. PBS Aspire edin ve standart orta ekleyin.
      2. Hücre monolayer 2 mL 5-10 dk 37 ° C'de % 0.05 tripsin ve 0,48 mM EDTA çözeltisi ile trypsinize Trypsinization durdurmak için FBS 200 µL ve takviyeleri olmadan muhabir Orta 7 mL ekleyin. Hücreleri pipetting tarafından resuspend. 10 µL Neubauer odasında hücreleri saymak için bir aliquot almak. Ortak kültür protokolü ile Hücre sayımı sonra devam.
      3. Hücreleri 430 x g RT, 5 min için de cips (Bu performans süspansiyon monosit büyümek beri ilk). Süpernatant atın ve yavaşça hücreleri floresan boyalar (1:2, 000 Takviyeler olmadan standart bir temel orta floresan boya), Önceden ısıtılmış çalışan bir çözüm 3 mL ile resuspend. Oksijen %5 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya CO2 çevre.
      4. Hücreleri tekrar cips, boya çalışma çözüm atın ve 5-7 mL 1 x PBS ile hafifçe resuspend. Bir kez daha cips, PBS atın ve 5-7 mL standart orta hücrelerde resuspend. 10 µL Neubauer odasında hücreleri saymak için hücre süspansiyon, bir aliquot almak. Ortak kültür protokolü ile Hücre sayımı sonra devam.
    2. Ortak kültür aşağıdaki gibi ayarlayın:: 4-şey odası slayt sisteminin her iyi bile bir katman oluşturmak için yeterli ECME kuyu dibinde yayıldı. İyi başına BrC hücre etiketli 5 × 105 içeren bir tek hücre süspansiyon, 20 µL plaka.
    3. 15-20 dk, kuluçka 37 ° C'de ekledikten sonra bir süspansiyon 2.5 x 105 etiketli monosit 80 µL tahlil orta (%60 ile desteklenmiş ECME).
    4. 15-20 dk 37 ° C'de kuvvetlendirmek ECME izin
    5. 1 mL 1:1 karışımı BrC hücreleri ve monosit kültür medya ekleyin.
    6. Oksijen %5 37 ° C'de ortak kültürler kuluçkaya CO2 çevre 24 h, 48 h veya farklı zaman noktalarda değişiklikleri izlemek için 5 gün için.
    7. ECM proteinler hücre kültürleri kurtarmak için bozulmasına yol açar. Aspire edin ve orta atmak, 0.5 mL 1 x PBS ile % 0,1 tripsin ve % 0.25 EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya Kuluçka sonra 1 x PBS % 10 ile 0.5 mL ekleyin FBS tripsin etkisiz hale getirmek ve hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmek için şiddetle pipetting tarafından resuspend için.
    8. Cips hücreleri 765 x g RT, 5 min için de, süpernatant atmak ve 5 mL 1 x PBS % 10 ile de hücrelerde resuspend FBS. Bir kez bu adımı yineleyin.
    9. Hücre süspansiyon Floresans aktif hücre (FACS) uygun araç ile sıralama tabi. Son nüfus en az % 95 saf olduğundan emin olun).
    10. Sıralama sonra steril 1 x PBS, pelet RT, 5 min için (430 x g) hücrelerle yıkama ve steril 1 x PBS resuspend. Hücrelerin RNA izolasyon ya da protein analizi için belirli protokollere göre işlenebilir.
    11. Her tahlil her tek hücre lineage 3D kültürleri denetimleri de dahil olmak üzere üç kez tekrarlayın.
  3. Kollajen bozulması değerlendirmek için 3D ortak kültürlerin doğrudan etkileşim
    1. 3D hücre ortak kültürleri 32,5 µg/mL türü IV kollajen floresein isothiocyanate ECME için etiketlenmiş ekleyerek ek bir adım ile 4.2, adımda açıklandığı gibi kurun. Kollajen IV ECME son konsantrasyonu % 0.5 olduğunu. Bir Petri yemeklerinde yerleştirilen bir 35 mm coverslip kültürlerde büyümek.
    2. Petri kabına dibinde ECME 40 µL tabakası yayıldı. 37 ° C'de kuvvetlendirmek ECME izin
    3. 2. 5 x 105 BrC hücreleri orta 10 µL içinde ekleyin ve yerleşmek hücreleri.
    4. 1,25 x 105 U937 monosit süspansiyon 40 µL tahlil orta (etiketli DQ-kollajen IV-ECME % 60'ı ile desteklenmiş) ekleyin.
    5. 15-20 dk 37 ° C'de kuvvetlendirmek ECME izin
    6. 2 mL 1:1 karışımı BrC hücreleri ve monosit kültür medya ekleyin.
    7. Ortak kültürler oksijen %5 37 ° C'de 5 gün kuluçkaya CO2 çevre. Kültür ortamı her 48 h değiştirin.
    8. Floresans emisyon confocal tarama mikroskop içinde analiz ve tümleşik optik yoğunluk (IOD) 50 µm2 kültürünün başına ölçün. IODs bireysel kültür ve kültür (Şekil 2) zaman sıfır karşı karşılaştırın.

5. Supernatants 3D kaynaklı analizi ile dolaylı etkileşimini ortak kültürler

  1. Ortak kültür 5 gün sonra supernatants üst ve alt bölmeler 3D ortak kültürlerin ve bireysel 3D kültür denetimleri kurtarmak. Her süpernatant pipetting tarafından karıştırın. Aliquot ve mağaza süpernatant −20 ° C kullanım (en çok bir ay) kadar.
    Not: Depolama bir aydan daha uzun olması durumunda supernatants −80 ° C devam et.
  2. Analiz tahlil platformlar, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) veya üreticinin önerilen prosedürleri aşağıdaki boncuk tabanlı uzun çoğullama ile supernatants.
    Not: Supernatants Ayrıca, Western blot tarafından analiz veya zenginleştirilmiş boyutu protein kesirler zymography analiz16,17gerçekleştirmek için almak için belirli gözenek filtreleri yoluyla yoğunlaşmıştır. Alternatif olarak, supernatants klimalı ortam olarak diğer deneyler için aşağıda açıklandığı gibi kullanın. Klimalı ortam genellikle bir 5 günlük kültür (şekil 3) elde edilir.

6. etkileri, Supernatants birincil BrC hücrelerden Acini oluşumu ve Acini yapısı karakterizasyonu

  1. Her şey bir 8-şey odası slaydın sistem ECME 40 µL tabanının yaymak ve 37 ° C'de 30 dk için kuvvetlendirmek izin
  2. Tohum 800 MCF-10A hücreler/iyi içinde adım 1.2 açıklandığı gibi ilave DMEM/F12 kültür orta 400 µL.
  3. İnsan rekombinant IL-1β 20 ng/mL ile klimalı ortam veya ilave DMEM/F12 kültür orta 400 µL ekleyin.
  4. Yer bir cam Petri 35 mm petri kabına içeren odası slayda bir nem ortamı oluşturmak için PBS 2 mL ile dolu.
  5. Medya/süpernatant her 48 h değiştirin.
  6. Glandüler acini oluşumu her 24 h 14 gün boyunca bir optik mikroskopla kaydedin.
  7. Acini, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) adlı bir toplama 100 100 µL ile Kültür 14 gün sonra leke hücre çekirdeği gözlemlemek için 1 x PBS nM. Sürekli karıştırarak RT adlı 25 min için kuluçkaya. Üç kez 5 min için 1 x PBS ile her zaman içinde sürekli RT. Mount floresan boyama için hazırlıklar belirli bir montaj orta ile karıştırarak durulayın. Mühür ile şeffaf Lehçe ve korumak ışık 4 ° C'de korumalı
  8. Acini acini (şekil 4A, B, C) farklı derinliklerde enine yığınları görüntülerini alarak confocal mikroskop ile analiz.
  9. Acini uygun boyama protokolleri ile farklı hücresel proteinler görselleştirin. Örneğin, E-cadherin hücre hücre adezyon, hücre polarite ve/veya Lümen oluşumu18 (şekil 4D) değerlendirmek için lekeli.

7. göç deneyleri

Not: U937 geçiş deneyleri gerçekleştirmek, THP-1 ve taze PMs polikarbonat kullanarak 24-şey düz-alt kültür tabak içinde kültür ekler 8 µm gözenek boyutu zarı ile hücre. Daha önce kemokinler GM-CSF, MCP-1 ve RANTES yüksek konsantrasyonda agresif BrC hücre hatları bireysel 3D kültürlerde salgılanan bulundu gösterilmiştir. Bu sitokinler monosit birincil tümör sitesine çekmek için kritik önerilmiş; Bu sitokinler chemoattractants kullanarak geçiş deneyleri içinde test edildi.

  1. Kültür U937, THP-1 veya taze PMs adım 4.1.1 açıklandığı gibi.
  2. Bir kez her INSERT RPMI 1640 200 µL sera membran hidrat olmadan ile yıkayın.
  3. Soğuk ECME 50 µL ile doldurmak, ekler bir 24-şey düz-alt kültür tabağına yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için polimerize ECME sağlar
  4. RPMI FBS olmadan 180 µL plaka üst bölümünde ekleyin. Ya 100 ng/mL ile GM-CSF, takıma RPMI kabarcıklanma 800 µL olmadan alt odasında eklemek MCP-1 veya chemoattractant olarak RANTES. Sitokinler olmadan orta bir negatif kontrol kullanın. 37 ° C'de Kemokin degrade oluşturmak için 30 dk için kuluçkaya.
  5. Monosit steril bir tüp, iki kez yıkama her tür yer 1.5 x 105 1 mL 1 x PBS ve RPMI FBS olmadan 20 µL RT. Resuspend monosit, 5 min için 430 x g, santrifüj ile yer onları ekler ve çok dikkatli bir şekilde (üst odası son hacmi ise 200 µL) hücre süspansiyon lunaparkçı.
  6. Oksijen %5 37 ° C'de 24 h için devam eden hücre göç izin CO2 çevre.
    Not: Monosit sigara yapışık olduğu için göçmen hücreleri genellikle alt bölmenin medyada olacaktır.
  7. Ekler kaldırmak, medya almak ve 2, 4, 6 ve 24 h Neubauer odası veya bir Akış Sitometresi kullanarak hücreleri saymak; Alternatif olarak, özellikle hiçbir hücre medyada bulunuyorsa, görüntüleri ekler alt kısmında bir dijital kamera ile elde etmek. Ortalama hücre sayısı (100 X büyütme), 3 rasgele alanlardan analiz (şekil 5) için kullanılır.

8. Invasion deneyleri

Not: BrC hücreleri istila deneyleri 24-şey düz-alt kültür plakaları 8 µm gözenek boyutu membranlar ile Polikarbonat hücre kültür ekler kullanarak gerçekleştirin. Özgün çalışmalarımız, Il-8 BrC hücre/monosit 3D ortak kültür supernatants zenginleştirilmiş sitokinler biriydi. Bu sitokin BrC hücre hatları işgali katılan olup olmadığını test edildi.

  1. 75 cm2 şişeler hücrelerde BrC genişletin. MCF-7, T47D, HS578T ve MDA-MB-231 olarak adımda 1.2 (ama ECME olmadan) ve birincil BrC hücreleri 2.4 adımda anlatıldığı gibi anlatılan.
  2. Orta (kullanılan orta bağlıdır test hücre kültürünü) sera olmadan 200 µL ile her polikarbonat 8 µm gözenek membran hücre kültürü Ekle sonra yıkayın membran hidrat için.
  3. Soğuk ECME (1:4 seyreltme ECME:cold orta FBS olmadan) 50 µL ekleme doldurmak, ekler bir 24-şey düz-alt kültür tabağına yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için polimerize ECME sağlar
  4. Sonra ECME polimerli, 180 µL FBS olmadan ilgili hücre medya ekleyin. 800 FBS olmadan µL medya ekleme yırtmaçlı aracılığıyla ekleyin. 37 ° C'de bir Il-8 degrade oluşturmak için 30 dk için kuluçkaya.
    Not: Kabarcıklar medyada oluşturmaktan kaçının. Kullanılan ortam FBS olmakla birlikte 100 ng/mL ile Il-8, chemoattractant veya FBS, negatif denetimleri olmadan saf medya olarak desteklenmiştir.
  5. 6 x 10 toplam5 hücreleri her hücre satırın aşağıdaki gibi elde edilir:
    1. Supernatants atmak, bir kez 10 mL 1 x PBS ile durulayın ve 2 mL % 0.05 tripsin/0.48 mM EDTA 2 min için 37 ° C hücreleri ayırmak için ekleyin. Tripsin reaksiyonu durdurmak ve şiddetle pipetting tarafından resuspend desteklenmiştir orta 4 mL ekleyin.
  6. 10 µL Neubauer odasında hücreleri saymak için hücre süspansiyon aliquot al. 6 x 105 hücreleri içeren hücre süspansiyon, bir birim alır. RT, 5 min için 430 x g, santrifüj kapasitesi, süpernatant atın ve 1 mL 1 x PBS hücrelerde durulayın. Durulama bir kez daha yineleyin.
  7. İlgili medya FBS olmadan 20 µL hücrelerde ve 180 µL FBS olmadan ilgili medya içeren ekler yerde resuspend. Dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon pipetting tarafından lunaparkçı.
  8. Oksijen %5 37 ° C'de 48 h için ilerleme cep işgali izin CO2 çevre.
  9. 48 h sonra Ekle Kaldır, süpernatant atmak ve INSERT bir kez çok dikkatli bir şekilde 1 x PBS 200 µL ile durulayın. Pamuk uçlu bir aplikatör ile PBS fazlalığı kaldırın.
    Not: Bu durumda hücre nerede gibi invaziv hücreleri genellikle eklemek diğer tarafına bağlı yapışık.
  10. 1 mL içeren bir 24-şey düz-alt kültür kalıbının kuyuya ekleme yerleştirerek hücreleri tamir/RT sonrası 15 dakika için de %4 paraformaldehyde ekler bir kez 1 x PBS ile durulayın.
  11. Hücreleri ekleme 1 mL içeren 24-şey düz-alt kültür plaka/1 x PBS ile % 0,2 kristal violet, RT. dikkatle, 45 dk ile pamuk uçlu aplikatör çıkarmak membran tepesinden bütün ECME için de bir kuyu yerleştirerek leke , değil göç hücreleri içeren ve ortadan kaldırarak önlemek için çok dikkatli bir şekilde distile su ile durulama invaziv hücreleri sabit.
  12. İşgal hücreleri ters mikroskop altında Ekle alt tarafında gözlemleyerek saymak. 3 rasgele alanları (100 X büyütme) üzerinden ortalama hücre sayısı kullanılır. Nerede hücreleri kümeleri istila ve tek tek saymak zor durumlarda 3 rasgele alanları (100 X büyütme) görüntülerden bir dijital kamera ile elde etmek. Görüntüleri görüntü analizi için yazılım ile analiz ve hücre işgali (şekil 6) ölçmek için IOD kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfolojik analiz 3D kültürlerde BrC hücre:

Düşük ve yüksek yoğunlukları, 3D kültürlerde büyüyen birincil BrC hücre morfolojisi 5 gün içinde incelenmiştir. İlk 48 saat boyunca hücreleri ECME için uygun ve düşük yoğunluklu korumak. Zaman bu noktada, bu açıkça hücreleri uzun bir iğ benzeri şekli, bazı iki veya daha fazla uzun sitoplazmik projeksiyonlar ile ve belirgin hücre-hücre kişiler belli etmeden mevcut takdir edilebilir. Kültür 5 gün sonra ilk onların morfolojisi koruyarak hücreleri hızla. Ayrıca, belirli bir yapısal organizasyon olmadan ağlar benzeyen yapılar oluşur ve hiçbir temas inhibisyonu ile kazıklı görünür. Hangi küresel yapıları glandüler acini benzeyen formu olmayan dönüştürülmüş MCF-10A hücreleri ile bir karşılaştırma yapıldı. Bu hücreler yuvarlak iyi sınırlandırılmış ve düzenli yapıları karakteristik bir Morfoloji (Toplam yaklaşık 50 µm) homojen boyutlarda görüntüler. Aksine, bir daha yakın kadar benzerlik agresif BrC hücrelerle MDA-MB-231 (şekil 1) payının birincil BrC hücreler.

Hücre hücre doğrudan etkileşim ve kollajen bozulması analizi:

Biz aşağıdaki değerlendirmek için 3D ortak kültür model tasarlanmış: hücre morfolojisi, kollajen bozulması, hücre göç, ve BrC hücreleri ve monosit ortak kültür arasında doğrudan bir etkileşim olsun. 5 gün sonra hem MCF-7 ve MDA-MB-231 ticari BrC hücreler düzensiz toplamları 3D kültürlerde formu, ancak, onların morfolojisi farklı. Agresif hücreleri MDA-MB-231 formu uzun formlarla saldırgan olmayan MCF-7 hücreleri nerede hücreleri yuvarlak şekiller korumak ve daha yoğun sıkıştırılmış (Şekil 2 gibi görünüyorlar toplamları sahipken diğerlerinden ayırmak için eğilimi bazı hücreler ile toplar. A, B). DQ kollajen IV proteolitik bozulması (yeşil), floresan faaliyet sergileyen iki BrC kültürlerle görselleştirmek için kurulmuştur. Kantitatif proteolitik aktivite değerlendirmek için yeşil Floresans altı 50 µm2 alanlarını IOD ölçülmüştür. Bir karşılaştırma arasında bireysel 3D MDA-MB-231 hücre ve ortak kültürler U937 monosit ile yapılmıştır. Proteolizis ortak kültür (Şekil 2C) istatistiksel olarak anlamlı artış gözlendi. Ayrıca, her 10 µm MDA-MB-231 seri enine confocal mikroskobu analizini yerleştirir ve ortak kültür U937 monosit (Şekil 2D) gerçekleştirilen. Bu çözümleme U937 monosit birkaç monosit BrC hücre tabakası ulaşan karşı agresif hücreleri MDA-MB-231 göç ortaya. Ancak, hücre-hücre doğrudan etkileşim siteleri mutlaka daha yüksek proteolitik aktivite alanları ile rastlayan değil ki açıktı: Bunun yerine, kollajen bozulması alanlarında düzgün kesmesi için önde gelen Kültür, bu kollajen yaymak bozulması dolaylı iletişim tarafından salgılanan faktörler aracılı sonucuydu. Bu nedenle, 3D ortak kültür modeli farklı bölmeleri tarafından salgılanan faktörlere bağlı olarak hücre-hücre iletişim sağlamak için gözenekli bir zar ayrılmış hücreleri yerleştirmek ve etiketleme ve kültür sonra sıralama hücre önlemek için değiştirildi.

Il-1β Supernatants 3D kültürlerden içinde analizi:

Dolaylı etkileşim 3D kültürler, bireysel birincil BrC den supernatants ile çalışan ve onların 5 gün ortak kültürler PM ile hasat edildi. Bu supernatants 18 sitokinler ve 5 MMPs ticari kitleri ve bu analiz için özel olarak tasarlanmış bir araç kullanarak eş zamanlı analizine tabi tutuldu. Test bütün analitler birincil BrC hücre-monosit co kültürlerde, malign ilerleme15ile, önceden ilişkili olan her iki çok önemli inflamatuar sitokinlerin IL-1β ve Il-8, önemli ölçüde yüksek düzeyde gözlenmiştir 18 , 19 , 20 (şekil 3; sonuçları IL-1β için). Bu örnek analiz 3D kültürler tümör microenvironment şekilleri iletişim ağı taklit etmek için izin ver başka bir türüdür.

