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Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande

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Summary

Nuevas estrategias terapéuticas en medicina regenerativa cardiaca requieren extensos y detallados estudios en modelos animales preclínicos grandes antes que pueden ser considerados para el uso en seres humanos. Aquí, demostramos una técnica de inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en conejos, que es valiosa para la hipótesis que prueba la eficacia de estas nuevas terapias.

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Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

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Abstract

Terapia celular y génica son emocionantes y prometedoras estrategias con el propósito de regeneración cardiaca en el contexto de la insuficiencia cardíaca con reducción fracción de eyección (HFrEF). Antes de que puedan ser considerados para su uso y aplicados en los seres humanos, se requieren extensos estudios preclínicos en modelos animales grandes para evaluar la seguridad, eficacia y destino de injectate (p. ej., células madre) una vez entregado en el miocardio. Modelos de roedores pequeños ofrecen ventajas (e.g., rentabilidad, receptividad para manipulación genética); sin embargo, debido a limitaciones inherentes de estos modelos, rara vez se traducen en la clínica de los resultados en estos. Por el contrario, los modelos animales grandes como conejos, tienen ventajas (e.g., electrofisiología cardíaca similar en comparación con los seres humanos y otros animales grandes), manteniendo un buen equilibrio rentable. Aquí, demostramos cómo realizar una técnica de inyección (IMI) percutánea contraste intramiocárdico guiada por ecocardiografía, que es mínimamente invasivo, seguro, bien tolerado y muy efectivo en la entrega específica de injectates, incluidas las células, en varios lugares en el miocardio de un modelo de conejo. Para la aplicación de esta técnica, también hemos tomado ventaja de un sistema de ecocardiografía clínica ampliamente disponibles. Después de poner en práctica el protocolo descrito aquí, un investigador con conocimientos de ecografía básica será competente en el desempeño de esta técnica mínimamente invasiva y versátil para uso rutinario en los experimentos, a la comprobación de la hipótesis de la capacidades de la terapéutica regenerativa cardiaca en el modelo de conejo. Una vez que se logra la competencia, todo el procedimiento se puede realizar dentro de 25 minutos después de la anestesia en el conejo.

Introduction

Las terapias celular y génica son emocionantes y nunca desarrollar estrategias para la regeneración o reparación del miocardio lesionado en HFrEF. Unos pocos estudios han comparado la eficacia (e.g., tasa de retención celular) de las diferentes rutas de entrega de la célula, que constantemente han demostrado la superioridad del IMI sobre rutas intravenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. por lo tanto, no es de extrañar que una gran proporción de los estudios sobre modelos traslacionales de la terapia de la célula de vástago del miocardio lesionado, entregar el injectate via IMI realizada bajo visión directa en un pecho abierto procedimiento6,7 . Sin embargo, este enfoque tiene varias limitaciones, incluyendo la naturaleza invasiva del procedimiento, que conlleva el riesgo de mortalidad peri-procedimiento (a menudo debajo-divulgado)8. Además, un IMI bajo visión directa no elimina la posibilidad de que la inyección inadvertida dentro de la cavidad ventricular. En la práctica clínica un IMI durante cirugía abierta de tórax podría ser un método adecuado para la entrega de la terapéutica celular, por ejemplo, en la arteria coronaria bypass cirugía del injerto (CABG); sin embargo, este enfoque no puede ser apropiado para la entrega de celular global miocardiopatía de origen no isquémico (p. ej., HFrEF secundaria a miocardiopatía inducida por antraciclinas (AICM)).

Cabe duda de que la cardiopatía isquémica (IHD) es la causa más común de HFrEF (~ 66%)9,10; sin embargo, la cardiomiopatía no isquémica, incluyendo AICM, todavía afecta a una proporción significativa de pacientes con HFrEF (33%)9 . De hecho, los recientes avances en oncología clínica han resultado en más de 10 millones de supervivientes de cáncer en los Estados Unidos solo11, con las estimaciones de un número similar en Europa, consistente con una tendencia global hacia la mejoría en la supervivencia de pacientes con cáncer12 ,13. Por lo tanto, explorar los beneficios de los nuevos tratamientos como el trasplante de células madre para la cardiomiopatía no isquémica, así como las pruebas de una ruta efectiva y mínimamente invasiva de la entrega de la célula de vástago es de suma importancia, dado el creciente número de pacientes afectados por cardiotoxicidad secundaria a medicamentos contra el cáncer.

De nota, usando terapia de células madre con el objetivo de reparación/regenerar el miocardio lesionado con frecuencia los estudios de prueba de hipótesis consiste en el uso de roedores pequeños (por ejemplo, ratones y ratas). Estos modelos requieren a menudo sistemas de ultrasonido de alta frecuencia costosos para la evaluación de la función miocárdica, generalmente equipada con transductores de arreglo lineal que tienen algunas limitaciones inherentes asociadas (e.g., reverberación)14. Sin embargo, otros modelos como los conejos, que representan un gran modelo preclínico, tienen algunas ventajas para la comprobación de hipótesis de terapias con células madre en HFrEF. Así, en contraste con las ratas y ratones, conejos mantienen un sistema de transporte de Ca+ 2 y electrofisiología celular que se asemeja a el de seres humanos y otros animales grandes (por ejemplo, perros y cerdos)15,16,17 ,18,19. Otra ventaja es su receptividad para ultrasonido cardiaco proyección de imagen usando relativamente baratos y los sistemas de ecocardiografía clínica ampliamente disponible equipados con transductores array relativamente para fase de alta frecuencia, por ejemplo, 12 MHz, tales como los utiliza con frecuencia en cardiología pediátrica y neonatal. Estos sistemas permiten excelente imagen ecocardiográfica con tecnología de vanguardia, y toman ventaja de la superioridad de la proyección de imagen20armónica. Además, comprobación de hipótesis amplia de las posibilidades de terapias regenerativas cardiacas (p. ej., terapia de células madre), su seguridad, eficacia, cardiomiogenético potencial, así como evaluación del destino de la injectate una vez entregado en el miocardio, es obligatorio antes de que se pueden considerar para el uso humano, y requieren el uso de modelos animales preclínicos grandes, tales como el conejo17,19. Aquí, describimos una técnica mínimamente invasiva para la entrega de la célula mediante ecocardiografía de contraste percutánea guiada por IMI utilizando un sistema de ecocardiografía clínica, destinada a terapia basadas en el trasplante con células madre para la cardiomiopatía no isquémica20 . También describimos las ventajas de la tinta de la India (InI, también conocido como tinta China) como un trazador ultrasonido contraste agente y en situ de injectate en el corazón de conejo.

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Protocol

Los experimentos descritos en este documento fueron aprobados por el Comité ético de investigación de la Universidad de Murcia, España y se realizaron según la Directiva 2010/63/UE de la Comisión Europea. Los pasos descritos fueron realizados bajo protocolos operativos que eran parte del plan de trabajo y no se ha realizado únicamente con el propósito de filmar el vídeo que acompaña a este trabajo.

1. preparación de las células y vectores de expresión mamíferos

Nota: Aquí, brevemente Describimos un protocolo para la preparación y transfección de una línea celular (riñón embrionario humano 293 (HEK-293)); sin embargo, protocolos específicos de célula apropiada para el tipo de la célula de interés deben ser optimizado (p. ej., células madre).

  1. Mantener las células HEK-293 en glucosa alta Dulbecco de modificado medio de águila (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS), piruvato de sodio 1%, 2 mM glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y se incubó a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 . Una vez que las células son el confluentes, en una relación de 1:3.
  2. Empezar a dividir las células por aspiración de los medios de comunicación, luego lave una vez con fosfato estéril tamponada con solución salina (PBS), quitar exceso PBS e incubar luego con 2,5 mL de 0,5 x ácido tripsina etilendiaminotetracético (EDTA) (5 minutos, 37 º C).
    1. Añadir un volumen de medio DMEM (complementada como se describe anteriormente) para detener la reacción y luego separar las células aspirando lenta y suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta electrónica.
  3. A continuación, transferir la suspensión de células en un contenedor adecuado (p. ej., tubo de centrífuga cónico de 15-50 mL). Centrifugar en una cubeta de swing (100 x g), eliminar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con PBS estéril.
  4. Resuspender el precipitado en medio DMEM fresco y semilla en una densidad de célula apropiada (p. ej., 1 x 106 células en un frasco de 75 cm2 ) en frascos de cultivo fresco o platos grandes de prácticas de laboratorio local.
    1. Sustituir los medios de comunicación existentes con medio fresco cada 2 días.
      Nota: El vector de expresión se deriva de pIRES1hyg y utilizado según las instrucciones del fabricante como se describió anteriormente21. p(EGFP) IRES1hyg ha sido generado por subcloning EGFP cDNA como un BamHI + NotI Inserte de pEGFP-N1 la BamHI + NotI digerido pIRES1hyg21.
  5. 1 día antes de la transfección, semilla HEK-293 células a una densidad de 0,5 x 105 células/cm2 en placas de cultivo de tejidos de 12 o 24 pocillos.
  6. En el día de la transfección, preparar complejos de reactivo de transfección de DNA de lípidos en tubos de microcentrífuga separados 1,5 mL (1 tubo/bien).
    1. Iniciar mediante la adición de 250 μl de medio de suero reducido en cada tubo y agregar entonces 4 μg ADN (mezclar suavemente).
    2. Posteriormente, Añadir 250 μl de una mezcla previamente preparada de 10 μl de reactivo de transfección lípidos y 250 μl de medio de suero reducido, a cada tubo (mezclar suavemente otra vez).
    3. Por último, continuar con transfecciones, incubando las células HEK-293 con complejos de reactivo de transfección ADN lípidos durante 4 h, reemplazar con medio DMEM complementado como se describió anteriormente (paso 1.1) e incubar otro 48 h. realizar selección de droga de estable transfectants con 100 μg/mL higromicina B.
  7. Separar las células HEK-293 con tripsina como se describió anteriormente (paso 1.2). Después de lavar las células en PBS estéril, resuspender en un vehículo apropiado (por ejemplo, 10% v/v InI en PBS), para lograr una concentración celular final de 5 x 106/ml.

2. preparación del conejo

Nota: La posición del conejo y el transductor para IMI no es óptima para evaluar la morfología y función del corazón del animal. Por lo tanto, es recomendable realizar una exploración ecocardiográfica completa20 antes de la IMI (véase abajo) y en momentos posteriores, según lo definido por el diseño experimental. Esto tendrá como objetivo evaluar las anatómicas y funcionales características basales del corazón en los animales que reciben una inyección y también evaluar los efectos, del IMI en la función del corazón.

  1. Llevar a cabo este examen de manera ciega y siguiendo las directrices del Comité de ecocardiografía de la Colegio Americano de medicina interna de veterinaria y la sociedad americana de ecocardiografía Europea Asociación para la proyección de imagen Cardiovascular 22 , 23 , 24.
  2. Obtener un trazo simultáneo de 1 cable de Electrocardiograma (ECG) durante todo el estudio ecocardiográfico todo.
  3. Anestesiar al conejo con ketamina 10 mg/kg, combinado con medetomidina 200 μg/kg, inyección intramuscular (I.M.).
  4. Verificar el nivel de la anestesia después de 10-20 min tras la administración de la anestesia.
  5. Usando un cortador de pelo eliminar el vello del pecho ampliamente (por ejemplo, debajo de la nuca a la región el xiphoid) (figura 1A).
  6. Afeitado más regiones de 1-2 cm2 en la cara interna de la extremidad delantera derecha (región mediocubital) y de ambas extremidades posteriores (región mediotibial) (figura 1B).
  7. Coloque los electrodos de ECG adhesivo en las regiones afeitadas de las extremidades síncrono monitorear el ritmo cardíaco durante el procedimiento (figura 1).
  8. Coloque el animal en la posición de decúbito supino en una manta térmica, con las extremidades extendidas con esparadrapo a la mesa (figura 1).
    1. Asegúrese de que los oídos se flexionan hacia atrás detrás de la cabeza/espalda del conejo y en una posición que es más baja que sus patas delanteras, ya que esto ayuda a mantener la correcta posición del tórax del animal durante todo el procedimiento.
  9. Permitir que el animal respire espontáneamente mientras que administrar oxígeno por mascarilla a lo largo de todo el proceso (100%, 2-3 L/min).

Figure 1
Figura 1. Preparación del conejo para IMI. (A) Clip pelo del tórax; (B) Clip pelo de miembros; (C) Coloque los electrodos y colocar el conejo con piernas estiradas en una manta térmica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. técnica de contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI en el conejo

  1. Limpiar y desinfectar la piel del tórax con una solución de clorhexidina.
    1. Utilizar una técnica aséptica durante todo el procedimiento, según mejores prácticas actuales.
    2. Siempre que sea posible y si es posible, realizar un procedimiento completamente estéril, incluyendo pero no limitado a, el uso de material estéril, tales como batas, guantes, cortinas de herida quirúrgica, preparación de material para la mesa, así como un ultrasonido estéril estériles cubierta y gel de ultrasonidos estéril. Esto reducirá al mínimo el riesgo de introducción de patógenos a los animales reciben el IMI y es una práctica estándar en el ajuste clínico (por ejemplo, durante la punción cardíaca).
      Nota: Se recomienda a proceder siempre conforme a las regulaciones locales y nacionales de investigación animal aplicable a las instituciones locales y el país de la práctica.
  2. Aplicar gel de transmisión del ultrasonido en el pecho o el transductor y el cable del transductor al cuello del experimentador, realizar un análisis rápido de la ventana del corazón del animal, que a menudo es útil para visualizar la anatomía y planificar para el IMI.
  3. Coloque el transductor manualmente en el 4 espacio intercostalth-6th , 2-3 cm de la línea paraesternal derecha con un ángulo de incidencia de ~ 90 ° con respecto a la derecha de la pared torácica (figura 2A).
  4. Ajuste la ubicación del transductor en relación con el espacio intercostal, así como sus anteroposterior y dorsoventral del ángulo para optimizar una vista modificada eje corto a nivel de los músculos papilares. Identificar en este punto de vista el ventrículo derecho (VD), ventrículo izquierdo (LV), septo interventricular (IVS), pared posterior (PW), así como anterolateral (AL) y músculos papilares posteromedial (PM) (figura 2B).
    1. Tienen un amplio campo de visión incrementando significativamente la profundidad mediante el control apropiado en el sistema (p. ej., botón, esfera).
    2. Prestar especial atención a la obtención de una imagen simétrica en esta vista, así como la adecuada diferenciación de contornos endocárdicos y epicárdicos y, si es necesario, ajuste a través de controles de optimización de la imagen (por ejemplo, ganancia).
  5. Una vez que la vista ecocardiográfica óptima se obtiene (figura 2B), mantener esta posición durante el resto del procedimiento, mientras que un segundo operador realiza el IMI (véase abajo).
    1. Mientras sostiene el transductor, evitar ocultar la marca de orientación del transductor, que siempre debe ser hacia delante, lo que permite su alineación con la aguja en pasos posteriores (figura 2A, C).
  6. Con una aguja 24 G conectada a una jeringa de 1 mL, coloque la aguja cerca de la piel de lo hemitórax simétricos espejado con respecto al transductor. A continuación, alinear manualmente la aguja con la marca de orientación del transductor en un ángulo de ~ 90° (figura 2) y haga avanzar lentamente la aguja a través de la piel y en la cavidad torácica.
    Nota: La inserción percutánea de la aguja en esta posición y la orientación facilita la visualización de la aguja en el plano de la viga del ultrasonido (Figura 2D, E), lo que permite el monitoreo en tiempo real y, cuando sea necesario, el ajuste de la ubicación de la aguja en relación con la región de destino del miocardio (figura 2 G, H).
  7. Con la punta en la ubicación de destino, lentamente entregar el injectate (hasta 0,25 mL por sitio de inyección) dentro de 10-30 s (Figura 2E), mientras que poco a poco y suavemente retrayendo la aguja durante la inyección para aumentar la extensión del miocardio tratados.
    1. Use InI 10% (v/v) diluido en PBS para la estandarización de la técnica y como un trazador en situ y adquisición de competencias, así como para confirmar la focalización exitosa de las cuatro localidades IMI en el miocardio por el grueso de la patología e histopatología (véase Representante de resultados). Una vez que se logra la competencia, InI podría ser sustituida por un agente de contraste de ultrasonido comercial adecuado si se desea.
      Nota: La entrega del 10% (v/v) InI diluido en PBS con o sin células en los resultados de miocardio transmural hyperechogenicity (es decir, aspecto brillante eco) en el sitio de destino de la inyección (Figura 2E, F). Transitoria desaceleración o aceleración del ritmo cardiaco, asociado a Extrasistolia ventricular (p. ej., aislados, pareados y trillizos) se observan con frecuencia incluso desde el primer contacto de la aguja con el epicardio, así como durante o poco después de IMI. Sin embargo, no se desarrollan arritmias peligrosas para la vida, y efectos adversos agudos se observan raramente con 0.25 mL (1.25 x 106 células) de injectate por sitio de la inyección de IMI (véase Representante resultados y discusión).
  8. Realizar cambios sutiles en el ángulo de incidencia de la aguja según sea necesario para completar las inyecciones de 0.25 mL a cada uno de los sitios IMI cuatro (tres en el ventrículo izquierdo libre de pared (LVFW) y en el IVS).
  9. Después de completar el procedimiento de contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI, evaluar ritmo cardíaco (por ejemplo, a través de la serie ECG trace o 24 h Holter ECG) y realizar análisis ecocardiográfico ventana serie para verificar la ausencia de complicaciones, hasta que el animal está recuperado de la anestesia y solo entonces transferencia a un cuarto ciclo de luz.
    1. Aquí, utilizamos 24 h Holter ECG para monitorizar los efectos del IMI con el InI en el ritmo cardíaco durante 24 h. Para ello, se compararon un grupo de 6 conejos con fenotipo normal (grupo Normal) y un grupo de 6 conejos que recibieron administración intravenosa de doxorubicina (una cardiotóxicos anthracycline droga, comúnmente utilizada para el tratamiento del cáncer; Grupo DOX) en una dosis de 2 mg/kg/semana durante 8 semanas y luego ambos cohortes recibido IMI con InI.

Figure 2
Figura 2 . Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en el conejo. (A) colocación del transductor en el hemithorax correcto en un ángulo de ~ 90 °. (B) imagen representativa de una visión de eje corto paraesternal (PSSX) del corazón a nivel de músculos papilares en el conejo. (C) alineamiento de la aguja en un ángulo de ~ 90 ° en relación con la marca de orientación del transductor. (D) Ubicación de la aguja en el sitio de destino en una vista PSSX del corazón (note que la aguja se visualiza fácilmente en el plano de la viga del ultrasonido). (E y F) demostración del hyperechogenicity en el sitio de destino en inyección intramiocárdica con tinta de la India (puntas de flecha de resaltar el hyperechogenicity transmural). (G) Ubicación Accidental de la aguja en la cámara del LV (puntas de flecha de resaltar el eje de la aguja). Nuevo (H) de la aguja a la pared libre del LV (puntas de flecha de resaltar el eje de la aguja). RV = ventrículo derecho; LV = ventrículo izquierdo; IVS = tabique interventricular; PW = pared posterior; AL = músculo papilar anterolateral; PM = músculo papilar posteromedial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. post IMI análisis

  1. Realizar el análisis histopatológico de las muestras de tejido de corazón de conejos.
    1. Fijar el tejido durante 24 horas en formaldehído al 10%, seguido de deshidratación con el aumento de las concentraciones de etanol como sigue:
      • 1 x 70% (60 min)
      • 1 x en metanol de ethanol/5% 95% (60 min)
      • 1 x 100% (60 min)
      • 1 x 100% (90 min)
      • 1 x 100% (120 min)
      Nota: Todas las anteriores incubaciones se realizan a temperatura ambiente (RT). Luego, sustituir dos veces con xileno 100% (1 h, RT) y finalmente incluir en parafina en dos pasos (60 min, 58 ° C)25.
    2. Realizar secciones de tejido de 4-5 μm con un micrótomo25. Monte las secciones en las diapositivas.
    3. Realizar tinción con hematoxilina-eosina y trichrome métodos25,26,27 de Masson.
  2. En secciones del tejido del corazón trasplantado, realizar inmunohistoquímica para detectar las células HEK-293 EGFP(+) (p. ej., utilizando el método de (ABC) complejo avidina-biotina), brevemente:
    1. La cera secciones corazón grueso de 4-5 μm en xileno 100% (10 min, a temperatura ambiente). Rehidratar el tejido lavando con la disminución de soluciones de concentración de etanol (2 x 100% (2 min) x 2 en el 95% (2 minutos) 1 x 70% (2 minutos); 1 x en el 50% (2 min); 1 x 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) a TA.
    2. Llevar a cabo la inhibición de la peroxidasa endógena que cubre las secciones con 100 μl de 3% H2O2 diluido en metanol (preparada con 5 mL de solución de H2O2y agregar metanol 30% hasta un volumen total de 50 mL) ( Incubar 30 min, RT) y luego lavar por inmersión con solución salina tamponada con Tris (TBS; pH 7,6).
    3. Realizar antígeno desenmascarar mediante tratamiento enzimático, cubriendo las secciones con 100 μl de 0,1% pronasa (preparada con 0.01 g pronasa diluida en 10 mL TBS) (incubar 12 min, RT), a continuación lavado con TBS (5 min, RT).
    4. Incubar en el bloqueo de solución (suero normal de cabra en 10% en TBS) con 100 μl por diapositiva (30 min, RT) y lavado con TBS (5 min, RT).
    5. Incubar con proteína de pollo anti-verde fluorescente (GFP) como anticuerpo primario (1: 500 en TBS) (1 h, 30 ° C) y lavado con TBS (5 min, RT).
    6. Incubar con el anticuerpo secundario biotinilado cabra anti-pollo IgG (1: 250 en TBS) (1 h, 30 ° C) y luego lavado con TBS (5 min, RT).
    7. Incubar con complejo avidina-biotina (20 min, 30 ° C) y luego la etiqueta usando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Finalmente, deshidratar por lavado en el aumento de las concentraciones de etanol (1 x 30% (2 minutos) 1 x 50% (2 minutos) 1 x 70% (2 minutos); 2 x (2 min.) el 95%; 2 x 100% (2 min)) en RT, contratinción secciones usando el método de hematoxilina-eosina25y luego montar diapositivas de cubierta. Son positivo, negativo así como controles de isotipo.
      Nota: El breve protocolo descrito anteriormente no está diseñado para uso general inmunohistoquímica; optimización para el tejido de interés y condiciones es necesario.

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Representative Results

Contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI con InI:

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, y una vez que la posición óptima de la punta de la aguja fue confirmada por la ecocardiografía y la inyección iniciadas, transmural hyperechogenicity se observó durante la entrega de InI (10% v/v en PBS) (Figura 2E) , así como poco después el IMI a la región de destino (figura 2F). Cuando IMI fue seguida inmediatamente por eutanasia y quitado el corazón, depósitos del InI eran fácilmente visibles en el examen externo del corazón (Figura 3A). Además, corazón cortes de tejido, por ejemplo, sección de eje corto a nivel de los músculos papilares (figura 3B), revelaron depósitos transmural del tinte del InI en el sitio de inyección, mostrando la entrega exitosa y eficaz de injectate en el miocardio con esta técnica. De nota, el hyperechogenicity transmural observado en vivo durante el IMI (Figura 2E, F), correlacionada bien con depósitos transmural de InI en especímenes ex vivo (Figura 3A, B). Esto demuestra claramente que el InI tiene propiedades duales en la configuración del IMI: un agente de contraste en vivo ultrasonido, así como un ex situ de vivoin trazador. Estas propiedades hacen InI un agente de contraste de ultrasonido muy versátil y de bajo costo, particularmente para la formación durante la adquisición de la competencia en esta técnica. Así, las características ecogénicas de InI ayudar a vigilar por ejemplo,IMI, determinar éxito IMI versus accidental intra-cámara o espacio pericárdico la inyección y, cuando sea necesario, dadas las capacidades de proyección de imagen en tiempo real de ultrasonido, para hacer seguimiento de las correcciones de la aguja en tiempo real (figura 2, H). Por otra parte, las capacidades de rastreo en situ de InI son de valor para localizar el injectate en vivo ex especímenes del miocardio de destino.

Contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI con las células HEK-293 InI y EGFP(+):

Antes de IMI, exitosa transfección de las células HEK-293 EGFP(+) fue confirmada por microscopía de fluorescencia durante en vitro las condiciones de cultivo (figura 3). La entrega exitosa de las células HEK-293 EGFP(+) en el miocardio se demostró mediante análisis de inmunohistoquímica de las secciones de tejido de corazón donde se observaron depósitos de InI. Así, utilizando el método complejo avidina-biotina (ver paso 4.2), abundantes células HEK-293 EGFP(+) fueron identificadas dentro del miocardio intercalado con depósitos de InI (figura 3D). Depósitos de InI todavía se observaron 24 h después de IMI en muestras de tejido miocárdico de conejos que recibieron InI en combinación con las células HEK-293 EGFP(+) (figura 3E) o InI solo (figura 3F). De la nota, se observó una respuesta inflamatoria aguda en este momento, con un predominante neutrophilic infiltra, en muestras de animales que recibieron células HEK-293 EGFP(+) (figura 3E), sugiriendo así el rechazo celular agudo. Por otro lado, los macrófagos se observaron en animales que recibieron solamente InI (figura 3F).

Figure 3
Figura 3 . In situ macroscópica e histopatológica de la evaluación y seguimiento de injectate. (A) demostración de la presencia de injectate en la examinación externa de un corazón suprimido después de IMI con InI (puntas de flecha de resaltar los sitios de inyección). (B) demostración de distribución transmural de injectate siguiendo IMI con InI en una sección transversal del corazón a nivel de los músculos papilares (puntas de flecha azules destacan transmural depósito InI; flecha blanca destaca un depósito visible de InI en el IVS). (C) autofluorescencia en vitro de células HEK-293 EGFP(+) mediante microscopía de fluorescencia. (FdeD) Análisis histopatológico de los sitios de inyección. EGFP(+) células visiblemente se intercalan con depósitos de InI en el miocardio en 0 h (D) y (E) de 24 h post IMI (puntas de flecha azul resaltar celdas EGFP(+); flechas rojas destaca la presencia de neutrófilos). Depósitos de InI entremezclan dentro del miocardio a las 24 h (F) después de IMI con InI solo (flechas azules destacan la presencia de macrófagos). RV = ventrículo derecho; LV = ventrículo izquierdo; IVS = tabique interventricular; IMI = inyección intramiocárdica; InI = tinta de la India. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Haber realizado más de 60 contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI procedimientos hasta la fecha, creemos que con cuidadosa atención al detalle y el buen manejo animal y el cuidado, el procedimiento es generalmente bien tolerado, y las complicaciones agudas son muy raras y generalmente leves. En general, en animales que se someten a IMI, la observación más frecuente durante y poco después el procedimiento transitorio aceleración o desaceleración de la frecuencia cardíaca, asociada con complejos ventriculares prematuros aislados (PVC) (Figura 4A). Así, monitoreo de Holter ECG de 24 h de animales que recibieron InI solo por IMI, reveló que la arritmia más frecuente detectada (número total de episodios en 24 h) fue aislado de PVC, a pesar de un mayor número de episodios fueron detectado en animales que fueron previamente tratados con DOX durante 8 semanas (figura 5A). PVC en pares y tríos parecen ser menos frecuentes (Figura 4B, C y figura 5B, C), aunque los trillizos son significativamente menos frecuentes en DOX-tratadas que en los conejos normales no tratados (figura 5). Por otro lado, la taquicardia ventricular no sostenida (TVNS) se observó con mayor frecuencia en animales normales (figura 4 y figura 5). Significativamente, mientras que la frecuencia cardiaca media no fue diferente entre los grupos Normal y DOX después de recibir el IMI con InI solo (figura 5E), la desviación estándar de intervalo R-R normal (SDNN), se redujo significativamente (< 100 ms) en el (grupo) DOX Figura 5F). El SDNN es una medida no lineal de estado salud de corazón, y por lo tanto, este resultado indica que el grupo DOX globales alteraciones en su estado fisiológico cardiaco.

Figure 4
Figura 4. Arritmias ventriculares observaron durante el monitoreo de Holter de 24 h en conejos que recibieron el IMI con InI. Las imágenes mostradas se obtienen imágenes de ECG Holter tachograms aparecen en pantalla durante el análisis fuera de línea e ilustran ejemplos representativos de los tipos más comunes de arritmias durante 24 h de vigilancia. (A) aislado PVC. (B) PVC en pareados. (C) PVC en tríos. (D) TVNS. PVC = contracciones ventriculares prematuras; TVNS = taquicardia ventricular no sostenida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Eventos arrítmicos detectados por monitoreo Holter ECG de 24 h después de IMI con InI en conejos. Número total de PVC aislado (A), PVC en PVC en trillizos, (C) (B), los pareados y TVNS (D), en conejos sin tratar (Normal + IMI) versus tratados con doxorrubicina (3 mg/kg/semana durante 6 semanas) conejos (DOX + IMI), después de IMI con InI. Significa pulso (E) y SDNN (F), en conejos de IMI y DOX, Normal + IMI grupos después de IMI con InI. Los datos se expresan como media ± SEM. * indica p < 0.05; y # indica p < 0.01, comparando Normal + IMI versus DOX + IMI grupos mediante t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El objetivo principal era desarrollar una técnica mínimamente invasiva que podría ser utilizada para la entrega de células madre en el miocardio de conejos (un gran tamaño animal modelo preclínico)17,18, mientras que tomando ventaja de la utilización de un relativamente barato, fácilmente disponible en muchas clínicas del sistema de imagen y centros de investigación. Aquí, demostramos que, utilizando un sistema de clínicas de la ecocardiografía, y ayudado por el InI, un agente ampliamente disponible, con capacidades de seguimiento en situ y propiedades ecogénicas, acertado contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI es muy eficaz en la entrega injectate a regiones de destino del conejo de corazón. Lo que sabemos, se trata de la primera descripción de una contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI celular entrega y en un modelo animal grande como el conejo18,19. Mientras que el InI se ha utilizado previamente en estudios para la localización en situ de injectate dentro de los tejidos7,28, esto es a nuestro conocimiento, la primera descripción de las dos propiedades de este agente como un en vivo agente de contraste de ultrasonido y un trazador en situ de injectate ex vivo. De hecho, mezclas complejas de agentes de contraste y en situ seguimiento sustancias anteriormente se han descrito en estudios murinos dirigidos a entregar injectates en el miocardio29. Sin embargo, dadas las propiedades ecogénicas de InI y sus capacidades de rastreo en situ , esta sustancia podría ser muy útil durante la adquisición de la competencia mientras que en formación con esta técnica.

Confirmación de entrega de injectate que contiene ambas InI, así como las células HEK-293 EGFP(+) usando immunohistochemistry demuestra la aplicabilidad de esta técnica de investigación preclínica a la terapia de células madre. Un IMI de InI junto con EGFP(+) HEK-293 dio lugar a una respuesta inflamatoria aguda con una predominante neutrophilic infiltra, lo que sugiere una respuesta de rechazo celular agudo (dentro de 24 h) a las células xenogeneicos. Esta respuesta probablemente no es de extrañar en un animal inmunocompetente. Por otro lado, un IMI con InI solo produce una respuesta inflamatoria aguda (dentro de 24 h) en el tejido miocárdico Tratado, que exhibió un infiltrado de macrófagos predominantes. Esto está en consonancia con la observación de inflamación aguda descrito en estudios previos siguientes IMI bajo visión directa en un pecho abierto procedimiento4,30,31,32,33. La inflamación aguda se ha observado en la inyección de suero salino o soluciones de PBS en el miocardio34,35e incluso en los músculos de gastrocnemius de la rata36, y por lo tanto, esta respuesta ha sido atribuido a lesión directa del tejido en lugar del injectate propiamente. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 en efecto, la sociedad internacional para la investigación traslacional Cardiovascular reconoce la ocurrencia común de la inflamación en el ajuste de IMI, pero no existe un consenso en cuanto a si o no medidas para reducir este proceso durante el peri-procedimiento tiempo son útiles (p. ej., corticosteroides intravenosos (I.V.))37. A pesar de que la inflamación en este estudio podría también atribuirse directa lesión del tejido, los resultados también sugieren que InI como un cuerpo extraño debe desempeñar también un papel en este proceso, proporciona un número de macrófagos parecen ser phagocytizing InI (figura 3F). Un análisis minucioso de los efectos funcionales de esta inflamación aguda secundaria a IMI dentro del corazón, o si no puede ser mejorados mediante la administración de fármacos profilácticos como los corticosteroides está fuera del alcance de este manuscrito. Sin embargo, percutánea contraste guiada por ecocardiografía IMI a cuatro regiones de destino del miocardio, con un volumen de injectate de hasta 0,25 mL (1.25 x 106 células) por sitio IMI, fue muy bien tolerado en el conejo.

Con más de 60 procedimientos realizados hasta la fecha, y después de competencia se logró, fue muy baja la mortalidad secundaria al procedimiento. Por ejemplo, no hay muertes ocurrieron en las dos cohortes descritas en el paso 3.9 (grupos Normal y DOX) después de IMI. De hecho, hasta la fecha después de 67 IMI procedimientos realizados como parte de un programa de investigación en curso, sólo hemos tenido dos muertes directamente relacionadas con el procedimiento (2.9% de mortalidad). En uno de ellos, la presencia de un Hemopericardio se demostró en el examen post mortem , mientras que el otro desarrolló signos clínicos neurológicos, consistentes con isquemia cerebral aguda secundaria a un evento cardioembólico, por lo que requiere un punto final humanitario. Esta tasa de mortalidad (2.9%) es significativamente más baja que el reportado por Lu et al. (11%)8 y Mu et al (27%)38, en conejos que recibieron IMI bajo visión directa en un procedimiento de pecho abierto. Así, consideramos que el procedimiento descrito en el presente estudio para ser seguro, y estamos utilizando esta técnica en los estudios en curso para evaluar la terapia basada en células madre en un modelo de conejo de AICM con prometedores resultados39,40.

Hay varios puntos críticos para un exitoso percutáneos guiada por ecocardiografía IMI de contraste. En primer lugar, garantizar la obtención de un eje corto paraesternal a nivel de los músculos papilares con clara delimitación de los contornos endocárdicos y epicárdicos. A continuación, asegúrese de que la punta de la aguja está dentro del campo de visión en todo momento una vez que esto ha entrado en la cavidad torácica y el miocardio para evitar entrega accidental en el espacio pericárdico o cámara de LV. A continuación, asegúrese de mantener al mínimo el número de pasajes a través de la cavidad torácica y en el pericardio y miocardio, ya que esto podría aumentar la probabilidad de traumatismo local (p. ej., Laceración) a estas estructuras y el riesgo asociado de Hemopericardio. Para ello, manteniendo la aguja en la cavidad torácica (y para algunos sitios de destino, en el mismo punto de entrada en el pericardio visceral (p. ej., pared lateral)), cuidadosamente realizar cambios sutiles en el ángulo de incidencia de la aguja. Por último, utilice siempre una aguja que tiene un claro y fácil paso a través de la piel en la cavidad torácica, evitando así los biseles de la aguja Roma entrar en el miocardio y causar daño significativo.

El procedimiento aquí descrito, no sólo permite una entrega confiable y exitosa de injectate a varios sitios de destino en el miocardio, pero también permite la corrección de la trayectoria de la aguja en tiempo real, evitando así () entrega intrachamber accidental Figura 2, H). Mientras que el cerrado pecho IMI procedimientos han sido descritos previamente en ratones, hay varias limitaciones inherentes a este modelo animal pequeño. Estas limitaciones incluyen el número de regiones de objetivo del miocardio susceptible de terapia y el bajo volumen/número de células que puede ser inyectado por destino sitio29,41. Además, la entrega exacta del injectate es a menudo una preocupación, con una tasa de éxito cerca de 60-70%42, y por lo tanto el uso de sistemas de ultrasonido de alta frecuencia menos ampliamente disponible es generalmente necesario29,41, 42. Estos sistemas están equipados con transductores de arreglo lineal que también tienen limitaciones inherentes a proyección de imagen (p. ej., reverberación es un artefacto frecuente)14. Otra limitación de los modelos de roedores pequeños como ratones y ratas, es sus diferencias intrínsecas en electrofisiología celular, que difiere de la de los seres humanos y modelos animales tamaño grandes como perros, cerdos y conejos y sistema de transporte de Ca+ 2 1516,de,43. Todas estas limitaciones a menudo crean dificultades en la traducción de los resultados en estos modelos en la clínica sin previa confirmación en un modelo animal grande.

Monitoreo cuidadoso de los animales en el período peri-procedimiento es obligatorio según las directrices contemporáneas para el cuidado de animales de laboratorio. Como se muestra aquí, esto podría hacerse mediante ecocardiografía serie ventana Análisis y trazos de ECG, por lo menos hasta que el animal se despierta de la anestesia. Los efectos agudos del IMI en el ritmo cardíaco también pueden ser monitoreados por Holter ECG de 24 h y es nuestra práctica habitual. De la nota, las arritmias más frecuentes fueron aisladas PVC, que son relativamente benignos en la naturaleza, y que fueron más comunes en animales que han sido tratados con doxorrubicina antes de IMI con InI (ver Figura 4A y figura 5A). Otras arritmias que fueron relativamente menos frecuentes incluyen: PVC en pareados; PVC en tríos; así como de TVNS (véase Figura 4BD yDde la figura 5B). Sin embargo, se observaron no arritmias amenazantes de la vida como taquicardia ventricular sostenida. De la nota, también se encontró que algunas manifestaciones cardiotóxicos en el grupo DOX podrían detectarse mediante Holter ECG, monitoreo, utilizando variables de dominio de la frecuencia de tiempo de la variabilidad del ritmo cardíaco (HRV) como SDNN. Así, una SDNN reducida (figura 5E, F), una medida no lineal de estado salud de corazón, se observó en el grupo DOX en comparación con el grupo Normal. Este es el primer informe de VFC reducida, según lo demostrado por una SDNN reducida, en el contexto de un conejo modelo del AICM, que coincide con la observación que reduce SDNN es un potente predictor independiente de muerte cardíaca en pacientes con HFrEF44 ,45,46. Las alteraciones en el grupo DOX SDNN probablemente no están relacionadas con el procedimiento IMI sin embargo, se requiere la confirmación de estos hallazgos en conejos recibiendo doxorrubicina, así como animales normales que no reciben el IMI. Si SDNN reducido en HFrEF también podría ser mejorado y por lo tanto se utiliza como una medida subrogada de los beneficios de la terapia de células madre basado, queda por ser evaluado, y será el foco de la investigación futura.

Se han explorado varias rutas de entrega de las células en el corazón, como intravenosa, intracoronario y entrega intramiocárdica; sin embargo, la vía intramiocárdica en este documento, ha demostrado el mayor nivel de célula retención tarifas1,2,3,4,5,37. No evaluamos tasa de retención celular en los estudios presentados aquí, como la metodología utilizada no es robusto y lo suficientemente específicas para cuantificar esta en vivo o ex vivo, que es una limitación de este estudio. En su lugar, utilizamos las células HEK-293 EGFP(+) cuyas características fenotípicas nos permitieron discriminar fácilmente la presencia de estas células dentro del miocardio, indicando entrega intramiocárdica exitosa. Sin embargo, el objetivo principal fue desarrollar una técnica mínimamente invasiva por el que nosotros podríamos realizar entrega IMI y celular en el miocardio de un modelo grande de tamaño, preclínico de miocardiopatía no isquémica. Como se muestra en la figura 2 y figura 3, esto se logró por primera vez por percutánea guiada por ecocardiografía IMI de contraste. Otros estudios son necesarios para evaluar la tasa de retención celular, así como cualquier potencial efectos beneficiosos de las células madre entregadas en el miocardio utilizando el procedimiento descrito en este documento; Estos estudios están actualmente en marcha. Recientemente comunicamos resultados prometedores en cuanto a efectos funcionales39,40.

IMI en un procedimiento de pecho abierto, un contraste percutáneo guiada por ecocardiografía IMI en un modelo preclínico grande como se describe en este estudio, es considerablemente menos invasivo en la naturaleza con la rápida recuperación del animal siguiendo el procedimiento y, como mencionadas, tiene también menor tasa de mortalidad8,38. Otro enfoque para IMI es IMI basadas en catéter, que también ha sido probado en modelos preclínicos y ensayos clínicos pequeños varios (para una revisión, véase Sheng et al.) 47. con este enfoque, un catéter es avanzado en la cavidad del LV y luego colocado en sitios de destino en el endocardio. Estos sitios de destino son que bien identificados antes del procedimiento, por ejemplo, utilizando el contraste de la proyección de imagen de resonancia magnética cardiaca (CMR)48, o durante el procedimiento, por ejemplo, por el trazado endocardiaco electromecánico (EEM), claramente diferenciar el miocardio viable antes de la inyección49. Este último enfoque es menos invasiva comparada para abrir cofre IMI bajo visión directa, que es una clara ventaja. También, puesto que CI en los seres humanos tiene una distribución irregular, EEM ayuda a dirigir la terapia específicamente a sitios viables del miocardio, que es particularmente importante en el ajuste de la CI. Sin embargo, un gran inconveniente es la inducción de arritmias ventriculares, que son una característica común de todos los enfoques IMI. Otros inconvenientes son el largo tiempo de procedimiento, con que EEM es una técnica muy exigente que requiere de amplia formación y un riesgo asociado de perforación cardiaca. En contraste, contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI como se describe en este estudio, técnicamente es menos exigente que IMI basadas en catéter, y, una vez que se logra la competencia, puede realizarse con seguridad en 25 min después de la anestesia. Del mismo modo, puesto que solamente una porción corta de la aguja se avanza en el miocardio, hay un menor riesgo de perforación cardiaca, aunque laceración cardiaca es todavía posible.

En conclusión, el contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI la técnica descrita en este estudio en un modelo animal grande, como el conejo16,43, es seguro, bien tolerado y eficaz en la entrega de injectate en la corazón. Por lo tanto, constituye una estrategia prometedora para la comprobación de hipótesis preclínica de los efectos de la terapéutica regenerativa cardiaca en la miocardiopatía no isquémica (por ejemplo, AICM), incluyendo pero no limitada a, la célula de vástago-basado terapia.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores agradecen excelente apoyo brindado durante la recogida de datos y Carlos Bueno para proporcionar las células HEK-293 EGFP(+) Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz y Manuel Molina. Este trabajo fue financiado en parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, España (JT) (número de autorización: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (no de la concesión. RD12/0019/0001) (JMM), cofinanciado con fondos estructurales de la Unión Europea (FEDER) (JMM); y la Universidad de Reading, Reino Unido (AG, GB) (financiación Central). Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

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References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

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