Задняя полукружных канала подход для доставки генов внутреннего уха у новорожденных мышей

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

В этом исследовании мы описываем задняя полукружных канала подход как надежный метод доставки генов внутреннего уха у новорожденных мышей. Мы показывают, что ген доставки через задний полукружных канала возможность perfuse всего внутреннего уха.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Внутреннее ухо генной терапии предлагает большие перспективы для потенциального лечения потеря слуха и головокружение. Одним из решающих факторов успеха внутреннего уха генной терапии является найти метод доставки, который приводит к постоянной трансдукции эффективности типов целевых клеток при сведении к минимуму потери слуха. В этом исследовании мы описываем задняя полукружных канала подход как действенного метода доставки генов внутреннего уха у новорожденных мышей. Мы показывают, что ген доставки через задний полукружных канала возможность perfuse всего внутреннего уха. Легко анатомические идентификации задняя полукружных канала, а также минимальная манипуляция височной кости требуется, сделать это хирургический подход привлекательным вариантом для доставки генов внутреннего уха.

Introduction

Внутреннее ухо генная терапия является быстро развивающейся области расследования. Она применялась в различных моделях животных к борьбе с ототоксичность, шум травмы и наследственный слуха потери1. Несколько недавних исследований показали функциональное восстановление слуха и равновесия функций мутантных мышей после внутреннего уха генной терапии доставки2,3,4,5,6, 7. одним из ключевых факторов в определении успеха внутреннего уха генной терапии является хирургический метод, используемый для доступа к внутреннему уху. Идеально хирургический подход будет легко выполнять, анатомические ориентиры будут последовательно и легко идентифицировать, и результирующая трансдукции типов целевых клеток будет высоким.

В недавнем исследовании мы показали, что при вирусных генной терапии было впрыснуто через задний полукружных канала черная мутант мыши (модель потери слуха и вестибулярной дисфункции), эффективный трансдукции Сензорные клетки волос был замечен в вестибулярного органы, а также как и улитки5. Высокая эффективность сенсорные клетки волос трансдукции привело к улучшению слуховые и вестибулярные функции в этих мутантных мышей.

В этой статье мы подробно описать подход задняя полукружных канала для доступа к неонатальной мыши внутреннего уха.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные процедуры были утверждены животное уход и использование Комитета при Национальном институте по глухота и других расстройств коммуникации (NIDCD ASP1378-15).

1. Процедура установки и подготовки

  1. Простерилизуйте все инструменты, окись этилена в начале эксперимента. Между животными чистые инструменты с использованием бисера стерилизации.
  2. Загрузите решение, содержащее вирусный генной терапии в микропипеткой на микро инжектор. Вирусный вектор, используемый в данном исследовании был AAV2/8-whirlin (копии генома13 1 x 10 на миллилитр, таблица материалов).
    Примечание: Как правило, 1.1 мкл общий объем загружается в микропипеткой.

2. анестезия

Примечание: Штамм мыши, используемые в данном исследовании является черная мышь. Гомозиготная мутантов (wi/wiWhrn) и гетерозиготных однопометники (Whrn+/ wi) были использованы.

  1. Место матери в отдельной клетке (отдельно от помета).
  2. Место дома клетки, содержащие помет (P0 - P5 щенков) на площадку рециркуляции тепла (комплект на 37,5 ° C) чтобы согреться мышей.
  3. Вырезать часть пальца латексных перчаток и место щенка в нем.
  4. Поместите щенка в латексных перчаток пальца в ведро льда для ~ 2 мин.
  5. Место наркотизированных щенка на большой площади коммерческих пластиковые замораживание пакет с 4 "x 4" марлю между щенком и пакет поверхности.
  6. Заполните тяжелых латексные перчатки с колотым льдом и поместите лед перчаткой вокруг щенка.
  7. Проверьте, чтобы увидеть, если щенок адекватно наркоз, полное отсутствие любого ответа на различные стимулы (в том числе щепотку фирмы мыс). Оставьте щенка на лед в течение операции (приблизительно 5-10 мин).
    Примечание: Мы рекомендуем, оставляя щенят на лед не более 15 минут во время операции.

3. хирургический подход (рис. 1)

  1. Очистите кожу за ухом с йода очистки и очистки спирта после наркоза животного.
  2. Сделать заушной разрез ~ 2 мм позади уха, с помощью микро ножницы и разделить ключично мышцы с микро ножницы.
  3. Идентифицировать лицевого нерва и буллы. Буллы хрящевой и полупрозрачные в этом возрасте, и он находится медиальнее лицевого нерва. Stapedial артерии можно увидеть через буллы в этом возрасте, который является полезным ориентиром.
  4. Следуйте лицевого нерва, главно и кзади найти задней полукружных канала (PSCC). Удаление мышечных волокон и мягких тканей, обволакивающие задняя полукружных канала с помощью микро ножницы.
    Примечание: PSCC хрящевой в этом возрасте.
  5. Проникать PSCC с использованием стекла микропипеткой (~ 10 мкм в диаметре) на микро инжектор.
  6. Inject вирусный генной терапии в внутреннего уха.
    Примечание: Как правило, в общей сложности 20 инъекций 49 nL генной терапии поставляются в задней полукружных канала более ~ 40 s (общий объем ~ 1 мкл). Вирусная титр используется был 1 x 1013 генома копий / мл.
  7. Закройте разрез кожи с помощью швов полиглактин 5-0.

4. послеоперационный уход

  1. Место щенка на потепление площадку, чтобы восстановить нормальную температуру тела при восстановлении от анестезии с постоянной ручной стимуляции/rolling с перчатке человеческие пальцы.
  2. Как только щенок проснулся, поместите его обратно в свои дома клетке.
  3. Ласкать каждого щенка с ватным тампоном, который подвергается постельные принадлежности дома Кейдж.
    Примечание: Цель этого является иметь запах, как они это делали до операции, который увеличивает вероятность матери, вновь принимая ее помета послеоперационный мышей. Если возможно мочи от матери может собраны и потер на щенков, используя ватный тампон для дальнейшего снижения вероятности отказа.
  4. Применять минеральные масла к матери нос Десенсибилизировать ее8и вновь мать в дома клетку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Инъекции AAV8-whirlin генной терапии в неонатальной черная мышей через задний полукружных канала привело к whirlin выражение (зеленый) в утрикулярной волосковых клеток (рис. 2), с общей эффективности инфекции 53,1% (SD 38.1, n = 28)5 . Transduced клетки волос удлиненные stereocilia (красный), по сравнению с клетки волос от контралатеральной не вводили уши (5.35 ± 2.11 мкм — 3,20 ± 0,34 мкм, соответственно)5.

Инъекции задняя полукружных канала AAV8-whirlin также привела к трансдукции улитковый клетки волос в Черная мышей (рис. 3). Средняя внутренняя волосы инфекции фотоэлементов был 77,1% (SD 12.7, n = 8)5. Transduced клетки волос выразил whirlin (зеленый) на stereocilia советы и удлиненные stereocilia (красный), по сравнению с клетки волос от контралатеральной не вводили уши (5.04 ± 0,72 мкм против 1.01 ± 0,08 микрон в улитковый Апекс, соответственно)5.

Figure 1
Рисунок 1 : Интраоперационная изображений.
Интраоперационная изображения показаны Хирургический доступ к задней полукружных канала (PSCC) в мыши P0. Показано левое ухо. PSCC изложил в черные пунктирные линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Вестибулярные клетки волос являются преобразованы с помощью доставки генов PSCC.
AAV8-whirlin доставлено через PSCC подход привел к высокие уровни заражения утрикулярной клетки волос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Улитковый клетки волос являются преобразованы с помощью доставки генов PSCC.
AAV8-whirlin доставлено через PSCC подход привел к высокие уровни инфекции улитковый клетки волос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для доступа к грызунов внутренний уши были описаны несколько хирургических вмешательств. Cochleostomy и круглое окно подходов наиболее часто используются для доступа к улитки, тогда как задняя полукружных канала и endolymphatic мешок подходы обычно используются для доступа к вестибулярных органов1. В недавнем исследовании мы показали, что задняя полукружных канала, инъекции вирусных генной терапии привело к высокой эффективности трансдукции клетки волос в вестибулярных органов и улитки5. В самом деле кохлеарных клетки волос трансдукции был выше через задний полукружных канала инъекции, когда по сравнению с круглое окно инъекции в ту же модель мыши наследственной слуха и вестибулярной дисфункции5,9. Учитывая анатомической близости между круглое окно и улитки, представляется парадоксальным, что круглое окно инъекции может привести к нижней трансдукции улитковый клетки волос, по сравнению с задней полукружных канала инъекции. Этот вывод может объяснить тот факт, что круглые окна расположен недалеко от кохлеарных акведук. Поэтому когда вирусная генной терапии вводят через круглое окно, его концентрация может разбавлена спинномозговой жидкости из улитковый акведук10.

Вывод, что инъекции задняя полукружных канала приводит к трансдукции кохлеарная и вестибулярная клетки волос сообщалось также в других исследованиях11,12. В исследовании Окада et al.было сообщено трансдукции кохлеарная и вестибулярная волосковых клеток, AAV-GFP. Однако численные количественная оценка не проводилась. В исследовании Suzuki et al., сообщили о высоком уровне трансдукции кохлеарная и вестибулярная клетки волос с AAV-Anc80-GFP с использованием подхода заднего канала в взрослых мышей. У взрослых мышей катетеризации задняя полукружных канала с небольшой катетер является предпочтительным, так как костлявые покрытие задней полукружных канала полностью окостеневший12. Катетеризация задняя полукружных канала в взрослых мышей может помочь свести к минимуму инъекции обратного потока, который может снизить эффективность трансдукции. Этот шаг не требуется в новорожденных мышей, поскольку в этом возрасте еще хрящевой костлявые покрытие задней полукружных канала.

Одним из недостатков инъекции задняя полукружных канала является тот факт, что нельзя быть определенные ли введенный генной терапии доставляется в перилимфе или эндолимфы. Несмотря на этот недостаток задняя полукружных канала анатомически легко найти и требует минимального манипуляции височной кости для его идентификации. Это уменьшает вероятность повреждения внутреннего уха, вызванные хирургической травмы. Инъекции задняя полукружных канала является привлекательным вариантом для внутреннего уха генной терапии доставки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют без соответствующих раскрытия сделать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана средств из NIDCD Отдела по очной исследования /NIH (DC000082-02 W.W.C.), а также DC000081 в передовых тепловизионных ядро. Мы благодарны за NIDCD животных фонда персонала для заботить для наших животных.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics