मलेरिया संक्रमण के दौरान Extracellular पुटिका समारोह का मूल्यांकन

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Immunology and Infection

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Summary

इस काम में, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए extracellular बुलबुले की भूमिका की जांच (ईवीएस) द्वारा जारी प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स । विशेष रूप से, हम endothelial कोशिकाओं के साथ ईवीएस की बातचीत पर ध्यान केंद्रित ।

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Andrea Hernández-Castañeda, M., Mbagwu, S., Babatunde, K. A., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection. J. Vis. Exp. (132), e57067, doi:10.3791/57067 (2018).

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Abstract

मलेरिया एक जीवन की धमकी प्लाज्मोडियम परजीवी की वजह से बीमारी है, पी फाल्सीपेरम के साथ सबसे अधिक प्रचलित अफ्रीकी महाद्वीप और सबसे मलेरिया से संबंधित मौतों के लिए दुनिया भर में जिंमेदार होने के साथ । ऊतकों में परजीवी ज़ब्ती सहित कई कारकों, संवहनी रोग, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं मलेरिया संक्रमित लोगों में रोग के विकास को प्रभावित. P. फाल्सीपेरम-संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं (iRBCs) छोटे extracellular बुलबुले जारी (ईवीएस) परजीवी और मेजबान के बीच रोगजनन और सेलुलर संचार मध्यस्थता कि कार्गो अणुओं के विभिन्न प्रकार से युक्त. ईवीएस कुशलता से उन कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है जिनमें वे अपने कार्य को व्यवस्थित करते हैं । यहां हम रणनीति पर चर्चा के लिए परजीवी में ईवीएस की भूमिका का पता-मेजबान बातचीत । सबसे पहले, हम लेबल और endothelial कोशिकाओं द्वारा EV internalization ट्रैकिंग के लिए एक सीधी विधि का वर्णन, एक हरे रंग की सेल linker डाई का उपयोग कर । दूसरा, हम एक फ्लोरोसेंट लेबल dextran का उपयोग करके एक endothelial सेल monolayer भर में पारगम्यता को मापने के लिए एक सरल तरीका रिपोर्ट. अंत में, हम endothelial सेल समारोह में छोटे गैर कोडिंग आरएनए अणुओं की भूमिका की जांच करने के लिए कैसे दिखा ।

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, दुनिया भर में २०१५ में मलेरिया के २१२,०००,००० नए मामले थे और लगभग ४२९,००० लोगों की मृत्यु हुई, जिनमें मुख्य रूप से पांच वर्ष से कम आयु के बच्चे1हैं । गंभीर रोग है, जो अक्सर संवहनी रोग के साथ जुड़ा हुआ है के लिए अग्रणी तंत्र, बीमार2परिभाषित रहते हैं । प्लाज्मोडियम-iRBCs स्रावित छोटे द्वि-लिपिड झिल्ली extracellular बुलबुले (ईवीएस) के रूप में जाना क्षेत्रों । यह ज्ञात है कि इन ईवीएस संभावित संक्रमण की प्रक्रिया के लिए और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया करने के लिए प्रासंगिक है संक्रमण; हालांकि, थोड़ा मलेरिया के संक्रमण के दौरान इन छोटे बुलबुले के सटीक समारोह के बारे में जाना जाता है3। यह संभव है कि वे दो महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं: एक तरफ, वे मैक्रोफेज को सक्रिय करके रोगजनन में योगदान दे सकते है4,5; और दूसरी ओर, वे परजीवी के बीच और परजीवी और मेजबान6,7के बीच सेलुलर संचार मध्यस्थता हो सकता है. वास्तव में, परजीवी ईवीएस के माध्यम से एक दूसरे के बीच प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड हस्तांतरण कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, Trypanosoma brucei rhodesiense ईवीएस डाह फैक्टर सीरम प्रतिरोध-संबद्ध (SRA) स्थानांतरित कर सकते हैं, और अन्य टी. brucei और होस्ट एरिथ्रोसाइट्स8दोनों को लक्षित कर सकते हैं । इसके अलावा, P. फाल्सीपेरम-iRBCs न्यूक्लिक एसिड को ईवीएस के भीतर स्थानांतरित करके एक दूसरे के बीच संवाद करता है । यह परजीवी अनुकूलन और इसके विकास को सिंक्रनाइज़ करने के लिए अनुमति देता है । वास्तव में, ईवीएस gametocyte रूपांतरण का प्रमुख नियामक हो सकता है, और इसलिए पारेषण चरण7के नियमन में योगदान देता है ।

न केवल ईवीएस परजीवी को विनियमित करते हैं, वे भी परजीवी मेजबान बातचीत मध्यस्थता । हमें हाल ही में पता चला है कि iRBCs से ईवीएस में मेजबान-व्युत्पंन microRNAs (miRNAs; 21-25 न्यूक्लियोटाइड की सीमा में छोटी आरएनए प्रजातियां शामिल हैं, जो मानव endothelial कोशिकाओं द्वारा ली गई थी । ईवीएस में miRNAs Ago2 के साथ एक स्थिर परिसर फार्म (आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने परिसर के एक सदस्य), जो एक बार प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को दिया, विशेष रूप से मुंह बंद करने जीन अभिव्यक्ति में सक्षम है और कोशिकाओंकीबाधा गुण 10 को प्रभावित. मानक प्रोटोकॉल ईवीएस के समारोह की जांच करने के लिए विकसित किया गया है । यहां, हम पहले एक प्रोटोकॉल है कि ईवीएस के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति देता है का वर्णन करने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा उनके ऊपर की जांच । इसके अलावा, एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, यह सेल के अंदर EV भाग्य ट्रैक करने के लिए संभव है । कई फ्लोरोसेंट रंजक ईवीएस ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अमीन-प्रतिक्रियाशील डाई, 5-(और-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl एस्टर (CFSE) और Calcein-एक बार बुलबुले के अंदर फ्लोरोसेंट बन गया है । हम amphiphilic लेबल, PKH, का उपयोग करना पसंद करते हैं, क्योंकि यह एक उज्जवल और अधिक वर्दी संकेत देता है । यह approach ईवीएस और प्राप्तकर्ता कक्षों के बीच सहभागिता को समझने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है । जबकि कुछ मामलों में कोशिकाओं की सतह के लिए ईवीएस बांध, कुछ बुलबुले तेजी से ले रहे हैं । पर, ईवीएस कोशिकाओं है, जिसमें वे अपने विनियामक कार्य लागू करने के लिए अपने माल उद्धार ।

यहाँ, हम एक सेलुलर monolayer के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट dextran के हस्तांतरण को बढ़ाता है द्वारा इन विट्रो में endothelial कोशिकाओं के बैरियर समारोह को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. अधिक संवेदनशील अनुरेखक ऐसे radiolabeled मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, वे उपयोग के लिए विशेष सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता होती है । अंय परख इस तरह के transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ), जो तंग जंक्शन अखंडता के उपाय के रूप में इन विट्रो बाधा समारोह में मापने के लिए मौजूद हैं । अंत में ZO-1, एक तंग जंक्शन प्रोटीन visualizing, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा तंग जंक्शन अखंडता के आकलन के रूप में अच्छी तरह से10की अनुमति देता है । चूंकि ईवीएस जटिल और विषम इकाईयां है जिनमें संभावित विनियामक विशेषता के साथ कई कार्गो हैं, यह प्राप्तकर्ता कोशिका पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विशिष्ट आरएनए को अभिव्यक्त करने के लिए उपयोगी है । इसलिए, हम भी एक प्रोटोकॉल है कि स्थिर सेल लाइन के लिए ब्याज की miRNA व्यक्त उत्पंन करने का लक्ष्य परिभाषित10

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Protocol

मानव RBCs स्वस्थ दाताओं के रक्त से प्राप्त किया गया, Swissethics (swissethics.ch) के दिशा निर्देशों के अनुसार ।

नोट: P. फाल्सीपेरम परजीवी संस्कृतियों (3D7) और EV उत्पादन पहले Mbagwu, एट अलमें वर्णित किया गया । 11 क्योंकि P. फाल्सीपेरम एक मानव रोगज़नक़ है, हैंडलिंग के लिए स्थानीय विनियमों से परामर्श करें । संस्कृतियों को पूरे समय बाँझ रखा जाना चाहिए.

1. ईवीएस के प्रतिदीप्ति लेबलिंग

नोट: निंनलिखित प्रक्रिया को लेबलिंग प्रौद्योगिकी का लाभ लेता है को छुरा EV झिल्ली के लिपिड क्षेत्र में बड़े aliphatic पूंछ के साथ एक हरी फ्लोरोसेंट डाई (PKH67) शामिल है । प्रतिक्रिया एक २०० µ एल अंतिम धुंधला एक 20 µ एम PKH67 के अंतिम एकाग्रता युक्त मात्रा में किया जाता है । परिवेश तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर सभी चरणों का पालन करें

  1. प्लेस १०० के एक microcentrifuge ट्यूब में पंजाब के 1 मिलीलीटर में ईवीएस के µ जी ।
  2. एक microcentrifuge ट्यूब में अधिकतम गति (२०,००० एक्स जी) में ईवीएस 7 गोली के लिए मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    नोट: चूंकि hemozoin ईवीएस में मौजूद है, एक लाल-गहरे भूरे रंग की गोली मनाया जाना चाहिए । यदि supernatant लाल है, तो ईवीएस लीजड ड है ।
  3. केंद्रापसारक के बाद, महाप्राण supernatant ध्यान से, क्रम में किसी भी ईवीएस हटाने से बचने के लिए ।
    नोट: reproducibility और धुंधलान की दक्षता बढ़ाने के क्रम में मंदक C में ईवीएस reसस्पैंड करने से पहले शेष बफर वर्तमान की मात्रा को कम करें ।
  4. मंदक सी (2x EV निलंबन) के १०० µ एल में EV गोली reसस्पेंड और धीरे प्लास्टिक पूरा फैलाव बीमा के लिए ।
  5. एक नया microcentrifuge ट्यूब तैयार करने और मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से मंदक सी भंवर के १०० µ एल के लिए PKH67 इथेनॉल डाई समाधान के 4 µ एल जोड़ें । इस 2x डाई समाधान (४० µ m) तुरंत धुंधला करने से पहले तैयार करें ।
    नोट: विषम धुंधला से बचने के लिए, PKH67 इथेनॉल डाई समाधान सीधे EV गोली करने के लिए जोड़ नहीं है ।
  6. तेजी से, 2x EV निलंबन के १०० µ एल गठबंधन (१.४) 2x डाई समाधान के १०० µ एल (कदम १.५) के साथ । फिर, 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूना मिश्रण ।
  7. 5 मिनट की मशीन के दौरान 3-4 बार भंवर द्वारा प्रकाश और मिश्रण से सुरक्षित 5 मिनट के लिए १.६ कदम से EV/
    नोट: अब समय के लिए EV/डाई निलंबन कोई लाभ प्रदान करता है, क्योंकि धुंधला इतनी तेजी से है ।
  8. अतिरिक्त डाई के बंधन की अनुमति देने के लिए 1 मिनट के लिए सीरम और मशीन के एक समान मात्रा (२०० µ एल) जोड़कर धुंधला प्रतिक्रिया बंद करो ।
    नोट: दाग को रोकने से पहले, 20 मिनट के लिए २०,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा ईवीएस से सीरम चूस ।
  9. पंजाब के साथ 3 बार धो लें और 5 मिनट के लिए २०,००० x g पर नीचे स्पिन करें । ईवीएस के १०० µ l को निरस्त कर 1 µ g/µ l के अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए ।

2. फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा ईवीएस की कल्पना ले लो

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल ग्लास coverslips पर उगाए गए endothelial कोशिकाओं द्वारा EV internalization की ट्रैकिंग का वर्णन करता है । endothelial कोशिकाओं अर्द्ध अमर मानव अस्थि मज्जा endothelial कोशिकाओं के रूप में12में वर्णित हैं ।

  1. कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए ०.०१% पाली-एल-lysine की एक अतिरिक्त के साथ एक बाँझ वातावरण, कोट coverslips में काम करना ।
  2. पाली-L-lysine हल महाप्राण और coverslips को पूरी तरह से सूखने दें ।
  3. प्रदर्शन एक व्यवहार्य endothelial सेल Trypan नीले अपवर्जन और एक hemocytometer का उपयोग कर गिनती ।
  4. स्थानांतरण 1 x 105 endothelial कोशिकाओं को पूरा endothelial सेल विकास मध्यम की 1 मिलीलीटर में पाली-L-lysine-लेपित coverslips के लिए पूरक मिश्रण युक्त और कोशिकाओं को एक monolayer के लिए विकसित करते हैं ।
    नोट: मध्यम वृद्धि कारक है कि कोशिकाओं को एक monolayer फार्म और तंग जंक्शनों फार्म के लिए अनुमति देते हैं ।
  5. एक बार कोशिकाओं को एक monolayer फार्म, ध्यान से मध्यम महाप्राण और ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए कोशिकाओं को धोने । एक बार और अधिक धोने दोहराएं । जोड़ें ५० µ के PKH67-लेबल ईवीएस और 4 एच के लिए मशीन ।
    नोट: के लिए इष्टतम समय-बिंदु खोजने के लिए, एक समय-पाठ्यक्रम किया जा सकता है ।
  6. 4 एच के बाद, मध्यम महाप्राण, और अधिक और असीम ईवीएस को दूर करने के लिए पंजाबियों के साथ 3 बार कोशिकाओं को धो लें । 15 मिनट के लिए पंजाब में 3% paraformaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
    नोट: मेथनॉल निर्धारण प्रक्रिया के दौरान actin को बाधित कर सकते हैं; इसलिए, यह fixatives या अंय विलायक आधारित fixatives युक्त किसी भी मेथनॉल से बचने के लिए सबसे अच्छा है । यह एक निर्धारण के रूप में मेथनॉल मुक्त formaldehyde का उपयोग करने की सिफारिश की है ।
  7. पंजाबियों के साथ 3 बार कोशिकाओं को धो लें । कक्षों को permeabilize करने के लिए पंजाबियों में ०.१% ट्राइटन X-१०० के जतन २५० µ l को जोड़ें । 5 मिनट के लिए आर टी पर मशीन ।
  8. पंजाबियों के साथ 3 बार धोएं । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग ब्लॉक करने के लिए RT पर 30 मिनट के लिए (पंजाब में 5% BSA) बफ़र अवरुद्ध के ४०० µ l जोड़ें ।
  9. पंजाबियों के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । कमजोर द्वारा धुंधला समाधान तैयार करें phalloidin स्टॉक सॉल्यूशन के 5 µ l को २०० µ l पंजाब में प्रत्येक कवर स्लिप के अनुसार 1% BSA/ प्लास्टिक २०० µ पर दाग समाधान के एल coverslip और आर टी पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
  10. पंजाबियों के साथ 3 बार धोएं । Hoechst ३३३४२ के साथ 30 एस के लिए डीएनए Counterstain 2 µ जी के अंतिम एकाग्रता में/एमएल पंजाब के २०० µ एल में ।
  11. µ को जोड़कर coverslip 2x को धो लें । ध्यान से संदंश के साथ coverslip हड़पने के लिए और एक गिलास स्लाइड पर antifade बढ़ते मीडिया की एक बूंद के शीर्ष पर यह उलटा । एक ऊतक के साथ धीरे अतिरिक्त मीडिया निकालें और नेल पॉलिश के साथ प्रत्येक पक्ष को सील ।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित स्लाइडों का संग्रह ।
  13. लेजर उत्तेजितताओं में एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं कल्पना ४०५, ४८८, और ५४३ एनएम और एक 63X, १.३ NA तेल उद्देश्य के साथ फ्लोरोसेंट उत्सर्जन में 450-470 एनएम (नीला), 505-530 एनएम (हरा), और ६२० एनएम ।
    नोट: विशिष्ट F-actin धुंधला परिणाम आरेख 1में दिखाए जाते हैं ।

3. Endothelial सेल पारगम्यता

नोट: Endothelial सेल पारगम्यता Endothelial सेल monolayer भर में rhodamine बी isothiocyanate-dextran (औसत मेगावाट ७०,०००) के हस्तांतरण को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया है. Dextran संवहनी पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करता है ।

  1. ०.४% Trypan नीले अपवर्जन और एक hemocytometer का उपयोग कर व्यवहार्य endothelial कोशिकाओं गिनती ।
  2. प्लेट endothelial कोशिकाओं के घनत्व पर ०.६ x 105 कोशिकाओं में संगम करने के लिए 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति आवेषण (०.४ µm ताकना आकार) और भेदभाव monolayers फार्म करने के लिए कम से कम 5 दिनों के लिए परेशान छोड़ दें. मीडियम को हर दूसरे दिन रिफ्रेश करें ।
  3. एक बार कोशिकाओं को एक monolayer तक पहुंचने के लिए, ऊपरी चैंबर पर ईवीएस (1 एमएल में ५० µ जी) लोड । 20 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता में अच्छी तरह से शीर्ष करने के लिए rhodamine-dextran जोड़ें । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
  4. ४० µ एल मध्यम aliquots से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को मापने के द्वारा अच्छी तरह से नीचे फ्लोरोसेंट dextran के हस्तांतरण की निगरानी । ५४४ एनएम उत्तेजना और ५९० एनएम उत्सर्जन में माप के लिए मल्टी-लेबल microplate रीडर सेट करें ।
    नोट: फैलाना dextran की मात्रा अंशांकन curves स्टॉक समाधान के साथ स्थापित का उपयोग कर quantified किया जा सकता है । इसके अलावा, एक समय पाठ्यक्रम (चित्रा 2) के दौरान बाहरी चैंबर माध्यम के छोटे नमूनों को हटाकर काइनेटिक प्रयोगों का प्रदर्शन किया जा सकता है. यहां तक कि बिना किसी उपचार के, dextran सेल monolayer के माध्यम से फैलाना होगा ।

4. Puromycin संवेदनशीलता का निर्धारण

नोट: lentivirus के साथ सेल लाइनों transducing से पहले, यह है कि विशेष रूप से सेल लाइन के लिए एक चयनित दवा का जलवा वक्र निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । सभी कोशिकाओं को मारने के लिए आवश्यक दवा एकाग्रता की न्यूनतम राशि का निर्धारण करने के लिए, चयनित दवा का वृद्धिशील खुराक का उपयोग कर एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग करते हैं. क्योंकि प्रत्येक स्तनधारी सेल लाइन एक अलग संवेदनशीलता है, प्रयोग करने से पहले, एंटीबायोटिक की इष्टतम एकाग्रता के रूप में नीचे विस्तृत अनुमापन मार वक्र के विकास के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए ।

  1. hemocytometer का उपयोग कर कक्षों को गिनना । पूरा endothelial सेल विकास मध्यम पूरक मिश्रण युक्त में 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर endothelial कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  2. Endothelial सेल विकास माध्यम के १०० µ एल की एक अंतिम मात्रा में एक ९६-अच्छी तरह से थाली में प्लेट 1 एक्स 104 कोशिकाओं.
  3. 0.1-10 µ g/mL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक युक्त माध्यम के १०० µ एल जोड़ें ( चित्र 3देखें) ।
  4. सेल व्यवहार्यता एक 20X उद्देश्य का उपयोग कर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हर 2 दिन की जांच करें । संस्कृति 10-14 दिनों के लिए कोशिकाओं और सेल विकास के आधार पर हर 2-3 दिन puromycin युक्त मीडिया की जगह ।
  5. जोड़ें 10 µ एल/अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से, मिश्रण में MTS, और मानक संस्कृति की स्थिति में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए मशीन ।
  6. एक शेखर पर प्लेट संक्षेप में हिला और इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं के उपाय अवशोषक ४९० एनएम (चित्रा 3) में एक प्लेट रीडर का उपयोग कर ।

5. Lentiviral वेक्टर के साथ Endothelial कोशिकाओं का Transduction

  1. प्लेट 1 x 105 endothelial कोशिकाओं को पूरा मध्यम के 1 मिलीलीटर में दिन transduction पहले । प्रदर्शन transduction जब कोशिकाओं 50-80% तक पहुंच गया है प्रवाह ।
  2. बर्फ पर lentivirus गल जाएं, और फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए वायरल स्टॉक्स का aliquots बना लें । 30 एस के लिए २०० x जी में सामग्री नीचे स्पिन, ट्यूबों में से अधिक फैल से बचने के खोलने से पहले ।
  3. 8 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं को hexadimethrine ब्रोमाइड जोड़ें ।
    नोट: Hexadimethrine ब्रोमाइड transduction क्षमता में मदद करता है, लेकिन कुछ मामलों में यह कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है । इसलिए, इष्टतम एकाग्रता transduction से पहले एक हत्या वक्र प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए ।
  4. थाली धीरे भंवर मिश्रण करने के लिए । संक्रमण (MOI) की एक उपयुक्त बहुलता पर वायरल कणों की उचित मात्रा (0.5-2 x 106 कणों) के बीच में जोड़ें और थाली धीरे भंवर के लिए मिश्रण करने के लिए 30 एस ।
  5. transduction क्षमता बढ़ाने के लिए ३०० x g पर ४५ मिनट के लिए आरटी में सेल वायरल कण मिश्रण केंद्रापसारक । रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल वायरल कण मिश्रण गर्मी ।
  6. सावधानीपूर्वक वायरल कण-युक्त माध्यम को निकालें और उचित रूप से त्यागें । यह ताजा, पूर्व गर्म पूर्ण संस्कृति माध्यम के साथ बदलें ।
  7. दूसरे दिन पर puromycin के साथ चयन प्रारंभ करें: माध्यम निकालें और इसे ताजा माध्यम के साथ बदलें puromycin की सही एकाग्रता युक्त के रूप में पहले से निर्धारित की धारा 4 (चित्रा 3).
  8. puromycin चयन के बाद फसल की कोशिकाओं और निर्माता के निर्देशों का पालन एक आरएनए अलग किट का उपयोग आरएनए को अलग.
  9. एक रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग कर चयनित miRNAs के साथ सीडीएनए संश्लेषण प्रदर्शन ( सामग्री की तालिकादेखें).
  10. उद्धृत प्रोटोकॉल13के अनुसार qPCR प्रतिक्रिया सेट करें ।

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Representative Results

यहां, हम मेजबान कोशिकाओं के साथ ईवीएस की बातचीत की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । फ्लोरोसेंट लेबल ईवीएस के ऊपर फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) द्वारा नजर रखी है । Endothelial कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक ईवीएस ऊपर ले, लेकिन ईवीएस के साथ मशीन समय को पटरी पर लाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । कोशिकाओं के अंदर ईवीएस के एक बेहतर स्थानीयकरण के लिए, phalloidin के साथ दाग actin । इसके बाद, हम शीर्ष पर एक फिल्टर झिल्ली का उपयोग करें जिसमें से endothelial कोशिकाओं का monolayer बढ़ता है । Rhodamine बी isothiocyanate-dextran फिल्टर झिल्ली के शीर्ष कक्ष पर लागू किया जाता है और फिर endothelial monolayer की पारगम्यता नीचे चैंबर (चित्रा 2a) में फ्लोरोसेंट dextran के हस्तांतरण की निगरानी द्वारा मापा जाता है. आमतौर पर, endothelial कोशिकाओं की पारगम्यता ईवीएस की एक बढ़ती हुई राशि (चित्रा बी) के साथ गर्मी पर प्रभावित है । यह कई दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे एक monolayer फार्म का होगा, अंयथा डाई जल्दी कुओं के माध्यम से फैलाना होगा बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । यह ध्यान रखें कि इलाज के बिना भी, dextran धीरे सेल monolayer के माध्यम से फैलाना होगा महत्वपूर्ण है ।

MicroRNAs ईवीएस के प्रमुख घटक है और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को हस्तांतरण के बाद, वे जीन अभिव्यक्ति को विनियमित । आदेश में विशेष रूप से miRNAs की भूमिका की जांच करने के लिए, यह बहुत उंहें प्राप्तकर्ता सेल लाइन में व्यक्त उपयोगी है । यहाँ हम endothelial कोशिकाओं में miRNAs transduce करने के लिए कैसे का वर्णन. पहला कदम puromycin की एकाग्रता है कि endothelial कोशिकाओं को मारता क्रम में छुरा transduced कोशिकाओं (चित्र 4a) का चयन करने के लिए निर्धारित करने के होते हैं । अंत में, miRNAs की अभिव्यक्ति का स्तर qPCR (चित्रा 4B) द्वारा नियंत्रित और मान्य किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: ईवीएस को endothelial कक्षों द्वारा लिया जाता है. शुद्ध ईवीएस PKH67 के साथ हरे रंग में लेबल थे, और endothelial कोशिकाओं के एक monolayer के साथ 4 एच के लिए मशीन । अनुपचारित endothelial कोशिकाओं एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । असीम ईवीएस को दूर करने के लिए व्यापक धुलाई के बाद, कोशिकाओं को phalloidin के दाग actin (लाल) और Hoechst ३३३४२ के साथ दाग को नाभिक (नीला) दाग थे । कोशिकाओं को फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया । छवियां एक लेजर फोकल माइक्रोस्कोप और एक 63x १.३ न तेल उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया । Hoechst ३३३४२ ४०५ एनएम पर उत्साहित है और उत्सर्जन के साथ 450-470 एनएम (नीला) पर एकत्र; PKH67 ४८८ एनएम पर उत्साहित है, उत्सर्जन 505-530 एनएम (हरा) पर एकत्र; और Phalloidin-५९४ ५४३ एनएम पर उत्तेजित है, उत्सर्जन ६२० एनएम पर एकत्र की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: endothelial बैरियर पर EV का प्रभाव । () rhodamine के प्रसार की योजनाबद्ध-लेबल dextran: endothelial कोशिकाओं को एक फिल्टर झिल्ली के शीर्ष पर संगम को उगाया जाता है, फ्लोरोसेंट dextran झिल्ली के माध्यम से समय के साथ शीर्ष कक्ष और फैलाना करने के लिए लागू किया जाता है । पारगम्यता पर ईवीएस का प्रभाव नीचे चैंबर के लिए dextran के प्रसार की दर को मापने के द्वारा शीर्ष चैंबर के लिए ईवीएस के अलावा के बाद मूल्यांकन किया जाता है. () ईवीएस की एक बढ़ती हुई मात्रा endothelial कोशिकाओं के साथ मशीन है । rhodamine के हस्तांतरण-समय पर एक ट्रांस-well झिल्ली भर में dextran लेबल पारगम्यता माप के लिए अनुमति देता है । endothelial परत के पार पारगम्यता काफी ५० और १०० µ जी के साथ मशीन के 2 ज के बाद वृद्धि हुई है/ईवीएस के एमएल । डेटा 3 प्रयोगों से मतलब (± s.e.m.) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: puromycin का अनुमापन । puromycin के शेयर समाधान (10 मिलीग्राम/एमएल) RPMI १६४० में पतला है 10% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय (५६ ° c, 30 min) भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 मिमी glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, १०० U/एमएल पेनिसिलिन/streptomycin । एक कुल 15 µ एल ट्यूब ए में मध्यम से 10 मिलीलीटर के लिए जोड़ा गया है । फिर ट्यूब ए से समाधान की ७.५ मिलीलीटर ट्यूब बी को RPMI के २.५ मिलीलीटर के लिए मिलाया जाता है । अंत में, १०० µ एल कमजोर पड़ने की कोशिकाओं के १०० µ एल करने के लिए जोड़ रहे हैं ७.५ µ के एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए एल/एमएल, ५.६२ µ एल/एमएल और इतने पर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: miR451a को व्यक्त करने वाले endothelial कक्षों की जनरेशन. () endothelial कोशिकाओं पर puromycin की हत्या की अवस्था का निर्धारण. Endothelial कोशिकाओं को बढ़ती खुराक पर puromycin के साथ मशीन थे । व्यवहार्यता MTS परख द्वारा मापा गया था ७२ के बाद एच । डेटा एक प्रतिनिधि प्रयोग के माध्य (± s.e.m.) का प्रतिनिधित्व करते हैं । () miR451a या एक नकारात्मक नियंत्रण व्यक्त endothelial कोशिकाओं से व्युत्पंन RNAs काटा गया और miR451a प्रतिलिपि वास्तविक समय पीसीआर द्वारा quantified गया था । qPCR परिणाम 2-सीटी एक नौकरानी जीन के रूप में U6 का उपयोग कर विधि द्वारा सामान्यीकृत है और अर्थ के रूप में व्यक्त (± s.e.m.) (n = 3 प्रयोग) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania सहित कई परजीवी, और ट्रायकॉमोनास संक्रमित मेजबान सेल द्वारा ईवीएस की रिहाई ट्रिगर । रोगजनकों पर निर्भर करता है, जारी ईवीएस मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मिलाना या परजीवी6के बीच सेलुलर संचार मध्यस्थता कर सकते हैं । फिर भी, वहां थोड़ा सुझाव है कि कैसे इन छोटे बुलबुले मलेरिया रोग के लिए योगदान सबूत है । यहां, हमने प्लाज्मोडियम संक्रमण के दौरान ईवीएस के फंक्शन की जांच करने के कई तरीके बताए हैं । उदाहरण के लिए, vivo में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा ईवीएस की कार्रवाई कुशलतापूर्वक PKH67 फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल द्वारा निगरानी की जा सकती है । लेबलिंग की विशिष्टता की गारंटी देने के लिए कई नियंत्रणों का प्रदर्शन किया जाना है । यह ध्यान दें कि एक बार मंदक सी के साथ मिश्रित महत्वपूर्ण है, PKH67 डाई समुच्चय के रूप में जाता है, और यह इसलिए ईवीएस बिना अकेले डाई के साथ एक नियंत्रण शामिल करने के लिए गैर विशिष्ट धुंधला निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । फोकल माइक्रोस्कोपी पसंद की विधि सतह से बंधे बुलबुले के बीच अंतर करने के लिए और सही मायने में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक है । इसके अलावा, यह ट्रैक और कोशिकाओं द्वारा उठाए गए बुलबुले की संख्या पर नजर रखने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करता है । हालांकि, यह कैसे ईवीएस प्राप्तकर्ता कक्ष14में संसाधित है अस्पष्ट रहता है; इसलिए, समय का उपयोग कर एक समय-पाठ्यक्रम प्रदर्शन 2, 4, और 8 एच के अंक, बहुत उपयोगी हो सकता है क्रम में के लिए इष्टतम स्थिति निर्धारित करने के लिए । उपसेलुलर डिब्बे मार्करों के अलावा फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं के अंदर ईवीएस को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । EV endocytosis को झिल्ली फ्यूजन या15के माध्यम से घटित होने के लिए दिखाया गया है । फ्यूजन को octadecyl rhodamine बी (R18) के साथ लेबलिंग ईवीएस से मॉनिटर किया जा सकता है । सेलुलर झिल्ली के साथ ईवीएस का फ्यूजन R18 के कमजोर पड़ने में परिणाम है, जो प्रतिदीप्ति में वृद्धि की ओर जाता है16. endocytosis द्वारा ईवीएस के ऊपर actin, microtubule, और dynamin10के विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है ।

ईवीएस के फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए, यह PKH रंजक और सह संस्कृति endothelial कोशिकाओं के साथ iRBCs के साथ सीधे iRBCs लेबल संभव है । यहां समस्या यह है कि कोशिकाओं को अलग मीडिया और गैस की रचनाओं की आवश्यकता है और EV हस्तांतरण की राशि कम हो सकती है । इसके अलावा, vesicular प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट टैग के साथ जुड़े इन विट्रो में दाता कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है और vivo में। हालांकि, अब तक यह iRBCs के साथ परीक्षण नहीं किया गया है

संक्रमित RBCs मस्तिष्क के microvasculature को cytoadherent हैं, एक प्रक्रिया में माना जाता है कि सेरेब्रल मलेरिया के कारण१७को जिम्मेदार माना जा रहा है. इसलिए, ईवीएस के माध्यम से परजीवी सामग्री के हस्तांतरण endothelial कोशिकाओं को प्रभावित करने की संभावना है और इसलिए संवहनी समारोह18. इन विट्रो परख यहां वर्णित है, एक आसान तरीका है endothelial कोशिकाओं के बुनियादी गुणों में से कुछ की जांच प्रदान करता है, उदाहरण के लिए अपनी पारगम्यता19के रूप में । ZO-1 के साथ तीळ या immunostaining जैसे अतिरिक्त परीक्षण से तंग जंक्शन अखंडता के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं10.

इसके अलावा, इन विट्रो मॉडल में एक शक्तिशाली उपकरण के लिए परजीवी और मेजबान कोशिकाओं के बीच सेलुलर संचार के पीछे आणविक तंत्र का अध्ययन हो जाता है । इसके अलावा, इस सेटअप इस प्रक्रिया में शामिल आणविक तंत्र की जांच की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, हम वास्तविक समय पीसीआर और सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट द्वारा स्वीकारकर्ता कोशिकाओं को miR451a के हस्तांतरण पर नजर रखी है । इसके अतिरिक्त, हम कैसे एक विशेष miRNA एक्सप्रेस सेल लाइनों उत्पंन करने के लिए, सीधे संवहनी समारोह10में इन छोटे आरएनए की भूमिका का पता वर्णन । हालांकि, transduction स्वयं सेलुलर फ़ंक्शन को प्रभावित हो सकता है के बाद से, गैर-transduced कक्षों का परीक्षण सहित कई नियंत्रण किया जाना चाहिए । इसके अलावा, miRNA अवरोधकों miRNAs के प्रभाव को बेअसर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के भाग में वित्तीय नोवार्टिस फाउंडेशन द्वारा चिकित्सा के लिए समर्थन किया गया था और जैविक अनुसंधान (PYM के लिए), Gottfried और जूलिया Bangerter-Rhyner-Stiftung (मेगावाट और PYM के लिए), और Fribourg विश्वविद्यालय के अनुसंधान पूल (करने के लिए PYM). अतिरिक्त अनुदान स्विस सरकार विदेशी विद्वानों के लिए उत्कृष्टता छात्रवृत्ति (KAB और एसएम के लिए) शामिल हैं । हम तकनीकी सहायता के लिए इसाबेल साहब और Solange Kharoubi हेस धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Diluent C Sigma-Aldrich G8278
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
PBS ThermoFisher - Gibco 10010023
Phalloidin CF594 Biotium #00045
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran ThermoFisher R9379-250MG
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Falcon 353095
Endothelial Cell Growth Medium MV Promocell C-22020
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit Biovision K300-500
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 107689-10G
MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a Sigma-Aldrich HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles Sigma-Aldrich NCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, Human Sigma-Aldrich NCLMIR0001
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit Qiagen 217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions ThermoFisher 4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns ThermoFisher 001141
U6 snRNA ThermoFisher 001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG ThermoFisher 4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System ThermoFisher 4376600

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References

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