파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

Immunology and Infection

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Summary

우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

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Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

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Abstract

파라핀 포함 통해 단면 진 핵 시스템에는 광범위 하 게 설립된 기술입니다. 여기 제공 하는 고정 하는 방법 포함, 끼얹는다 파라핀 왁 스를 사용 하 여 그대로 미생물 식민지 biofilms의 단면. 식민지 biofilms에 사용 하기 위해이 메서드를 적용 하 우리 각 샘플의 성장 기판에 유지 하 고 agar overlayer와 코팅 기술을 개발 하 고 리 통 솔루션에 추가. 이러한 최적화는 샘플 보존 및 micromorphological 기능의 보존을 향상 시킵니다. 이 방식으로 준비 샘플 얇은 단면 및 빛, 형광, 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 이미징 의무가 있다. 우리는 녹 농 균, 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae식민지 biofilms에이 기술을 적용 했습니다. 세부 사항이이 메서드에 의해 생성 된 샘플에서 볼 수의 높은 수준의 결합 기자 스트레인 엔지니어링 또는 특정 염료를 사용 하 여 생리 및 미생물 지역 사회 개발에 대 한 흥미로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

대부분 미생물 형태 biofilms 용량을가지고, 셀의 지역 사회 자체 제작된 행렬에 의해 함께 개최. Biofilms는 영양소와 기판의 다양 한 정권으로 물리적 설정의 많은 종류에 성장 될 수 있다. Biofilm 형성에 대 한 구체적인 분석 재현성 다세포 구조, 항복 하는 경향이 그리고 일반적인 아키텍처 phylogenetically 다양 한 종 지역 사회 또는 거시적인 수준에서 관찰 된다. 미생물 고체 매체는 대기권의 밑에 식민지로 재배 되 고, 거시적인 형태학 매트릭스 생산 용량에 대 한 정보를 전달 하 고 종종 다른 특성 1,2,3와 상관 관계가. 미생물 식민지의 내부 아키텍처 biofilm 특정 화학 및 생리학에 대 한 단서를 제공할 수도 있습니다 하지만 특성화 하는 어려운 되었습니다. 세균성 식민지를 cryoembedding 및 cryosectioning 기술의 최근 응용 프로그램 이미징 및 시각화 전례 없는 해상도 4,,56에서 특정 기능을 활성화 했습니다. 그러나, 동물 조직으로 연구는 파라핀 포함 형태 cryoembedding 7 에 비해 뛰어난 보존 하며 조직을 8,9에서 박테리아를 시각화 하는 데 사용 되었습니다 나타났습니다. 우리는 따라서 기정, 파라핀 포함, 그리고 미생물 식민지 biofilms의 얇은 단면에 대 한 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 녹 농 균 PA14 식민지 biofilm 얇은 섹션 10,11, 준비 설명 합니다 하지만 우리 박테리아에 의해 형성 된 biofilms에 또한 성공적으로이 기술을 적용 된 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis,비 브리 오 cholerae12.

파라핀 포함 및 얇은 단면 biofilms의 과정에는 간단한 논리를 다음과 같습니다. 먼저,는 biofilms는 처리 하는 동안 형태를 보존 하는 agar의 레이어 쌌 다. 둘째, 쌌 다 biofilms crosslink 고분자에는 정착 액에 잠긴, micromorphology를 유지. 이 알코올 탈수 한 다음, 더 비 극 지 용 매로 지워지고 액체 파라핀 왁 스와 함께 침투. 침투, 일단 샘플 단면에 대 한 왁 스 블록에 포함 됩니다. 섹션은, 슬라이드에 잘라내어 다음 그들을 원래의 상태로 돌아가도록 rehydrated. 이 시점에서 그들은 수 수 스테인드 또는 현미경 분석에 대 한 설치 매체에서.

이 프로토콜 조직학 분석을 위한 적합 한 미생물 biofilms의 얇은 섹션을 생성합니다. 이 메서드를 사용 하 여 준비 하는 얇은 단면도 가벼운 현미경 검사 법에 의해 군데 식민지 biofilm 콘텐츠의 표시 됩니다. Biofilms 또한 개별 기능에 대 한 특정 미디어 포함 형광 얼룩에 성장 하거나 재 단계 장착 (9.5-9.6 단계) 직전에서 스테인드 수 있습니다. 마지막으로, 미생물이 지역이 사회 내에서 셀 배포 또는 유전자 표현의 보고 제자리에 있도록 제정 또는 레 귤 레이트 된 패션에 형광 단백질을 생산 하기 위해 설계 될 수 있다. 식민지 biofilm 깊이, 셀 유통, 매트릭스 유통, 성장 패턴 및 spatiotemporal 유전자 발현을 확인 하기 위해 이러한 방법을 사용 했습니다.

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Protocol

1입니다. 녹 농 균 식민지 Biofilms의 성장

  1. 매체-Bilayer 접시의 준비
    1. 10 g/L tryptone, 한 천 10 g/L를 준비 이온 물에서 ( 재료의 표참조) 솔루션.
    2. 20 분 50-60 ° C에 시원한 물 욕조에 대 한 오토 클레이 브.
    3. 100 mm x 100 mm 정사각형 접시에 agar tryptone 솔루션의 45 mL를 붓고 ( 재료의 표참조) 50 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여. 공고히 한 천 수 (20 ~ 30 분). 두 번째, 15 mL 레이어의 첫 번째 레이어 위에 붓는 다. 밤새 공고히 하자, 보풀 티슈로 닦아 하 여 필요한 경우 뚜껑에서 결로 제거.
  2. 식민지 Biofilms 안보
    1. 관심 종자 파운드 한 천 격판덮개13 에 냉장고 주식에서 행진 하 고 37 ° C와 80-100% 상대 습도에서 12-16 h에 대 한 어둠 속에서 품 어.
    2. 각 스트레인 또는 복제에 대 한 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 2 개 mL를 접종 하 여 37 ° C에서 12-16 h 250 rpm 동요에 대 한 어둠 속에서 품 어.
    3. 서브 1: 100 파운드 신선 하 고 37 ° C에서 2.5-3 h 250 rpm에서 진동에 대 한 어둠 속에서 잠복기에 diluting 하 여 문화.
    4. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 하 고 살 균 파운드는 OD와 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 조정500 nm ~ 0.5의.
    5. 원하는 서식 지에 따라 다릅니다 피펫으로 2.5-10 µ L (단계 1.1에서에서 준비) 매체 bilayer 플레이트에 셀 서 스 펜 션의 크기 하 고 자리 ~ 20 분 페 트리 뚜껑 열린 불꽃 근처 열려 떠나 건조 용이 하 게 수에 대 한 건조를 허용.
    6. 최대 4 일 동안 어둠 속에서 25 ° C 및 80-100% 상대 습도에서 자리 식민지를 품 어.

2입니다. 통 솔루션의 준비

  1. 샘플 수확의 날에 통 솔루션을 준비 합니다. 1 x 4%의 최종 농도에 PBS에 37% 포름알데히드 (FA)를 희석 FA.
    주의: FA은 휘발성과 독성이 있습니다. 보호 장비를 착용 하 고 통풍이 잘되는 증기 두건에서 작동.
  2. 즉시 사용 하기 전에 분해 4% 염 산 L-리 신 FA 50mm L 리 진 HCl의 최종 농도를 실 온에서 (단계 2.1에서에서 준비).

3. [옵션] 식민지 Biofilm에 정착 액의 응용 프로그램을 직접

참고: 우리는 biofilm 형태학 agar 오버레이 고정 하기 전에 추가 될 때 가장 잘 유지 되는 발견 했다. 그러나,이 단계는 또한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 환경 조건에 변화를 구성 합니다. 따라서 여기에 설명 된 대로 있는 고정 단계는 실시 한 오버레이 추가 하기 전에 별도 프로토콜을 사용 하 여 형광 기자 식 패턴에 확인 한다.

  1. 고정, 그리고 환기가 증기 두건에서 한 일에 식민지의 가장자리, 그것은 그것을 잠수 없이 식민지의 주변에 도달 수 있도록 주위 agar 표면에 직접 2 단계에서 준비 하는 정착 제 플라스틱. 약 500 µ L. 허용 식민지 및 주변 agar에 확산 정착 액으로 많은 정착 액 만큼은 완전히 식민지를 둘러싸고에 적용 됩니다.
  2. 일단은 정착 액 식민지 및 주변 미디어, 약 20-30 분에 완전히 흡수 되었으며 잔여 FA는 더 이상 접시에 표시, 단계 3.1을 반복 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액을 허용 합니다.
  3. 일단은 정착 액 완전히 식민지로 흡수 되었으며 주변 미디어 반복 단계 3.1, 식민지의 표면에 직접 고정 제를 적용 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액, 진행 단계 4에만 모든 후 통 흡수 되었으며 더 이상 접시에 볼 수 없습니다.

4. 오버레이 Agar와 식민지

  1. 고정 일에는 10 g/L 이온된 물과 분해에 10-20 분 압력솥에 한 솔루션 준비. 50 ˚C에 물 욕조에 멋진.
  2. 부드럽게 붓는 다 15 mL agar 솔루션의 성장 매체 및 식민지. 5 분 (그림 1B)에 대 한 실 온에서 젤을 형성 하기 위하여 한을 수 있습니다.
  3. 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 최고 2 개의 층 사이 적 층 하는 식민지와 정사각형, 3 층 척을. 여러 샘플을 준비, 각 척 비슷한 크기로 잘라는 확인 합니다.
  4. 부드럽게 식민지 포함 된 척에서 과도 한을 제거 합니다.
  5. 척 (그림 1C)의 아래쪽 계층에서 agar (식민지 포함)의 2 개의 상위 계층을 해제, PBS 또는 물 1 주걱의 플랫 머리 젖은 하 고 부드럽게 위쪽 및 아래쪽 레이어 사이 삽입 합니다. 적 층된 식민지 아래 계층에서 분리 해야 합니다. 조심 하지 왜곡 하거나 그것의 기초에서 그것을 해제 하는 때 적 층된 식민지를 벤드 합니다.

5입니다. 고정

  1. 적 층된 식민지 (즉, 2 층 척) 포함 카세트로 전송 즉시 환기가 연기 후드, 작업 ( 재료의 표참조), 화학 방지 마킹 펜으로 표시. 유리 슬라이드 우편물 포함 카세트를 넣습니다 (재료의 표 참조) 포함 하는 준비 단계 2.1-2.2에서에서 정착 액. 없음 기포 포함 카세트 안에 갇혀 있다 다는 것을 확인 하십시오.
  2. 하룻밤 실 온에서 어둠 속에서에서 정착 액에 샘플을 품 어.

6. 샘플 처리: 버퍼 세척, 탈수, 개간, 및 침투

  1. 야간 고정 후 샘플 1 h 1 x PBS에 두 번 세척. 최상의 결과 얻으려면 시 균질 스핀을 사용 하 여 자동화 기능 자동 조직 프로세서의 낮은 설정으로 설정 (자료의 표 참조). 없는 프로세서를 사용할 수 있는 경우 처리는 수동으로 실행할 수 있습니다.
  2. 실 온에서 1 h 각 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%)에서 에탄올 (EtOH) 희석의 등급된 시리즈를 통해 탈수로 버퍼 세척을 따릅니다.
  3. 100%의 3 개의 세척 탈수 EtOH 각 실 온에서 1 h.
  4. 100% 오렌지 오일 기반 개간 에이전트의 세 가지 세척 탈수 샘플 취소 (재료의 표 참조) 각 실 온에서 1 h.
  5. 침투 지운된 샘플 두 번와 녹은 파라핀 왁 스 ( 재료의 표참조), 55˚C, 2 h에 대 한가 열.

7. 샘플 포함

  1. 55 ˚C를가 열 하는 녹은 파라핀 왁 스 왁 스 몰드를 채우십시오. 온수, 편평한 주걱을 사용 하 여 신속 하 게 포함 카세트의 침투 척 물림 쇠 병렬 형의 기지에 달려 있도록 왁 스 금형에 전송. 물림 쇠에 과도 한 압력을 적용 하지 마십시오. 왁 스 금형 사용자 지정 3 차원 인쇄 될 수 있습니다 또는 상용 ( 재료의 표참조).
  2. 4 ˚C에서 하룻밤을 강화 하기 위해 왁 스를 수 있습니다. 고체 왁 스 몰드 샘플 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.
  3. 왁 스가 고형화 되 면 금형에서 샘플을 삭제할 고 면도날으로 샘플 주위에서 과잉 왁 스 손질. 두고 과잉 왁 스 샘플, 단면, 평면에 평행한의 한쪽 끝에서 연장는 톰으로 클램프 하는 데 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 또한 샘플 주위 왁 스, 약 1 m m 두께의 칼 집 두고 그 얼굴을 부드럽게.

8. 단면

  1. 42 ˚C에 물 목욕을 열. 잎의 가장자리에 수직으로 동쪽으로 향하게 하는 식민지의 표면으로 톰으로 샘플을 클램프 ( 재료의 표참조).
  2. 식민지의 원하는 평면 섹션을 수집 된 것입니다 도달 했습니다 때까지 샘플 50 µ m 간격으로 잘라.
  3. 10 µ m 두께 섹션 75-80 rpm의 단면 속도 6-10˚의 허가 각도를 설정 하는 톰을 사용 하 여 원하는 수의 리본을 잘라. 뾰족한 붓을 사용 하 여 잎에서 리본을 분리.
  4. 부드럽게 전송 파스퇴르 피 펫 (선호) 또는 집게의 끝에 물 한 방울을 사용 하 여, 물 목욕 리본. 섹션에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다.
  5. 즉시 물 욕조에 슬라이드를 삽입 하 고 45˚에서 리본 메뉴 아래에 위치.
  6. 슬라이드 반투명된 레이블 바로 아래에 리본의 좁은 가장자리를 터치 합니다. 리본을 준수 해야 합니다.
  7. 물 목욕, 물, 표면에 수직이 되도록 각도 조정 하 고 그것의 길이 따라 슬라이드에 대 한 평면을 리본 허용에서 슬라이드를 당겨. 리본 메뉴 아래 초과 물을 트래핑 하지 마십시오.
  8. 부드럽게 서는 흡수 성 보풀 조직, 섹션에서 초과 물을 wicking에 슬라이드.
  9. 종이 타월에 슬라이드를 어둠 속에서 하룻밤 실 온에서 건조 그것을 허용. 슬라이드는 어둠 속에서 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.

9. 열 고정, 재, 및 장착

  1. 45 ˚C를 수준별된 핫 플레이트를 열. 30-60 분에 대 한 슬라이드를 열. 왁 스 것 이다 될 세미-녹은 평평 하 게 슬라이드에 대 한.
  2. 부드럽게 핫 플레이트에서 슬라이드를 올리고 누워 부드러운, 수준별, 실내 온도 표면에 평면 녹은 왁 스 왁 스 굳은 (~ 1 분) 때까지 슬라이드의 어느 사이드를 당겨 하지 않습니다 보장 하기 위해 관리 사용 하 여.
  3. 세척 사이 솔루션을 제거 하는 Büchner 흡 인기를 사용 하 여 각, 5 분에 대 한 에이전트를 비운의 4 개의 세척 슬라이드 왁 스 드 유리 슬라이드 메일러를 사용 하 여.
  4. 100%에 슬라이드 세 번 씻어 EtOH 1 분.
  5. 각 1 x PBS에이 분 세척 뒤 1 분 (95%, 70%, 50% 및 25%)를 처리 하는 역 순서에서 에탄올의 등급 시리즈에서 슬라이드 리하이드레이션
  6. 즉시 Tris 버퍼 장착 매체에 섹션을 탑재 ( 재료의 표참조) 기포의 도입을 방지 하는 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에서 유해를 장착 중간을 수 있습니다.
  7. 일단 생산, 투명 매니큐어를 사용 하 여 슬라이드에 coverslip 인감. 봉인 된 슬라이드 4 ˚C에서 어둠 속에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.

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Representative Results

이 메서드는 biofilm 얇은-섹션 점에서 뚜렷한 형태 기능 및 유전자 발현의 영역 DIC, 형광 현미경 검사 법, 그리고 가장 군데 될 수를 생성 합니다. DIC 이미징 기름 침수 목표 X 40을 사용 하 여 몇몇 형태학 상 특징 (그림 2E)를 표시 하기에 충분 한 수 있습니다, 우리는 발견 그 형광 현미경 constitutively 익스프레스 형광 단백질을 설계 하는 긴장의 향상을 제공 합니다 (그림 2D) 샘플 내 세포 분포의 시각화. 개별 섹션의 이미지 (그림 2B) 전체 식민지의 횡단면을 생성 하 고 거시적인 수준 (비교 전체적인 형태 구조 기능 지역화에 대 한 컨텍스트를 제공 함께 바느질 될 수 있다 그림 2A, B 및 C). 형태학 상 특징 및 형광 신호는 이미징 소프트웨어14를 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 구조가 biofilm 또는 유전자 발현의 영역 간의 전환 대사 산물 또는 화학 그라디언트11 의 배포판와 상관 다음 수 있습니다.

이 프로토콜 개정 하 고 여러 가지 방법으로 적용할 수 있습니다. 특정 발기인 통제 익스프레스 형광 단백질을 설계 하는 긴장의 사용에는 유전자 발현 (그림 3A)의 분포의 시각화 수 있습니다. 식민지는 염료를 포함 하는 매체에 성장 될 수 있다 또는 단면 이후 염료를 추가할 수 있습니다, 그리고 특정 류 얼룩 (그림 3B와 C). 마지막으로,이 프로토콜의 수정된 버전에서 샘플 DIC로 사용 하는 보다 높은 해상도에서 시각화 수 있도록 가장 (그림 3D) 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 시험 될 수 있다.

Figure 1
그림 1: 회로도 고정 전 식민지 성장 위한 설치를 묘사
(A) 식민지 천 경화 성장 매체 (위쪽 및 아래쪽)의 2 개의 층 위에 성장 하 고 식민지 형태를 유지 하는 추가 레이어 (오버레이)과 겹쳐 다음 (B)는. (C) 오버레이 및 상위 레이어 사이 끼여 식민지 다음 추가 처리를 위해 하단의 레이어에서 분리 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: Micromorphological 기능 및 파라핀 끼워 넣어진 식민지의 횡단면에서 YFP 형광.
녹 농 균 PA14 Δphz 식민지15 constitutively YFP 표현에 대 한 대표적인 데이터 블루 1 %tryptone, 콩고 빨간색과 Coomassie 포함 하는 1 %agar 3 일 동안 성장. (A) 형광 이미지 고정 이전 식민지의 절반을 보여주는 상단 보기. (B) 파라핀 포함 후 전체 식민지의 크로스 섹션. 박스형된 지역은 10 배 목표 렌즈 (C)와 몇 군데. (C) 박스형된 지역은 다음 기름 침수 렌즈 형광 (D)와 DIC (전자)를 사용 하 여 X 40 몇 군데. 스케일 바는 2 m (A) m, 500 µ m (B), 및 100 µ m (C-E)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 기자 식, 사전 및 사후 biofilm 기능과 파라핀 끼워 넣어진 식민지 biofilm 샘플의 가장 이미징의 얼룩.
Tryptone 1%, 1 %agar 3 일 동안 성장 피. 녹 농 균 PA14 식민지에 (A) mexGPr-GFP 기자 형광 (B)의 염료를 포함 하는 중간에 5 일 동안 성장 P. synxantha 식민지에 바인딩된 콩고 레드의 형광 (C) 등나무 floribunda lectin 얼룩 Pel 다 당 류 피 농 균 PA14 Δphz 식민지 (2 일 동안에 성장 tryptone 1%, 1% 한 천은 포함 콩고 빨강 및 Coomassie 파란), 단면 후 적용에 대 한의 형광 (D) TEM 이미지 (성장 1 %tryptone, 콩고 빨간색과 Coomassie 포함 하는 1 %agar 3 일 동안 블루), P. 농 균 PA14 Δphz 식민지의 파라핀 포함 통해 단면에 대 한 처리 및 *. 눈금 막대는 40 µ m (A-B), 20 µ m (C), 및 5 µ m (D)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

*이 샘플 4 단계 위의 프로토콜의 단계 4.1 4.3, 생략을 통해 파라핀 포함 통해 단면 처리 되었고 다음은 별도로 처리 TEM 분석에 대 한.

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Discussion

파라핀 포함 및 얇은 단면 조직 샘플은 고전적인 조직학 기술 마이크로 형태 구조의 이미징 수 있도록 진 핵 조직에 일반적으로 사용 되 고 약간의 성공을 함께 미생물 샘플8에 적용 된 ,9. Cryoembedding 생 및 immunofluorescent 신호의 강한 보존에 대 한 수, 파라핀 포함 바람직합니다 일반적으로 형태학16의 더 나은 보존을 제공 합니다. 이 방법을 응용 미생물 biofilms에 적응, 우리 우리의 시스템에 고유한 특성에 집중 했다. 세포 및 조직의 매트릭스 종종 함께 비교적 견고 하 게, 동안 유지 biofilms 경향이 더 섬세 한; 우리는 그러므로 일상적인 고정 및 샘플 보존을 극대화 하기 위해 프로토콜을 포함 하는 왁 스를 최적화. 그것의 성장 기판에 샘플을 유지 하 고 고정 직전 agar와 식민지를 오버레이 샘플 상단 이나 기지에서 손실 되지 않습니다 보장 합니다. 그러나, 너무 뜨거운 agar와 식민지를 오버레이 수 손상 식민지, 그래서 추가이 단계 동안 주의 해야 합니다.

고정 지우기, 가혹한 탈수를 통해 구조를 유지 위한 중요 한 단계 이며 침투 단계 파라핀 포함에 필요한. 우리는 그 리 포름알데히드 고정 최고의 샘플의 무결성을 보존 발견. 녹는 lysine, diamine, 교차 결합 된 중합체를 형성 하는 알데하이드를 반응 하 고 기계적 저하17,18에 대 한 exopolymeric 물질 (EPS)을 강화 하기 위해 제안 되었습니다.

우리는 배경 형광 감소 오렌지 오일 기반 개간 에이전트 또는 장기간된 노출을 통해 연속 세척 샘플 재 (단계 9.3) 동안 관찰 했습니다. 그러나 개간 에이전트-처리 과민 샘플 섹션19하기 어려운, 발생할 수 있습니다. 그것은 볼륨 또는 왁 스 각 재 중의 금액을 반영 하는 세척 수를 조정 하려면 필요할 수 있습니다. 증가 배경 형광 마찬가지로 오염 처리 시 약, 왁 스, 약간 autofluorescent는 완전히 또는 부분적으로 혼합할 수 있는 개간 용 매 또는 에탄올 다음이 단계 (단계에에서 사용 되는 조직에서 발생할 수 있는 6.1 6.4). 또한, 우리 그 발견 에탄올 감소 기자 신호를 다시 (단계 9.5-9.6) 장착 전에 PBS의 두 세척에 fluorophore를 구성 하는 것이 중요.

이 메서드는 셀의 해상도에서 제정 및 모터 구동 형광의 지역화에 대 한 또한 수 있습니다. 그러나, 우리는 유전자 발현 해석 하는이 메서드를 사용할 때 주의 조언. 50 ˚C에 고정 하기 전에 적용이 프로토콜 (단계 4.2)에 도입 된 오버레이 단계 유전자 표현 패턴에 영향을 미칠 수 있는 초기 성장 조건 기준으로 상당한 환경 변화를 선물 한다. 그것은 형태학 (선택적 단계 3.1-3.3)을 직접 식민지, 오버레이, 따르기 이전 즉시 하지만 비용 정착 액을 적용 하 여 식 패턴을 확인 하려면 유용할 수 있습니다.

형광의 해석에 영향을 미치는 또 다른 요인은 자체 섹션의 지형 이다. biofilm의 다른 지역 구조적 무결성의 다양 한 각도 전시 하 고 더 많거나 적은,에 따라 고정을 통해 보존 의무가 있을 수 있으면, 기능적인 그룹 구성 요소 수 있습니다 통 cross-linking 를 20. 그 결과, 섹션 손실 될 수 있습니다 바이오 매스 편중 섹션 표면에서 다른 식민지의 z 축을 따라 한 형태학 또는 대사 영역에서 전환할 때. 이 섹션의 그대로 초점 슬라이스 confocal 현미경 이미징 하 여 해결할 수 있습니다.

익스프레스 형광 단백질을 조작 하는 계통에이 기술을 적용, 뿐만 아니라 우리 검사 micromorphological 기능 전송 전자 현미경 (TEM)와 특정 형광 염료 (그림 3A와 스테인드 biofilm 샘플 ). 제닝스 외. 최근 염료 특정 Pel, 주요 다 당 류 피 농 균 PA14 biofilms 21에 의해 생성에 대 한 설명. 위의 프로토콜 및 대표 결과에 설명 된 대로이 염료의 응용 프로그램 섹션을 높은 해상도 (그림 3C) 3에서 PA14 식민지 biofilms에 Pel 분포의 시각화 수 있습니다. 반대로, 콩고 레드 같은 형광 염료 성장 매체에 추가 될 수 있습니다 하 고 몇 군데 후 단면 (그림 3B). 오버레이 응용 프로그램은 또한 가장 (그림 3D)에 대 한 처리 과정 식민지 biofilm 형태학 및 세포 구조를 유지.

여기 설명 하는 최적화 된 방법을 통해 파라핀 포함 단면에 대 한 식민지 biofilms의 준비, 어떤 점에서 생 신호 및 기능이 나 complexed 염료 수 있습니다 지역화 vivo에서 우수한 해상도로 샘플을 최소화 하면서 손실 그리고 네이티브 식민지 매크로 및 마이크로 형태학을 보존. 우리는 상당한 노력과 시간, 시 약 사용이이 방법에 대 한 필요는 인정 합니다. 그러나, 우리가 이러한 단점 형태학 보존, 제자리에서 형광의 해상도 사전 및 후 착 절차 또는 다른 처리 전략 (예: 준비를 순종의 정도 의해 반박는 느낌 이 기술에 의해 여유 가장).

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 작품은 NSF 경력 수상 1553023 및 NIH/NIAID 상 R01AI103369에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

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References

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