Bakre halvcirkelformade kanalen strategi för innerörat gen leverans i Neonatal mus

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I denna studie beskriver vi metoden bakre halvcirkelformade kanalen som en tillförlitlig metod för innerörat gen leverans hos neonatala möss. Vi visar att gen leverans via den bakre halvcirkelformade kanalen är att BEGJUTA hela innerörat.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Innerörat genterapi erbjuder stort löfte som en potentiell behandling för hörselnedsättning och yrsel. En av de kritiska faktorerna för framgång för innerörat genterapi är att hitta en leveransmetod som resulterar i konsekvent transduktion effektivitet riktade celltyper samtidigt minimera hörselnedsättning. I denna studie beskriver vi metoden bakre halvcirkelformade kanalen som en livskraftig metod för innerörat gen leverans hos neonatala möss. Vi visar att gen leverans via den bakre halvcirkelformade kanalen är att BEGJUTA hela innerörat. Lätt anatomiska identifiering av den bakre halvcirkelformade kanalen, liksom minimal manipulation av tinningbenet krävs, gör detta kirurgiska tillvägagångssätt ett attraktivt alternativ för innerörat gen leverans.

Introduction

Innerörat genterapi är ett snabbt växande fält av undersökningen. Det har tillämpats i olika djur modeller att bekämpa ototoxicitet, buller trauma och ärftliga hörsel förlust1. Flera nyare studier har visat funktionell återhämtning av hörsel och balans funktioner hos muterade möss efter innerörat gen terapi leverans2,3,4,5,6, 7. ett av viktigaste faktorer för att fastställa framgång innerörat genterapi är en kirurgisk metod som används för åtkomst till innerörat. Helst den kirurgiska metoden skulle vara lätt att utföra de anatomiska landmärkena skulle vara konsekventa och lätta att identifiera och den resulterande transduktion riktade celltyper skulle vara hög.

I en färsk studie visade vi att när viral genterapi injicerades genom den bakre halvcirkelformade kanalen Dubbingtwistern mutant musen (en modell av hörselnedsättning och vestibulär dysfunktion), effektiv transduktion av sensoriska hårceller sågs i den vestibulära organ samt som i cochlean5. Den höga verkningsgraden av sensorisk hår cell transduktion resulterade i förbättring av auditorisk och vestibulär funktion i dessa muterade möss.

I den här artikeln beskriver vi i detalj den bakre halvcirkelformade kanal strategin för att komma åt neonatal mus innerörat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur förfaranden godkändes av djur vård och användning kommittén vid National Institute on dövhet och andra Communication Disorders (NIDCD ASP1378-15).

1. förfarande installationsprogrammet och förberedelse

  1. Sterilisera alla instrument av etylenoxid i början av experimentet. Ren instrument använder pärla sterilisering mellan djur.
  2. Ladda lösningen innehållande viral genterapi i en mikropipett på mikro-injektorn. Den virala vektor som används i denna studie var AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genomet kopior per milliliter, se tabellen för material).
    Obs: Vanligtvis 1.1 µL totala volym är laddad i mikropipett.

2. anestesi

Obs: Mus stammen används i denna studie är ca musen. Både homozygota mutanter (Whrnwi/wi) och heterozygot littermates (Whrn+/ wi) användes.

  1. Placera mor i en separat bur (separat från kullen).
  2. Placera buren som innehåller kullen (P0 - P5 pups) på en recirkulerande hetta madrassera (set vid 37,5 ° C) för att hålla möss varma.
  3. Klipp ut tummen portion av en latexhandske, och placera en valp i den.
  4. Placera pup i latexhandske tummen i en hink med is för ~ 2 min.
  5. Placera den sövda pup på en stor fyrkantig kommersiella plast frysa pack med en 4 ”x 4” kompress mellan pup och i pack yta.
  6. Fyll en tunga latexhandske med krossad is och placera ishandsken runt pup.
  7. Kontrollera om pup är tillräckligt sövd av den totala avsaknaden av alla reaktioner på olika stimuli (inklusive en fast tå nypa). Lämna pup på istillbehör under hela operationen (cirka 5-10 min).
    Obs: Vi rekommenderar att lämna valparna på istillbehör för mer än 15 min under operationen.

3. kirurgisk metod (figur 1)

  1. Ren huden bakom örat med en jod torka och en spritservett när djuret är sövd.
  2. Gör en postauricular snitt ~ 2 mm bakom örat med mikro-sax och dela sternocleidomastoideus med mikro-sax.
  3. Identifiera ansiktsnerven och bulla. Bulla är brosk och halvtransparent vid denna ålder och den ligger mediala till ansiktsnerven. Den stapedial artären kan ses genom bulla vid denna ålder, vilket är ett bra landmärke.
  4. Följ ansiktsnerven fint och posteriort till lokalisera den bakre halvcirkelformade kanalen (PSCC). Ta bort muskelfibrer och mjuk vävnad överliggande den bakre halvcirkelformade kanalen med mikro-sax.
    Obs: PSCC är brosk vid denna ålder.
  5. Penetrera de PSCC med en glas mikropipett (~ 10 μm i diameter) på mikro-injektorn.
  6. Injicera viral genterapi i innerörat.
    Obs: Typiskt, totalt 20 injektioner av 49 nL av genterapin levereras till den bakre halvcirkelformade kanalen över ~ 40 s (total volym ~ 1 µL). Viral titern används var 1 x 1013 genomet kopior per mL.
  7. Nära huden snittet med hjälp av en 5-0 polyglactin suturen.

4. postoperativ vård

  1. Placera pup på en värmande pad för att återställa en normal kroppstemperatur under återhämtning från anestesi med konstant manuell stimulering/rullande med behandskade mänskliga fingrar.
  2. När pup är vaken, Lägg tillbaka i sin hem bur.
  3. Smek varje valp med en bomullstuss som har utsatts för buren sängkläder.
    Obs: Syftet med detta är att ha möss luktar som de gjorde före operation, vilket ökar sannolikheten för mor åter acceptera hennes kull efter operationen. Om möjligt, kan urin från mamman samlas och gnuggade på valparna med en bomullspinne för att ytterligare minska risken för avstötning.
  4. Applicera mineralolja till moderns näsa att okänsliga hennes8, och återinföra mor i buren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injektion av AAV8-whirlin genterapi i neonatal Dubbingtwistern möss genom den bakre halvcirkelformade kanalen resulterade i whirlin uttryck (grön) i utricular hårcellerna (figur 2), med infektion totaleffektiviteten i 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Sensorik hårcellerna hade långsträckta sinneshår (rött) jämfört med hårcellerna från kontralaterala icke-injiceras öron (5.35 ± 2.11 µm vs. 3,20 ± 0,34 µm, respektive)5.

Bakre halvcirkelformade kanalen injektion av AAV8-whirlin resulterade också i transduktion av cochlear hårceller i Dubbingtwistern möss (figur 3). Den genomsnittliga inre hår infektion cellverkningsgrad var 77,1% (SD 12,7, n = 8)5. Sensorik hårcellerna uttryckt whirlin (grön) på längdförändringar tips och hade långsträckta sinneshår (rött) jämfört med hårcellerna från kontralaterala icke-injiceras öron (5,04 ± 0,72 µm vs. 1,01 ± 0,08 µm vid cochlear spetsen, respektive)5.

Figure 1
Figur 1 : Intraoperativ bilder.
Intraoperativ bilder visar kirurgiska tillgång till den bakre halvcirkelformade kanalen (PSCC) i en P0-mus. Vänster öra visas. PSCC beskrivs i streckad svarta linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Vestibulära hårcellerna är sensorik använder PSCC gen leverans.
AAV8-whirlin levereras via PSCC strategi resulterade i höga nivåer av utricular hår cell infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Cochlear hårcellerna är sensorik använder PSCC gen leverans.
AAV8-whirlin levereras via PSCC strategi resulterade i höga nivåer av cochlear hår cell infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera kirurgiska metoder har beskrivits för att komma åt gnagare inre öron. Cochleostomy och runda fönstret tillvägagångssätt används oftast tillgång till snäckan, medan den bakre halvcirkelformade kanalen och endolymphatic sac metoder används vanligtvis tillgång till vestibulära organ1. I en färsk studie visade vi att bakre halvcirkelformade kanalen injektioner av viral genterapi resulterade i hög effektivitet av hår cell transduktion i både de vestibulära organen och den snäckan5. Cochlear hår cell transduktion var faktiskt högre genom bakre halvcirkelformade kanalen injektionerna, jämfört med runda fönstret injektioner i samma musmodell av ärftlig hörselnedsättning och vestibulär dysfunktion5,9. Tanke på anatomiska närheten mellan det runda fönstret och snäckan, verkar det paradoxalt att runda fönstret injektioner kan leda till lägre cochlear hår cell transduktion jämfört med bakre halvcirkelformade kanalen injektioner. Detta konstaterande kan förklaras av det faktum att det runda fönstret är beläget nära cochlear akvedukten. Därför, när viral genterapi injiceras genom det runda fönstret, dess koncentration kan spädas av ryggmärgsvätskan kommer från cochlear akvedukten10.

Konstaterandet att bakre halvcirkelformade kanalen injektion resulterar i cochlear och vestibulära hår cell transduktion har också rapporterats av andra studier11,12. I studien av Okada et al.rapporterades transduktion av cochlear och vestibulära hårcellerna av AAV-GFP. Numeriska kvantifiering var dock inte utförs. Studien av Suzuki et al., rapporterade höga nivåer av cochlear och vestibulära hår cell transduktion med den AAV-Anc80-GFP med metoden bakre halvcirkelformade kanalen i vuxna möss. I vuxna möss är kanylering av den bakre halvcirkelformade kanalen med en liten kateter att föredra, eftersom den beniga beläggningen av den bakre halvcirkelformade kanalen är fullständigt12. Kateterisering av den bakre halvcirkelformade kanalen i vuxna möss kan hjälpa till att minimera injektion återflödet, vilket kan minska transduktion effektivitet. Det här steget krävs inte hos neonatala möss, eftersom beniga beläggningen av den bakre halvcirkelformade kanalen är fortfarande brosk vid den åldern.

En av nackdelarna med bakre halvcirkelformade kanalen injektionen är det faktum att man inte kan vara vissa om den injicerade genterapin levereras in i perilymph eller endolympha. Trots denna brist, den bakre halvcirkelformade kanalen är anatomiskt lätt att hitta och kräver minimal manipulation av tinningbenet för dess identifiering. Detta minskar risken för innerörat skador orsakade av kirurgiskt trauma. Bakre halvcirkelformade kanalen injektionen är ett attraktivt alternativ för innerörat gen terapi leverans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga relevanta upplysningar att göra.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av medel från den NIDCD Division av intramurala forskning /NIH (DC000082-02 till W.W.C.), samt DC000081 till avancerade imaging kärna. Vi är tacksamma för den NIDCD djuranläggningen personalen ta hand om våra djur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics