Achterste Semicircular Canal aanpak voor binnenoor Gene levering in neonatale muis

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

In deze studie beschrijven we de achterste semicircular canal-benadering als een betrouwbare methode voor binnenoor gene levering in neonatale muizen. We laten zien dat gene levering door het posterieure semicircular-kanaal vermag perfuse het gehele binnenoor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De therapie van het gen van de innerlijke oor biedt grote belofte als een mogelijke behandeling van gehoorverlies en duizeligheid. Een van de kritische determinanten van het succes van de therapie van het gen van de innerlijke oor is een leveringsmethode die tot consistente transductie efficiëntie van gerichte celtypes leidt terwijl het minimaliseren van verlies van het gehoor te vinden. In deze studie beschrijven we de achterste semicircular canal-benadering als een levensvatbare methode voor binnenoor gene levering in neonatale muizen. We laten zien dat gene levering door het posterieure semicircular-kanaal vermag perfuse het gehele binnenoor. De anatomische identificatie van het posterieure semicircular kanaal, alsmede minimale manipulatie van het bot van de temporale vereist, maken dit chirurgische aanpak een aantrekkelijke optie voor binnenoor gene levering.

Introduction

De therapie van het gen van de innerlijke oor is een zich snel ontwikkelende gebied van onderzoek. Deze is vereffend in verschillende modellen van de dieren te bestrijden ototoxiciteit, lawaai trauma, erfelijke hoorzitting verlies1. Verschillende recente studies hebben aangetoond functionele herstel van gehoor en evenwicht functies in mutant muizen na binnenoor gene therapie levering2,3,4,5,6, 7. een van de belangrijkste factoren bij het bepalen van het succes van de therapie van het gen van de innerlijke oor is de chirurgische aanpak gebruikt voor toegang tot het binnenoor. In het ideale geval de chirurgische benadering zou zijn gemakkelijk uit te voeren, de anatomische bezienswaardigheden zou consistent zijn en gemakkelijk te identificeren, en de resulterende transductie van gerichte celtypes hoog zou zijn.

In een recente studie toonden we dat toen virale gentherapie werd geïnjecteerd door het posterieure semicircular-kanaal van de mutant muis van whirler (een model van verlies van het gehoor en vestibulair dysfunctie), efficiënte transductie van sensorische haarcellen werd gezien in de vestibulaire ook organen zoals in het slakkenhuis5. De hoge efficiëntie van sensorische Haarcel transductie geleid tot verbetering van de auditieve en vestibulaire functies in deze mutant muizen.

In dit artikel beschrijven we in detail de achterste semicircular canal aanpak voor toegang tot het binnenoor neonatale muis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij het National Institute on doofheid en andere communicatie stoornissen (NIDCD ASP1378-15).

1. procedure Setup en voorbereiding

  1. Steriliseren alle instrumenten in ethyleenoxide in het begin van het experiment. Reinig instrumenten met behulp van de kraal sterilisatie tussen dieren.
  2. Laden van de oplossing met virale gentherapie in een micropipet op de micro-injector. De virale vector gebruikt in deze studie was AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoom kopieën per milliliter, zie de inhoudsopgave materialen).
    Opmerking: Doorgaans 1.1 µL totaalvolume wordt geladen in de micropipet.

2. anesthesie

Opmerking: De spanning van de muis gebruikt in deze studie is de whirler-muis. Homozygoot mutanten (Whrnwi/wi) zowel heterozygoot nestgenoten (Whrn+/ wi) werden gebruikt.

  1. Plaats de moeder in een aparte kooi (Los van het nest).
  2. Plaats de kooi met het nest (P0 - P5 pups) op een recirculatie warmte pad (set bij 37,5 ° C) de muizen om warm te houden.
  3. Knip uit het gedeelte van de duim van een latex handschoen, en plaats een pup in het.
  4. Plaats de pup in latex handschoen duim in een emmer van ijs voor ~ 2 min.
  5. Plaats de narcose pup op een groot plein commerciële kunststof bevriezen pack met een 4 "x 4" gaas tussen de pup en het pack van oppervlak.
  6. Vul een heavy-duty latex handschoen met crushed ijs en plaats de handschoen ijs rond de pup.
  7. Controleer als de pup voldoende is verdoofd door het volledig ontbreken van een reactie op verschillende stimuli (met inbegrip van een stevige teen snuifje). Laat de pup op de ice pack voor de duur van de operatie (ongeveer 5-10 min).
    Opmerking: We raden aan het verlaten van de pups op de ice pack voor niet meer dan 15 min tijdens de operatie.

3. de chirurgische benadering (Figuur 1)

  1. Reinig de huid achter het oor met een veeg van jodium en een alcohol doekje zodra het dier wordt verdoofd.
  2. Maken van een postauricular incisie ~ 2 mm achter het oor met behulp van de micro-schaar, en verdeel de musculus sternocleidomastoideus met micro-schaar.
  3. Identificeer de nervus facialis en de ' bulla '. De ' bulla ' kraakbeenachtige en semi-transparante is op deze leeftijd en het ligt mediaal op de nervus facialis. De stapedial slagader kan worden gezien door de ' bulla ' op deze leeftijd, dat een nuttige mijlpaal is.
  4. Volg de nervus facialis superiorly en posteriorly te vinden van het posterieure semicircular kanaal (PSCC). Verwijder de spiervezels en het zachte weefsel overliggende het posterieure semicircular-kanaal met behulp van de micro-schaar.
    Opmerking: De PSCC is kraakbeenachtige op deze leeftijd.
  5. Doordringen de PSCC met behulp van een glas micropipet (~ 10 micrometer in diameter) op de micro-injector.
  6. Virale gentherapie injecteren in het binnenoor.
    Opmerking: Doorgaans 20 injecties van 49 in totaal nL van de gentherapie worden geleverd in de achterste semicircular kanaal meer dan ~ 40 s (totale volume ~ 1 µL). De virale titer gebruikt was 1 x 1013 genoom kopieën per mL.
  7. Sluit de insnijding van de huid met behulp van een 5-0 polyglactin hechtdraad.

4. de postoperatieve zorg

  1. Plaats de pup op een opwarming pad om te herstellen van een normale lichaamstemperatuur tijdens het herstel van anesthesie met constante handmatige stimulatie/rollen met gehandschoende menselijke vingers.
  2. Zodra de pup wakker is, plaats het terug in zijn kooi.
  3. Elke pup met een wattenstaafje dat is blootgesteld aan de kooi beddengoed strelen.
    Opmerking: Het doel hiervan is dat de muizen ruiken zoals ze deden vóór de operatie, die vergroot u de kans van de moeder opnieuw haar nest na chirurgie aanvaarding. Indien mogelijk, kan urine van de moeder worden verzameld en wreef over de pups met behulp van een wattenstaafje om te verder verlagen de kans op afwijzing.
  4. Toepassing van minerale olie op de Moederdag neus te desensibiliseren haar8, en opnieuw de moeder in hun kooi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injectie van gentherapie in neonatale whirler muizen door het posterieure semicircular-kanaal AAV8-whirlin resulteerde in de whirlin expressie (groen) in utricular haarcellen (Figuur 2), met de algehele efficiëntie van de infectie van 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Getransduceerde haarcellen had langwerpige stereocilia (rood) in vergelijking met de haarcellen van contralaterale niet-ingespoten oren (5.35 ± 2.11 µm vs. 3,20 ± 0.34 µm, respectievelijk)5.

Achterste semicircular canal injectie van AAV8-whirlin ook resulteerde in signaaltransductie van cochleair haarcellen in de whirler muizen (Figuur 3). De gemiddelde binnenste Haarcel infectie efficiëntie was 77,1% (SD 12,7, n = 8)5. Getransduceerde haarcellen uitgedrukt whirlin (groen) op stereocilia tips en stereocilia (rood) in vergelijking met de haarcellen van contralaterale niet-ingespoten oren had langwerpige (5.04 ± 0.72 µm vs. 1.01 ± 0.08 µm op het cochleair apex, respectievelijk)5.

Figure 1
Figuur 1 : Intraoperatieve beelden.
Intraoperatieve afbeeldingen tonen chirurgische toegang tot de achterste semicircular canal (PSCC) in een muis P0. De linker oor wordt weergegeven. De PSCC is uiteengezet in zwarte stippellijnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Vestibulaire haarcellen zijn getransduceerde als met PSCC gene delivery.
AAV8-whirlin geleverd via de PSCC aanpak resulteerde in hoge niveaus van utricular Haarcel infectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Cochleair haarcellen zijn getransduceerde als met PSCC gene delivery.
AAV8-whirlin geleverd via de PSCC aanpak resulteerde in hoge niveaus van cochleair Haarcel infectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verschillende chirurgische benaderingen zijn beschreven voor toegang tot knaagdier inner oren. Cochleostomy en ronde venster benaderingen zijn meestal gebruikt voor toegang tot het slakkenhuis, terwijl de achterste semicircular canal en de endolymphatic sac benaderingen doorgaans gebruikt worden voor toegang tot de vestibulaire organen1. In een recente studie toonden we dat posterieure semicircular canal injecties van virale gentherapie in hoge efficiëntie van Haarcel signaaltransductie in zowel de vestibulaire organen en het slakkenhuis5 resulteerde. In feite, was cochleair Haarcel transductie hoger via de achterste semicircular canal injecties, in vergelijking met ronde venster injecties in de dezelfde muismodel van erfelijke gehoorverlies en vestibulaire dysfunctie5,9. Gezien de nabijheid van de anatomische tussen het ronde venster en het slakkenhuis, lijkt het paradoxaal dat ronde venster injecties tot lagere cochleair Haarcel transductie ten opzichte van achterste semicircular canal injecties leiden kunnen. Deze bevinding kan worden verklaard door het feit dat het ronde venster het cochleair aquaduct ligt. Daarom, wanneer virale gentherapie wordt geïnjecteerd via het ronde venster, kan de concentratie door de cerebrospinale vloeistof uit de cochleair aquaduct10worden verdund.

De bevinding dat posterieure semicircular canal injectie in cochleaire en vestibulaire Haarcel transductie resulteert is ook gemeld door andere studies11,12. In de studie van Okada et al., werd transductie van cochleaire en vestibulaire haarcellen door AAV-GFP gemeld. Numerieke kwantificering werd echter niet uitgevoerd. De studie van Suzuki et al., gemeld hoge niveaus van cochleaire en vestibulaire Haarcel transductie met de AAV-Anc80-GFP met behulp van de achterste semicircular kanaal-aanpak bij volwassen muizen. Bij volwassen muizen is cannulation van het posterieure semicircular-kanaal met een kleine katheter beter, omdat de benige dekking van het posterieure semicircular-kanaal volledig12. Catheterisatie van het posterieure semicircular-kanaal in volwassen muizen kan bijdragen tot het minimaliseren van injectie terugvoer, die transductie efficiëntie kan afnemen. Deze stap is niet vereist in neonatale muizen, want de benige dekking van het posterieure semicircular-kanaal nog steeds kraakbeenachtige op die leeftijd is.

Een van de nadelen van de achterste semicircular canal injectie is het feit dat men kan niet bepaalde of de ingespoten gentherapie wordt geleverd in de perilymph of de endolymfe. Ondanks deze tekortkoming, de achterste semicircular canal is anatomisch makkelijk terug te vinden en vereist minimale manipulatie van de temporale-bone voor de identificatie. Dit vermindert de kans op het binnenoor schade als gevolg van chirurgisch trauma. De achterste semicircular canal-injectie is een aantrekkelijke optie voor binnenoor gene therapie levering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen relevante informatie te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door fondsen van het NIDCD divisie van intramurale onderzoek /NIH (DC000082-02 tot W.W.C.), alsook DC000081 aan geavanceerde imaging core. We zijn dankbaar voor het NIDCD dier faciliteit personeel voor de zorg voor onze dieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics