Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этой работе мы описываем протоколы для расследования роли внеклеточных везикулы (EVs) выпущен в эритроцитах Plasmodium falciparum инфицированных. В частности мы сосредоточены на взаимодействии EVs с эндотелиальных клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Andrea Hernández-Castañeda, M., Mbagwu, S., Babatunde, K. A., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection. J. Vis. Exp. (132), e57067, doi:10.3791/57067 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Малярия — это болезнь, угрожающих жизни, вызванной Plasmodium паразитов, с P. falciparum наиболее распространенных на африканском континенте и ответственность за большинство случаев смерти, связанных с малярией во всем мире. Эволюция заболевания малярии инфицированных людей влияют несколько факторов, включая поглощение паразита в тканях, сосудистые дисфункции и воспалительные реакции. P. falciparum-зараженные красные кровяные клетки (iRBCs) релиз малых внеклеточного везикулы (EVs), содержащие различные виды грузов молекул, которые посредником патогенеза и сотовой связи между паразитов и хост. EVs, эффективно поглощаются клетки, в которых они модулировать их функции. Здесь мы обсуждаем стратегии для рассмотрения роли EVs в паразита хост взаимодействий. Во-первых мы опишем простой метод для маркировки и отслеживания EV интернализации эндотелиальных клеток, использованием компоновщика красителя Зеленые ячейки. Во-вторых мы приводим простой способ измерения проницаемости через эндотелиальные клетки однослойная с помощью дневно обозначенные декстрана. Наконец мы покажем, как расследовать роль малых молекул РНК-кодирования в функции эндотелиальных клеток.

Introduction

По данным Всемирной организации здравоохранения там были 212 миллионов новых случаев заболевания малярией во всем мире к 2015 году и приблизительно 429,000 человек погибло, главным образом детей младше пяти лет возраст1. Механизмы, ведущие к тяжелой болезни, которая часто ассоциируется с сосудистой дисфункции, остаются нечетко2. Plasmodium- iRBCs выделяют небольшие Би липидные мембраны сферах, известный как внеклеточного везикулы (EVs). Известно, что эти EVs потенциально имеющих отношение к процесс инфицирования и иммунного ответа к инфекции; Однако мало что известно о точной функции этих мелких пузырьков во время малярия инфекции3. Вполне возможно, что они играют две важные функции: с одной стороны, они могли бы содействовать патогенеза, активизируя макрофаги4,5; и с другой стороны, они могут быть посредником сотовой связи между паразитов и паразитов и разместить6,7. В самом деле паразиты могут передавать белки и нуклеиновые кислоты между друг с другом через EVs. К примеру Trypanosoma brucei rhodesiense EVs могут передавать фактор вирулентности Serum Resistance-Associated (SRA) и можно ориентировать другие т. brucei и принимающих эритроцитов8. Кроме того P. falciparum- iRBCs общаться друг с другом путем передачи нуклеиновых кислот в EVs. Это позволяет паразитов для оптимизации и синхронизировать ее роста. В самом деле EVs могут быть основной регулятор gametocyte преобразования и поэтому способствуют регуляции передачи этап7.

Не только сделать EVs регулировать паразитов, они также посредником паразит хост взаимодействий. Недавно мы обнаружили, что EVs от iRBCs содержат хост производные микроРНК (интерферирующим; малые РНК видов в диапазоне 21-25 нуклеотидов9), которые были приняты эндотелиальных клеток человека. Адаптивной в EVs образуют прочную комплекс с давности2 (членом РНК индуцированной глушителей комплекс), который после доставки на получателя ячейки, способен специально подавления экспрессии генов и затрагивающих барьерные свойства ячейки10. Были разработаны стандартные протоколы исследовать функцию EVs. Здесь мы сначала описать протокол, который позволяет люминесцентные маркировки EVs расследовать их усвоение клетками получателей. Кроме того с помощью конфокального микроскопа, можно проследить судьбу EV внутри клетки. Несколько флуоресцентных красителей могут использоваться для отслеживания EVs. Амин реактивных красителей, 5-(and-6)-Карбоксифлуоресцеина диацетата Succinimidyl эфира (CFSE) и Флуорексон-ам становится люминесцентные раз внутри везикул. Мы предпочитаем использовать метку амфифильных PKH, потому что он дает сигнал ярче и более равномерным. Этот подход обеспечивает важную информацию, чтобы понять взаимодействие между EVs и получателей клетки. Хотя в некоторых случаях EVs привязать к поверхности клеток, некоторые везикулы быстро take up. После поглощения EVs доставки их грузов в клетки, в которых они оказывают свои нормативные функции.

Здесь мы описываем протокол для измерения барьерной функции эндотелиальных клеток в пробирке путем определения количественных показателей передачи флуоресцентные декстран через сотовый монослоя. Более чувствительные Трейсеры может использоваться как radiolabeled маркеров. Однако они требуют особых мер предосторожности для использования. Другие анализы существуют для оценки функции барьера в пробирке , например трансэндотелиальной электрическое сопротивление (ТЕЕР), который измеряет туго Джанкшен целостности. Наконец визуализации ZO-1, белок плотный узел, с помощью иммунофлуоресцентного позволяет оценку целостности жесткие соединения как хорошо10. Так как EVs сложной и разнородной сущности, содержащие несколько грузов с потенциальными нормативной характеристикой, полезно overexpress конкретные РНК для изучения его воздействия на получателей ячейки. Таким образом мы также определить протокол, который направлен на создание стабильных клеточных линий, выражая Мирна интерес10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Человека эритроциты были получены от крови здоровых доноров, в соответствии с руководящими принципами Swissethics (swissethics.ch).

Примечание: P. falciparum паразита культур (3D 7) и EV производства были ранее описанные в Mbagwu, и др. 11 потому что P. falciparum человеческий патоген, консультироваться местные правила для обработки. Культуры должны храниться стерильные весь время.

1. флуоресценции маркировки EVs

Примечание: Следующая процедура использует маркировки технологии для стабильно включения зеленого флуоресцентного красителя (PKH67) с большими алифатических хвосты в регионе липидные мембраны EV. Реакция проводится в 200 мкл окончательный пятнать тома, содержащие PKH67 конечная концентрация 20 мкм. Выполните все шаги при температуре (20-25 ° C)

  1. Место 100 мкг EVs в 1 мл PBS в пробки microcentrifuge.
  2. Центрифуга EVs в пробки microcentrifuge на максимальной скорости (20000 x g) за 7 мин в гранулах.
    Примечание: Поскольку гемин присутствует в EVs, красный темно коричневого Пелле должны соблюдаться. Если супернатант красноватые, лизированы EVs.
  3. После центрифугирования аспирационная супернатант тщательно, чтобы избежать удаления любых EVs.
    Примечание: Минимизируйте количество оставшихся буфера перед resuspending EVs в разбавителя C с целью повышения эффективности окрашивание и повторяемость.
  4. Ресуспензируйте Пелле EV в 100 мкл разбавителя C (2 X EV подвеска) и аккуратно пипетки для обеспечения полной дисперсии.
  5. Подготовить новые пробки microcentrifuge и добавить 4 мкл раствора обколоть красителя PKH67 100 мкл растворителя C. Vortex хорошо перемешать. Подготовьте этот раствор красителя 2 x (40 мкм) немедленно до окрашивания.
    Примечание: Чтобы избежать гетерогенных окрашивания, не добавляйте раствор спиртовой красителя PKH67 непосредственно в Пелле EV.
  6. Быстро объединить 100 мкл 2 X подвеска EV (шаг 1.4) с 100 мкл 2 X раствор красителя (шаг 1.5). Затем смешайте образца, закупорить вверх и вниз по 10 раз.
  7. Инкубируйте EV/краска подвеска из шага 1.6 5 мин защищены от света и микс vortexing 3 - 4 раза в течение 5 минут инкубации.
    Примечание: Инкубации подвеска EV/краска для больше раз обеспечивает никакое преимущество, потому что окрашивание происходит настолько быстро.
  8. Остановите окрашивание реакции путем добавления равного объема (200 мкл) сыворотки и инкубировать 1 мин разрешить связывание избыточного красителя.
    Примечание: Перед остановкой окрашивание, разрушающим сыворотки от EVs центрифугированием в 20,000 g x 20 мин.
  9. Вымойте 3 раза с PBS и спин вниз на 20000 x g 5 мин Ресуспензируйте EVs в 100 мкл PBS до конечной концентрации 1 мкг/мкл.

2. Визуализируйте поглощение EVs, конфокальная микроскопия

Примечание: Следующий протокол описывает отслеживания EV интернализации эндотелиальных клеток, выращенных на стекло coverslips. Эндотелиальные клетки являются полу увековечен костного эндотелиальных клеток человека, как описано в12.

  1. Работая в стерильных условиях, пальто coverslips с избытком 0,01% поли L-лизин за 10 мин при комнатной температуре (RT).
  2. Аспирационная поли L-лизин решения и позволяют coverslips полностью высохнуть.
  3. Выполните жизнеспособной эндотелиальных клеток игр, с помощью исключения Трипановый синий и Горяева.
  4. Передача 1 х 105 эндотелиальных клеток в 1 мл полной эндотелиальных клеток роста средних содержащие дополнения смесь поли L-лизин покрытием coverslips и пусть растут в монослое клеток.
    Примечание: Средство содержит факторы роста, которые позволяют клеткам формировать монослоя и формируют плотные соединения.
  5. После того, как клетки формируют монослоя, тщательно аспирационная среды и добавьте 1 mL свежих средних вымыть клетки. Повторите еще раз мыть. Добавьте 50 мкг PKH67-меченых EVs и проинкубируйте 4 ч.
    Примечание: Чтобы найти оптимальный момент для поглощения, время курс может быть проведена.
  6. После 4 ч аспирационная среднего и мыть ячейки 3 раза с PBS для удаления избыточных и несвязанных EVs. Исправьте клетки с 3% раствором параформальдегида в PBS на 15 мин.
    Примечание: Метанол может нарушить актина во время процесса фиксации; Таким образом это лучше, чтобы избежать любых метанола, содержащие фиксативов или других растворителей фиксаторы. Рекомендуется использовать метанол свободного формальдегида в качестве фиксатором.
  7. Вымойте клетки 3 раза с PBS. Добавьте тщательно 250 мкл 0,1% тритон X-100 в PBS для разрушения клеток. Инкубируйте на RT на 5 мин.
  8. Вымойте 3 раза с PBS. 400 мкл блокировки буфера (5% BSA в PBS), за 30 мин при RT блокировать неспецифической привязки.
  9. Вымойте клетки один раз с PBS. Подготовьте окрашивание раствора путем разбавления 5 мкл Фаллоидин Стоковый раствор в 200 мкл PBS/1% BSA за каждую крышку выскальзования. Накапайте 200 мкл окрашивание раствора на coverslip и проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
  10. Вымойте 3 раза с PBS. Counterstain ДНК для 30 s с Hoechst 33342 в конечной концентрации 2 мкг/мл в 200 мкл PBS.
  11. Вымойте 2 x coverslip, добавляя 400 мкл PBS. Тщательно захватить coverslip пинцетом и инвертировать его на вершине капля antifade монтаж СМИ на стеклянное скольжение. Осторожно удалите избыток средств массовой информации с ткани и печать каждой стороне с ногтей.
  12. Хранить слайды, защищенный от света при 4 ° C.
  13. Визуализировать клетки с помощью Конфокальный микроскоп лазера возбуждений 405, 488 и 543 Нм и 63 X, 1.3 цель нефти NA с Флуоресцентные выбросов на 450-470 Нм (синий), 505-530 Нм (зеленый) и 620 Нм.
    Примечание: Типичный F-актина окрашивание результаты показаны на рисунке 1.

3. эндотелиальных клеток проницаемость

Примечание: Эндотелиальных клеток проницаемость оценивается путем измерения передачи родамин B Изотиоцианаты декстрана (средняя 70 000 МВт) по всему монослою эндотелиальных клеток. Декстран обеспечивает отличный инструмент для изучения сосудистой проницаемости.

  1. Количество жизнеспособных эндотелиальные клетки, с помощью исключения Трипановый синий 0,4% и Горяева.
  2. Пластина эндотелиальных клеток на плотности тарелок 0,6 x 105 клеток до впадения в 24-ну тканевые культуры вставок (размер пор 0,4 мкм) и оставить нетронутыми для по крайней мере 5 дней сформировать дифференцированной монослои. Обновление среды каждый второй день.
  3. После того, как клетки достигают однослойные, нагрузка EVs (50 мг в 1 мл) на верхней палаты. Добавьте родамин декстран верхнего колодца в конечной концентрации 20 мг/мл. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
  4. Контролировать передачу флуоресцентные декстрана в нижней хорошо путем измерения флуоресценции выбросов от 40 мкл средних аликвоты. Настройка Считыватель микропланшетов мульти лейбл на 544 Нм возбуждения и 590 нм выбросов для измерений.
    Примечание: Количество рассеянного декстрана может быть определена количественно с помощью калибровочных кривых с Стоковый раствор. Кроме того может быть кинетическая эксперименты, удалив небольшие образцы средство внешней камеры во время курса (рис. 2). Даже без лечения через монослое клеток будет диффузный декстрана.

4. Определите Puromycin чувствительность

Примечание: Прежде чем преобразователя клеточных линий с человека, важно определить убить кривой выбранного препарата для этой конкретной ячейки строки. Чтобы определить минимальное количество концентрации препарата необходимо убить всех клеток, выполните дозы ответ эксперимент с использованием дополнительных доз выбранного препарата. Потому что каждая линия клеток млекопитающих имеет различную чувствительность, прежде чем эксперименты, оптимальная концентрация антибиотика должны определяться путем разработки кривой титрования убить как описано ниже.

  1. Подсчет количества ячеек, используя Горяева. Ресуспензируйте эндотелиальных клеток в концентрации 1 х 105 клеток/мл в полной эндотелиальных клеток роста носитель, содержащий дополнения микс.
  2. Пластина 1 x 104 клетки в 96-луночных плиту в окончательный объем 100 мкл эндотелиальных клеток среднего роста.
  3. 100 мкл среды, содержащие антибиотики для получения концентрации 0,1-10 мкг/мл (см. рис. 3).
  4. Изучите жизнеспособность клеток каждые 2 дня под микроскопом света, с использованием 20 X цель. Культура клетки для 10-14 дней и заменить средства массовой информации, содержащие puromycin каждые 2-3 дня в зависимости от роста клеток.
  5. Добавить 10 мкл/хорошо МТС реагента в каждую лунку, перемешать и проинкубируйте 4 ч при 37 ° C в условиях стандартной культуры.
  6. Коротко встряхнуть пластину на шейкер и измерения оптической плотности обработанных и необработанных клеток с помощью пластины читателя на 490 Нм (рис. 3).

5. трансдукции эндотелиальных клеток с лентивирусные вектор

  1. Пластина 1 х 105 эндотелиальных клеток в 1 мл полного среднего за день до трансдукции. Выполните трансдукции, когда клетки достигли 50-80% confluency.
  2. Оттепель человека на льду и сделать аликвоты вирусный запасов, чтобы избежать циклов замораживания оттаивания. Спин вниз материал на 200 x g 30 s, в трубы перед открытием чтобы избежать разлива.
  3. Добавьте hexadimethrine бромид к ячейкам в конечной концентрации 8 мкг/мл.
    Примечание: Hexadimethrine бромид помогает электромеханической эффективности, однако в некоторых случаях могут быть токсичны для клеток. Таким образом оптимальная концентрация должна определяться путем выполнения убийство кривой до трансдукции.
  4. Вихрем пластину осторожно, чтобы перемешать. Добавьте соответствующее количество вирусных частиц (между частицами6 0,5-2 x 10) на разносторонности подходит инфекции (МВД) и вихрем пластины слегка за 30 s смешивать.
  5. Центрифуга смесь клеток вирусных частиц в центрифуге на RT 45 мин на 300 x g для повышения эффективности трансдукции. Инкубируйте смесь клеток вирусных частиц при 37 ° C на ночь.
  6. Тщательно удалите вирусных частиц содержащих среднего и утилизируйте надлежащим образом. Замените его свежие, подогретым полной питательной среды.
  7. Начать выделение с puromycin на второй день: удалить носитель и заменить его с свежей средой, содержащей правильную концентрацию puromycin как определено ранее в разделе 4 (рис. 3).
  8. Урожай клетки после выбора puromycin и изолировать РНК с помощью РНК изоляции комплект следуя инструкциям производителя.
  9. Синтез cDNA с выбранной адаптивной, с помощью обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалов).
  10. Настройка реакции ПЦР согласно цитируется протокол13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы описываем протоколы для изучения взаимодействия EVs с клеток хозяина. Поглощение дневно обозначенные EVs контролируется confocal микроскопии (рис. 1). Эндотелиальных клеток эффективно рассматривать EVs, однако время инкубации с EVs могут быть оптимизированы для отслеживания поглощение. Для лучшей локализации EVs внутри клетки пятно актина с Фаллоидин. Далее мы используем мембране фильтра, на вершине которой растет монослоя эндотелиальных клеток. Родамин B Изотиоцианаты декстран применяется на верхней палаты мембраны фильтра и затем проницаемость эндотелия монослоя измеряется путем контроля за передачей флуоресцентные декстрана в нижней камере (рис. 2A). Как правило проницаемость эндотелиальных клеток влияет при инкубации с растущим количеством EVs (рис. 2B). Важно вырастить клетки для несколько дней, чтобы убедиться, что они станут монослоя, иначе краска будет быстро распространять через скважины. Важно отметить, что даже без лечения, декстран будет диффузный медленно через монослое клеток.

МикроРНК являются ключевыми компонентами EVs и после передачи получателя клетки, они регулируют экспрессию генов. Для того, чтобы исследовать именно роль адаптивной, это очень полезно для overexpress их в строке получателя ячейки. Здесь мы опишем, как передавать интерферирующим в эндотелиальных клеток. Первый шаг состоит из определения концентрации puromycin, которая убивает эндотелиальные клетки для того чтобы выбрать стабильно transduced клеток (рис. 4A). Наконец уровень экспрессии интерферирующим можно контролировать и подтверждена ПЦР (рис. 4B).

Figure 1
Рисунок 1: EVs принимаются эндотелиальных клеток. Очищенный EVs были помечены в зеленый с PKH67 и инкубируют для 4 h с монослоя эндотелиальных клеток. Неочищенные эндотелиальные клетки используются в качестве отрицательного контроля. После обширных мытья удаление несвязанных EVs, клетки окрашивали Фаллоидин пятно актина (красный) и Hoechst 33342 пятно ядро (синий). Клетки были отмечены confocal микроскопии. Изображения были взяты с помощью лазерного конфокального микроскопа и 63 x 1.3 NA нефти цели. Hoechst 33342 спешит на 405 нм и с выбросами, собранных на 450-470 Нм (синий); PKH67 спешит на 488 нм, выбросы, собранных на 505-530 Нм (зеленый); и Фаллоидин-594 спешит на 543 Нм, выбросы, собранных на 620 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: эффект поглощения EV на эндотелиальный барьер. (A) схема диффузии родамин меченых декстрана: эндотелиальные клетки растут до места впадения верхней части мембраны фильтра, флуоресцентный декстрана применяется к верхней палаты и рассеивает со временем через мембрану. После добавления EVs в верхней палате эффект EVs на проницаемость оценивается измерения скорости диффузии декстрана в нижней камере. (Б) увеличение количество EVs инкубируют с эндотелиальных клеток. Передача родамин меченых декстран через мембрану транс ну со временем позволяет для измерения проницаемости. Проницаемость через эндотелиального слоя значительно возросла после 2 ч инкубации с 50 и 100 мкг/мл EVs. Данные представляют собой среднее (± s.e.m.) от 3 экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: титрование puromycin. Стоковый раствор puromycin (10 мг/мл) разводят в RPMI 1640 с 10% тепло инактивированных (56 ° C, 30 мин) плода телячьей сыворотки, глютамин 2 мм, пируват натрия 1 мм, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. Добавлено в общей сложности 15 мкл до 10 мл средний в трубы A. Смешивают 7,5 мл раствора из трубы A к 2,5 мл RPMI трубу б. Наконец 100 мкл разбавления добавляются к µL 100 клеток дать окончательный концентрации 7,5 мкл/мл, 5,62 мкл/мл и так далее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: поколение эндотелиальных клеток, экспрессирующих miR451a. (A) определение убийства кривой puromycin на эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки инкубировали с puromycin на повышение дозы. Жизнеспособность было измерено МТС assay после 72 ч. Данные представляют собой среднее (± s.e.m.) один представитель эксперимента. (B) РНК из эндотелиальных клеток, экспрессирующих miR451a или отрицательный контроль были собраны и Стенограмма miR451a был количественно методом ПЦР в реальном времени. результаты ПЦР нормированный методом 2-Ct, используя U6 в качестве экономки ген и выразили как означает (± s.e.m.) (n = 3 экспериментов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Некоторые паразиты, включая Токсоплазма, Трипаносомы, лейшмании и трихомонады вызвать освобождение EVs зараженных принимающей ячейки. В зависимости от патогенов выпущенные EVs можно модуляции иммунного ответа или посредником сотовой связи между паразитов6. Тем не менее существует мало свидетельств о том, как эти небольшие пузырьки способствуют заболевания малярией. Здесь мы описали несколько способов, чтобы исследовать функцию EVs во время инфекции плазмодия . Например поглощение EVs получателей клетки в естественных условиях может контролироваться эффективно, снабдив их с PKH67 Люминесцентную краску. Несколько элементов управления должны быть выполнены для того, чтобы гарантировать специфика маркировки. Важно отметить, что как только смешанные с разбавителя C, PKH67 красителя, как правило, формы агрегатов, и поэтому необходимо включить элемент управления с красителем, только без EVs для определения неспецифичный пятнать. Конфокальная микроскопия является методом выбора для того чтобы продифференцировать между везикулы привязан к поверхности и действительно относить на счет получателя клетки. Кроме того он обеспечивает отличный инструмент, чтобы отслеживать и контролировать количество пузырьков, принятые клетки. Однако остается неясным, как обрабатываются EVs в получателя клетки14; Поэтому, выполняя время курс с использованием времени пунктов 2, 4 и 8 ч, может быть очень полезным для того, чтобы определить оптимальные условия для поглощения. Добавление маркеров субцеллюлярные отсек может использоваться для отслеживания EVs внутри клетки confocal микроскопии. Было показано, что EV поглощение происходит через мембраны fusion или эндоцитоза15. Слияние может контролироваться маркировки EVs с octadecyl родамин B (R18). Сплавливание EVs с результатами клеточных мембран в разведении R18, что приводит к увеличению флуоресценции16. Поглощение EVs путем эндоцитоза могут быть изучены с помощью специфичные ингибиторы актина, микротрубочки и Динамин10.

Изучение физиологии EVs, это возможно для обозначения iRBCs непосредственно с PKH красители и совместно культуры iRBCs с эндотелиальных клеток. Проблема здесь заключается в том, что клетки требуют различных средств массовой информации и газа композиции и количество EV передачи может быть низким. Кроме того везикулярной белки, сливается с флуоресцентные метки может быть выражено в донорских клеток в пробирке и в естественных условиях. Однако пока он не протестирована с iRBCs

Cytoadherent для microvasculature головного мозга, в процессе считается ответственным вызвать церебральной малярии17инфицированных эритроцитов. Таким образом передача материала паразита через EVs может влиять на эндотелиальных клеток и следовательно сосудистой функции18. Assay в пробирке , описанных здесь, обеспечивает простой способ, чтобы исследовать некоторые из основных свойств эндотелиальных клеток, например, его проницаемости19. Дополнительные испытания например ТЕЕР или иммуноокрашивания с ZO-1 может предоставить дополнительные сведения о жесткой развязки целостности10.

Кроме того модель в vitro оказывается мощным инструментом для изучения молекулярных механизмов за сотовую связь между паразитов и клетки хозяина. Помимо поглощения эта установка позволяет изучение молекулярных механизмов вовлеченных в этот процесс. Например мы наблюдали передачу miR451a на акцептор ячейки ПЦР в реальном времени и флуоресцентные в situ гибридизация. Кроме того мы опишем, как для создания линии клеток, экспрессирующих особое Мирна, непосредственно рассмотреть роль этих малых РНК в функции сосудистого10. Однако должны выполняться несколько элементов управления, включая тестирование не преобразованы клетки, так как трансдукции, сама может повлиять на клетчатую функцию. Кроме того Мирна ингибиторов может использоваться для нейтрализации эффекта адаптивной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Это исследование финансово поддержали частично Фондом Новартис лечебно - и биологических исследований (для ПИМ), Готфрид и Джулия Бангертера-Rhyner-Stiftung (чтобы МВт и ПИМ), и исследования пул Фрибургского университета (для ПИМ). Дополнительные гранты включают швейцарского правительства Excellence стипендии для иностранных ученых (ЗСБ и SM). Мы благодарим Isabelle Fellay и Соланж Kharoubi Hess за технической поддержкой.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Diluent C Sigma-Aldrich G8278
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
PBS ThermoFisher - Gibco 10010023
Phalloidin CF594 Biotium #00045
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran ThermoFisher R9379-250MG
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Falcon 353095
Endothelial Cell Growth Medium MV Promocell C-22020
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit Biovision K300-500
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 107689-10G
MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a Sigma-Aldrich HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles Sigma-Aldrich NCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, Human Sigma-Aldrich NCLMIR0001
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit Qiagen 217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions ThermoFisher 4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns ThermoFisher 001141
U6 snRNA ThermoFisher 001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG ThermoFisher 4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System ThermoFisher 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. WHO Malaria Report 2015. (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16, (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6, (1), e1000744 (2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5, (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13, (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153, (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164, (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76, (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4, (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6, (7), e1001021 (2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25, (4), 501-515 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics