تتبع السلوك المورفولوجية اليرقات في الاستجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك الخلايا العصبية حاسة الشم

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ويحلل هذا البروتوكول السلوك الملاحية ليرقة المورفولوجية استجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك المتزامنة في الخلايا العصبية حاسة الشم. ضوء الطول الموجي نانومتر 630 يستخدم لتنشيط الخلايا العصبية حاسة الشم الفردية معربا عن رودوبسين قناة إزاحة الأحمر. تنقل اليرقات يتم تعقبها في نفس الوقت، سجلت رقمياً، وتحليلها باستخدام برنامج مخصص مكتوب.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Clark, D. A., Kohler, D., Mathis, A., Slankster, E., Kafle, S., Odell, S. R., et al. Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57353, doi:10.3791/57353 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتستند قدرة الحشرات على الانتقال نحو مصادر رائحة أنشطة تلك الخلايا العصبية مستقبلات الشم الدرجة الأولى (أورنس). بينما تم إنشاؤها قدرا كبيرا من المعلومات فيما يتعلق بالردود اورن إلى أودورانتس، يظل دور ORNs محددة في قيادة الاستجابات السلوكية غير مفهومة. تنشأ مضاعفات في تحليل السلوك بسبب التقلبات المختلفة من أودورانتس أن تنشيط الفردية أورنس، أورنس متعددة تنشيط أودورانتس واحد، والصعوبة في تكرار الملاحظة بطبيعة الحال التغيرات الزمنية في حاسة الشم المحفزات استخدام طرق الإيصال رائحة التقليدية في المختبر. هنا، يمكننا وصف بروتوكول الذي يحلل السلوك المورفولوجية اليرقات في الاستجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك المتزامن لما أورنس. أوبتوجينيتيك التكنولوجيا المستخدمة هنا يسمح لخصوصية اورن التنشيط ومراقبة دقيقة للأنماط الزمانية للتنشيط اورن. يتم تعقب حركة اليرقات المقابلة والمسجلة رقمياً وتحليلها باستخدام مخصص كتابة البرمجيات. باستبدال المحفزات رائحة بالمنبهات الخفيفة، يسمح هذا الأسلوب لعنصر تحكم أكثر دقة من فرادى اورن التنشيط من أجل دراسة تأثيرها على سلوك اليرقات. ويمكن تمديد أسلوبنا كذلك دراسة أثر إسقاط الدرجة الثانية من الخلايا العصبية (السندات الإذنية) فضلا عن الخلايا العصبية المحلية (لنس) في سلوك اليرقات. وبالتالي سيمكن هذا الأسلوب تشريح شاملة لوظيفة دائرة حاسة الشم وتكملة الدراسات المتعلقة بحاسة الشم كيف العصبية أنشطة ترجمة في إلى استجابات السلوك.

Introduction

هو لمست حاسة الشم من المعلومات في بيئة المورفولوجية ليرقة قبل 21 فقط ORNs المتميزة وظيفيا، الأنشطة التي تحدد في نهاية المطاف سلوك اليرقات1،2،،من34. ومع ذلك، المعروف قليل نسبيا عن المنطق الذي يتم ترميز المعلومات الحسية في أنشطة هذه أورنس 21. ومن ثم هناك حاجة تجريبيا قياس المساهمات الفنية لكل اورن اليرقات للسلوك.

ورغم أن درست الشخصية الاستجابة الحسية المورفولوجية اليرقات ORNs مرجع كامل في التفصيل1،4،5، المساهمات المقدمة أورنس الفردية على حلبة حاسة الشم وبالتالي السلوك الملاحية لا تزال مجهولة إلى حد كبير. تنشأ صعوبات في دراسات سلوك اليرقات، حتى الآن، بسبب عدم القدرة على تنشيط مكانياً وزمنياً أورنس واحد. وكان فريق أودورانتس التي تنشط على وجه التحديد 19 21 المورفولوجية اليرقات ORNs مؤخرا وصف1. كل الرائحة في الفريق، في تركيزات منخفضة، يتسبب استجابة فسيولوجية فقط من اورن المشابهة لها. ومع ذلك، يتسبب كل الرائحة في تركيزات أعلى التي تستخدم عادة لفحوصات السلوك التقليدية، الاستجابات الفسيولوجية من عدة أورنس1،،من56. علاوة على ذلك، فقد تنوعت odorants في هذا الفريق التقلبات أن تعقيد التفسير لدراسات السلوك التي تعتمد على تشكيل من رائحة مستقرة التدرجات7،8. أخيرا، وبطبيعة الحال قد تحدث رائحة المحفزات مكون الزمانية التي من الصعب تكرار الظروف المختبرية. ولذلك من المهم وضع طريقة التي يمكن قياس سلوك اليرقات أثناء تنشيط ORNs الفردية في نفس الوقت بطريقة المكانية والزمانية.

هنا، علينا أن نظهر فحوصات أسلوب يحتوي على مزايا أكثر من تعقب اليرقات هو موضح سابقا1،8. والرزن تتبع الموصوفة في جيرشوو et al. تستخدم صمامات التحكم الإلكتروني للمحافظة على تدرج مستقرة من رائحة في الساحة السلوك8. ومع ذلك، نظراً لمستوى الهندسية المعقدة المعنية لبناء برنامج الإعداد التحفيز رائحة، هذا الأسلوب صعبة للنسخ المتماثل في مختبرات أخرى. علاوة على ذلك، لم تحسم المسائل المتصلة باستخدام أودورانتس لتنشيط أورنس واحد على وجه التحديد. مقايسة تتبع الموصوفة في ماثيو et al. يستخدم نظام إيصال رائحة أبسط، ولكن التدرج رائحة الناتجة تعتمد على التقلب في اختبار الرائحة وغير مستقرة لفترات طويلة من الفحص1. وهكذا، باستبدال المحفزات رائحة بالمنبهات الخفيفة، لدينا أسلوب مزايا خصوصية ودقة السيطرة الزمنية لتفعيل اورن ولا تعتمد على تشكيل من رائحة التدرجات من مختلف نقاط القوة.

لدينا طريقة سهلة لإعداد والمناسبة للباحثين المهتمين في قياس جوانب الملاحة المورفولوجية اليرقات. هذا الأسلوب يمكن تكييفه للنظم النموذجية الأخرى شريطة أن يكون قادراً على التعبير عن كشريمسون في neuron(s) نظامهم المفضل لاختيار محرك الباحث. كشريمسون صيغة تحول الأحمر من رهودوبسن القناة. يتم تنشيطه عند أطوال موجية التي غير مرئية لنظام فوتوتاكسيس لليرقة. ولذلك نحن قادرة على التلاعب بنشاط الخلايا العصبية مع خصوصية، والموثوقية، وإمكانية تكرار نتائج9. عن طريق تعديل مخصص كتابة البرامج لحساب حجم التغييرات من الموضوعات، هذا الأسلوب يمكن بسهولة تكييف لزحف اليرقات من أنواع الحشرات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-بناء ساحة سلوك وإعداد الأجهزة لتمكين أوبتوجينيتيك في التحفيز على الساحة السلوك

  1. لبناء ساحة سلوك المحرومين من الضوء، إنشاء مربع مع بعدا من 89 × 61 × 66 سم3 (35 "L x 24 بوصة W x 26" ح) مصنوعة من ألواح اﻷكريليك شبكي اللون الأسود (3 مم) (انظر الجدول للمواد). ينبغي أن تكون المواد لبناء مثل مربع المتوفرة في المتاجر المحلية. وضع هذا المربع في أعلى جدول في غرفة السلوك (الشكل 1أ).
  2. جبل كاميرا USB 3.0 CCD أحادية اللون مزودة بمرشح نانومتر طويلة-تمرير 830 الأشعة تحت الحمراء وعدسة F1.4 ج-جبل 8 مم (انظر الجدول للمواد) إلى المركز للحد الأقصى للصندوق الأسود. شرائط مكان اثنين LED الأشعة تحت الحمراء (انظر الجدول للمواد) في أعلى الجدول بغية إلقاء الضوء على اليرقات في الساحة المظلمة (الشكل 1أ).
  3. لبناء منصة الصمام، الحصول على صفيحة ألومنيوم مربع 22 سم × 22 سم (يفضل أن يكون الرش رسمت مع انتهاء من أسود غير لامع للقضاء على أي أفكار). في وسط اللوحة، باستخدام قاطع معدنية، قطع حفرة كبيرة بما يكفي لتناسب حول الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر.
  4. وتغطي اللوحة المعدنية مع أضواء قطاع LED الحمراء (انظر الجدول للمواد). لحام أسلاك قطاع ضوء الصمام في سلسلة وتغذية قطاع الأسلاك إلى ترحيل optocoupler يسيطر عليها المعالج الصغرى 2B Pi التوت (انظر الجدول للمواد) (الشكل 1ب و 2).
  5. تثبيت وتكوين أوبونتو رفيقه/راسبيان جيسي/لينكس على أساس نظام التشغيل على المعالج Pi التوت قبل توصيل ترحيل أوبتوكوبلير إلى الشرائط الصمام. إرفاق إمدادات طاقة السلطة وشرائط LED وأوبتوكوبلير (الشكل 2) (انظر الجدول للمواد). جبل منهاج الصمام حول الكاميرا CCD (الشكل 1ب).
    ملاحظة: نظام التشغيل أوبونتو ماتي v16.04 متاحة بحرية. مجموعة بسيطة بيثون على أساس أوامر يمكن تكييفها بسهولة للبرنامج أنماط المنبهات الخفيفة الصمام (انظر ملف بناء جملة).
  6. ضمان الإشعاع متجانسة في نقاط مختلفة في مجال السلوك. قياس الإشعاع المطلقة على السطح في الساحة بمساعدة مطياف وتحديد أن يكون ~1.3 ث/م2 في جميع أنحاء سطح على الساحة.
    ملاحظة: في هذه الكثافة، كبير لم تلاحظ أي تغييرات في درجة الحرارة خلال التجارب. آخر دراسة10 المستخدمة الإشعاع أعلى من ~1.9 ث/م2 ولاحظ أي تغيير في درجة الحرارة خلال التجارب.

2-إعداد اليرقات المورفولوجية لتحليل السلوك

  1. الحفاظ على الذباب على الطعام يطير القياسية (انظر الجدول للمواد) في 25 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 50-60%، ودائرة ضوء/الظلام ح 12/12 ساعة.
  2. من أجل التعبير عن كشريمسون في زوج واحد من أورنس، عبور الإناث العذراء من خط UAS-الحبس-كشريمسون للذكور من خط أوركس-Gal4 ('X' يناظر واحد من مستقبلات الرائحة اليرقات 21 (أو) الجينات التي يتم التعبير عنها في شكل فريد في كل 21 زوجاً من أورنس)9،11.
    1. بدلاً من ذلك، من أجل التعبير عن كشريمسون في جميع أورنس اليرقات 21، عبر الإناث العذراء من UAS-الحبس-كشريمسون خط للذكور من خط أركو-Gal4 ('أركو' هو مستقبلات المشارك التي يتم التعبير عنها في جميع أورنس 21).
    2. استخدام خط UAS-الحبس-كشريمسون بحد ذاته كعنصر تحكم في هذه التجارب.
      ملاحظة: يطير الأرصدة المذكورة هنا كل ما هو متاح في مركز الأسهم المورفولوجية بلومينغتون (انظر الجدول للمواد).
  3. وبمجرد الذباب الذكور والإناث في صليب مسموح لتتزاوج وتضع البيض ح 48، نقل الكبار لقنينة جديدة.
    1. على سطح من القنينة الأغذية المحتوية على البيض، إضافة 400 ميليلتر من خليط يحتوي على السكروز 89 مم المذابة في الماء المقطر وميكرومتر 400 كل-ترانس الشبكية (ATR) الذي حل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
      ملاحظة: كمية صغيرة من السكروز يعزز تغذية اليرقات الحل أية تي آر. ATR مساعد المطلوب أوبريجولاتينج كشريمسون التعبير9،10. ATR حساسة للضوء.
    2. حالما تتم إضافة أية تي آر للقنينات الأغذية المحتوية على البيض، احتضان القنينات في الظلام ح 72 إضافية.
      ملاحظة: في حين لا لاحظت هذه الدراسة والدراسات اثنين أعلاه آثار على سلوك اليرقات بسبب التغذية ATR، ينصح السيطرة لآثار تغذية ATR بإخضاع بنود الاختبار لنفس المقدار من الخليط أعلاه التي لا تحتوي على أية تي آر.
  4. استخراج يرقات الطور الثالث (~ 120 ح بعد وضع البيض) من سطح الغذاء يطير العائمة لهم باستخدام حل سكروز عالية كثافة (15%). استخدام P1000 ميكروبيبيتي فصل اليرقات تطفو على سطح محلول السكروز في كوب زجاج 1000 مل.
  5. أغسل اليرقات 3 – 4 مرات خلال تبادل 800 مل ماء مقطر الطازجة في كوب الزجاج في كل مرة. تسمح اليرقات الراحة لمدة 10 دقائق قبل إخضاعها لتحليل السلوك.

3-السلوك بالانزيم

  1. الحفاظ على درجة الحرارة متسقة (بين 22-25 درجة مئوية) والرطوبة (بين 50 و 60% رطوبة نسبية) في الغرفة السلوك.
  2. إعداد متوسطة زحف اليرقات بصب 150 مل من ذاب [اغروس] (1.5 ٪) في ساحة 22 × 22 سم طبق بيتري. سكب طبق بيتري واحد لكل محاكمة للمقايسة، 8-10 تجارب كل تجربة. يسمح [اغروس] إلى ترسيخ وبارد ح 1 – 2 في أطباق بتري قبل استخدامها في تحليل السلوك.
    1. نقل أي أكثر من 20 يرقات الطور الثالث بريبيد إلى مركز طبق بتري (الشكل 1ج). تغطية صحن بيتري مع غطاء لها. ضع طبق بيتري في الساحة السلوك تحت الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر.
      ملاحظة: اعتماداً على التجربة، فحوصات السلوك عادة ما تنفذ لمدة 3 – 5 دقائق. إذا الرائحة يستخدم في المقايسة لتوفير إشارات التوجيه، قد لوحظ أن التدرج رائحة الناتجة عن ذلك لا تزال مستقرة ل مدة 5 دقائق تقريبا1. لا ينصح بوقت أطول للمقايسة. لا لوحظت آثار ضارة على اليرقات بسبب الجفاف أو التعرض المطول 630 نيوتن متر الضوء الأحمر داخل هذه النقاط الزمنية.
  3. بدوره على 850 الأشعة تحت الحمراء نانومتر الصمام مصدر الضوء لتصور اليرقات في شريط الفيديو. بدء تشغيل الكاميرا CCD لتسجيل حركة اليرقات.
  4. باستخدام البرمجيات المرتبطة بالمعالج Pi التوت، البرنامج الداخلي لإدارة الأنماط الملائمة لتحفيز الضوء الأحمر.
    ملاحظة: مجموعة بسيطة بيثون على أساس أوامر يمكن تكييفها بسهولة ببرنامج أنماط المنبهات الخفيفة الصمام (انظر ملف بناء جملة).

4-تجهيز البيانات وتحليلها

  1. استيراد الفيديو المسجلة لكل محاكمة في أي برنامج البرمجة المتاحة مثل Matlab.
  2. الحصول على إحداثيات س وص لكل يرقة في فيلم كدالة للزمن. استناداً إلى حدود تتبع البرمجيات، يمكن تعقب يرقات الطور الثالث 15 – 20 في1،فيلم واحد8.
    ملاحظة: يتم توفير مجموعة من رموز Matlab بسيطة ('تراكلارفا') التي يمكن تكييفها بسهولة لتناسب الظروف المناسبة (انظر ملف بناء جملة). هذا البرنامج يجمع بين جميع المحاكمات في تجربة ونواتج إحداثيات س وص كل يرقة لكامل مدة المقايسة (انظر بناء الجملة في التعليمات البرمجية أدناه). بشكل بديل، يمكن للمرء استخدام العديد من البرامج المستندة إلى المصدر المفتوح التي متاحة بحرية للباحثين. مثل 12من الجعبة (http://jaaba.sourceforge.net/).
  3. استخدام إحداثيات س وص يتم إنشاؤه لرسم مسارات اليرقات وكذلك تحليل تنقل اليرقات.
    1. لتحليل السلوك، استخدام إحصائيات الملاحية مثل السرعة، انحناء المسار، وعنوان زاوية، لتقسيم المسارات الفردية اليرقات إلى متواليات من يدير ويتحول بالتناوب.
    2. يتم تعريف يعمل كفترات مستمرة للتحرك إلى الأمام. يتحول منفصلة تدير المتعاقبة. يتم وضع علامة على تحول عندما تم إدخال تغييرات على مسار اتجاه زوايا > 45° (انظر ملف بناء جملة).
  4. حساب متوسط القيم لسرعة التشغيل، وتشغيل طول واتجاه التشغيل ومعلمات أخرى كما هو مطلوب.
    ملاحظة: يتم توفير مجموعة من بناء جملة بسيطة لاستخراج 'تشغيل' و 'إيقاف' من مسارات اليرقات (انظر ملف بناء جملة). بسيطة Matlab أو Excel استناداً إلى مهام يمكن تطبيقها على البيانات المستخرجة حساب القيم 'سرعة التشغيل'، 'تشغيل طول' إلخ.
  5. وتمثل البيانات لكل مقياس السلوكية كما يعني ± sem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وللتدليل على الطابع الخاص لتفعيل اورن، لدينا أسلوب كان تطبيقها بنجاح على تحديد الأثر المترتب على اثنين اورن المختلفة (ORN::7a & ORN::42a) التنشيط (ORNs معربا عن Or7a أو Or42a) في سلوك اليرقات (الشكل 3). يتسق مع دراسات حديثة هذا الفرد ORNs اليرقات هي متميزة وظيفيا1،،من1013، لدينا بيانات تمثيلية توضح أنه عندما كان تحفيز ORN::7a الإعراب عن كشريمسون من الضوء، كان هناك انخفاض ملحوظ في طول التشغيل مقارنة بمراقبة الحيوانات. على العكس من ذلك، عندما كان تحفيز ORN::42a الإعراب عن كشريمسون من الضوء، كان هناك زيادة كبيرة في طول التشغيل مقارنة بمراقبة الحيوانات (الشكل 3). تحليل البيانات الجماعية من ~ 100-120 تم الحصول على المسارات اليرقات من (n = 8) إجراء محاكمات لكل الوراثي. أشرطة الخطأ تمثل sem. بينما يصف لنا معلمة سلوك واحد فقط (طول التشغيل) هنا، نلاحظ أنه يمكن تحليل كل مسار اليرقات كذلك لحساب المعلمات للسرعة، انحناء المسار، وينحني الجسم،1،،من813 ،من 1415. معلمات أكثر تتصل باتجاهيه مثل عنوان زاوية ومدة تشغيل وتشغيل سرعة نحو وبعيدا عن روائح يمكن الحصول عليها إذا لم يتم توفير مصدر رائحة على جانب واحد من الساحة1،،من813.

لشرح طريقة لدينا القدرة على تغيير أنماط الزمانية للتنشيط اورن، نحن متنوعة لدينا الحافز للتناوب بين الأضواء وتشغيله. نحن تعرض اليرقات معربا عن UAS-كشريمسون في ORN::42a إلى ثلاثة أنماط الزمنية المختلفة من المنبهات الخفيفة أثناء فترة عن الأضواء (0.04 هرتز، 1 هرتز، وثابت). ثم قمنا بقياس التغيرات في المعايير السلوكية التي تحدث أثناء إيقاف الأضواء ← على المرحلة وخلال الأضواء على المرحلة OFF ←. ووجدنا أن مختلف أنماط التحفيز الخفيفة الزمانية ل ORN::42a، أثارت استجابات سلوكية مختلفة (الشكل 4). هذه التغييرات لم تراع في مراقبة اليرقات التي لا تعبر عن UAS-كشريمسون في أي أورنس. تسليط الضوء على هذه النتائج أهمية فهم أنماط الزماني كيفية تفعيل اورن تسهم في سلوك الحيوانات.

Figure 1
الشكل 1 : السلوك الساحة والمتوسطة زحف اليرقات. (أ) الأمامية عرض الساحة السلوك مربع أسود. الباب مفتوحاً للساحة يكشف كاميرا CCD أوقف من سقف المربع. (ب) يتم تحميل العرض أسفل منصة معدنية تحتوي على شرائط الضوء LED الحمراء المستخدمة للتحفيز أوبتوجينيتيك حول الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر. ((ج)) عرض أعلى من المتوسط زحف اليرقات المستخدمة في الفحص. قبل البدء بتسجيل حركة اليرقات، الطبقات ~ 20 يرقات غسلها تزرع على طول وسط 22 × 22 سم طبق بيتري مع 1.5% [اغروس]. ويوضع طبق بتري يحتوي على اليرقات في وسط الساحة تحت الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر، وبين الأشعة تحت الحمراء الصمام الخفيفة الشريطين التي يتم استخدامها كمصدر ضوء للكاميرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : إعداد أوبتوجينيتيكس- Infographic عرض الترتيب الإلكتروني للإعداد أوبتوجينيتيكس. باختصار، أدى ضوء (630 نيوتن متر) متصلة في سلسلة شرائط وأسلاك من الشرائط هي تغذي optocoupler متصل بمعالج 2B PI توت. الصمام الخفيفة الشرائط وأوبتوكوبلير هي مدعوم من إمدادات طاقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تأثير التنشيط الخفيفة من أورنس الفردية في سلوك اليرقات. تشغيل طول اليرقات معربا عن كشريمسون في ORN::7a و ORN::42a وتأثرت بطريقة مختلفة مقارنة بالسيطرة على اليرقات عند التنشيط الخفيفة. يمثل كل شريط متوسط ري ± ووزارة شؤون المرأة (n = 8). وكان طول التشغيل لليرقات عند تنشيط ORN::7a أقل بكثير من التحكم. وكان طول التشغيل لليرقات عند تنشيط ORN::42a أعلى بكثير من التحكم. تمثل الأشرطة يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 8، اختبار t الطالب؛ "*" ف < 0.05، "* *" ف < 0.001)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تأثير مختلف أنماط الزمانية للتنشيط اورن في سلوك اليرقات. (أ) ثلاثة أنماط الزمانية للمحفزات المستخدمة لتنشيط أورنس. ج: حافز ثابت 1 دقيقة الخفيفة خلال التحفيز باء: هرتز 0.04 التحفيز الخفيفة، حافزا c: 1 هرتز التحفيز الخفيفة خلال الفترة على الصمام في الدقيقة 2. (ب) تعرض اليرقات إلى ثلاثة أنماط مختلفة من المنبهات الخفيفة الموصوفة في ألف. ويمثل كل نقطة التغيير في سلوك اليرقات، تحت كل نمط من المنبهات الخفيفة، عندما يتم تبديل التنشيط الخفيفة من على إلى OFF. تغيير في 'تشغيل طول' (شارع تشغيل الطول (خارج)-شارع تشغيل الطول (على)) المرسومة على المحور س. تغيير في 'تشغيل سرعة' (شارع تشغيل سرعة (خارج)-شارع تشغيل السرعة (على)) المرسومة على المحور ص. الرسم البياني الأيسر (النقاط الرمادية) يمثل قياسات من مراقبة اليرقات والرسم البياني الصحيح (نقاط حمراء) القياسات من اليرقات معربا عن كشريمسون في ORN::42a. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Final Code PDF
ملف تكميلية لبناء الجملة: مجموعة من رموز Matlab بسيطة ('تراكلارفا') التي يمكن تكييفها بسهولة لتناسب ظروف ملائمة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف أسلوب يسمح لقياس سلوك اليرقات المورفولوجية استجابة للتنشيط أوبتوجينيتيك المتزامنة من الخلايا العصبية حاسة الشم. سبق وصف اليرقات تتبع أساليب1،8 استخدام تكنولوجيا التسليم رائحة مختلفة لتنشيط أورنس. ومع ذلك، يتعذر التحكم هذه الأساليب لخصوصية أو الأنماط الزمنية لتفعيل اورن. أسلوبنا ويتغلب على هذه العجوزات باستخدام المنبهات الخفيفة بدلاً من رائحة المحفزات لتحكم أكثر دقة لتفعيل اورن.

المواد اللازمة لبناء على الساحة السلوك يمكن الحصول عليها بسهولة في مخزن الجهاز المحلي، وتتطلب الحد الأدنى من الجهد في الجمعية. الإلكترونيات اللازمة لإعداد الوحدة النمطية أوبتوجينيتيكس أيضا متاحة بسهولة وشيدت. الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم الضوء الأحمر لتنشيط رودوبسين قناة إزاحة الأحمر (كشريمسون) المعرب عنها في الخلايا العصبية المحددة. يتم تسجيل سلوك اليرقات الناتجة عن ذلك استجابة للتنشيط اورن المقابلة باستخدام كاميرا CCD، وتقاس باستخدام البرمجيات المكتوبة المخصصة التي يتم توفيرها هنا. لدينا أسلوب يسمح للباحثين لطرح إجابات للعديد من الأسئلة التي لم تكن ممكنة من قبل: 1) ما هو تأثير أنماط مختلفة من التحفيز حاسة الشم على قدرة الحيوان على الانتقال نحو رائحة؟ 2) مماثلة لمركز على وقبالة مركز خلايا العقدة في الثدييات الشبكية16، هناك أورنس التي تلبي على وجه التحديد إلى انخفاض في حاسة الشم المنبهات بالإضافة إلى أورنس التي تستجيب لزيادة المحفزات حاسة الشم؟ وأخيراً، لدينا طريقة تصاريح مجموعة متنوعة من التطبيقات المستقبلية، بما في ذلك قياس الأثر للمتلقين للمعلومات من الخلايا العصبية في حلبة حاسة الشم (السندات الإذنية ولنس) تنقل اليرقات.

في حين أن هناك العديد من المزايا لأسلوبنا، نعترف بقيود معينة. من غير الواضح ما إذا كانت آثار تركيز لاحظ مع odorants يمكن يمكن تكرارها بسهولة استخدام هذا النظام. بينما لدينا الإعداد الحالي لا يسمح بذلك، يمكن بسهولة تعديل وحدة أوبتوجينيتيكس لاستيعاب الزيادة أو النقصان في كثافة الضوء الحافز. في المستقبل، ونحن سوف تحقق لمعرفة ما إذا كانت كثافة المتغيرة من التحفيز الخفيفة يحاكي آثار تركيز odorants. يمكن استخدام التقنيات الوراثية يطير البسيطة للتعبير عن كشريمسون في أما أزواج 21 كل من أورنس (باستخدام أركو-Gal4) أو في زوج واحد من أورنس (باستخدام الفردية أو-Gal4s). ومع ذلك، سيلزم الوراثة المعقدة للتعبير عن كشريمسون في 1 < n < 21 ' الخلايا العصبية. ونتيجة لهذا، فإنه سيكون من الصعب تكرار التأثيرات التي لوحظت مع رائحة الخلائط فيها مكونات فردية من الخليط الحصول على ردود من اورن واحد أو أكثر. على الرغم من أن سلوك الملاحية اليرقات يعتبر سلوكاً الأبعاد منخفضة، ونعترف أن لدينا برنامج تعقب اليرقات يمكن زيادة تحسين في المستقبل بالنظر في واصفات السلوكية إضافية استناداً إلى الموقف الحيوانية (مثلاً احتمالية رب يتحول، في هيئة الانحناءات إلخ)8،17. وكان دراستنا تنحصر في أول ترتيب الخلايا العصبية الحسية في اليرقة. مطلوب إجراء مزيد من التحقيقات قبل أن يمكن تطبيقها لدينا طريقة لإسقاط النظام الثانية من الخلايا العصبية والخلايا العصبية المحلية المضمنة في منطقة الفص الدماغ في الدماغ18.

وباختصار، لدينا أسلوب يوفر القدرة على تشريح ووظيفة كل اورن بسيطة، والمرونة في حلبة حاسة الشم من اليرقة المورفولوجية . بالقيام بذلك، سيمكن لنا طريقة وضع نماذج حسابية أكثر دقة تصف كيفية ترجمة الإشارات رائحة إلى نواتج سلوكية مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل بأموال بدء التشغيل من جامعة نيفادا، رينو، والتي نيجمس من "المعهد الوطني للصحة" تحت رقم المنحة P20 GM103650.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Video camera to capture larval movement
CCD Camera  Edmund Optics 106215
M52 to M55 Filter Thread Adapter Edmund Optics 59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses  Edmund Optics 59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass Filter Edmund Optics 46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2B RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supply newegg.com 9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relay amazon.com 6454319
630nm Quad-row LED strip lights environmentallights.com red3528-450-reel
850nm LED strips environmentallights.com wp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
Matlab Mathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04 Nubuntu https://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylic Home Depot MC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly food Genesee Scientific 66-112
Agarose powder Genesee Scientific 20-102
22cm X 22cm square petri-dish VWR Inc. 25382-327
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
All trans-retinal Sigma-Aldrich R2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center 55134
Orco-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 26818
Or42a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 9970
Or7a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 23907

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics