Incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos colônia para análise microscópica

Immunology and Infection

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Summary

Descrevemos a fixação, incorporação de parafina e técnicas de corte finas para biofilmes microbianos de colônia. Em amostras preparadas, padrões de expressão de subestrutura e repórter de biofilme podem ser visualizados por microscopia.

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Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

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Abstract

Corte através de incorporação de parafina é uma técnica amplamente estabelecida em sistemas eukaryotic. Aqui nós fornecemos um método para a fixação, incorporação e corte de biofilmes intactos colônia microbiana usando cera de parafina perfundida. Para adaptar esse método para uso em biofilmes de colônia, desenvolveu técnicas para a manutenção de cada amostra no seu substrato de crescimento e estratificação-lo com uma sobrecamada de agar e adicionado lisina para a solução de fixador. Essas otimizações melhoram a retenção de amostra e preservação de recursos recorrendo. Amostras preparadas desta maneira são passíveis de fino seccionamento e por microscopia de luz, fluorescência e transmissão de imagem. Nós aplicamos esta técnica a colônia de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilise Vibrio cholerae. O elevado nível de detalhe visível nas amostras geradas por esse método, combinado com a estirpe de repórter engenharia ou a utilização de corantes específicos, pode fornecer insights emocionantes sobre a fisiologia e o desenvolvimento de comunidades microbianas.

Introduction

A maioria dos micróbios têm a capacidade de forma de biofilmes, comunidades de células realizaram em conjunto pelas matrizes de produção própria. Biofilmes podem ser cultivadas em muitos tipos de configurações físicas, com diferentes regimes de fornecimento de nutrientes e substrato. Ensaios específicos para a formação de biofilme tendem a produzir estruturas multicelulares reprodutíveis e arquiteturas comuns são observadas para espécies filogeneticamente diversos no nível macroscópico ou comunidade. Quando os micróbios são crescidos como colônias em meio sólido sob uma atmosfera, morfologia macroscópica transmite informações sobre a capacidade de produção de matriz e muitas vezes se correlaciona com outros traços 1,2,3. A arquitetura interna das colónias microbianas também pode fornecer pistas sobre biofilme específico química e fisiologia, mas tem sido difícil de caracterizar. Recentes aplicações de técnicas de cryoembedding e cryosectioning de colônias bacterianas permitiram imaging e visualização de características específicas na resolução sem precedentes 4,5,6. No entanto, estudos com tecido animal mostraram que parafina incorporação fornece superior preservação da morfologia quando comparado com o cryoembedding 7 e tem sido usado para visualizar as bactérias em tecidos 8,9. Portanto, nós desenvolvemos um protocolo para fixação, incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos de colônia. Aqui, iremos descrever a preparação de Pseudomonas aeruginosa PA14 colônia-biofilme seções finas 10,11, mas temos aplicado também com sucesso esta técnica de biofilmes formados pelas bactérias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, e Vibrio cholerae12.

O processo de incorporação de parafina e fino-corte biofilmes segue uma lógica simples. Primeiro, os biofilmes são encerradas em uma camada de ágar para preservar a morfologia durante o processamento. Em segundo lugar, os biofilmes envolto estão submersas no fixador a macromoléculas crosslink e preservar a micromorfologia. Estes são então desidratados com álcool, limpo com um solvente apolar mais e em seguida infiltradas com cera de parafina líquida. Uma vez que se infiltrou, as amostras são incorporadas em blocos de cera para corte. Seções são cortadas, montadas em lâminas e depois reidratadas para devolvê-los para um estado mais nativo. A partir deste ponto, podem ser manchadas ou cobertos de meio de montagem para análise microscópica.

Este protocolo produz seções finas de biofilmes microbianos apropriados para análise histológica. Subestruturas de biofilme colônia são visíveis quando seções finas preparadas usando este método são imaginadas por microscopia de luz. Biofilmes também podem ser cultivadas em manchas de fluorescente contendo mídia específica para recursos individuais ou manchados na etapa de reidratação, imediatamente antes da montagem (etapas 9.5-9,6). Finalmente, os micróbios podem ser projetados para produzir proteínas fluorescentes de maneira constitutiva ou regulamentado permitindo em situ relatórios de célula distribuição ou gene expressão dentro dessas comunidades. Usamos esses métodos para determinar a profundidade de biofilme de colônia, distribuição de célula, distribuição da matriz, os padrões de crescimento e expressão gênica spatiotemporal.

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Protocol

1. crescimento de Pseudomonas aeruginosa biofilmes de colônia

  1. Preparação de placas de médio-BICAMADA
    1. Preparar um triptona 10 g/L, o ágar de 10 g/L (veja a Tabela de materiais) solução em água desionizada.
    2. Autoclave de 20 min. esfriar até 50-60 ° C em banho-maria.
    3. Despeje a 45 mL da solução de ágar triptona em um prato quadrado 100 mm x 100 mm (ver Tabela de materiais) usando um tubo cónico de 50 mL. Permitir que o ágar solidificar (~ 20-30 min). Despeje uma camada em segundo lugar, 15 mL em cima da primeira camada. Deixe solidificar durante a noite, removendo a condensação de tampas se necessário esfregando com um pano livre de fiapos.
  2. Mancha de biofilmes de colônia
    1. Marcam as cepas de interesse dos estoques do congelador para LB ágar placas13 e incubar no escuro para 12-16 h a 37 ° C e 80-100% de umidade relativa.
    2. Para cada estirpe ou replicar, use uma única colônia para inocular 2 mL de LB e incubar no escuro para 12-16 h a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
    3. Subcultura por diluição 1: 100 em fresco LB e incubação no escuro para 2,5-3 h a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
    4. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro e ajustar com LB estéril para conseguir uma suspensão de células com uma OD500 nm de ~ 0,5.
    5. Dependendo da colônia desejada tamanho, Pipetar 2,5-10 µ l de suspensão de células em uma placa de médio-BICAMADA (preparada na etapa 1.1) e permitir que o local para secar por ~ 20 min. deixar a tampa petri aberta perto de chamas pode facilitar a secagem.
    6. Incube a ponto colônias em 25 ° C e 80-100% umidade relativa, no escuro por até 4 dias.

2. preparação da solução de fixador

  1. Prepare a solução de fixador no dia da colheita da amostra. Diluir o formol 37% (FA) em PBS 1x para uma concentração final de 4% FA.
    Cuidado: FA é volátil e tóxico. Utilize equipamento de protecção e trabalhar em uma coifa bem ventilada.
  2. Imediatamente antes do uso, dissolver cloridrato de L-lisina em 4% FA (preparado no passo 2.1) à temperatura ambiente a uma concentração final de 50 mM L-lisina HCl.

3. direcionar a aplicação do fixador para o biofilme de Colônia [opcional]

Nota: Achamos que morfologia de biofilme é melhor preservada durante a gelose é adicionada antes da fixação. No entanto, esta etapa constitui também uma mudança nas condições ambientais que podem afetar a expressão do gene. Padrões de expressão repórter fluorescente, portanto, devem ser verificados usando um protocolo separado no qual é realizada a etapa de fixação antes da adição da gelose, conforme descrito aqui.

  1. No dia da fixação e trabalhando em uma coifa ventilada, pipete o fixador preparado no passo 2, diretamente para a superfície de ágar em torno da borda da colônia, permitindo-lhe alcançar a periferia da colônia sem submergindo-lo. Aplicam-se somente como muito fixador como é necessário para totalmente cercam a colônia, aproximadamente 500 µ l. permitem que o fixador para a colônia e o ágar circundante se espalham.
  2. Uma vez que o fixador foi completamente absorvido pela colônia e mídia circundante, cerca de 20-30 min, e FA residual não é mais visível na placa, repita o passo 3.1. Permitir que este fixador para a colônia e o ágar circundante se espalham.
  3. Uma vez que o fixador foi completamente absorvido pela colônia e mídia circundante repita o passo 3.1, desta vez aplicando o fixador à superfície da colônia diretamente. Permitir que este fixador para a colônia e o ágar circundante se espalham, avançar para o passo 4 só afinal fixador tenha sido absorvido e não é mais visível na placa.

4. sobreposição colônias com ágar

  1. No dia da fixação, prepare um 10 g/L solução de ágar em água desionizada e autoclave para 10-20 minutos para dissolver. Resfriar em um banho de 50 ˚ c.
  2. Delicadamente, despeje 15 mL da solução de ágar sobre o meio de crescimento e colônia. Permitir que o agar para formar um gel à temperatura ambiente por 5 min (figura 1B).
  3. Use uma lâmina afiada para cortar um quadrado, 3 camadas de chuck com a colônia laminada entre as duas camadas superiores. Se preparar amostras múltiplas, certifique-se de que cada chuck corta-se um tamanho comparável.
  4. Suavemente retire o chuck colônia contendo agar em excesso.
  5. Para levantar as duas camadas superiores de ágar-ágar (contendo a colônia) longe da camada inferior do mandril (Figura 1), molhar a cabeça plana de uma espátula em 1X PBS ou água e introduza delicadamente entre as camadas superior e inferior. A colônia laminada deve separar a camada inferior. Tenha cuidado para não distorcer ou dobrar a colônia laminada quando levantá-lo de sua base.

5. fixação

  1. Trabalhando em uma boa ventilação exaustora, imediatamente transferir a colônia laminada (ou seja, 2-camada chuck) dentro de um estojo de encastre (ver Tabela de materiais), rotulado com uma caneta resistente a produtos químicos. Coloque a fita de incorporação em um mailer de slide de vidro (veja a tabela de materiais) contendo o fixador preparado em passos 2.1-2.2. Certifique-se que há nenhuma bolha de ar presa dentro da gaveta de encastre.
  2. Incube a amostra no fixador durante a noite, no escuro à temperatura ambiente.

6. amostra processamento: Wash Buffer, desidratação, clareira e infiltração

  1. Após a fixação durante a noite, lave a amostra duas vezes em PBS 1x por 1h cada. Para melhores resultados, automatizar a homogeneização de reagente usando o spin função de um processador automático de tecidos (ver tabela de materiais) definido para uma configuração baixa. Se o processador não está disponível, processamento pode ser executado manualmente.
  2. Siga a tampão de lavagem pela desidratação através de uma série graduada de diluições de etanol (EtOH) em PBS 1x (25%, 50%, 70%, 95%) por 1 hora em temperatura ambiente.
  3. Desidrata-se em três lavagens de 100% EtOH para 1 h à temperatura ambiente.
  4. Limpar a amostra desidratada em três lavagens de agente laranja clareira à base de óleo de 100% (ver tabela de materiais) para 1 h à temperatura ambiente.
  5. Infiltrar a amostra limpa duas vezes com parafina derretida de cera (ver Tabela de materiais), aquecido a 55˚C, de 2h cada.

7. amostra incorporação

  1. Encha um molde de cera com cera de parafina derretida, aquecida a 55 ˚ c. Use uma espátula aquecida, plana para transferir o chuck infiltrado da gaveta a incorporação em molde de cera, garantindo que o chuck repousa paralelo à base do molde. Evite aplicar pressão excessiva sobre o chuck. Moldes de cera podem ser 3D personalizado imprimido, ou estão comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
  2. Permitir que a cera solidificar durante a noite a 4 ˚ c. Amostras moldadas em cera sólida podem ser armazenadas indefinidamente no 4 ˚ c.
  3. Uma vez que a cera tem solidificado, excisar a amostra do molde e aparar a cera em excesso ao redor da amostra com uma lâmina de barbear. Deixe a cera em excesso, estendendo-se desde uma extremidade da amostra, paralela ao plano de corte, que pode ser usada para fixá-lo no micrótomo (ver Tabela de materiais). Também deixar uma bainha de cera, de aproximadamente 1 mm de espessura, em torno da amostra e suavizar seus rostos.

8. corte

  1. Aqueça a banho-maria a 42 ˚ c. Fixar a amostra no micrótomo com a superfície da colônia orientada perpendicularmente à borda da lâmina (ver Tabela de materiais).
  2. Corte a amostra em intervalos de 50 µm até o avião desejado da colônia foi alcançado, do qual serão recolhidas as seções.
  3. Corte uma fita do número desejado de 10 µm espessura seções usando um micrótomo definido como uma velocidade de corte de 75-80 rpm e um ângulo de 6-10. Use um pincel de ponta fina para retirar a fita da lâmina.
  4. Usando uma gota de água na ponta de uma pipeta Pasteur (preferida) ou fórceps, gentilmente transferi a faixa de opções para o banho de água. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar captura sob a seção.
  5. Imediatamente inserir um slide para o banho de água e posicioná-lo abaixo da faixa de opções em um ângulo de 45º.
  6. Toca a borda estreita da faixa de opções para o slide, logo abaixo do rótulo fosco. A faixa de opções deve aderir.
  7. Puxe o slide sair do banho de água, ajustar o ângulo a ser perpendicular à superfície da água e permitindo que a faixa de opções deitado contra o deslizamento ao longo de seu comprimento. Evite prendendo o excesso de água abaixo da faixa de opções.
  8. Delicadamente se o slide em um tecido absorvente de fiapos, absorção de água em excesso da seção.
  9. Colocar o slide em uma toalha de papel e deixe-o secar à temperatura ambiente durante a noite, no escuro. Slides podem ser armazenados indefinidamente no 4 ˚ c no escuro.

9. calor-fixação, reidratação e montagem

  1. Aqueça uma chapa quente nivelada a 45 ˚ c. Calor do slide para 30-60 min. A cera se tornará semi-fundido e achatar contra o slide.
  2. Delicadamente Levante o slide da placa quente e colocá-lo horizontalmente sobre uma superfície lisa, nivelada, temperatura, usando cuidado para assegurar que a cera derretida não puxa para o outro lado do slide, até que a cera se solidifica (~ 1 min).
  3. Usando um mailer de slide de vidro, de cera slides em quatro lavagens de agente por 5 min cada, usando um aspirador de Büchner para remover a solução entre lavagens de limpeza.
  4. Lavar as lâminas três vezes em 100% EtOH por 1 min cada.
  5. Hidratar os slides em uma série graduada de etanol na ordem inversa de processamento (95%, 70%, 50% e 25%) por 1 min, que cada um seguido de duas lavagens 1-min em 1X PBS.
  6. Imediatamente, montar as seções em um meio de montagem de tampão Tris (ver Tabela de materiais) e uma lamela, evitando a introdução de bolhas de ar. Permitir que o meio de montagem polimerizar durante a noite em temperatura ambiente.
  7. Uma vez polimerizada, sele a lamela para o slide usando esmaltes claros. Selado de slides podem ser armazenados indefinidamente no escuro no 4 ˚ c.

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Representative Results

Este método gera o biofilme-cortes finos onde características morfológicas distintas e zonas de expressão gênica podem ser fotografadas por DIC, microscopia de fluorescência e TEM. Enquanto DIC imagem usando um 40 X objetivo de imersão de óleo pode ser suficiente para mostrar algumas características morfológicas (Figura 2E), encontramos essa fluorescência microscopia de cepas é projectado para proteína constitutivamente expressa fluorescente fornece avançado visualização da distribuição de célula dentro da amostra (Figura 2D). Imagens de seções individuais podem ser costuradas para gerar um corte transversal de toda a colônia (Figura 2B) e fornecer contexto para localização de características estruturais dentro a morfologia global a nível macroscópico (comparar Figura 2A, B e C). Características morfológicas e sinais fluorescentes podem ser medidos usando imagem software14. Estruturas dentro do biofilme ou transições entre as zonas de expressão gênica em seguida podem ser correlacionadas com as distribuições dos metabolitos ou gradientes químicos11 .

Este protocolo pode ser alterado e adaptado de várias maneiras. Uso de uma cepa de engenharia a proteína fluorescente expressa sob o controle de um promotor específico permite a visualização da distribuição de expressão gênica (Figura 3A). Colônias podem ser cultivadas em meio contendo corantes, ou corantes podem ser adicionados após seccionamento manchar polissacáridos específicos (figuras 3B e C). Finalmente, amostras preparadas em uma versão modificada do presente protocolo podem ser examinadas pela temperatura (Figura 3D) para permitir a visualização em maior resolução do que habilitado por DIC ou microscopia de fluorescência.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático mostrando a configuração para o crescimento da colônia antes da fixação.
(A) colônias são cultivadas em cima de duas camadas de meio de cultura ágar-solidificado (superior e inferior) e depois (B) são revestidas com uma camada adicional (sobreposição), que conserva a morfologia das colónias. (C) a colônia imprensada entre a sobreposição e a camada superior é então separada da camada inferior para processamento adicional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Características recorrendo e fluorescência YFP em secções transversais das colônias de parafina.
Dados representativos para a Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz colônia15 constitutivamente expressa YFP e cultivadas por 3 dias a triptona 1%, 1% de ágar contendo vermelho Congo e Coomassie azul. (A) vista superior, imagem de fluorescência mostrando metade de uma colônia antes da fixação. (B) seção transversal de toda a colônia após a incorporação de parafina. A área de box foi fotografada com um 10 X da lente objetiva (C). A área de box em (C) Então foi fotografada com um 40 X lente de objetiva de imersão de óleo usando fluorescência (D) e DIC (E). Barras de escala representam 2 mm (A), (B) de 500 µm e 100 µm (C-E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Expressão de repórter, pré e pós-coloração de funcionalidades biofilme e TEM imagens de amostras de biofilme colônia de parafina.
(A) mexGPr-GFP fluorescência de repórter em uma colônia de p. aeruginosa PA14 cultivada por 3 dias em triptona 1%, 1% de ágar. (B) fluorescência de vermelho de Congo acoplado em uma colônia de p. synxantha crescido durante 5 dias num meio contendo o corante. (C) fluorescência da mancha lectina floribunda Wisteria para Pel polysaccharide em uma p. aeruginosa PA14 Δphz colônia (cultivada por 2 dias em triptona 1%, 1% ágar contendo vermelho de Congo e Coomassie azul), aplicada após o corte. (D) imagem a temperatura de uma colônia dephz Δ PA14 p. aeruginosa (cultivada por 3 dias a triptona 1%, 1% de ágar contendo vermelho Congo e Coomassie azul) e processadas para secionar através de incorporação de parafina *. Barra de escala representa 40 µm (A-B), (C) de 20 µm e 5 µm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

* Esta amostra foi processada para secionar através de incorporação de parafina a etapa 4 do protocolo acima, omitindo etapas 4.1-4.3 e então processada separadamente para análise de temperatura.

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Discussion

Amostras de tecido parafina-incorporação e fino-corte é uma técnica histológica clássica que permite imagens de estruturas morfológicas-micro e é comumente usada em tecidos de eucariotas e aplicou-se com algum sucesso para amostras microbianas8 ,9. Enquanto cryoembedding permite forte retenção de sinal endógeno e imunofluorescência, incorporação de parafina é geralmente é preferível, pois proporciona melhor preservação da morfologia16. Em adaptar esse método para aplicação em biofilmes microbianos, enfocamos as características que são exclusivas de nosso sistema. A matriz dos tecidos e células são frequentemente mantidos juntos relativamente robusta, enquanto biofilmes tendem a ser mais delicada; Portanto, nós aperfeiçoamos rotina fixação e incorporação de protocolos para maximizar a retenção de amostra de cera. Manter a amostra em seu substrato de crescimento e sobrepondo a colônia com ágar imediatamente antes da fixação garante que a amostra não está perdida de topo ou base. No entanto, sobrepor colônias com ágar que está muito quente pode danificar as colônias, então cuidados extras devem ser tomados durante esta etapa.

A fixação é um passo crítico para reter a estrutura através da desidratação severa, limpando, e infiltração etapas necessárias para a incorporação de parafina. Encontramos que essa fixação de lisina-formaldeído melhor preserva a integridade da amostra. Lisina solúvel, uma diamina, pode reagir com aldeídos para formar polímeros reticulados e tem sido proposta para reforçar a substância exopolymeric (EPS) contra a degradação mecânica17,18.

Temos observado que a fluorescência de fundo diminui com lavagens sucessivas em laranja à base de óleo despachante, ou através de uma exposição prolongada, durante a reidratação de amostra (passo 9.3). Excesso de tratamento com o despachante pode, no entanto, resultar em amostras frágeis que são difíceis de secção19. Pode ser necessário ajustar o volume ou o número de lavagens para refletir a quantidade de cera presente durante cada reidratação. Fluorescência de aumento de plano de fundo da mesma forma pode surgir de contaminação do tecido processamento reagentes, onde a cera, que é um pouco autofluorescent, é totalmente ou parcialmente miscível no solvente de limpeza ou álcool etílico usado nestes passos (passos 6.1-6.4). Além disso, descobrimos que etanol diminui o sinal de repórter, e é essencial para reconstituir o fluoróforo em duas lavagens de PBS antes da montagem (etapa 9.5-9,6).

Este método também permite a localização de fluorescência constitutiva e orientado para o promotor na resolução das células. No entanto, aconselhamos cautela ao usar esse método para interpretar a expressão gênica. A etapa de sobreposição introduzida neste protocolo (passo 4.2), aplicados antes da fixação em 50 ˚ c, apresenta uma mudança ambiental considerável em relação as condições de crescimento inicial que possam influenciar os padrões de expressão do gene. Pode ser útil verificar os padrões de expressão aplicando fixador para a colônia diretamente, imediatamente antes de derramar a sobreposição, mas a um custo de morfologia (etapa opcional 3.1-3.3).

Outro fator que influencia a interpretação da fluorescência é a topografia da seção própria. Diferentes regiões do biofilme podem exibem diferentes graus de integridade estrutural e ser mais ou menos receptiva a preservação através de fixação, dependendo de que, se for o caso, grupos funcionais esses componentes são capazes de contribuir para o cross-linking fixador 20. como resultado, as seções podem perder biomassa desproporcionalmente da superfície da seção ao fazer a transição de uma zona de morfológica ou metabólica para outro ao longo do eixo z da colônia. Isto pode ser dirigido por uma fatia de focal intacta da seção de imagem com um microscópio confocal.

Além de aplicar esta técnica para as cepas de engenharia de proteínas fluorescentes expresso, examinamos características recorrendo por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e em amostras de biofilme coradas com corantes fluorescentes específicos (Figura 3A ). Et al . Jennings recentemente descreveu um corante específico para Pel, o principal polissacarídeo produzido por p. aeruginosa PA14 biofilmes 21. Conforme descrito nos resultados do protocolo e representante acima, aplicação desta tintura para seções permite a visualização da distribuição de Pel em biofilmes de colônia PA14 em alta resolução (Figura 3) 3. Por outro lado, corantes fluorescentes, como o vermelho de Congo podem ser adicionados ao meio de crescimento e cuja imagem pós-corte (Figura 3B). O pedido de uma sobreposição também preserva a colônia biofilme morfologia celular estrutura e durante todo o processamento de temperatura (Figura 3D).

O método otimizado aqui descrito permite a elaboração de biofilmes de colônia para seccionamento através de incorporação de parafina, onde sinal endógeno e características ou complexados corantes podem ser localizadas na vivo com resolução superior minimizando a amostra perda e preservando nativo colônia macroe micromorfologias. Reconhecemos que uso substancial de esforço, tempo e reagente são necessárias para este método. No entanto, sentimos que essas desvantagens são contrariadas pelo grau de preservação morfológica, a resolução da fluorescência em situ e a acessibilidade para procedimentos pré e pós-coloração ou estratégias de processamento alternativo (como preparação para TEM) proporcionada por esta técnica.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela NSF carreira prêmio 1553023 e prêmio NIH/NIAID R01AI103369.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

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References

  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51, (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4, (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195, (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81, (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. 171538 (2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186, (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321, (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68, (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33, (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290, (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (36), 11353-11358 (2015).

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