Author Produced

Perkutan kontrast ekokardiografi-guidad Intramyocardial injektion och Cell leverans i en stor preklinisk modell

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nya terapeutiska strategier i hjärt regenerativ medicin kräver omfattande och detaljerade studier i stora prekliniska djurmodeller innan de kan anses för användning på människa. Här visar vi en perkutan kontrast ekokardiografi-guidad intramyocardial injektionsteknik i kaniner, vilket är värdefullt för hypotesprövning effekten av sådana nya terapier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cell och genterapi är spännande och lovande strategier i syfte att hjärtats förnyelse i inställningen av hjärtsvikt med nedsatt ejektionsfraktion (HFrEF). Innan de kan använda, och genomföras i människor, krävs omfattande prekliniska studier i stora djurmodeller att utvärdera säkerhet, effekt och ödet av injectate (t.ex., stamceller) en gång levereras i myokardiet. Små gnagare modeller erbjuder fördelar (t.ex., kostnadseffektivitet, föredragandens för genetisk manipulation); men översätta med tanke på inneboende begränsningar av dessa modeller, resultaten i dessa sällan till kliniken. Omvänt, stora djurmodeller såsom kaniner, har fördelar (t.ex., liknande hjärtats elektrofysiologi jämfört med människor och andra stora djur), samtidigt som de behåller en bra kostnadseffektivt balans. Här visar vi hur du utför en perkutan kontrast ekokardiografi-guidad intramyocardial injektion (IMI) teknik, som är minimalt invasiv, säker, tolererades väl och mycket effektiv i riktade leveransen av injectates, inklusive celler, till flera platser inom myokardiet av en kanin-modell. För genomförandet av denna teknik, har vi också tagit fördel av ett allmänt tillgängliga kliniska ekokardiografi system. Efter att sätta i praktiken i protokollet som beskrivs här, en forskare med grundläggande ultraljud kunskap blir behöriga i utförandet av denna mångsidiga och minimalinvasiv teknik för rutinmässig användning i experiment, som syftar till att hypotesprövning av den funktionerna i hjärtats regenerativa therapeutics i kanin modellen. När kompetens uppnås, kan hela förfarandet utföras inom 25 min efter bedöva kaninen.

Introduction

Cell och genterapi terapier spännande och ständigt utveckla strategier för regenererande/reparera skadade hjärtmuskeln i HFrEF. Ett fåtal studier har jämfört effektiviteten (t.ex., cell avdragssatsen) av de olika administreringsvägar cell leverans, som konsekvent har uppvisat IMI överlägsenhet över intracoronary eller intravenös rutter1,2 , 3 , 4 , 5. det är således inte förvånande att en stor del av studierna på translationella modeller av stamcellsterapi skadade hjärtmuskeln, levererar injectate via IMI utförs under direkt Visa i en öppen kista förfarande6,7 . Detta tillvägagångssätt har dock flera begränsningar, inklusive invasiva arten av förfarandet, som bär risken för peri-processuella dödlighet (ofta underrapporterade)8. En IMI under direkt Visa eliminerar dessutom inte möjligheten för oavsiktlig injektion i ventrikulära kaviteten. I klinisk praxis skulle kunna en IMI under öppna bröst operation vara en lämplig metod för terapeutisk cell leverans, t.ex., under koronar bypassoperation (CABG); Detta tillvägagångssätt kan dock inte lämpliga för cell leverans i globala kardiomyopati av icke-ischemisk ursprung (t.ex., HFrEF sekundärt till antracyklin-inducerad kardiomyopati (AICM)).

Det finns ingen tvekan om att ischemisk hjärtsjukdom (IHD) är den vanligaste orsaken till HFrEF (~ 66%)9,10; icke-ischemisk kardiomyopati, inklusive AICM, påverkar dock fortfarande en betydande andel av patienter med HFrEF (33%)9 . Ja, senaste framstegen inom klinisk onkologi har resulterat i mer än 10 miljoner överlevande av cancer i USA ensam11, med uppskattningar av ett liknande nummer i Europa, konsekvent med en övergripande trend mot bättre överlevnad för cancerpatienter12 ,13. Således, att utforska fördelarna med romanen terapier såsom stamcellstransplantation för icke-ischemisk kardiomyopati, samt trialing av en effektiv och minimalinvasiv väg av stamceller leverans är av yttersta vikt, med tanke på det ökande antalet patienter påverkas av kardiotoxicitet sekundärt till cytostatika.

Notera innebär hypotesprövning studier med hjälp av stamcellsterapi som syftar till att reparera/regenerera skadade hjärtmuskeln ofta användning av smågnagare (t.ex., möss och råttor). Dessa modeller kräver ofta dyra högfrekvent ultraljud system för utvärdering av myokardiell funktion, oftast utrustade med linjär array givare som har vissa inneboende associerade begränsningar (t.ex., efterklang)14. Andra modeller såsom kaniner, som representerar en stor preklinisk modell, har dock några fördelar för hypotesprövning av stamceller terapier i HFrEF. Således, till skillnad från råttor och möss, kaniner upprätthålla en Ca+ 2 transportsystem och cellulär elektrofysiologi som påminner om människor och andra stora djur (t.ex., hundar och svin)15,16,17 ,18,19. En annan fördel, är deras föredragandens för ekokardiografi imaging använder relativt billig och allmänt tillgängliga kliniska ekokardiografi system utrustade med relativt hög frekvens fas array givare, t.ex., 12 MHz, såsom de som ofta används i neonatal och pediatrisk kardiologi. Dessa system låter utmärkt ekokardiografiska imaging med toppmodern teknik och de utnyttja överlägsenheten av harmonic imaging20. Dessutom omfattande hypotesprövning av hjärtats regenerativa behandlingar (t.ex., stamcellsterapi) potential, sin säkerhet, effekt, cardiomyogenic potential, samt utvärdering av ödet för injectate en gång levereras till den hjärtmuskeln, är obligatoriskt innan de kan anses för humant bruk, och de kräver användning av stora prekliniska djurmodeller, såsom kanin17,19. Här, beskriver vi en minimalinvasiv teknik för cell leverans via perkutan kontrast-ekokardiografi guidade IMI med hjälp av en klinisk ekokardiografi system, vars syfte är att transplantation-baserade stamcellsterapi för icke-ischemisk kardiomyopati20 . Vi beskriver också fördelarna med tusch (InI, även känd som Kina bläck) som ett ultraljud kontrast agent och i situ tracer av injectate i kanin hjärtat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experiment som beskrivs häri godkändes av utskottet för etisk forskning av den universitet Murcia, Spanien, och utfördes i enlighet med direktiv 2010/63/EU av Europeiska kommissionen. Stegen som beskrivs utfördes under operativa standardprotokoll som var en del av arbetsplanen och har inte utförts enbart för att filma den medföljande videon till denna uppsats.

1. beredning av celler och däggdjur uttryck vektor

Obs: Här, vi kortfattat beskriva ett protokoll för förberedelse och transfection av en cellinje (mänskliga embryonala njure 293 (HEK-293)); cell lämplig särskilda protokoll för den celltyp av intresse bör dock optimerad (t.ex., stamceller).

  1. Upprätthålla HEK-293 celler i hög glukos Dulbecco ändrade örnens medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% natrium pyruvat, 2 mM glutamin, 1% penicillin/streptomycin, och inkuberas vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 . När cellerna är sub konfluenta, delas upp i ett förhållande av 1:3.
  2. Börja dela celler vid aspirering media, och sedan tvätta en gång med steril fosfat buffrad saltlösning (PBS), ta bort överflödig PBS och sedan Inkubera med 2,5 mL 0,5 x Trypsin-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (5 min, 37 ° C).
    1. Lägga till en volym av DMEM media (kompletteras enligt ovan) att stoppa reaktionen, och sedan lossa cellerna genom att långsamt och försiktigt aspirera upp och ner med en elektronisk pipett.
  3. Överför sedan cellsuspensionen till en lämplig behållare (t.ex., 15-50 mL koniskt centrifugrör). Centrifugera i en gunga hink (100 x g), avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
  4. Återsuspendera pelleten i färska DMEM media och frö på en cell lämplig densitet (t.ex., 1 x 106 celler i en 75 cm2 kolv) i färsk kultur kolvar eller stora rätter enligt lokala laboratoriepraxis.
    1. Ersätt befintliga media med färska media varje 2 dagar.
      Anmärkning: Uttrycket vektorn var härrör från pIRES1hyg och användas enligt tillverkarens anvisningar som tidigare beskrivits21. p(EGFP) IRES1hyg genererades av subkloning andra cDNA som en BamHI + NotI Infoga från pEGFP-N1 i BamHI + NotI rötas pIRES1hyg21.
  5. 1 dag före transfection, celler utsäde HEK-293 med en täthet av 0,5 x 105 celler/cm2 i 12 - eller 24-väl vävnadsodling plattor.
  6. På dagen för transfection, förbereda DNA-lipid transfection reagens komplex i separata 1,5 mL mikrocentrifugrör (1 tube per brunn).
    1. Starta genom att lägga 250 µL av minskade serum medium i varje rör och sedan lägga till 4 µg DNA (blanda försiktigt).
    2. Därefter Tillsätt 250 µL från en tidigare beredda mix 10 µL lipid transfection reagens och 250 µL av minskade serum medium, i varje rör (blanda igen försiktigt).
    3. Slutligen, fortsätta med transfections, genom ruvning HEK-293 celler med DNA lipid transfection reagens komplex för 4 h, och sedan ersätta med DMEM medium kompletteras enligt ovan (steg 1.1) och inkubera i en annan 48 h. utför drog urval av stabil transfectants med 100 µg/mL hygromycin B.
  7. Lossa HEK-293 celler med trypsin som beskrivs ovan (steg 1.2). Efter tvättning cellerna i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, blandas i ett lämpligt fordon (t.ex., 10% v/v InI i PBS), att uppnå en slutlig cell koncentration av6/5 x 10 ml.

2. beredning av kanin

Obs: Att placera kaninen och givaren för IMI är inte optimalt att utvärdera morfologi och funktion av hjärtat av djuret. Således är det lämpligt att utföra en undersökning, komplett ekokardiografiska20 före IMI (se nedan), och efterföljande tidpunkter som definieras av experimentell design. Detta syftar till att utvärdera baslinjen anatomiska och funktionella egenskaper hos hjärtat i djuret som kommer att få en injektion, och också utvärdera effekterna, av IMI i funktionen av hjärtat.

  1. Utföra denna undersökning i en blindad mode och följa riktlinjerna i utskottet ekokardiografi av American College of Veterinary Internal Medicine och amerikanska samhället av ekokardiografi/Europeiska föreningen för hjärt Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Skaffa en samtidig 1-bly elektrokardiogram (EKG) spårning under hela ekokardiografiska studien.
  3. Söva kaninen med ketamin 10 mg/kg, kombinerat med medetomidin 200 µg/kg, intramuskulär (I.M.) injektion.
  4. Kontrollera nivån av anestesi efter 10-20 min efter administrering av anestesi.
  5. Använda en hårklippare ta bort håret på bröstet allmänt (t.ex., nedanför halsen till regionen sub xiphoid) (figur 1A).
  6. Raka ytterligare regioner av 1-2 cm2 i inre ansiktet rätt forelimb (mediocubital region) och båda bakbenen (mediotibial region) (figur 1B).
  7. Placera självhäftande EKG-elektroder på rakad regionerna i extremiteterna synkront övervaka hjärtrytmen under förfarandet (figur 1 c).
  8. Placera djuret i decubitus ryggläge på en värmefilt, med armar och ben utsträckta med kirurgtejp fäst till tabellen (figur 1 c).
    1. Kontrollera öronen är böjd bakåt bakom huvud/baksidan av kaninen, och på en position som är lägre än dess framben, eftersom detta bidrar till att upprätthålla korrekt positionering av bröstkorgen av djuret under hela förfarandet.
  9. Låt djuret andas spontant medan administrera syre genom ansiktsmask under hela förfarandet (100%, 2-3 L/min).

Figure 1
Figur 1. Beredning av kaninen för IMI. (A) klipp håret från bröstkorgen; (B) klipp håret från lemmar; (C) fäster elektroder och placera kaninen med benen utsträckta på en värmefilt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI teknik hos kanin

  1. Rengör och desinficera huden på bröstkorgen med en klorhexidin-baserad lösning.
    1. Använd aseptisk teknik under hela förfarandet, enligt nuvarande bästa praxis.
    2. När så är möjligt, och om det är praktiskt möjligt, utför en helt steril, inklusive men inte begränsat till, användning av sterilt material såsom klänningar, handskar, operationssåret draperier, sterila förband material för tabellen, liksom en steril ultraljud givare cover och sterila ultraljud gel. Detta kommer att minska till ett minimum risken att införa patogener att djuret får IMI och är praxis i den kliniska inställningen (t.ex., under hjärt punktering).
      Obs: Det rekommenderas att alltid fortsätta i linje med lokala och nationella regler för djurförsök tillämplig till den lokala institutionen och hemland i praxis.
  2. Applicera ultraljud överföring gel till bröstet och/eller givaren och med givaren sladden runt de experimenter's hals, göra en snabb fönster genomsökning av djurets hjärta, som ofta är bra att visualisera anatomi och att planera för IMI.
  3. Placera givaren manuellt på den 4: e-6: e interkostalrummet, 2-3 cm från höger parasternal raden med en meta av förekomsten av ~ 90 ° med avseende på höger sida av bröstkorgens vägg (figur 2A).
  4. Justera placeringen av givaren i förhållande till interkostalrummet samt dess anteroposterior och dorsoventral vinkel för att optimera en modifierad kort axis syn på nivån av papillära muskler. Identifiera i den här vyn höger kammare (RV), vänster kammare (LV), interventricular septum (IVS), bakre väggen (PW), samt anterolaterala (AL) och posteromedial (PM) papillär muskler (figur 2B).
    1. Har ett brett synfält genom att avsevärt öka djupet med hjälp av lämpliga kontrollen på systemet (t.ex., knapp, dial).
    2. Särskilt uppmärksamma att erhålla en symmetrisk bild i denna vy, liksom lämplig differentiering av endokardiella och epikardiell konturer, och, om nödvändigt, justera genom bild optimering kontroller (t.ex., vinst).
  5. När vyn optimal ekokardiografiska erhålls (figur 2B), behålla denna position under hela resten av förfarandet, medan en andra operatör utför IMI (se nedan).
    1. Samtidigt håller givaren, undvika döljer givaren orientering märket, som ska alltid vara vänd framåt, vilket gör att dess justering med nålen i efterföljande steg (figur 2A, C).
  6. Med 24-G nål bifogas en 1 mL spruta, placera nålen nära huden på den vänstra hemithorax i en symmetrisk spegling position med avseende på givaren. Sedan manuellt justera nålen med varumärket givaren orientering i en vinkel på ~ 90° (figur 2 c), och långsamt föra nålen genom huden och in i bröstkorghålet.
    Obs: Perkutan nål införande i denna position och orientering underlättar visualisering av nålen i planet för ultraljud balken (figur 2D, E), vilket möjliggör realtidsövervakning och, vid behov, justering av placeringen av nålen i förhållande till målregionen hjärtmuskeln (figur 2 G, H).
  7. Med spets på målplatsen, långsamt levererar injectate (upp till 0,25 mL per injektionsställe) inom 10-30 s (figur 2E), medan långsamt och försiktigt Upprullningskraften nålen vid injektion att öka omfattningen av myokardiet behandlas.
    1. Använda InI 10% (v/v) utspätt i PBS för standardisering av tekniken, och som en i situ -tracer samtidigt förvärva kompetens, samt för att bekräfta lyckad inriktning av alla fyra IMI platser inom myokardiet av brutto patologi och histopatologi (se Representativa resultat). När kompetens uppnås, kunde InI ersättas av en lämplig kommersiella ultraljud kontrastmedel om så önskas.
      Obs: Leverans av 10% (v/v) InI utspätt i PBS med eller utan celler in i myokardiet resultaten i transmural hyperechogenicity (dvs, echo ljusa utseende) till målwebbplatsen injektionsstället (figur 2E, F). Övergående retardation eller acceleration av hjärtfrekvensen, associerade med prematura ventrikulära kontraktioner (t.ex., isolerade, kupletter och trillingar) observeras ofta även från nålen med epicardium första kontakt som under eller strax efter IMI. Dock ingen livshotande arytmier är utvecklade och akuta negativa effekter observeras sällan med upp till 0,25 mL (1,25 x 106 celler) injectate per IMI injektionsställe (se Representativa resultat och diskussion).
  8. Utföra subtila förändringar i meta av förekomsten av nålen som behövs för att slutföra injektioner av 0,25 mL till varje av de fyra mål IMI webbplatser (tre i vänster ventrikulära fri vägg (LVFW) och en i IVS).
  9. Efter avslutad perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI förfarandet, utvärdera hjärtrytm (t.ex., genom seriell ECG spår eller 24 h Holter ECG) och utföra seriell fönster ekokardiografiska genomsökningar för att kontrollera frånvaron av komplikationer, tills djuret är helt återhämtat sig från anestesi och endast överför sedan till en ljus cykel rum.
    1. Här använder vi 24 h Holter ECG för att övervaka effekterna av IMI med InI på hjärtrytmen under 24 h. För detta jämförde vi en grupp 6 kaniner med normala fenotyp (Normal grupp) och en grupp av 6 kaniner som fick intravenös administrering av Doxorubicin (en kardiotoxiska antracyklin drog, vanligen används för behandling av cancer; DOX-gruppen) med en dos på 2 mg/kg/vecka i 8 veckor, och sedan båda kohorterna fick IMI med InI.

Figure 2
Figur 2 . Perkutan kontrast ekokardiografi-guidad intramyocardial injektion hos kanin. (A) placering av givaren i den högra hemithorax i en vinkel på ~ 90 °. (B) representativ bild av en parasternal kort axis syn (PSSX) på hjärtat i nivå med papillär muskler hos kanin. (C) justering av nålen med en vinkel på ~ 90 ° i förhållande till varumärket givaren orientering. (D) platsen för nålen på målwebbplatsen i en PSSX vy av hjärtat (Observera att nålen lätt visualiseras i planet för ultraljud balken). (E och F) Demonstration av hyperechogenicity på målwebbplatsen vid intramyocardial injektion med tusch (pilspetsar Markera den transmural hyperechogenicity). (G) oavsiktlig läge av nålen i LV kammaren (pilspetsar Markera nål axeln). (H) Repositioning av nålen på LV gratis väggen (pilspetsar Markera nål axeln). RV = höger kammare; LV = vänster kammare; IVS = interventricular septum; PW = bakre väggen; AL = anterolaterala papillär muskler; PM = posteromedial papillär muskel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. inlägg IMI analyser

  1. Utföra histopatologisk analys av hjärtat vävnadsprover från kaniner.
    1. Fixa vävnad för 24 h i 10% formaldehyd, följt av uttorkning med ökande etanol koncentrationer enligt följande:
      • 1 x i 70% (60 min)
      • 1 x i 95% ethanol/5% metanol (60 min)
      • 1 x 100% (60 min)
      • 1 x 100% (90 min)
      • 1 x 100% (120 min)
      Obs: Alla de ovanstående inkubationer utförs vid rumstemperatur (RT). Sedan ersätta två gånger med 100% xylen (1 h, RT) och slutligen bädda in i paraffin i två steg (60 min, 58 ° C)25.
    2. Utför 4-5 µm vävnadssnitt med en mikrotom25. Montera sektioner på bilder.
    3. Utföra färgning med hematoxylin-eosin och Massons trikrom metoder25,26,27.
  2. I vävnadssnitt från transplanterade hjärtan, utföra immunhistokemi för att upptäcka EGFP(+) HEK-293 celler (t.ex., med avidinen-biotin komplexa (ABC)-metoden), kortfattat:
    1. De-vax 4-5 µm tjock hjärta sektioner i 100% xylen (10 min, på RT). Rehydrera vävnad genom tvättning med minskande etanol koncentrationen lösningar (2 x 100% (2 min) 2 x på 95% (2 min) 1 x i 70% (2 min); 1 x i 50% (2 min), 1 x 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) på RT.
    2. Utföra endogena peroxidas hämning genom att täcka avsnitten med 100 µL av 3% H2O2 utspätt i () metanol (förberedd med 5 mL 30% stamlösning av H2O2och lägga till metanol upp till en total volym om 50 mL) Inkubera i 30 min, RT), och sedan tvätta genom nedsänkning med Tris buffrad koksaltlösning (TBS; pH 7,6).
    3. Utföra antigen demaskera via enzymatisk behandling, genom att täcka avsnitten med 100 µL 0,1% Pronase (förberedd med 0,01 g Pronase spädning i 10 mL TBS) (Inkubera 12 min, RT), tvätta sedan med TBS (5 min, RT).
    4. Inkubera i blockering lösning (normal get serum på 10% i TBS) använder 100 µL per slide (30 min, RT) och tvätta med TBS (5 min, RT).
    5. Inkubera med kyckling anti grönt fluorescerande protein (GFP) som primär antikropp (1: 500 i TBS) (1 h, 30 ° C) och tvätta med TBS (5 min, RT).
    6. Inkubera med sekundär antikropp biotinylerade get-anti-kyckling IgG (1: 250 i TBS) (1 h, 30 ° C) och sedan tvätta med TBS (5 min, RT).
    7. Inkubera med metoden-biotin komplex (20 min, 30 ° C) och sedan en etikett med 3,30-Diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Slutligen torkar genom tvättning i ökande etanol koncentrationer (1 x 30% (2 min) 1 x i 50% (2 min) 1 x i 70% (2 min), 2 x på 95% (2 min); 2 x 100% (2 min)) på RT, motfärg sektioner med hematoxylin-eosin metoden25, och sedan montera locket bilder. Inkludera positiva, negativa samt isotypen kontroller.
      Obs: Korta protokollet beskrivs ovan är inte avsedd för allmänna immunhistokemi; optimering för vävnaden i ränta och villkor är nödvändiga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI med InI:

Protokollet beskrivs ovan, och när optimal positionering av spetsen på nålen bekräftades genom ekokardiografi och injektionen initierade, transmural hyperechogenicity observerades under leverans av InI (10% v/v i PBS) (figur 2E) , samt som strax efter IMI till målregionen (figur 2F). När IMI följdes omedelbart av dödshjälp och hjärtat bort, var fyndigheter av InI väl synlig vid yttre undersökning av hjärtat (figur 3A). Dessutom avslöjade hjärtat vävnadssnitt, t.ex., kort axel avsnitt i nivå med papillär musklerna (figur 3B), transmural insättningar InI färgämnet vid injektionsstället, vilket visar att framgångsrik och effektiv leverans av injectate i myokardiet med denna teknik. Notera den transmural hyperechogenicity observerats i vivo under IMI (figur 2E, F) korrelerade väl med transmural insättningar på InI i ex vivo exemplar (figur 3A, B). Detta visade tydligt att InI har dubbla egenskaper i fastställandet av IMI: som en kontrast i vivo ultraljud agent, as well as en ex situ-vivoin tracer. Båda dessa egenskaper gör InI en mycket mångsidig och billig ultraljud kontrastmedel, särskilt för utbildning under förvärv av kompetens i denna teknik. Således, de echogenic egenskaperna hos InI att övervaka IMI t.ex., avgöra framgångsrika IMI kontra oavsiktlig intra-kammare eller perikardiell utrymme injektion, och, vid behov, ges ultraljud, realtid imaging kapacitet att göra korrigeringar av nålen spåra i realtid (figur 2 g, H). Däremot, är i situ spårning kapacitet InI av värde att lokalisera injectate i ex vivo exemplar mål hjärtmuskeln.

Perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI med InI och EGFP(+) HEK-293 celler:

Innan IMI bekräftades framgångsrika transfection EGFP(+) HEK-293 celler av fluorescensmikroskopi under i vitro kultur förhållanden (figur 3 c). Framgångsrik leverans av EGFP(+) HEK-293 celler i hjärtmuskeln visades via immunohistokemi analys av hjärtat vävnadssnitt där InI insättningar observerades. Således, med avidinen-biotin komplexa metoden (se steg 4,2), riklig EGFP(+) HEK-293 celler identifierades inom myokardiet varvat med InI insättningar (figur 3D). Fyndigheter av InI observerades fortfarande 24 h efter IMI i hjärtinfarkt vävnadsprover från kaniner som fick antingen InI i kombination med EGFP(+) HEK-293 celler (figur 3E) eller InI ensam (figur 3F). Notera observerades en akut inflammatorisk reaktion vid denna tidpunkt, med en dominerande neutrofil infiltrera, i prover från djur som får EGFP(+) HEK-293 celler (figur 3E), vilket tyder på akut cellulära avstötning. Däremot, sågs makrofager hos djur som fick InI ensam (figur 3F).

Figure 3
Figur 3 . In situ makroskopiska och histopatologiska utvärdering och spårning av injectate. (A) Demonstration av förekomsten av injectate på yttre undersökning av ett exciderad hjärta efter IMI med InI (pilspetsar Markera platser för injektion). (B) Demonstration av transmural distribution av injectate efter IMI med InI i en tvärgående delen av hjärtat på nivån av papillära muskler (blå pilspetsar belysa transmural InI insättning; vit pil belyser en synlig insättning av InI på IVS). (C) autofluorescens in vitro- EGFP(+) HEK-293 celler använder fluorescensmikroskopi. (DF) Histopatologisk analys av injicerade platser. EGFP(+) celler är synbart varvat med InI insättningar inom myokardiet vid 0 h (D) och 24 hEpost IMI (blå pilspetsar Markera EGFP(+) celler, röda pilar uppmärksamma förekomsten av neutrofiler). Fyndigheter av InI interspersed inom myokardiet på 24 h (F) efter IMI med InI ensam (blå pilar Markera närvaron av makrofager). RV = höger kammare; LV = vänster kammare; IVS = interventricular septum; IMI = Intramyocardial injektion; InI = India färgpulver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter att ha utfört över 60 perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI förfaranden hittills, tror vi att med noggrann uppmärksamhet på Detaljer och bra djurhantering och vård, förfarandet är i allmänhet tolereras väl, och akuta komplikationer är mycket sällsynta och oftast milda. I allmänhet, i djur som genomgår IMI, mest frekventerar observationen under och strax efter proceduren är övergående acceleration eller retardation av puls, i samband med isolerade prematura ventrikulära komplex (PVC) (figur 4A). Således, 24 h Holter ECG övervakning av djur som fick InI enbart via IMI, avslöjade att den vanligaste arytmi som upptäcks (totala antalet episoder inom 24 h) var isolerad PVC, trots ett högre antal episoder upptäcktes hos djur som var tidigare behandlats med DOX i 8 veckor (figur 5A). PVC i kupletter och trillingar tycks vara mindre frekventa (figur 4B, C och figur 5B, C), även om trillingar är betydligt mindre frekventa i DOX-behandlade än i obehandlade normala kaniner (figur 5 c). Däremot, icke-ihållande kammartakykardi (NSVT) observerades oftare hos normala djur (figur 4 d och figur 5 d). Betydligt, medan den genomsnittliga hjärtfrekvensen inte skiljde sig mellan DOX och normala grupper efter IMI med InI ensam (figur 5E), standardavvikelsen för normala R-R intervall (SDNN), reducerades signifikant (< 100 ms) i den DOX grupp ( Figur 5F). SDNN är ett icke-linjära mått på hjärtat hälsostatus och därför detta resultat indikerar att gruppen DOX har globala förändringar i dess fysiologiska hjärtstatus.

Figure 4
Figur 4. Ventrikulära arytmier observerats under 24 h Holter-övervakning hos kaniner som fick IMI med InI. Bilderna fås skärmdumpar från Holter-EKG tachograms visas på skärmen under offline analys och illustrerar representativa exempel på de vanligaste typerna av arytmier under 24 h av övervakning. (A) isolerad PVC. (B) PVC i kupletter. (C) PVC i trillingar. (D) NSVT. PVC = prematura ventrikulära kontraktioner; NSVT = icke-ihållande kammartakykardi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Arytmier händelser upptäcks av 24 h Holter ECG övervakning efter IMI med InI i kaniner. Totala antalet isolerade PVC (A), PVC i kupletter (B), PVC i trillingar, (C) och (D), NSVT i obehandlade kaniner (Normal + IMI) kontra behandlade med Doxorubicin (3 mg/kg/vecka i 6 veckor) kaniner (DOX + IMI), efter IMI med InI. Menar puls (E) och SDNN (F), i kaniner från Normal + IMI och DOX + IMI grupper efter IMI med InI. Data är uttryckta som medelvärde ± SEM. * indikerar p < 0,05; och # indikerar p < 0,01, jämföra Normal + IMI kontra DOX + IMI grupper av t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det primära målet var att utveckla en minimalinvasiv teknik som kan användas för distribution av stamceller i myokardiet kaniner (en stor storlek prekliniska djurmodeller)17,18, medan du tar fördel av användningen av en relativt billig imaging system lätt tillgänglig i många kliniska och forskningscentra. Här visar vi att, med hjälp av en klinisk ekokardiografi system, och med hjälp av InI, ett allmänt tillgängliga medel, med både i situ spårning kapacitet och echogenic egenskaper, framgångsrika perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI är mycket effektivt att leverera injectate till målregionerna kaninens hjärtat. Såvitt vi vet, är detta den första beskrivningen av en perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI och cell leverans i en stor djurmodell såsom kanin18,19. Samtidigt InI har tidigare använts i studier för i situ lokalisering av injectate inom vävnader7,28, är detta vår kunskap, den första beskrivningen av denna agent dubbla egenskaper som i vivo kontrastmedel för ultraljud och som en i situ -tracer av injectate ex vivo. Faktiskt har komplexa blandningar av kontrastmedel och i situ spårning ämnen tidigare beskrivits i murina studier syftar till att leverera injectates i myokardiet29. Men med tanke på de echogenic egenskaperna hos InI och dess i situ spårning kapacitet, kunde detta ämne vara mycket användbart under kompetens förvärv samtidigt som genomgår utbildning med denna teknik.

Bekräftelse av leverans av injectate som innehåller både InI samt som EGFP(+) HEK-293 celler med immunohistokemi visar tillämpligheten av denna teknik till preklinisk forskning syftar till att stamcellsterapi. En IMI på InI i samband med EGFP(+) HEK-293 resulterade i en akut inflammatorisk reaktion med en dominerande neutrofil infiltrera, vilket tyder på ett svar av akut cellulära avstötning (inom 24 h) till xenogena celler. Detta svar är förmodligen inte förvånande i ett immunkompetenta djur. Däremot, uppnås en IMI med InI ensam också en akut inflammatorisk reaktion (inom 24 h) hos den behandlade hjärtinfarkt vävnad, som uppvisade en dominerande makrofag infiltrera. Detta är i linje med observationen av akut inflammation beskrivs i tidigare studier efter IMI under direkt Visa i en öppen kista förfarande4,30,31,32,33. Akut inflammation har observerats vid injektion av fysiologisk koksaltlösning eller PBS lösningar i myokardiet34,35, och även till gastrocnemius musklerna rat36, och detta svar har därför varit tillskrivas direkt vävnadsskada i stället för den injectate i sig.. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 Indeed, den internationella föreningen för kardiovaskulär translationell forskning bekräftar den vanliga förekomsten av inflammation i fastställandet av IMI, men det finns ingen konsensus om huruvida eller inte åtgärder för att minska denna process under de Peri-processuella tid är användbar (t.ex., intravenös (I.V.) kortikosteroider)37. Även om inflammation i denna studie kan också hänföras direkt vävnadsskada, föreslå resultaten också att InI som en främmande kropp måste också spela en roll i denna process, som ett antal makrofager verkar phagocytizing InI (figur 3F). En grundlig analys av de funktionella effekterna av denna akut inflammation sekundärt till IMI inom hjärtat, eller om huruvida dessa kan förbättras via administration av profylaktiska läkemedel såsom kortikosteroider är utanför ramen för detta manuskript. Ändå, perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI till fyra målregionerna hjärtmuskeln, med en volym av injectate upp till 0,25 ml (1,25 x 106 celler) per IMI webbplats, tolererades väl hos kanin.

Med mer än 60 granskningsåtgärder till datum, och efter kompetensen uppnåddes, var dödligheten sekundärt till förfarandet mycket låg. Till exempel inträffade inga dödsfall i de två kohorterna beskrivs i steg 3,9 (Normal och DOX grupper) efter IMI. Faktiskt, hittills efter 67 IMI förfaranden utförts som en del av ett pågående forskningsprogram, vi har endast haft två dödsfall med direkt koppling till förfarandet (2,9% dödlighet). I en av dessa, närvaron av en hemopericardium visades i obduktion undersökning, medan den andra utvecklat kliniska neurologiska tecken, förenlig med akut cerebral ischemi sekundärt till en cardioembolic händelse, vilket kräver en humana slutpunkten. Denna dödlighet (2,9%) är betydligt lägre än vad som rapporterats av Lu et al. (11%)8 och Mu et al. (27%)38, hos kaniner som fick IMI under direkt Visa i en öppen kista förfarande. Således anser vi att det förfarande som beskrivs i den aktuella studien vara säkra, och vi använder denna teknik i pågående studier för att utvärdera stem cell-baserad terapi i en kanin modell av AICM med lovande resultat39,40.

Det finns flera kritiska punkter för en framgångsrik perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI. Först, se till att parasternal kort axel utsikt på nivån av papillär musklerna erhålls med tydlig avgränsning endokardiella och epikardiell konturer. Nästa, se till att nålspetsen är i synfältet hela tiden när detta har angett brösthålan och hjärtmuskeln att förhindra oavsiktlig leverans i perikardiell utrymme eller LV. Se sedan till att hålla en låg antalet passager genom brösthålan, och in i hjärtsäck och hjärtmuskeln, eftersom detta skulle öka sannolikheten för lokala trauma (t.ex., laceration) att dessa strukturer och associerade risken för hemopericardium. För detta, samtidigt som nålen i brösthålan (och för vissa mål områden, på samma införselorten i viscerala hjärtsäck (t.ex., laterala väggen)), noggrant utföra subtila förändringar i meta av förekomsten av nålen. Slutligen, Använd alltid en nål som har en tydlig och enkel passage genom huden in i bröstkorghålet, därmed undvika trubbig nål fasningar in hjärtmuskeln och orsakar betydande skada.

Det förfarande som beskrivs häri, inte bara tillåter pålitlig och framgångsrik leverans av injectate till flera mål platser inom myokardiet, men det tillåter även korrigering av nålen banan i realtid, vilket förhindrar oavsiktlig intrachamber förlossning ( Figur 2 g, H). Samtidigt stängs bröstet IMI förfaranden har beskrivits tidigare i möss, det finns flera begränsningar inneboende här små djurmodell. Dessa begränsningar inkluderar antalet målregionerna hjärtmuskeln kan bli föremål för behandling, och det låg volym/antalet celler som kan injiceras per target webbplats29,41. Dessutom korrekt leverans av injectate är ofta ett problem, med en framgång nära 60-70%42, och bruket av mindre allmänt tillgänglig högfrekvent ultraljud system är därför vanligtvis krävs29,41, 42. Dessa system är utrustade med linjär array givare som också har inneboende imaging begränsningar (t.ex., efterklang är en frekvent artefakt)14. En annan begränsning av små gnagare modeller såsom möss och råttor, är deras inneboende skillnader i Ca+ 2 transportsystem och cellulär elektrofysiologi, som skiljer sig från människor och stora medelstora djurmodeller som hundar, grisar och kaniner 15,16,43. Alla dessa begränsningar skapar ofta svårigheter att omsätta resultaten i dessa modeller till kliniken utan bekräftelse i en stor djurmodell.

Noggrann övervakning av djur i peri-processuella perioden är obligatoriskt enligt samtida riktlinjer för vård av försöksdjur. Såsom visas här, detta kan göras genom seriell ekokardiografi fönster skanningar och ECG tracings, åtminstone tills djuret är vaken från anestesi. De akuta effekterna av IMI på hjärtrytm också kan övervakas av 24 h Holter ECG och är vår praxis. Notera de vanligaste arytmier var isolerade PVC, som är relativt godartade karaktär, och som var vanligare hos djur som har behandlats med Doxorubicin innan IMI med InI (se figur 4A och figur 5A). Andra arytmier som var relativt mindre frekvent inkluderar: PVC i kupletter; PVC i trillingar; liksom NSVT (se figur 4BD och figur 5BD). Dock observerades inga liv livshotande arytmier såsom ihållande kammartakykardi. Notera fann vi också att vissa kardiotoxiska manifestationer i gruppen DOX kunde ha upptäckts av Holter-EKG övervakning, med hjälp av tid frekvensplanet variabler hjärtfrekvensvariationen (HRV) såsom SDNN. Således observerades en minskad SDNN (figur 5E, F), ett icke-linjära mått hjärta hälsostatus, i gruppen DOX jämfört med den normala gruppen. Detta är den första rapporten från minskad HRV, vilket framgår av en reducerad SDNN, i samband med en kanin modell av AICM, vilket är i linje med iakttagelsen att minskad SDNN är en kraftfull oberoende prediktor för hjärtdöd hos patienter med HFrEF44 ,45,46. Förändringarna i SDNN i gruppen DOX är förmodligen inte relaterade till själva IMI förfarandet; dock krävs bekräftelse av dessa fynd hos kaniner som fick Doxorubicin, liksom normala djur som inte får IMI. Om minskad SDNN i HFrEF kan också vara bättre och därför används som ett surrogat mått av baserat stamcellsterapi, återstår för att utvärderas, och kommer att vara i fokus för den framtida forskningen.

Flera vägar för leverans av celler i hjärtat har undersökts, däribland intravenös, intracoronary, och intramyocardial leverans; intramyocardial rutten som används häri, har dock konsekvent visat den största andelen cell retention priser1,2,3,4,5,37. Vi inte bedöma cell avdragssatsen i de studier som presenteras här, eftersom den metod som används inte är robust och tillräckligt specifik för att kvantifiera detta i vivo eller ex vivo, vilket är en begränsning av denna studie. Istället använde vi EGFP(+) HEK-293 celler vars fenotypiska egenskaper tillät oss att enkelt diskriminera förekomsten av dessa celler i hjärtmuskeln, vilket indikerar framgångsrika intramyocardial leverans. Men var det huvudsakliga syftet att utveckla en minimalinvasiv teknik där vi kunde utföra IMI och cell leverans i myokardiet av en stor storlek, preklinisk modell av icke-ischemisk kardiomyopati. Som framgår i figur 2 och figur 3, uppnåddes detta för första gången av perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI. Ytterligare studier är nödvändiga för att bedöma cell avdragssatsen samt eventuella positiva effekter av stamceller levereras i myokardiet med hjälp av proceduren som beskrivs häri; dessa studier pågår för närvarande. Vi meddelade nyligen lovande resultat när det gäller funktionella effekter39,40.

Jämfört med IMI i en öppen kista förfarande, en perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI i en stor preklinisk modell som beskrivs i denna studie är betydligt mindre invasiva karaktär med snabb återhämtning av djuret efter förfarandet, och som nämnts ovan, har den också lägre dödlighet klassar8,38. En annan metod att IMI är kateter-baserade IMI, som också har testats i prekliniska modeller och flera små kliniska prövningar (för en genomgång, se Sheng et al.) 47. med detta synsätt en kateter är avancerade i LV kaviteten och sedan placerad på target platser inom endocardium. Dessa mål platser är antingen identifieras före ingreppet, t.ex., använder kontrast hjärt magnetisk resonanstomografi (CMR)48, eller under förfarandet, t.ex., av elektromekaniska endokardiella mappning (EEM), att tydligt differentiera livskraftig hjärtmuskeln före injektion49. Detta senare synsätt är mindre invasiva jämfört med öppna bröstet IMI under direkt Visa, vilket är en klar fördel. Även sedan IHD i människor har en ojämn fördelning, hjälper EEM direkt terapin specifikt till livskraftiga områden av hjärtmuskeln, vilket är särskilt viktigt i fastställandet av IHD. En stor nackdel är dock induktion av ventrikulära arytmier, som är gemensamt för alla IMI-metoder. Andra nackdelar omfatta den långa processuella tid, förutsatt att EEM är en mycket krävande teknik vilket kräver omfattande utbildning och en associerad risk för kardiella perforation. Däremot perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI som beskrivs i denna studie, tekniskt är mindre krävande än kateter-baserade IMI, och, när kompetensen är uppnått, det kan utföras på ett säkert sätt inom 25 min efter anestesi. På samma sätt, eftersom endast en kort del av nålen är avancerade i myokardiet, finns det en lägre risk för hjärt perforering, men hjärt laceration är fortfarande möjligt.

Sammanfattningsvis, perkutan kontrast ekokardiografi-guidad IMI tekniken som beskrivs i denna studie i ett stort djur, t ex kanin16,43, är säker, väl tolererad och effektivt leverera injectate in i den hjärta. Det utgör därför en lovande strategi för prekliniska hypotesprövning av effekterna av hjärt regenerativ therapeutics i icke-ischemisk kardiomyopati (t.ex., AICM), inklusive, men inte begränsat till, stem cell-baserad terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Författarna tackar Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz och Manuel Molina för utmärkt support under insamling av data och Carlos Bueno föreskrivs att tillhandahålla EGFP(+) HEK-293 cellerna. Detta arbete var stöds delvis av: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanien (JT) (bevilja nummer: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Rades, VI PN de jag + D + jag 2008-2011 (bevilja nr. RD12/0019/0001) (JMM), medfinansieras med strukturell finansiering av Europeiska unionen (FEDER) (JMM); och, universitetet i Reading, Storbritannien (AG, GB) (Central finansiering). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics