तेल embedding और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए माइक्रोबियल कॉलोनी की धारा

Immunology and Infection

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Summary

हम निर्धारण, आयल embedding, और पतली माइक्रोबियल कॉलोनी फिल्म के लिए अनुभाग तकनीक का वर्णन । तैयार नमूनों में, फिल्म उपसंरचना और रिपोर्टर अभिव्यक्ति पैटर्न माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized किया जा सकता है ।

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Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

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Abstract

आयल embedding के जरिए अनुभाग eukaryotic प्रणालियों में एक मोटे तौर पर स्थापित तकनीक है । यहां हम निर्धारण, embedding, और बरकरार माइक्रोबियल कॉलोनी perfused आयल मोम का उपयोग कर फिल्म के अनुभाग के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । कॉलोनी पर उपयोग के लिए इस विधि को अनुकूलित करने के लिए, हम अपने विकास सब्सट्रेट पर प्रत्येक नमूने को बनाए रखने और यह एक आगर परत के साथ फाड़ना के लिए तकनीक विकसित की है, और निर्धारण समाधान के लिए lysine जोड़ा । इन अनुकूलन नमूना प्रतिधारण और micromorphological सुविधाओं के संरक्षण में सुधार होगा । इस तरीके से तैयार किए गए नमूनों में प्रकाश, प्रतिदीप्ति, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पतले सेक्शनिंग और इमेजिंग के लिए उत्तरदायी होते हैं । हमने इस तकनीक को Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, बैसिलस सबटिलिस, और Vibrio हैजाकी कॉलोनियों में लागू किया है । इस विधि द्वारा उत्पंन नमूनों में दिखाई विस्तार के उच्च स्तर, रिपोर्टर तनाव इंजीनियरिंग या विशिष्ट रंगों के उपयोग के साथ संयुक्त, शरीर विज्ञान और माइक्रोबियल समुदायों के विकास में रोमांचक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

Introduction

अधिकांश रोगाणुओं की क्षमता है कि वे स्व-निर्मित मैट्रिक्स के द्वारा एक साथ आयोजित की जाने वाली कोशिकाओं के समुदायों को बनाते हैं । कई प्रकार के भौतिक स्थापकों में, पोषक तत्वों और सब्सट्रेट प्रावधान की विभिन्न सरकारों के साथ-साथ फिल्में उगाई जा सकती हैं । विशेष रूप से फिल्म निर्माण के लिए परख reproducible कोशिकीय संरचनाओं उपज करते हैं, और आम वास्तुकला समुदाय या macroscopic स्तर पर phylogenetically विविध प्रजातियों के लिए मनाया जाता है । जब रोगाणुओं एक वातावरण के तहत ठोस माध्यम पर कालोनियों के रूप में हो रहे हैं, macroscopic आकृति विज्ञान मैट्रिक्स उत्पादन के लिए क्षमता के बारे में जानकारी देते है और अक्सर अंय लक्षण 1,2,3के साथ संबद्ध । माइक्रोबियल कालोनियों की आंतरिक वास्तुकला भी जैव फिल्म विशिष्ट रसायन विज्ञान और शरीर विज्ञान के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं, लेकिन विशेषताएं मुश्किल हो गया है । बैक्टीरियल कालोनियों के लिए cryoembedding और cryosectioning तकनीक के हाल के अनुप्रयोगों के अभूतपूर्व संकल्प 4,5,6पर इमेजिंग और विशिष्ट सुविधाओं के दृश्य सक्षम है । हालांकि, पशु ऊतक के साथ अध्ययन से पता चला है कि आयल embedding के बेहतर संरक्षण प्रदान करता है, जब cryoembedding 7 की तुलना में है और ऊतकों में बैक्टीरिया की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 8,9. हम इसलिए निर्धारण, आयल embedding, और माइक्रोबियल कॉलोनी की पतली धारा के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । यहां, हम Pseudomonas aeruginosa PA14 कॉलोनी की तैयारी का वर्णन-फिल्म पतली वर्गों 10,11, लेकिन हम भी सफलतापूर्वक बैक्टीरिया द्वारा बनाई गई फिल्म के लिए इस तकनीक को लागू किया है Pseudomonas synxantha, बैसिलस सबटिलिस,Vibrio हैजा१२

आयल-एम्बेडिंग और थिन-सेक्शनिंग की प्रक्रिया एक साधारण तर्क के बाद होती है । सबसे पहले, प्रसंस्करण के दौरान आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए, एक परत में विचित्रित हैं । दूसरा, crosslink अणुओं और micromorphology को संरक्षित करने के लिए एक निर्धारण में डूबे हुए हैं । ये तो शराब के साथ निर्जलित हैं, एक और गैर-ध्रुवीय विलायक के साथ मंजूरी दे दी, और फिर तरल तेल मोम के साथ घुसपैठ की । एक बार घुसपैठ के नमूने, अनुभाग के लिए मोम ब्लॉकों में एंबेडेड हैं । अनुभाग स्लाइड पर घुड़सवार, काट रहे हैं, और फिर एक अधिक देशी राज्य के लिए उन्हें वापस करने के क्रम में reहाइड्रेटेड. इस बिंदु से, वे दाग या सूक्ष्म विश्लेषण के लिए बढ़ते माध्यम में कवर किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त माइक्रोबियल फिल्म के पतले वर्गों का उत्पादन । इस विधि का उपयोग कर तैयार पतली वर्गों प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा imaged कर रहे हैं जब कॉलोनी फिल्म उपसंरचना दिखाई दे रहे हैं. फिल्म भी फ्लोरोसेंट दाग व्यक्तिगत सुविधाओं या निर्जलीकरण कदम पर दाग के लिए विशिष्ट युक्त मीडिया पर उगाया जा सकता है, तुरंत बढ़ते (चरण 9.5-9.6) से पहले । अंत में, रोगाणुओं को एक गठित या विनियमित फैशन इन समुदायों के भीतर सेल वितरण या जीन अभिव्यक्ति की रिपोर्टिंग में सीटू की अनुमति में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन इंजीनियर जा सकता है । हम कॉलोनी फिल्म गहराई, सेल वितरण, मैट्रिक्स वितरण, विकास पैटर्न, और spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है ।

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Protocol

1. Pseudomonas aeruginosa कॉलोनी के विकास की फिल्म

  1. मीडियम-Bilayer प्लेट्स की तैयारी
    1. एक 10 g/l tryptone, 10 g/l आगर ( सामग्री की तालिकादेखें) जल में पानी के घोल को तैयार करें ।
    2. आटोक्लेव के लिए 20 मिनट के लिए एक पानी में स्नान 50-60 ° c के लिए ठंडा ।
    3. एक 100 मिमी x 100 मिमी स्क्वायर डिश में आगर-tryptone समाधान के 45 मिलीलीटर डालो ( सामग्री की तालिकादेखें) एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब का उपयोग कर. आगर (~ 20-30 मिनट) जमना करने की अनुमति दें । पहली परत के शीर्ष पर एक दूसरे, 15 मिलीलीटर परत डालो । रात भर जमना, एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ पोंछते द्वारा आवश्यक अगर ढक्कन से संघनित्र हटाने ।
  2. खोलना कॉलोनी फिल्म
    1. लकीर फ्रीजर शेयरों से पौंड आगर पर ब्याज की उपभेदों प्लेटें13 और अंधेरे में 12-16 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और ८०-१००% सापेक्ष आर्द्रता में मशीन ।
    2. प्रत्येक तनाव या दोहराने के लिए, 250 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 एच के लिए अंधेरे में पौंड और गर्मी के 2 मिलीलीटर inoculate करने के लिए एक एकल कॉलोनी का उपयोग करें ।
    3. कमजोर 1:100 द्वारा उप संस्कृति ताजा पौंड में और 2.5 के लिए अंधेरे में गर्मी-3 एच के लिए 250 rpm में मिलाते के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. एक spectrophotometer का उपयोग कर ऑप्टिकल घनत्व को मापने और ~ 0.5 के एक आयुध डिपो के500 एनएम के साथ एक सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए बाँझ पौंड के साथ समायोजित करें ।
    5. वांछित कॉलोनी आकार पर निर्भर करता है, प्लास्टिक एक मध्यम-bilayer प्लेट पर सेल निलंबन के 2.5-10 µ एल (चरण 1.1 में तैयार) और स्थान के लिए शुष्क करने की अनुमति ~ 20 मिनट । एक खुली लौ के पास पेट्री ढक्कन अझर छोड़ने सुखाने की सुविधा कर सकते हैं ।
    6. 4 दिनों तक के लिए अंधेरे में, 25 डिग्री सेल्सियस और ८०-१००% सापेक्षिक आर्द्रता पर जगह कॉलोनियों ।

2. निर्धारण समाधान की तैयारी

  1. नमूना संचयन के दिन निर्धारण समाधान तैयार करें । 4% एफए के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1x पंजाब में 37% formaldehyde (एफए) पतला ।
    चेतावनी: एफए अस्थिर और विषाक्त है । सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और एक अच्छी तरह हवादार धुएं-हुड में काम करें ।
  2. तुरंत उपयोग करने से पहले, 4% एफए में एल lysine हाइडरोक्लॉराइड भंग (चरण 2.1 में तैयार) कमरे के तापमान पर 50 मिमी एल lysine एचसीएल के अंतिम एकाग्रता के लिए ।

3. कॉलोनी के लिए निर्धारण के सीधे आवेदन फिल्मी [वैकल्पिक]

नोट: हमने पाया है कि जब आगर ओवरले निर्धारण से पहले जोड़ा जाता है, तो सर्वश्रेष्ठ संरक्षित है । हालांकि, इस कदम को भी पर्यावरण की स्थिति है कि जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता में परिवर्तन का गठन किया । फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अभिव्यक्ति पैटर्न इसलिए एक अलग प्रोटोकॉल का उपयोग कर सत्यापित किया जाना चाहिए जिसमें निर्धारण कदम आगर ओवरले के अलावा से पहले किए गए है, जैसा कि यहां वर्णित है ।

  1. निर्धारण के दिन, और एक अच्छी तरह हवादार धुएं में काम करने वाले डाकू, पिपेट को सीधे चरण 2 में तैयार करने के लिए कॉलोनी के किनारे के आसपास आगर सतह के लिए अनुमति देता है, यह बिना विलय के इस कॉलोनी की परिधि तक पहुँचने की इजाजत दी । लागू करने के रूप में अधिक निर्धारण के रूप में पूरी तरह से कॉलोनी चारों ओर की जरूरत है, लगभग 500 µ एल निर्धारण कॉलोनी और आसपास के आगार में फैलाना अनुमति देते हैं ।
  2. एक बार निर्धारण पूरी तरह से कॉलोनी और आसपास के मीडिया में अवशोषित कर लिया गया है, के बारे में 20-30 मिनट, और अवशिष्ट एफए प्लेट पर अब दिखाई नहीं है, दोहराने के कदम 3.1 । इस निर्धारण को कॉलोनी और आसपास के आगार में फैलाना अनुमति दें ।
  3. एक बार निर्धारण पूरी तरह से कॉलोनी और आसपास के मीडिया दोहराने कदम 3.1 में अवशोषित कर लिया गया है, इस बार सीधे कॉलोनी की सतह के लिए निर्धारण लागू करने । इस निर्धारण को कॉलोनी और आसपास के आगार में फैलाना, सभी निर्धारण के बाद केवल चरण 4 पर कार्यवाही करने के लिए अवशोषित कर लिया गया है और अब थाली पर दिखाई नहीं देता है ।

4. आगार के साथ कालोनियों ओवरले

  1. निर्धारण के दिन, एक 10 जी/एल आगर समाधान में पानी और 10-20 मिनट के लिए आटोक्लेव भंग करने के लिए तैयार करें । एक जल स्नान में ठंडा करने के लिए 50 ˚ सी ।
  2. धीरे विकास माध्यम और कॉलोनी पर आगर समाधान के 15 मिलीलीटर डालो । आगर को 5 मिनट (चित्र 1b) के लिए कमरे के तापमान पर जेल बनाने की अनुमति दें ।
  3. एक तेज उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करने के लिए एक वर्ग, 3 परत चक काट कॉलोनी के साथ शीर्ष दो परतों के बीच में फाड़ा । यदि कई नमूनों की तैयारी, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चक एक तुलनीय आकार के लिए काट रहा है ।
  4. धीरे से अतिरिक्त आगर कॉलोनी से युक्त चक हटा दें ।
  5. (कॉलोनी युक्त) आगर के दो ऊपरी परतों चक (चित्रा 1C) के नीचे की परत से दूर उठा, 1x पंजाब या पानी में एक रंग के फ्लैट सिर गीला और धीरे ऊपर और नीचे परतों के बीच डालने के लिए । फाड़ी गई कॉलोनी को निचली परत से अलग करना चाहिए । विकृत करने के लिए या अपने बेस से इसे उठाने जब फाड़ा कॉलोनी मोड़ नहीं सावधान रहना ।

5. निर्धारण

  1. एक अच्छी तरह से हवादार धुएं में काम कर रहे डाकू, तुरंत एक एंबेडिंग कैसेट में (यानी, 2 परत चक) फाड़ा हुआ कॉलोनी हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें), एक रासायनिक प्रतिरोधी कलम अंकन के साथ लेबल । एक गिलास स्लाइड मेलर में एंबेडिंग कैसेट प्लेस (सामग्री की तालिका देखें) के चरणों 2.1-2.2 में तैयार निर्धारण युक्त । सुनिश्चित करें कि वहां कोई हवा एंबेडिंग कैसेट के अंदर फंस बुलबुले हैं ।
  2. कमरे के तापमान पर अंधेरे में रातोंरात निर्धारण में नमूना मशीन ।

6. नमूना प्रसंस्करण: बफर धोने, निर्जलीकरण, समाशोधन, और घुसपैठ

  1. रात के निर्धारण के बाद, 1 घंटे प्रत्येक के लिए 1x पंजाब में नमूना दो बार धो लो । सबसे अच्छा परिणाम के लिए, स्वचालित reagent homogenization एक स्वत: ऊतक प्रोसेसर के स्पिन समारोह का उपयोग कर (सामग्री की तालिका देखें) एक कम सेटिंग के लिए सेट करें । कोई प्रोसेसर उपलब्ध है, तो संसाधन मैन्युअल रूप से चलाया जा सकता है ।
  2. (ेतोः) 1x पंजाब में कमजोर पड़ने वाले इथेनॉल की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से निर्जलीकरण द्वारा बफर वॉश का पालन करें (25%, 50%, 70%, 95%) 1 h प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर ।
  3. एक कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 100% ेतोः के तीन बहाकर में निर्जलीकरण ।
  4. 100% संतरे का तेल आधारित समाशोधन एजेंट के तीन बहाकर में निर्जलित नमूना स्पष्ट (सामग्री की तालिका देखें) के लिए 1 घंटे कमरे के तापमान पर प्रत्येक ।
  5. दो घंटे प्रत्येक के लिए, 55 ˚ सी के लिए गरम, पिघला हुआ आयल मोम ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक बार साफ़ नमूना घुसपैठ.

7. नमूना एंबेडिंग

  1. पिघला हुआ तेल के साथ एक मोम मोल्ड भरें 55 ˚ C को गर्म मोम एक गर्म, सपाट रंग का प्रयोग जल्दी से मोम मोल्ड में एंबेडिंग कैसेट से घुसपैठ चक हस्तांतरण, यह सुनिश्चित करना है कि चक मोल्ड के आधार के समानांतर टिकी हुई है । चक पर अत्यधिक दबाव लागू करने से बचें । वैक्स मोल्ड कस्टम 3-डी मुद्रित हो सकते हैं, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. मोम को 4 ˚ C पर रात भर जमना की अनुमति दें । ठोस मोम में ढाला नमूनों 4 ˚ सी पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है
  3. एक बार मोम जम गया है, उत्पाद मोल्ड से नमूना और एक उस्तरा ब्लेड के साथ नमूना चारों ओर से अतिरिक्त मोम ट्रिम कर दीजिए । अतिरिक्त नमूना के एक छोर से विस्तार मोम छोड़ दो, खोदी के विमान के समानांतर, कि यह microtome में दबाना इस्तेमाल किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) । इसके अलावा मोम के एक म्यान, लगभग 1 मिमी मोटी, नमूना चारों ओर और उसके चेहरे चिकनी छोड़ दें ।

8. खोदी

  1. 42 ˚ सी के लिए एक पानी स्नान गर्मी । ब्लेड के किनारे करने के लिए सीधा उंमुख कॉलोनी की सतह के साथ microtome में नमूना दबाना ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. 50-µm के अंतराल में नमूना छांटो जब तक कॉलोनी के वांछित विमान तक पहुंच गया है, जहां से वर्गों को एकत्र किया जाएगा ।
  3. 75-80 rpm की एक धारा वेग के लिए सेट एक microtome का उपयोग कर 10-µm मोटी वर्गों की वांछित संख्या के एक रिबन में कटौती और ६-१० ˚ की एक मंजूरी कोण. एक ठीक-इत्तला दे दी तूलिका का उपयोग करने के लिए ब्लेड से रिबन अलग ।
  4. एक पाश्चर पिपेट की नोक पर पानी की एक बूंद का उपयोग करना (पसंदीदा) या संदंश, धीरे पानी स्नान के लिए रिबन हस्तांतरण । अनुभाग के तहत हवा के बुलबुले फँसाने से बचने के लिए सावधान रहें ।
  5. तुरंत पानी स्नान में एक स्लाइड डालें और यह एक 45 ˚ कोण पर रिबन के नीचे की स्थिति ।
  6. केवल फ्रॉस्टेड लेबल के नीचे, स्लाइड पर रिबन के संकीर्ण किनारे को स्पर्श करें । रिबन का पालन करना चाहिए ।
  7. पानी के स्नान के बाहर स्लाइड खींचो, कोण का समायोजन करने के लिए पानी की सतह को सीधा हो गया है, और रिबन अपनी लंबाई के साथ स्लाइड के खिलाफ फ्लैट देना करने की अनुमति । रिबन के नीचे अतिरिक्त पानी फँसाने से बचें.
  8. धीरे एक शोषक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक, बाती अनुभाग से अतिरिक्त पानी पर स्लाइड खड़े हो जाओ ।
  9. एक कागज तौलिया पर स्लाइड रखना, और अंधेरे में रात भर कमरे के तापमान पर शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं । स्लाइड अंधेरे में 4 ˚ सी पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

9. गर्मी फिक्सिंग, निर्जलीकरण, और बढ़ते

  1. 45 ˚ सी के लिए एक leveld गर्म थाली गर्मी । 30-60 मिनट के लिए स्लाइड हीट । मोम अर्द्ध पिघला हुआ है और स्लाइड के खिलाफ समतल हो जाएगा ।
  2. धीरे गर्म थाली से स्लाइड उठा और यह एक चिकनी, समतल, कमरे के तापमान की सतह पर फ्लैट करना, देखभाल का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि पिघला हुआ मोम स्लाइड के दोनों ओर से खींच नहीं है, जब तक मोम जम (~ 1 मिनट) ।
  3. एक ग्लास स्लाइड मेलर, de-मोम समाशोधन एजेंट के 5 मिनट प्रत्येक के लिए चार धोने में स्लाइड का उपयोग कर, एक Büchner aspirator का उपयोग करने के बीच समाधान को दूर बहाकर ।
  4. प्रत्येक 1 मिनट के लिए स्लाइड को 100% ेतोः में तीन बार धोएं ।
  5. प्रसंस्करण के रिवर्स क्रम में इथेनॉल की एक वर्गीकृत श्रृंखला में reहाइड्रेट (95%, 70%, 50%, और 25%) 1 मिनट के लिए प्रत्येक दो 1-ंयूनतम 1x में बहाकर पंजाबियों के बाद ।
  6. तुरंत एक Tris में वर्गों माउंट-बढ़ते मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक coverslip लागू होते हैं, हवा के बुलबुले की शुरूआत से परहेज । बढ़ते मध्यम को कमरे के तापमान पर रात भर polymerize की अनुमति दें ।
  7. एक बार बहुलक, स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग कर स्लाइड को coverslip सील । सील स्लाइडें अनिश्चित रूप से 4 ˚ C पर अंधेरे में संग्रहित किया जा सकता है ।

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Representative Results

इस विधि में एक फिल्म पतली-वर्गों जिसमें विशिष्ट रूपात्मक सुविधाओं और जीन अभिव्यक्ति के क्षेत्रों को उद्योग, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और उनि द्वारा imaged किया जा सकता है उत्पंन करता है । जबकि एक 40X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर रहा है एक उद्योग के लिए कुछ रूपात्मक विशेषताएं (चित्रा 2E) दिखाने के लिए पर्याप्त हो सकता है, हम ने पाया है कि उपभेदों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी constitutively एक्सप्रेस फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए इंजीनियर बढ़ाया प्रदान करता है नमूना के भीतर सेल वितरण के दृश्य (चित्रा 2d). व्यक्तिगत वर्गों की छवियाँ एक साथ सिले जा सकता है पूरी कॉलोनी (चित्रा बी) के एक पार अनुभाग उत्पन्न करने के लिए और macroscopic स्तर पर समग्र आकृति विज्ञान के भीतर संरचनात्मक सुविधाओं के स्थानीयकरण के लिए संदर्भ प्रदान करने के लिए (तुलना करें चित्रा 2a, बी, और सी) । रूपात्मक सुविधाओं और फ्लोरोसेंट संकेतों इमेजिंग सॉफ्टवेयर14का उपयोग कर मापा जा सकता है । जैव फिल्म या जीन अभिव्यक्ति के क्षेत्रों के बीच संक्रमण के भीतर संरचनाओं तो चयापचयों या रासायनिक ढाल के वितरण के साथ संबंधित किया जा सकता है11

इस प्रोटोकॉल में संशोधन किया जा सकता है और कई मायनों में अनुकूलित । एक विशेष प्रवर्तक के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक इंजीनियर तनाव का उपयोग जीन अभिव्यक्ति (चित्र 3ए) के वितरण के दृश्य में सक्षम बनाता है । कालोनियों में रंगों से युक्त मध्यम पर उगाया जा सकता है, या रंजक पोस्ट-सेक्शनिंग जोड़ा जा सकता है, विशिष्ट polysaccharides (अंक बी और सी) दाग करने के लिए । अंत में, इस प्रोटोकॉल के एक संशोधित संस्करण में तैयार नमूनों को उनि द्वारा जांच की जा सकती है (चित्रा 3d) से उच्च संकल्प पर दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए कि उद्योग या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा सक्षम है ।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध निर्धारण करने से पहले कॉलोनी के विकास के लिए सेटअप चित्रण ।
(क) कालोनियों में दो परतों के शीर्ष पर हो रहे है आगर-जम विकास मध्यम (ऊपर और नीचे) और (ख) तो एक अतिरिक्त परत (उपरिशाई) है, जो कॉलोनी आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है के साथ मढ़ा । (ग) ओवरले और शीर्ष परत के बीच की कॉलोनियों को फिर आगे की प्रक्रिया के लिए नीचे की परत से अलग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आयल-एंबेडेड कालोनियों के क्रॉस-सेक्शन में Micromorphological फीचर्स और YFP प्रतिदीप्ति ।
एक Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz कॉलोनी15 constitutively व्यक्त YFP और 1% tryptone, 1% पर 3 दिनों के लिए उगाया के लिए प्रतिनिधि डेटा कांगो लाल और Coomassie नीले रंग युक्त आगर । (क) ऊपर से देखने, प्रतिदीप्ति छवि निर्धारण से पहले एक कॉलोनी के आधे दिखा । (ख) आयल-embedding के बाद पूरी कॉलोनी का क्रॉस सेक्शन. बॉक्स्ड क्षेत्र एक 10x उद्देश्य लेंस (सी) के साथ छवि थी । (सी) में बॉक्सिंग क्षेत्र तो एक 40X तेल विसर्जन उद्देश्य प्रतिदीप्ति (डी) और उद्योग (ई) का उपयोग कर लेंस के साथ छवि थी । स्केल पट्टियां 2 मिमी (A), 500 µm (B), और 100 µm (सी-ई) का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: रिपोर्टर अभिव्यक्ति, पूर्व और बाद में, और फिल्म सुविधाओं के दाग, और आयल-एंबेडेड कॉलोनी फिल्म के नमूनों की उनि इमेजिंग ।
(a) mexGPr-GFP रिपोर्टर प्रतिदीप्ति एक पृ. aeruginosa PA14 कॉलोनी में 3 दिनों के लिए उगाया 1% tryptone, 1% आगर । (ख) एक पी synxantha कॉलोनी में बंधे कांगो लाल के प्रतिदीप्ति एक डाई युक्त माध्यम पर 5 दिनों के लिए उगाया । (ग) प्रतिदीप्ति के Wisteria floribunda लेक्टिन दाग के लिए पॅल polysaccharide में एक पी. aeruginosa PA14 Δphz कॉलोनी (1% tryptone पर 2 दिनों के लिए उगाया जाता है, 1% कांगो लाल और Coomassie नीले रंग से युक्त आगर), अनुभाग के बाद लागू होता है । (घ) एक पी. aeruginosa PA14 Δphz कॉलोनी के उनि छवि (1% tryptone पर 3 दिनों के लिए उगाया, 1% कांगो लाल और Coomassie ब्लू युक्त आगर), और तेल embedding * के माध्यम से अनुभाग के लिए कार्रवाई की । स्केल बार 40 µm (A-B), 20 µm (C), और 5 µm (D) का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

* इस नमूने को आयल के माध्यम से खोदी जा रही थी-इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल के 4 कदम के माध्यम से embedding, कदम 4.1-4.3 छोड़, और फिर उनि विश्लेषण के लिए अलग से संसाधित ।

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Discussion

आयल-embedding और पतली-खंड ऊतक के नमूने एक क्लासिक ऊतकवैज्ञानिक तकनीक है कि सूक्ष्म रूपात्मक संरचनाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है और सामांयतः eukaryotic ऊतकों पर प्रयोग किया जाता है, और माइक्रोबियल नमूनों को कुछ सफलता के साथ लागू किया गया है8 ,9. जबकि cryoembedding अंतर्जात और immunofluorescent संकेत के मजबूत प्रतिधारण के लिए अनुमति देता है, तेल embedding आम तौर पर बेहतर है के रूप में यह आकृति विज्ञान16का अच्छा संरक्षण प्रदान करता है । माइक्रोबियल जैविक फिल्म के लिए आवेदन के लिए इस विधि के अनुकूल में, हम विशेषताओं है कि हमारी प्रणाली के लिए अद्वितीय है पर ध्यान केंद्रित किया । कोशिकाओं और ऊतकों के मैट्रिक्स अक्सर एक साथ अपेक्षाकृत मजबूती से आयोजित कर रहे हैं, जबकि फिल्म के लिए और अधिक नाजुक हो जाते हैं; हम इसलिए अनुकूलित नियमित निर्धारण और मोम embedding प्रोटोकॉल नमूना प्रतिधारण को अधिकतम करने के लिए । अपने विकास सब्सट्रेट पर नमूना बनाए रखने और तत्काल निर्धारण करने से पहले आगार के साथ कॉलोनी ओवरले सुनिश्चित करता है कि नमूना शीर्ष या आधार से खो नहीं है । हालांकि, बहुत गर्म है कि आगार के साथ कालोनियों ओवरले कालोनियों को नुकसान पहुंचा सकता है, तो अतिरिक्त देखभाल इस कदम के दौरान लिया जाना चाहिए ।

निर्धारण कठोर निर्जलीकरण के माध्यम से संरचना बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, समाशोधन, और घुसपैठ तेल embedding के लिए आवश्यक कदम । हमने पाया है कि lysine-formaldehyde निर्धारण सर्वश्रेष्ठ नमूना की अखंडता को बरकरार रखता है । घुलनशील lysine, एक डायमाइन, क्रॉस-लिंक्ड पॉलिमर बनाने के लिए aldehydes के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और यांत्रिक क्षरण के खिलाफ exopolymeric पदार्थ (ईपीएस) को सुदृढ़ करने का प्रस्ताव किया गया है17,18.

हमने देखा है कि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संतरे का तेल आधारित समाशोधन एजेंट, या लंबे समय तक जोखिम के माध्यम से, नमूना निर्जलीकरण (चरण 9.3) के दौरान में उत्तराधिकारी बहाकर के साथ कम हो जाती है । पर समाशोधन एजेंट के साथ इलाज कर सकते हैं, तथापि, भंगुर नमूनों कि धारा19के लिए मुश्किल है में परिणाम । यह प्रत्येक निर्जलीकरण के दौरान मौजूद मोम की मात्रा को प्रतिबिंबित करने के लिए मात्रा या बहाकर की संख्या को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । बढ़ी हुई पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति इसी तरह ऊतक प्रसंस्करण रिएजेंट के संदूषण से पैदा कर सकते हैं, जहां मोम, जो थोड़ा फ्लोरोसेंट है, या तो पूरी तरह से या आंशिक रूप से समाशोधन विलायक या इन चरणों में इस्तेमाल इथेनॉल में मिश्रणीय है (कदम 6.1-6.4). इसके अतिरिक्त, हमने पाया है कि इथेनॉल रिपोर्टर संकेत घटता है, और यह फिर से महत्वपूर्ण है कि पंजाब के दो बहाकर में fluorophore (9.5-9.6 कदम) से पहले का गठन ।

इस विधि भी गठन और प्रमोटर के स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है-कोशिकाओं के संकल्प पर संचालित प्रतिदीप्ति । हालांकि, हम सावधानी जब इस विधि का उपयोग जीन अभिव्यक्ति की व्याख्या करने के लिए सलाह । उपरिशाई कदम इस प्रोटोकॉल (4.2 कदम) में शुरू की, निर्धारण से पहले लागू 50 ˚ सी, प्रारंभिक विकास की स्थिति है कि जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को प्रभावित कर सकते है के सापेक्ष काफी पर्यावरणीय परिवर्तन प्रस्तुत करता है । यह सीधे कॉलोनी के लिए निर्धारण लागू करने से अभिव्यक्ति पैटर्न सत्यापित करने के लिए उपयोगी हो सकता है, तुरंत ओवरले डालने से पहले, लेकिन आकृति विज्ञान के लिए एक लागत पर (वैकल्पिक कदम 3.1-3.3).

एक अंय पहलू प्रतिदीप्ति की व्याख्या को प्रभावित करने की धारा की स्थलाकृति ही है । फिल्म के विभिंन क्षेत्रों संरचनात्मक अखंडता की डिग्री बदलती है और अधिक या कम निर्धारण के माध्यम से संरक्षण के लिए उत्तरदाई हो सकता है, जिसके आधार पर, यदि कोई हो, कार्यात्मक समूहों उन घटकों को निर्धारण पार से जोड़ने में योगदान कर सकते है 20. एक परिणाम के रूप में, वर्गों बायोमास कम अनुभाग सतह से जब एक रूपात्मक या चयापचय क्षेत्र से एक और है कॉलोनी जेड धुरी के साथ संक्रमण हो सकता है । यह इमेजिंग द्वारा संबोधित किया जा सकता है एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अनुभाग का एक अक्षुण्ण फोकल टुकड़ा ।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर उपभेदों के लिए इस तकनीक को लागू करने के अलावा, हम संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा micromorphological सुविधाओं की जांच की है और में फिल्म के नमूने विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों के साथ सना हुआ (चित्र 3 ए ). Jennings एट अल. हाल ही में एक पॅल के लिए विशिष्ट डाई, प्रमुख पी aeruginosa PA14 के द्वारा उत्पादित polysaccharide 21फिल्म का वर्णन किया । के रूप में प्रोटोकॉल और ऊपर प्रतिनिधि परिणाम में वर्णित है, वर्गों के लिए इस डाई के आवेदन उच्च संकल्प (चित्रा3 सी) में PA14 कॉलोनी में पॅल वितरण के दृश्य के लिए अनुमति देता है । इसके विपरीत, इस तरह कांगो लाल के रूप में फ्लोरोसेंट रंजक विकास के माध्यम से जोड़ा जा सकता है और छवि पोस्ट (चित्र बी) के बाद खोदी । एक ओवरले के आवेदन भी उनि (चित्रा 3 डी) के लिए प्रसंस्करण भर में कॉलोनी के साथ फिल्म आकृति विज्ञान और सेल संरचना को बरकरार रखता है ।

अनुकूलित विधि यहां बताया आयल embedding, जिसमें अंतर्जात संकेत और सुविधाओं या जटिल रंजक के माध्यम से अनुभाग के लिए कॉलोनी की तैयारी में सक्षम बनाता है बेहतर संकल्प के साथ vivo में स्थानीयकृत हो सकता है, जबकि नमूना ंयूनतम हानि और देशी कॉलोनी स्थूल संरक्षण-और सूक्ष्म morphologies । हम स्वीकार करते है कि पर्याप्त प्रयास, समय और एजेंट का उपयोग इस विधि के लिए आवश्यक हैं । हालांकि, हमें लगता है कि इन कमियों रूपात्मक संरक्षण की डिग्री के द्वारा काउंटर कर रहे हैं, सीटू प्रतिदीप्ति में के संकल्प, और सुविधा पूर्व और बाद-धुंधला प्रक्रियाओं या वैकल्पिक प्रसंस्करण रणनीतियों के लिए (जैसे की तैयारी के लिए उनि) ने इस तकनीक को वहन किया.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

इस कार्य को NSF कैरियर अवार्ड १५५३०२३ और NIH/NIAID अवार्ड R01AI103369 द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

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References

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