Supernatants ve Acini yapısı karakterizasyonu:

Nerede MCF-10A model oncogenesis, ister değerlendirilmesi ile ilgili mekanizmalar olarak kuruldu Debnath, Muthuswamy ve Brugge7tarafından Gelişmiş 3D deneysel sistem temelinde birincil BrC hücreden salgılanan faktörler supernatants MCF-10A 3D acini benzeri yapıları, iletim viral ve hücresel oncogenes7,21 gerçekleştirmesinden sonra gözlenen etkinliği benzer oluşumu etkiledi. MCF-10A hücreleri iki birincil BrC hücre satırlarından Lümen oluşum (olarak bir ölçü anoikis direnç) gözlemlemek için iki farklı supernatants ile ekili. Gün 14, pulcuklarının 0, 25, 50, 75 ve % 100 derinliği confocal mikroskobu enine keser tarafından değerlendirildi ve her iki durumda da, o MCF-10A hücreleri yapmamış anoikis (ölçülen acini (şekil 4 Merkezi (luminal) hücre sayısı sayarak bulundu B, C)). Böylece, BrC hücrelerden şartına medya ile kurulan MCF-10A hücre acini onun standart kültür ortamı ile (olarak açıklandığı adım 1.2) (şekil 4A) yetiştirilen MCF-10A aksine iyi biçimlendirilmiş bir oyuk Lümen eksikliği. 3D ortak kültür sistemi içinde çok IL-1β salgılanan; Bu nedenle, MCF-10A hücreleri de insan rekombinant IL-1β18ile ekili vardı. Şekil 4 D confocal mikroskobu enine acini IL-1β (alt panelleri) varlığında % 50 derinlikte kesmek gösterir ve bu sitokin aynı zamanda anoikis direnç confers ortaya koymaktadır. Böylece, çözünür faktörler gibi IL-1β, birincil BrC hücreleri tarafından salgılanan ECM etkileşimleri, kaybetmek dönüştürülmüştür MCF-10A hücreleri invaziv kanserlerin karakteristik bir yaşama teşvik.

3D ortak kültürler monosit geçirilmesi ve kanser hücrelerinin işgali ile ilgili bir enflamatuar yanıt teşvik:

Biz daha önce 3D kültür birincil BrC hücrelerde pro-inflamatuar kemokinler monosit14çekmek için bilinen yüksek bazal düzeyleri salgılar gösterdi. Böylece, monosit BrC hücreleri şartına medyada zenginleştirilmiş yanıt buldum kemokinler olarak göçmen kapasiteleri analiz ettik. Ticari monosit U937 ve THP-1 ve taze PMs göçmen kapasitesini üç farklı kemokinler karşılık olarak değerlendirildi: GM-CSF, MCP-1 ve RANTES. U937 ve THP-1 monosit GM-CSF ve MCP-1, en duyarlı olarak U937 ile karşısında her iki monosit RANTES için boş bir yanıt varken geçiş yetenekli olduğunu. Önemlisi, PMs yüksek Bazal göçmen etkinlik ve MCP-1 (şekil 5) en güçlü tepki gösterdi. Il-8 de birincil BrC hücreleri ve monosit 3D co kültürünü sonra zenginleştirilmiş. Il-8 ticari ve birincil BrC hücre hatları işgali kapasitesini değiştiren olup olmadığını Böylece, analiz ettik. Saldırgan olmayan (MCF-7 ve T47D) değil işgal ederken ticari agresif BrC hücre hatları (HS578T ve MDA-MB-231) Il-8, yanıt olarak işgal etti. Doğal olarak, birincil BrC hücreleri daha invaziv ticari agresif BrC hücre hatları Il-8 (şekil 6A, doğru kapı aynası) karşılık olarak daha vardı. Bazı durumlarda, hücre kümeleri istila ve bu nedenle IOD analiz gerekli (şekil 6B).

Figure 1
Resim 1 : 3D kültürlerde BrC hücrelerinin temsilcisi görüntüler. Soldan sağa: Sigara dönüştürülmüş MCF-10A hücreleri ile karakteristik glandüler acini, şekillendirme kontrolünü yuvarlak Morfoloji, iyi sınırlanmış hücre kişiler ve organize homojen boyutları (yaklaşık 50 µm ortalama, optik büyütme üzerinde yapıları 200 X). Orta kapı aynası düşük yoğunluklu (2 gün) ve yüksek yoğunluklu (5 gün) kültürlü birincil BrC hücreleri gösterir. Hücreleri ECME için uygun ve düşük yoğunluklu erken zaman noktalarda korumak. Bu hücreler bir uzun iğ benzeri şekli, bazı iki veya daha fazla uzun sitoplazmik projeksiyonlar ile ve hiçbir belirgin hücre-hücre adezyon ile mevcut açıktır. Öte yandan, daha sonra noktalarda yüksek yoğunluklu hücreleri belirli bir yapısal organizasyon olmadan ağlar benzeyen yapılar kurdu. Bu hücreler kazıklı çıktı hiçbir temas inhibisyonu gösterilen kadar. Bir denetim ticari MDA-MB-231 hücre 3D kültür 5 gün sonra gösterilir; Bu agresif BrC hücreler birincil BrC kültürleri (100 X optik büyütme) ile bir çok daha yakın benzerlik paylaşın. Ölçek temsil 50 µm. 800 hücreleri bar deneyin başında seribaşı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : ECM bozulması analizini. 3D koşullarında 5 gün boyunca ekili kırmızı fluorochrome (B) ile lekeli sarı fluorochrome(a)ve agresif MDA-MB-231 hücreleri ile sigara agresif MCF-7 hücreleri lekeli; 0.5 yeşil Floresans etiketli kollajen IV % ECM bozulması görselleştirmek için kurulmuştur. A ve B, üst sol resimler kollajen bozulması düzeylerini göstermek, üst sağ panelleri optik resimler temsil, sol alt BrC hücreleri gösteren ve floresan ve optik birleştirme alt doğru kapı aynası göstermek görüntüleri. A ve Biçin 200 X optik büyütme ve ölçek çubuğu 100 µm olarak sunulmaktadır. ECM proteolizis MDA-MB-231 3D ortak kültür U937 monosit ile karşılaştırıldığında (C) temsilcisi görüntülerini ECM proteolizis (yeşil) denetimi, olarak bireysel MDA-MB-231 hücre 3D kültüründe. Ölçek çubuklar 10 µm gösterir. Her durum altı 50 µm2 alanlarının IOD (tümleşik optik yoğunluk) ölçüldü. Ortalama ve standart hata quantifications üzerinden (SEM) ortalamaya sunulur; iki yıldız p < 0,01 (Mann-Whitney testi) ile istatistiksel olarak anlamlı bir fark gösterir. (D) doğrudan etkileşim MDA-MB-231 hücre (gri gölge kitle) ile fluorescently lekeli U937 monosit (turuncu); Yeşil Floresans proteolizis için karşılık gelir. Seri dilimleri oluşturulan her 10 µm Yerelleştirme ve her iki hücre hatları arasındaki doğrudan etkileşim adrese confocal mikroskobu tarafından. 200 X optik büyütme; ölçek çubukları temsil 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: IL-1β konsantrasyon 3D co kültürlerde arttı. IL-1β düzeyleri (pg/mL) hücrelerden ayrı ayrı 3 boyutlu (3D) kültürlü ve kendi 3D ortak kültürlerini karşı PM (CC) ile karşılaştırıldığında sekiz (PC1-8) birincil BrC, supernatants bir temsilcisi sonucu. AM bireysel 3D kültür kontrolünü karşılaştırma için (AM) dahil edildi. Sonuçlar nerede çeşitli sitokinlerin aynı anda her örnekte bir immunodetection tabanlı teknik ticari bir kit mevcut aracılığıyla algılanan bir daha büyük çoğullama analiz elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Birincil BrC hücrelerden salgılanan faktörler neden anoikis sigara dönüştürülmüş MCF-10A hücrelerdeki direnci. MCF-10A hücreleri ile standart kültür içinde bu acini tipik içi boş Lümen (% 25-75 derinlik) ile kırmızı bir kare vurgulanır; mevcut görülebilir medya (sütun A ve d üst panelleri), 3D ortamlarda yetiştirilmiştir MCF-10A hücreleri iki birincil BrC kültürler (B ve C sütun) iki farklı supernatants ile yetişkin, Lümen anoikis direnç ifade eden hücrelerle içi boş ama dolu değildir. Benzer şekilde, ne zaman MCF-10A hücreleri kültürlü insan rekombinant IL-1β ekleyerek 3D ortamlarda (20 ng/mL), içi boş yok Lümen % 50 derinlik confocal mikroskobu bölümleri acini (d alt panelleri) takdir edilebilir. Şu oval karikatür 0, 25, 50, 75 ve %100 acini derinlikte yapılmıştır confocal mikroskobu bölümler temsil eder. Resimleri DAPI (mavi) ve E-cadherin ile yeşil lekeli çekirdek göster. Optik büyütme 200 X ölçeği çubuklar gösterir 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Monosit göçmen kapasitesi. U937, THP-1 ve yanıt olarak GM-CSF, MCP-1 PM göçmen kapasitesi temsilcisi görüntüleri ve RANTES. Kemokin olmadan dahil (ilk sütun soldan sağa) denetimleridir. Görüntüleri aşağıdaki sayıları her durumda göçmen hücreleri olduğunu gösterir; PM bir yüksek göçmen kapasite başınagösterdi ve MCP-1 en duyarlı hücrelerin U937 ve THP-1 monosit GM-CSF ve MCP-1, esas olarak duyarlı bulunmuştur. 100 X optik büyütme; ölçek çubukları temsil eden 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Agresif ve birincil BrC hücreleri istila Il-8 yanıt. A. işgali deneyleri ile iki saldırgan olmayan (MCF-7 ve T47D), iki son derece agresif (HS578T ve MDA-MB-231) BrC hücre satır ve Il-8 chemoattractant kullanılan yanıt olarak bir birincil BrC kültür. Üst panelleri olmadan hiçbir istilası, Il-8, yanıt son derece agresif BrC hücreleri ve hücre kültür Ekle membran istila birincil BrC hücreleri ile alt panelleri göster gösterilen Kemokin denetimlere karşılık gelir. B.örnek kümelerde istila hücre; Bu durumlarda, alan başına IOD (tümleşik optik yoğunluk) açısından işgali belirlemek için bir görüntü analiz programıyla işgalinin ölçümleri yapılır. Görüntüleri aşağıdaki sayıları her durumda işgal hücre sayısını gösterir. 100 X optik büyütme; ölçek çubukları temsil 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitel hücreleri bir 3D kayma uyum içinde büyümek ve ECM proteinler ile onların etkileşim doku homeostazı için çok önemli. Monolayers (2D) yetiştirilen hücrelerde tabanlı birçok kanser çalışmaları ve onlar tümör oluşumu ve ilerleme birçok açıdan anlamak için kritik olmasına rağmen monolayers için hücrelerdeyse, ECM dayatır özellikleri özetlemek değil Örnek: sınırlayıcı yayılması, yapışma bağımlı hücre hayatta kalma, apikal demiri polarite, ECM remodeling, hücre farklılaşması, vb Önemlisi, sadece tümör hücreleri ve ECM arasındaki etkileşimi kanser ilerlemesi için önemlidir, ama aynı zamanda tümör ve bağışıklık hücreleri gibi sigara tümör hücreleri arasında iletişim kurulan. Burada sağlanan iletişim kuralları tarafından ECM, inflamatuar yanıt bu etkileşimler tarafından terfi sağlanan ve inflamatuar bu koşul oluşturmak nasıl bağışıklık hücreleri ve kanser hücrelerinin ortamında arasındaki etkileşimler anlayış kolaylaştırmak bir pozitif döngü chemoattraction monosit ve kanser hücrelerinin daha fazla işgal teşvik.

ECME kullanarak büyük bir avantaj biyolojik iskele deneysel 3D çeşitli gerçekleştirmek için uygun22modelleri sağlar olduğunu. ECM proteinler laminin, kollajen IV, entactin, heparan sülfat proteoglikan ve büyüme faktörleri, hangi içinde vivo epitel hücreleri ile etkileşim olacak gibi ile zenginleştirilmiştir. Çünkü fare sarkomlar lysates gelir, konsantrasyon bileşenlerinin farklı birçok arasında değişir bir dezavantajdır. Yani, daha homojen verileri elde etmek için birkaç birçok bir sürü karakterize etmek genellikle gereklidir. Laboratuvarda, her yeni çok iki şekilde test: hücre satırları köklü invaziv kapasitesi 1) tarafından doğru acini oluşumu MCF-10A hücre değerlendirmek ve 2) tarafından BrC invasiveness değerlendirilmesi. Bir sentetik nanofiber peptid iskele var. hidrojel gibi diğer iskele ürünleri ile çalışmak için başka bir seçenektir. 3D kültür sertliği hidrojel23,24konsantrasyonu ayarlayarak denetlenebilir. Önemlisi, bu sistem neoplastik hücre ve hematopoetik herhangi bir tür veya sigara hematopoetik hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için uygulanabilir. Hatta iki farklı hücre soy kullanarak daha karmaşık sistemleri tasarlamak mümkün olabilir. 3D modellerin bir önemli avantaj hücre morfolojisi ve hücre organizasyon oncogenic dönüştürme sırasında değiştirilmiş ECM etkileşimleri şekillendirdiği çalışma sağlamasıdır. Aynı şekilde, bir oncogenic şekil öyle aynı derecede proteolitik bozulması, okuyabilir ve hücreleri başlangıçta doğrudan etkileşim/iletişimi teşvik için kültür sinyal birbirlerine farklı katmanlarda yer olup olmadığını. Ayrıca, böylece onlar kullanarak, örneğin RNA ve/veya protein ifade analiz13her tek hücre türü için belirli soruları için deneme sonra izole olabilir farklı hücre soy ile farklı fluorochromes etiketli. Burada, tümör hücreleri ve monosit Malign ilerleme tetikleyen arasındaki dolaylı iletişimde bu sitokin, olası bir rol destekleme IL-1β salgı birincil BrC hücreler/PM co kültürlerde orta gösterilir.

Başka bir önemli deneysel protokol laboratuvarda 3D kültürlerde acini oluşumu MCF-10A hücreleri olmayan dönüştürülmüş analizidir. Bu tahlil viral ve hücresel onkogen için test etkinliği ve nasıl etkilediği tümör microenvironment özellik için agresif kanser ile ilgili test etmek için kullanılmıştır. Örneğin, acini normal gelişimi sırasında luminal Merkezi hücreleri (ECME tarafından sağlanan) Bazal membran proteinlerinin ile kaybetmek hücre ölümü mekanizmaları uyarının harekete geçirilmesine karşılık, anoikis da bilinir. Her iki supernatants birincil BrC hücreleri veya rekombinant IL-1β MCF-10A hücreleri direnç anoikis için teşvik gözlendi. IL-1β yüksek konsantrasyon BrC hücre-monosit etkileşim yükseltilir, bu gözlem tümör stroma son derece agresif aşamalarında tümör ilerleme ayrılmaz bir parçasıdır destekler.

Burada açıklanan geçiş ve işgal protokolleri yararlı 3D tamamlayıcı deneyleri içinde biz hücreleri geçiş veya tümör stroma türetilmiş uyaranlara yanıt olarak işgal kapasitesini destekleyebilir oluşturmaktadır. Bu yüksek konsantrasyonlarda birincil BrC hücre 3D kültürlerde bulundu kemokinler (GM-CSF ve MCP-1) U937, göç teşvik edebilirsiniz gösterildi THP-1 ve PMs, pro-inflamatuar microenvironment tanıtmak için agresif tümör hücreleri yeteneğini destekleme. Ayrıca, ticari agresif BrC hücreleri (HS578T ve MDA-MB-231) ve birincil BrC hücreleri artan işgali terfi de BrC hücreler/monosit, supernatants ortak kültürler içinde artan konsantrasyon içinde bulunur Il-8.

Hücre durumu ile ilgili olarak, onlar kendi nükleer silahların yayılmasına karşı en yüksek yararlanmak ve vitro kaynaklanan potansiyel sonrası yalıtım genetik ve epigenetik değişiklikler önlemek için on pasajlar ulaşmadan birincil BrC hücrelerle çalışmak önemlidir Kültür. Primer hücre ile çalışırken başka bir önemli yönü yalıtım sonra kimliklerini onaylamak içindir. Biyolojik bir panel PanCK, Muc-1 ve EpCAM (2.5 adımda belirtilen) içerir epitel lineage kimliklerini belirlemek için kullanılır. Benzer şekilde, onlar farklılaşma aynı aşamada olan güvence her toplu iş iş hangi test edilmiş taze PMs kullanmak tercih edilir. Kullanılan her yeni toplu fenotip CD34negatif CD11bpos CD14pos CD64pos CD68negatif CD16negatifolmayan aktif olgunlaşmamış monosit karşılık gelen, sundu. Önemlisi, biz monosit olarak monosit harekete geçirmek sonuçlarında karıştırma farklı bağışçılardan birlikte kullanmayın. Bunun yerine, bağımsız olarak BrC test en az iki farklı bağışçılardan monosit kullanarak ortak kültürler.

3D kültür sistemleri hala tümör Biyoloji sadece birkaç unsurları güvenilir modellenebilir aynýsýna sahiptir. Organoids, genişleme ve kök hücre farklılaşma temel alan daha karmaşık 3D modelleri yeni bir alternatiftir tüp bebek. Organoids da son derece organize epitel yapıları geliştirmek. Gastrik 25,26, 27karaciğer ve böbrek organoids28örnekler. Ancak, organoid modelleri her insan organı için elde kalır; Ayrıca, onlar çok daha karmaşık ve pahalı deneysel koşullar gerektirir.

Sonuç olarak, burada biz ayrıntılı olarak iş akışı deneyleri tarif: yalıtım nasıl o inflamatuar microenvironment onları işe almak için hizmet test BrC hastalarda inflamatuar kapasitelerini bir 3D kültür ECME tabanlı modeli sınama, tümör hücrelerinin başlayarak ek inflamatuar hücreler, monosit sonunda hücre türleri, hem nasıl o iletişim daha fazla ilerleme daha agresif kanseri aşamaları için teşvik bir inflamatuar microenvironment teşvik arasındaki iletişimi analiz için gibi. Ayrıca, morfoloji ve fenotip birincil BrC hücre açıklanmaktadır. Gelecekte çalışmaları, test diğer inflamatuar hücreleri veya bile BrC hücreleri ve genellikle tümör stroma içinde bulunan birden çok hücre arasındaki iletişimi test ilginç olacaktır. Bu birden çok hücreli 3D kültürler içinde vivo biyolojik olarak kanser ilerlemesi sırasında neler daha büyük bir resim sağlar. Vitro veri ve hastanın klinik sonuçlar arasında karşılaştırmalar kanser saldırganlık üzerinde daha yüksek bir etkisi potansiyel mekanizmaları tanımlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar herhangi bir çıkar çatışması yok bildirin.

Acknowledgments

Bu eser CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE Proje No 233061 Ezequiel M. Fuentes-Pananá için ve Fondo de Apoyo a la Investigación, hastane Infantil de México Federico Gómez (proje numarası HIM-2014-053) tarafından desteklenmiştir. Espinoza-Sánchez NA Programa de Doctorado tr Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autonoma de México (UNAM) ve alınan bursu 231663 CONACYT gelen doktora öğrencisidir. E-S NA, da Meksika Enstitüsü sosyal güvenlik (IMSS) tarafından sağlanan mali destek kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95, (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8, (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18, (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3, (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2, (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11, (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65, (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16, (1), 118-126 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics