疟疾感染中胞外囊泡功能的评价

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Immunology and Infection

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Summary

在这项工作中, 我们描述了研究由恶性疟原虫感染的红细胞释放出的细胞外囊 (EVs) 作用的协议。特别是, 我们关注的是电动车与内皮细胞的相互作用。

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Andrea Hernández-Castañeda, M., Mbagwu, S., Babatunde, K. A., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection. J. Vis. Exp. (132), e57067, doi:10.3791/57067 (2018).

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Abstract

疟疾是由疟原虫寄生虫引起的危及生命的疾病, 而P. 恶性疟原虫是非洲大陆上最普遍的, 对全球大多数与疟疾有关的死亡负责。包括寄生虫在组织中的封存、血管功能障碍和炎症反应等几个因素影响了疟疾感染者的病情演变。恶性疟原虫-感染的红细胞 (iRBCs) 释放出小的胞外囊泡 (EVs), 其中含有不同种类的货物分子, 它介导寄生虫与宿主之间的致病机制和细胞间通讯。电动汽车是由它们调节其功能的细胞有效地占用的。在这里, 我们讨论的策略, 以解决电动车在寄生虫宿主互动的作用。首先, 我们描述了一种直接的方法来标记和跟踪的 EV 内化的内皮细胞, 使用绿色细胞链接染料。第二, 我们报告了一个简单的方法来测量渗透率跨内皮细胞单层, 使用荧光标记葡聚糖。最后, 我们展示了如何研究小的非编码 RNA 分子在内皮细胞功能中的作用。

Introduction

根据世界卫生组织的报告, 2015年全世界有2亿1200万起新的疟疾病例, 大约42.9万人死亡, 主要是五岁以下的儿童1。导致严重疾病的机制, 通常与血管功能障碍有关, 仍未定义为2疟原虫-iRBCs 分泌小的双脂膜球体, 称为胞外囊泡 (EVs)。众所周知, 这些电动车与感染过程和宿主对感染的免疫反应有潜在的相关性;然而, 对这些小泡在疟疾感染期间的确切功能知之甚少3。他们有可能扮演两个重要的角色: 一方面, 他们可能通过激活巨噬细胞4,5来促进发病机制;另一方面, 他们可能会调解寄生虫之间的细胞通讯和寄生虫和主机6,7。事实上, 寄生虫可以通过电动车相互转移蛋白质或核酸。例如,锥寄生虫罗得西亚 EVs 可以转移毒力因子血清抗性相关 (), 并可针对其他 T . 寄生虫和宿主红细胞 8.此外,恶性疟原虫-iRBCs 通过在电动车内转移核酸来相互通信。这使得寄生虫能够优化和同步其生长。实际上, EVs 可能是 gametocyte 转换的主要调节器, 因此有助于对传输阶段7的调节。

电动车不仅能调节寄生虫, 而且还能调解寄生宿主之间的相互作用。我们最近发现, 电动车从 iRBCs 包含主机衍生的 microRNAs (miRNAs; 小 RNA 物种的范围内21-25 核苷酸9), 由人类内皮细胞占去。在电动车中的 miRNAs 形成一个稳定的复杂与 Ago2 (RNA 诱导沉默复合体的成员), 一旦交付给接受细胞, 能够明确地沉默基因表达和影响细胞的屏障属性10。为研究电动汽车的功能, 开发了标准协议。在这里, 我们首先描述一个协议, 允许电动车的荧光标记, 以调查他们的接收细胞的吸收。此外, 通过使用共焦显微镜, 可以跟踪 EV 的命运在细胞内。几种荧光染料可用于跟踪电动车。胺反应染料, 5 (和-6)-羧基双乙酸琥珀酸酯 (CFSE) 和 Calcein-在囊泡内成为荧光。我们更喜欢使用两亲的标签, PKH, 因为它给一个更明亮和更均匀的信号。此方法为了解 EVs 和接收单元之间的交互提供了重要信息。在某些情况下, 电动车绑定到细胞的表面, 一些囊泡迅速占去。在吸收后, 电动车将他们的货物运送到细胞中, 并在其中发挥调节作用。

在这里, 我们描述了一个协议, 以测量内皮细胞的屏障功能在体外通过量化的转移荧光葡聚糖通过细胞单层。更灵敏的示踪剂可以使用, 如核素标记。但是, 它们需要特殊的安全预防措施才能使用。还有其他的化验方法来测量体外屏障功能, 如 transendothelial 电阻 (志愿者), 它测量紧密接合的完整性。最后可视化 ZO-1, 一个紧密的连接蛋白, 通过免疫荧光允许评估紧密连接完整性以及10。由于 EVs 是复杂和异构实体, 包含若干具有潜在监管特性的货物, 因此过度表达 tshr 一个特定的 RNA 来研究它对接收单元的影响是有用的。因此, 我们还定义了一个协议, 其目的是生成稳定的单元格线, 表达感兴趣的 miRNA10

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Protocol

根据 Swissethics (swissethics.ch) 的指导原则, 从健康捐赠者的血液中获得人体红细胞。

注意:恶性疟原虫寄生虫培养 (3D7) 和 EV 生产以前是在 Mbagwu ( et al) 中描述的。11由于P. 恶性疟原虫是人类病原体, 请查阅当地的规章以进行处理。文化应该保持不育的整个时间。

1. 电动汽车的荧光标记

注: 以下程序利用标签技术稳定地将绿色荧光染料 (PKH67) 与大脂肪族尾部结合在 EV 膜的脂质区内。反应是在200µL 最终染色量, 其中包含20µM 最终浓度的 PKH67。在室温下执行所有步骤 (20-25 °c)

  1. 在离心管中, 将100µg 的电动车放在1毫升的 PBS 中。
  2. 将电动汽车在离心管中以最大速度 (2万 x g) 离心, 以7分钟为颗粒。
    注意: 由于 hemozoin 存在于电动车中, 因此应观察到一种红色深褐色颗粒。如果上清是红色的, 那么电动车就有裂解。
  3. 离心后, 小心地吸上清液, 以避免去除任何电动车。
    注: 在稀释剂 C 中 resuspending 电动车之前, 尽量减少剩余的缓冲量, 以提高染色的重现性和效率。
  4. 并用重悬100µL 稀释剂 C (2X ev 悬浮) 中的 EV 颗粒, 并轻轻吸管确保完全分散。
  5. 准备一个新的离心管, 并添加4µL 的 PKH67 乙醇染料溶液的100µL 稀释剂 c. 漩涡井混合。在染色前立即准备此2x 染料溶液 (40 µM)。
    注意: 为了避免异质染色, 请勿将 PKH67 乙醇染料溶液直接添加到 EV 颗粒上。
  6. 快速, 结合100µL 2X EV 悬浮 (步骤 1.4) 与100µL 2X 染料溶液 (步骤 1.5)。然后, 通过吹打的10倍来混合样品。
  7. 孵化的 EV/染料悬浮从步骤1.6 为5分钟保护, 从光和混合在5分钟孵化期间涡流3-4 倍。
    注: 孵化的 EV/染料悬浮较长时间提供没有好处, 因为染色是如此之快。
  8. 通过添加等量 (200 µL) 的血清和孵育1分钟来阻止染色反应, 从而使过量染料具有约束力。
    注: 在停止染色前, 用 2万 x g 离心法从电动车上消耗20分钟的血清。
  9. 用 pbs 清洗3次, 在 2万 x g 处旋转5分钟并用重悬电动车在µL 的100个, 达到最终浓度1µg/µL。

2. 用共焦显微镜可视化电动汽车的吸收

注意: 下面的协议描述了在玻璃盖玻片上生长的内皮细胞对 EV 内化的跟踪。内皮细胞是半永生化的人骨髓内皮细胞, 如12所述。

  1. 在无菌环境中工作, 在室温下 (RT), 涂盖玻片0.01% 多聚 l-赖氨酸, 10 分钟以上。
  2. 吸入聚 l-赖氨酸溶液, 使盖玻片完全干燥。
  3. 使用台盼蓝排除和 hemocytometer 进行可行的内皮细胞计数。
  4. 将 1 x 105内皮细胞移植到1毫升完整的内皮细胞生长培养基中, 其中含有补充剂与聚 l-赖氨酸涂层盖玻片, 并让细胞生长成单层。
    注意: 培养基中含有生长因子, 允许细胞形成单层, 形成紧密的连接。
  5. 一旦细胞形成单层, 仔细吸入培养基, 并添加1毫升的新鲜培养基来洗涤细胞。再重复一次洗涤。添加50µg PKH67-labeled 电动车和孵育4小时。
    注意: 为了找到最佳的摄取时间点, 可以执行一个时间过程。
  6. 4小时后, 吸入培养基, 用 PBS 冲洗细胞3次以去除多余和未绑定的电动车。将3% 多聚甲醛溶液的细胞固定在 PBS 中15分钟。
    注: 甲醇可在固定过程中扰乱肌动蛋白;因此, 最好避免含有护或其他溶剂型护的甲醇。建议使用无甲醇甲醛作为固定剂。
  7. 用 PBS 冲洗细胞3次。仔细添加250µL 0.1% 海卫 X-100 在 PBS permeabilize 细胞。在 RT 孵育5分钟。
  8. 用 PBS 洗3次。在 RT 中添加400个阻塞缓冲区 (PBS 中的 5% BSA) µL, 以阻止非特定绑定。
  9. 用 PBS 洗一次细胞。在200µL PBS/1%bsa 每套µL 中稀释5的罗丹明溶液, 以制备染色溶液。吸管200µL 的染色溶液在盖玻片和孵化20分钟的 RT。
  10. 用 PBS 洗3次。Counterstain DNA 为三十年代与赫斯特33342在最后集中2µg 或 mL 在200µL PBS。
  11. 通过添加400µL 的 PBS 来洗涤2x 的盖玻片。小心地抓住盖玻片与镊子, 并倒置它在一滴 antifade 安装介质上的玻璃幻灯片。用纸巾轻轻地取出多余的介质, 并用指甲油封住两侧。
  12. 将受保护的幻灯片存储在4摄氏度的光线下。
  13. 用共焦显微镜在激光激发405、488和 543 nm 和63X、1.3 NA 油目标上可视化细胞, 其荧光量为 450-470 nm (蓝色)、505-530 nm (绿色) 和 620 nm。
    注意: 典型的 F 肌动蛋白染色结果显示在图 1中。

3. 内皮细胞通透性

注: 通过测量内皮细胞单层中罗丹明 B 异硫氰酸酯-葡聚糖 (平均兆瓦 7万) 的转移, 评估内皮细胞通透性。葡聚糖为研究血管通透性提供了极好的工具。

  1. 使用0.4% 台盼蓝排斥和 hemocytometer 计数可行的内皮细胞。
  2. 将内皮细胞密度为 0.6 x 105细胞以汇合24井组织培养插入物 (0.4 µm 孔径), 不受干扰地留在至少5天内形成分化的单分子膜。每隔一天刷新一次介质。
  3. 一旦细胞达到单层, 载入电动车 (50 µg 在1毫升) 在上部室。将罗丹明-葡聚糖添加到顶部井中, 最终浓度为20毫克/毫升。孵化细胞在37°c 与 5% CO2
  4. 通过测量40µL 中整除数的荧光辐射, 监测荧光葡聚糖在井底的转移。设置多标签微板块读取器544毫微米励磁和 590 nm 发射测量。
    注: 通过与库存溶液建立的校准曲线, 可以量化扩散葡聚糖的数量。此外, 通过在时间课程中去除外腔介质的小样本 (图 2), 可以进行动力学实验。即使没有任何治疗, 葡聚糖也会通过细胞单层扩散。

4. 确定嘌呤霉素灵敏度

注意: 在传感细胞系与慢病毒北疆之前, 确定某一特定细胞系的药物的杀死曲线是很重要的。为了确定杀死所有细胞所需的药物浓度的最小量, 用所选药物的增量剂量进行剂量反应实验。由于每个哺乳动物细胞系都有不同的灵敏度, 在试验之前, 应根据以下详细情况确定抗生素的最佳浓度。

  1. 使用 hemocytometer 计数单元格。并用重悬内皮细胞浓度为 1 x10 5 细胞/毫升, 在完全内皮细胞生长培养基中含有补充剂组合物。
  2. 板 1 x 104细胞成96井板在最后容量100µL 内皮细胞生长培养基。
  3. 添加100µL 含有抗生素的培养基, 以获得 0.1-10 µg/毫升的浓度 (请参见图 3)。
  4. 使用20X 目标, 每2天在光显微镜下检查细胞的生存能力。培养细胞10-14 天, 并根据细胞生长, 每2-3 天更换含有嘌呤霉素的培养基。
  5. 在标准培养条件下, 将10µL/井 MTS 试剂添加到每个井中, 混合, 并孵育4小时37摄氏度。
  6. 用 490 nm (图 3) 在一个振动筛上简单地摇动盘子, 用平板阅读器测量处理过的和未经治疗的细胞的吸光度。

5. 慢病毒载体载体对内皮细胞的转导

  1. 板 1 x 105内皮细胞在1毫升完全培养基前的前一天转导。当细胞达到50-80% 融合时进行转导。
  2. 在冰上解冻慢病毒北疆, 使整除数的病毒储存避免冻融循环。三十年代在 200 x g 的材料上旋转, 在管子打开之前, 避免溢出。
  3. 在最终浓度为8µg/毫升的细胞中加入铵溴化物。
    注: 铵溴有助于转导效率, 但在某些情况下, 它可能是有毒的细胞。因此, 在转导前执行一条杀死曲线来确定最佳浓度。
  4. 轻轻地将盘子搅拌。增加适当数量的病毒微粒 (在 0.5-2 x 106微粒之间) 在适当的传染多样性 (语言) 和旋转板材轻轻地三十年代混合。
  5. 离心机中的细胞-病毒粒子混合在45分钟的 300 x g, 以提高转导效率。在一夜之间孵化出37摄氏度的细胞病毒颗粒混合物。
  6. 小心去除含有病毒的微粒介质, 并适当丢弃。用新鲜的, 预热的完整培养基替换。
  7. 在第二天使用嘌呤霉素启动选定内容: 移除介质并用新鲜介质替换它, 其中包含嘌呤霉素的正确浓度(图 3)。
  8. 收获细胞后嘌呤霉素选择和分离 rna 使用 rna 隔离套件后, 制造商的指示。
  9. 使用反向转录套件对所选 miRNAs 进行 cDNA 合成 (请参阅材料表)。
  10. 根据引用的协议13设置 qPCR 反应。

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Representative Results

在这里, 我们描述了研究电动汽车与宿主细胞相互作用的协议。荧光标记的 EVs 的摄取是通过共焦显微镜 (图 1) 来监测的。内皮细胞有效地占去了电动车, 但是利用 evs 的潜伏期可以优化以跟踪吸收。为了更好地定位电动汽车内部的细胞, 染色肌动蛋白与罗丹明。接下来, 我们使用一个过滤膜的顶端, 其中一层内皮细胞生长。罗丹明 B 异硫氰酸酯-葡聚糖应用于滤膜的顶部, 然后通过监测荧光葡聚糖在底部腔内的转移来测量内皮层的渗透性 (图 2A)。通常情况下, 血管内皮细胞的通透性会受到增加的 EVs 的影响 (图 2B)。重要的是要培养细胞几天, 以确保他们将形成一个单层, 否则染料将迅速扩散通过水井。重要的是要注意, 即使没有治疗, 葡聚糖将慢慢地扩散到细胞单层。

MicroRNAs 是电动汽车的关键部件, 在移植到受体细胞后, 它们调节基因表达。为了具体研究 miRNAs 的作用, 在接收单元线过度表达 tshr 它们是非常有用的。在这里, 我们描述如何传感器 miRNAs 到内皮细胞。第一步包括确定杀死内皮细胞的嘌呤霉素浓度, 以选择稳定的转基因细胞(图 4A)。最后, 可以通过 qPCR (图 4B) 控制和验证 miRNAs 的表达式级别。

Figure 1
图 1: EVs 由内皮细胞占用.纯化的电动车被标记为绿色与 PKH67, 并孵化4小时的内皮细胞单层。未经治疗的内皮细胞被用作阴性对照。经过广泛的洗涤, 以去除未绑定的电动车, 细胞被染色罗丹明染色肌动蛋白 (红色) 和赫斯特33342染色的细胞核 (蓝色)。用共焦显微镜观察细胞。使用激光共聚焦显微镜和 63x 1.3 NA 油目标拍摄图像。赫斯特33342是激动的在405毫微米和与放射收集在450-470 毫微米 (蓝色);PKH67 在488纳米的兴奋, 排放量收集在 505-530 nm (绿色);和 Phalloidin-594 是兴奋的 543 nm, 排放量收集在 620 nm。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: EV 吸收对内皮屏障的影响.(A) 对罗丹明标记的葡聚糖的扩散示意图: 内皮细胞生长在滤膜顶部, 荧光葡聚糖被应用于顶室, 通过膜逐渐扩散。通过测量右旋糖酐在底部腔内的扩散速率, 可以评估电动汽车对渗透率的影响。(B) 越来越多的 EVs 与内皮细胞一起孵化。随着时间的推移, 将罗丹明标记的葡聚糖转移到过孔膜上, 可以进行渗透性测量。在2小时的孵化后, 在50和100µg/毫升的电动汽车中, 内皮层通透性显著增加。数据代表了3实验中的平均值 (s.e.m.)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 嘌呤霉素的滴定。嘌呤霉素 (10 毫克/毫升) 的库存溶液稀释在 RPMI 1640 补充10% 热灭活 (56 °c, 30 分钟) 胎小牛血清, 2 毫米谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸钠, 100 U/毫升青霉素/链霉素。在管 a 中共添加15µL 10 毫升培养基。然后7.5 毫升的溶液从管 A 混合到2.5 毫升的 RPMI 到管 B。最后, 100 µL 的稀释被添加到100µL 的细胞, 使最终浓度7.5 µL/毫升, 5.62 µL/毫升等。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 内皮细胞 overexpressing miR451a 的生成.(A) 测定嘌呤霉素在内皮细胞上的杀伤曲线。内皮细胞以嘌呤霉素的增加剂量进行孵化。用 MTS 测定法测定72小时后的生存能力。这些数据代表了一个代表性实验的平均值 (s.e.m.)。(B) 从内皮细胞 overexpressing miR451a 或阴性对照获得的 rna, 通过实时 PCR 对 miR451a 转录进行量化。qPCR 结果是规范化的 2 Ct 方法使用 U6 作为管家基因和表示为平均值 (s.e.m.)(n = 3 实验)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

一些寄生虫, 包括弓形虫、锥、利什曼原虫和滴虫, 触发受感染的宿主细胞释放电动车。根据病原体, 释放的电动车可以调节宿主免疫应答或调解寄生虫之间的细胞通讯6。然而, 几乎没有证据表明这些小囊泡是如何导致疟疾疾病的。在这里, 我们描述了几种方法来调查在疟原虫感染期间 EVs 的功能。例如, 通过用 PKH67 荧光染料对其进行标记, 可以有效地监测接收单元体内对 EVs 的吸收。为了保证标签的特异性, 必须执行几个控件。值得注意的是, 一旦与稀释剂 C 混合, PKH67 染料倾向于形成聚合体, 因此有必要在没有电动车的情况下包括单独的染料控制, 以确定非特异染色。共焦显微术是一种选择的方法, 以区分囊泡与表面, 真正内化的受体细胞。此外, 它提供了一个很好的工具来跟踪和监测细胞所占的囊泡数量。但是, 仍不清楚如何在收件人单元格14中处理 EVs。因此, 使用2、4和 8 h 的时间点执行时间路线可能非常有用, 以便确定最佳吸收条件。添加亚细胞室标记可以用来跟踪的电动车内部的电池通过共焦显微镜。通过膜融合或吞15来显示 EV 的吸收。这种融合可以通过标记 EVs (R18) 来监测。电动车与细胞膜的融合导致 R18 的稀释, 导致荧光16的增加。利用肌动蛋白、微管和动力蛋白10的特定抑制剂, 可以研究吞对电动汽车的吸收.

为了研究电动汽车的生理特性, 可以直接用 PKH 染料标记 iRBCs, 并与内皮细胞共培养 iRBCs。这里的问题是, 细胞需要不同的介质和气体成分, 而 EV 传输量可能很低。此外, 与荧光标记融合的水泡蛋白可以在捐献细胞体外体内中表达。然而, 到目前为止, 它尚未测试与 iRBCs

感染的红细胞是 cytoadherent 的大脑微血管, 在一个过程中认为负责导致脑疟疾17。因此, 通过电动汽车传输寄生虫材料可能会影响内皮细胞, 因此血管功能为18。这里描述的体外检测提供了一种简单的方法来调查内皮细胞的一些基本特性, 例如它的渗透性19。附加测试 (如志愿者或染色与 ZO-1) 可以提供有关紧密连接完整性10的更多信息。

此外,体外模型原来是研究寄生虫和宿主细胞之间细胞间通信的分子机制的有力工具。除了吸收, 这个设置允许调查的分子机制参与这个过程。例如, 我们通过实时 PCR 和荧光原位杂交监测了 miR451a 对受体细胞的转移。此外, 我们描述如何生成 overexpressing 特定 miRNA 的细胞线, 以直接解决这些小 RNA 在血管功能10中的作用。然而, 应该执行一些控制, 包括测试非转基因细胞, 因为传导本身可能影响细胞功能。此外, miRNA 抑制剂可用于中和 miRNAs 的作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究由诺华医学和生物研究基金会 (PYM)、戈特弗里德和朱莉娅 Bangerter Rhyner 基金会 (兆瓦和 PYM) 和大学 (PYM) 的研究池等部分财政支助。额外赠款包括瑞士政府优秀奖学金为外国学者 (对 KAB 和 SM)。我们感谢伊莎贝尔 Fellay 和 Solange Kharoubi 赫斯的技术支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Diluent C Sigma-Aldrich G8278
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
PBS ThermoFisher - Gibco 10010023
Phalloidin CF594 Biotium #00045
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran ThermoFisher R9379-250MG
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Falcon 353095
Endothelial Cell Growth Medium MV Promocell C-22020
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit Biovision K300-500
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 107689-10G
MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a Sigma-Aldrich HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles Sigma-Aldrich NCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, Human Sigma-Aldrich NCLMIR0001
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit Qiagen 217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions ThermoFisher 4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns ThermoFisher 001141
U6 snRNA ThermoFisher 001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG ThermoFisher 4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System ThermoFisher 4376600

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References

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