घ्राण न्यूरॉन्स की Optogenetic उत्तेजना के जवाब में ट्रैकिंग Drosophila लार्वा व्यवहार

Neuroscience

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Summary

यह प्रोटोकॉल इसके घ्राण न्यूरॉन्स के एक साथ optogenetic उत्तेजना के जवाब में Drosophila लार्वा के नौवहन व्यवहार का विश्लेषण करती है । 630 एनएम तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के लिए व्यक्तिगत घ्राण न्यूरॉन्स एक लाल-स्थानांतरित चैनल rhodopsin व्यक्त सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है । लार्वा आंदोलन एक साथ, ट्रैक डिजिटल दर्ज की है, और कस्टम-लिखा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया है ।

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Clark, D. A., Kohler, D., Mathis, A., Slankster, E., Kafle, S., Odell, S. R., Mathew, D. Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57353, doi:10.3791/57353 (2018).

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Abstract

गंध स्रोतों की ओर नेविगेट करने के लिए कीड़ों की क्षमता उनकी पहली आदेश घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) की गतिविधियों पर आधारित है. जबकि जानकारी का एक काफी मात्रा odorants को ORN प्रतिक्रियाओं के बारे में उत्पंन किया गया है, व्यवहार प्रतिक्रियाओं ड्राइविंग में विशिष्ट ORNs की भूमिका खराब समझ में रहता है । व्यवहार में जटिलताओं odorants के विभिन्न volatilities कि व्यक्तिगत ORNs सक्रिय करने के कारण उत्पन्न होती है, एकाधिक ORNs एकल odorants द्वारा सक्रिय है, और स्वाभाविक रूप से घ्राण उत्तेजनाओं में लौकिक रूपांतरों का उपयोग करते हुए नकल करने में कठिनाई पारंपरिक गंध-प्रयोगशाला में वितरण के तरीके । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि इसके ORNs के एक साथ optogenetic उत्तेजना के जवाब में Drosophila लार्वा व्यवहार का विश्लेषण करती है का वर्णन । optogenetic प्रौद्योगिकी यहां इस्तेमाल किया ORN सक्रियण और ORN सक्रियण के लौकिक पैटर्न के सटीक नियंत्रण की विशिष्टता के लिए अनुमति देता है । इसी लार्वा आंदोलन, ट्रैक डिजिटल दर्ज की है, और कस्टम लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया है । प्रकाश उत्तेजनाओं के साथ गंध उत्तेजनाओं की जगह से, इस विधि लार्वा व्यवहार पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के क्रम में व्यक्तिगत ORN सक्रियण के एक अधिक सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है । हमारी विधि को और भी लार्वा व्यवहार पर दूसरे क्रम के प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (पीएन) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्थानीय न्यूरॉन्स (LNs) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. इस विधि इस प्रकार घ्राण सर्किट समारोह के एक व्यापक विच्छेदन सक्षम और कैसे घ्राण ंयूरॉन गतिविधियों में अनुवाद के व्यवहार के जवाब पर अध्ययन पूरक होगा ।

Introduction

एक Drosophila लार्वा के वातावरण में घ्राण जानकारी केवल 21 कार्यात्मक विशिष्ट ORNs द्वारा महसूस किया जाता है, जो की गतिविधियों अंततः लार्वा व्यवहार1,2,3,4निर्धारित करते हैं । फिर भी, अपेक्षाकृत कम तर्क है जिसके द्वारा संवेदी जानकारी इन 21 ORNs की गतिविधियों में इनकोडिंग है के बारे में जाना जाता है । वहां इस प्रकार एक प्रयोग के लिए एक लार्वा ORN के कार्यात्मक योगदान को मापने की जरूरत है व्यवहार ।

हालांकि संवेदी प्रतिक्रिया Drosophila लार्वा ORNs के पूरे प्रदर्शनों की रूपरेखा विस्तार में अध्ययन किया गया है1,4,5, घ्राण सर्किट के लिए व्यक्तिगत ORNs के योगदान और इस तरह से करने के लिए नौवहन व्यवहार काफी हद तक अनजान रहते हैं । लार्वा व्यवहार अध्ययन में कठिनाइयों, अब तक, विशेष रूप से और अस्थाई एकल ORNs को सक्रिय करने के लिए अक्षमता के कारण पैदा होते हैं । odorants के एक पैनल कि विशेष रूप से सक्रिय 21 Drosophila लार्वा ORNs के 19 हाल ही में1वर्णित किया गया था । पैनल में प्रत्येक गंध, कम सांद्रता पर, केवल अपनी cognate ORN से एक शारीरिक प्रतिक्रिया बटोरता है । हालांकि, उच्च सांद्रता कि सामांय रूप से पारंपरिक व्यवहार परख के लिए प्रयोग किया जाता है पर, प्रत्येक गंध एकाधिक ORNs1,5,6से शारीरिक प्रतिक्रियाओं को दूर करता है । इसके अलावा, इस पैनल में odorants विभिंन volatilities कि व्यवहार अध्ययन है कि स्थिर गंध ढाल7,8के गठन पर निर्भर की व्याख्या जटिल है । अंत में, स्वाभाविक रूप से होने वाली गंध उत्तेजनाओं एक लौकिक घटक है कि प्रयोगशाला की स्थिति के तहत दोहराने के लिए मुश्किल है । यह इसलिए एक विधि है कि लार्वा व्यवहार उपाय कर सकते हैं, जबकि एक साथ एक स्थानिक और लौकिक तरीके से व्यक्तिगत ORNs को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यहां, हम एक विधि है कि पहले से अधिक वर्णित लाभ है प्रदर्शन परख1,8लार्वा ट्रैकिंग । ट्रैकिंग Gershow एट अल में वर्णित परख । इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित वाल्व का उपयोग करता है व्यवहार arena8में गंध के एक स्थिर ढाल बनाए रखने के लिए । हालांकि, परिसर में गंध उत्तेजना सेटअप बनाने के लिए शामिल इंजीनियरिंग के स्तर के कारण, इस विधि को अंय प्रयोगशालाओं में दोहराने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, विशेष रूप से एकल ORNs सक्रिय करने के लिए odorants का उपयोग करने से संबंधित मुद्दों अनसुलझे रह । ट्रैकिंग मैथ्यू एट अल में वर्णित परख । एक सरल गंध वितरण प्रणाली का उपयोग करता है, लेकिन परिणामस्वरूप गंध ढाल परीक्षण गंध की अस्थिरता पर निर्भर है और परख1की लंबी अवधि के लिए अस्थिर है । इस प्रकार, प्रकाश उत्तेजनाओं के साथ गंध उत्तेजनाओं की जगह से, हमारे विधि ORN सक्रियण के विशिष्टता और सटीक लौकिक नियंत्रण के लाभ है और विभिंन शक्तियों की गंध ढाल के गठन पर निर्भर नहीं है ।

हमारे विधि स्थापित करने के लिए आसान है और Drosophila लार्वा नेविगेशन के पहलुओं को मापने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है । इस तकनीक को अंय मॉडल प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि शोधकर्ता अपने पसंदीदा प्रणाली के ंयूरॉन (एस) में पसंद के CsChrimson की अभिव्यक्ति ड्राइव करने में सक्षम है । CsChrimson चैनल rhodopsin का एक लाल-खिसका हुआ संस्करण है । यह तरंग दैर्ध्य है कि लार्वा phototaxis प्रणाली के लिए अदृश्य कर रहे हैं पर सक्रिय है । इसलिए हम विशिष्टता, विश्वसनीयता के साथ न्यूरॉन्स की गतिविधि में हेरफेर करने में सक्षम हैं, और reproducibility9. विषयों के आकार में परिवर्तन के लिए खाते के लिए कस्टम लिखित सॉफ्टवेयर को संशोधित करके, इस विधि आसानी से अन्य कीट प्रजातियों के लार्वा रेंगने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. निर्माण एक व्यवहार क्षेत्र और हार्डवेयर की तैयारी व्यवहार क्षेत्र में Optogenetic उत्तेजना को सक्षम करने के लिए

  1. एक प्रकाश-वंचित व्यवहार के क्षेत्र का निर्माण, 89 x 61 x 66 cm3 (35 "एल x 24" डब्ल्यू एक्स 26 "एच) के एक आयाम के साथ एक बॉक्स का निर्माण काले रंग का सामिल एक्रिलिक शीट्स (3 मिमी मोटी) ( सामग्री की तालिकादेखें) से बना है । इस तरह के एक बॉक्स बनाने के लिए सामग्री स्थानीय हार्डवेयर की दुकानों पर उपलब्ध होना चाहिए । इस बॉक्स को व्यवहार कक्ष (आरेख 1a) में तालिका-शीर्ष पर रखें ।
  2. माउंट एक मोनोक्रोम यूएसबी 3.0 एक IR के साथ सज्जित सीसीडी कैमरा लंबी-830 एनएम फ़िल्टर और एक 8 मिमी f 1.4 C-माउंट लेंस ( सामग्री की तालिकादेखें) ब्लैक बॉक्स की छत के केंद्र के लिए । अंधेरे क्षेत्र (चित्रा 1) में लार्वा रोशन करने के क्रम में टेबल-टॉप पर दो इंफ्रा-लाल एलईडी स्ट्रिप्स ( सामग्री की तालिकादेखें) रखें ।
  3. एलईडी मंच बनाने के लिए, एक 22 सेमी × 22 सेमी वर्ग एल्यूमीनियम थाली प्राप्त (अधिमानतः स्प्रे एक मैट काले खत्म करने के लिए किसी भी प्रतिबिंब को खत्म करने के साथ चित्रित) । प्लेट के केंद्र में, एक धातु कटर का उपयोग कर, एक छेद है कि काफी बड़ा है सीसीडी कैमरे के आसपास फिट कटौती ।
  4. लाल एलईडी पट्टी रोशनी के साथ धातु की थाली को कवर ( सामग्री की तालिकादेखें) । मिलाप श्रृंखला में प्रकाश पट्टी तारों का नेतृत्व किया और एक optocoupler रिले एक रास्पबेरी पीआई 2 बी माइक्रोप्रोसेसर द्वारा नियंत्रित में पट्टी तारों फ़ीड ( सामग्री की तालिकादेखें) (चित्रा 1बी और 2).
  5. स्थापित करें और कॉंफ़िगर Ubuntu मेट/Raspian जेसी/लिनक्स आधारित ऑपरेटिंग सिस्टम रास्पबेरी Pi प्रोसेसर पर एलईडी स्ट्रिप्स के लिए optocoupler रिले जोड़ने से पहले. एलईडी स्ट्रिप्स और optocoupler (चित्रा 2) ( सामग्री की तालिकादेखें) बिजली के लिए एक बिजली की आपूर्ति देते हैं । सीसीडी कैमरा (चित्रा 1बी) के आसपास एलईडी मंच माउंट ।
    नोट: Ubuntu मेट v 16.04 ऑपरेटिंग सिस्टम आज़ादी से उपलब्ध है. सरल पायथन आधारित आज्ञाओं का एक सेट आसानी से एलईडी प्रकाश उत्तेजनाओं के कार्यक्रम के पैटर्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (वाक्यविंयास की फ़ाइल देखें) ।
  6. व्यवहार के क्षेत्र में विभिंन बिंदुओं पर समरूप विकिरण सुनिश्चित करें । एक स्पेक्ट्रोमीटर की मदद से क्षेत्र की सतह पर निरपेक्ष विकिरण उपाय और यह निर्धारित करने के लिए ~ 1.3 W/क्षेत्र की सतह भर में2
    नोट: इस तीव्रता पर, कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रयोगों के पाठ्यक्रम पर तापमान में मनाया गया । एक अंय अध्ययन10 के एक उच्च विकिरण का इस्तेमाल किया ~ 1.9 W/और प्रयोगों के पाठ्यक्रम पर तापमान में कोई परिवर्तन नहीं मनाया ।

2. व्यवहार विश्लेषण के लिए Drosophila लार्वा की तैयारी

  1. मानक मक्खी भोजन पर मक्खियों को बनाए रखने ( सामग्री की तालिकादेखें) पर 25 डिग्री सेल्सियस, 50-60% आरएच, और एक 12 घंटे/
  2. ORNs की एकल जोड़ी में CsChrimson व्यक्त करने के लिए, एक OrX-Gal4 लाइन से पुरुषों के लिए एक यूएएस-IVS-CsChrimson लाइन से पार कुंवारी महिलाओं (' एक्स ' 21 लार्वा गंध रिसेप्टर (या) जीन है कि विशिष्ट प्रत्येक में व्यक्त कर रहे है में से एक से मेल खाती है के 21 जोड़े ORNs)9,11.
    1. वैकल्पिक रूप से, आदेश में सभी 21 लार्वा ORNs में CsChrimson व्यक्त करने के लिए, एक IVS- CsChrimson लाइन से पुरुषों के लिए एक यूएएस-Orco-Gal4 रेखा से पार कुंवारी महिलाओं (' Orco ' सह रिसेप्टर है कि सभी 21 ORNs में व्यक्त किया जाता है) है ।
    2. इन प्रयोगों में नियंत्रण के रूप में यूएएस-IVS-CsChrimson रेखा का उपयोग करें ।
      नोट: फ्लाई यहां सूचीबद्ध स्टॉक्स ब्लूमिंगटन Drosophila शेयर केंद्र पर सभी उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. एक बार एक क्रॉस में नर और मादा मक्खियों दोस्त के लिए अनुमति दी जाती है और 48 एच के लिए अंडे देना, एक ताजा शीशी में वयस्कों के हस्तांतरण ।
    1. खाद्य अंडे युक्त शीशी की सतह के लिए, 400 µ एम सब ट्रांस रेटिना (एटीआर) Dimethyl sulfoxide (DMSO) और 89 मिमी आसुत जल में भंग सुक्रोज में भंग युक्त मिश्रण के 400 µ एल जोड़ें । ।
      नोट: सुक्रोज की छोटी राशि एटीआर समाधान के लार्वा खिलाने को बढ़ावा देता है । एटीआर एक cofactor CsChrimson अभिव्यक्ति9,10के विनियमन के लिए आवश्यक है । एटीआर प्रकाश संवेदनशील है ।
    2. एक बार एटीआर भोजन अंडे युक्त शीशियों में जोड़ा जाता है, एक अतिरिक्त 72 एच के लिए अंधेरे में शीशियों गर्मी ।
      ध्यान दें: जबकि इस अध्ययन और इसके बाद के संस्करण दो अध्ययनों लार्वा एटीआर खिलाने के कारण व्यवहार पर प्रभाव नहीं देखा है, यह ऊपर मिश्रण है कि एटीआर शामिल नहीं करता है की एक ही राशि के लिए परीक्षण लाइनों विषय द्वारा एटीआर खिलाने के प्रभाव के लिए नियंत्रित करने की सिफारिश की है ।
  4. तीसरा instar लार्वा निकालें (~ 120 ज अंडे बिछाने के बाद) उंहें एक उच्च घनत्व (15%) सुक्रोज समाधान का उपयोग कर तैरते द्वारा फ्लाई भोजन की सतह से । एक P1000 का उपयोग micropipette एक 1000 मिलीलीटर ग्लास चोंच में सुक्रोज समाधान की सतह पर तैर लार्वा अलग ।
  5. हर बार काँच की चोंच में ८०० मिलीलीटर ताजे आसुत जल का आदान-प्रदान करके लार्वा ३-४ बार धोयें. उंहें व्यवहार परख करने के लिए विषय से पहले 10 मिनट के लिए लार्वा आराम करने की अनुमति दें ।

3. व्यवहार परख

  1. लगातार तापमान (22 के बीच-25 डिग्री सेल्सियस) और आर्द्रता (50 और 60% आरएच के बीच) व्यवहार कक्ष में बनाए रखें ।
  2. एक 22 सेमी x 22 सेमी स्क्वायर पेट्री डिश में पिघला agarose (1.5%) की 150 मिलीलीटर डालने से लार्वा रेंगने मध्यम तैयार करें । एक पेट्री पकवान परख के प्रत्येक परीक्षण के लिए डाला जाता है, 8-प्रयोग प्रति 10 परीक्षणों । agarose जमना और 1 के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें-पेट्री व्यंजन में 2 ज व्यवहार परख में उंहें प्रयोग करने से पहले ।
    1. पेट्री डिश (चित्रा 1सी) के केंद्र के लिए prepped तीसरे instar लार्वा के 20 से अधिक नहीं स्थानांतरण । इसके ढक्कन के साथ पेट्री डिश कवर । सीसीडी कैमरे के तहत व्यवहार के क्षेत्र में पेट्री डिश रखें ।
      नोट: प्रयोग पर निर्भर करता है, व्यवहार परख आमतौर पर 3 के लिए किया जाता है-5 मिनट । यदि एक गंध परख में प्रयोग किया जाता है मार्गदर्शन cues प्रदान करते हैं, यह देखा गया है कि जिसके परिणामस्वरूप गंध ढाल लगभग 5 मिनट के लिए स्थिर रहता है1। अब परख समय की सिफारिश नहीं कर रहे हैं । निर्जलीकरण के कारण या लंबे समय तक 630 एनएम रेड-लाइट एक्सपोजर से लार्वा पर बचके इफेक्ट इन टाइम पॉइंट्स के अंदर नहीं देखा गया है ।
  3. वीडियो में लार्वा की कल्पना करने के लिए 850 एनएम इंफ्रा-रेड एलईडी लाइट सोर्स को चालू करें । लार्वा आंदोलन रिकॉर्ड करने के लिए सीसीडी कैमरा प्रारंभ करें ।
  4. रास्पबेरी पीआई प्रोसेसर के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रक्रिया कार्यक्रम लाल बत्ती उत्तेजना के उचित पैटर्न के प्रशासन के लिए.
    नोट: सरल पायथन आधारित आज्ञाओं का एक सेट आसानी से एलईडी प्रकाश उत्तेजनाओं के कार्यक्रम के पैटर्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (वाक्यविंयास की फ़ाइल देखें) ।

4. डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. Matlab जैसे किसी भी उपलब्ध प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में प्रत्येक परीक्षण के रिकॉर्ड वीडियो आयात करें ।
  2. समय के एक समारोह के रूप में एक फिल्म में हर लार्वा के XY निर्देशांक प्राप्त करें । ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की सीमा के आधार पर, 15 – 20 तृतीय-instar लार्वा एक एकल मूवी1,8में ट्रैक किए जा सकते हैं ।
    नोट: सरल Matlab कोड का एक सेट (' Tracklarva ') है कि आसानी से उपयुक्त शर्तों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है (देखें वाक्यविंयास की फ़ाइल) प्रदान की जाती है । इस कार्यक्रम के एक प्रयोग में सभी परीक्षणों को जोड़ती है और outputs XY परख की पूरी अवधि के लिए हर लार्वा के निर्देशांक (नीचे कोड वाक्यविंयास देखें) । वैकल्पिक रूप से, एक कई खुले स्रोत आधारित प्रोग्राम है कि शोधकर्ताओं के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है उपयोग कर सकते हैं । उदा. JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. उत्पन्न XY निर्देशांक लार्वा पथ प्लॉट करने के लिए और आगे लार्वा गतिवान का विश्लेषण करने के लिए का उपयोग करें ।
    1. व्यवहार विश्लेषण के लिए, गति, पथ वक्रता, शीर्ष कोण जैसे नेविगेशनल आंकड़ों का उपयोग करें, व्यक्तिगत लार्वा पथ को रन के अनुक्रम में विभाजित करने के लिए और मुड़ता है ।
    2. रन आगे आंदोलन की सतत अवधि के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । पृथक क्रमिक रन देता है । बदल जाता है जब पथ अभिविंयास कोण में परिवर्तन थे ध्वजांकित है > 45 ° (सिंटेक्स की फ़ाइल देखें) ।
  4. रन गति के लिए औसत मानों का परिकलन करें, लंबाई चलाएँ, दिशा चलाएँ और आवश्यकतानुसार अन्य पैरामीटर.
    नोट: लार्वा पथ से ' रन ' और ' स्टॉप ' निकालने के लिए सरल वाक्यविंयास का एक सेट (वाक्यविंयास की फ़ाइल देखें) प्रदान की जाती है । सरल Matlab या एक्सेल आधारित कार्यों ' रन गति ', ' रन लंबाई ' आदिके लिए मूल्यों की गणना करने के लिए निकाले गए डेटा के लिए लागू किया जा सकता है
  5. अर्थ ± SEM के रूप में प्रत्येक व्यवहार मीट्रिक के लिए डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

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Representative Results

ORN सक्रियण की विशिष्टता को प्रदर्शित करने के लिए, हमारी विधि सफलतापूर्वक दो अलग ORN के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए लागू किया गया था (ORN:: 7a & ORN:: 42a) (ORNs या Or7a व्यक्त) Or42a व्यवहार पर सक्रियण (चित्र 3) । हाल के अध्ययनों से सुसंगत है कि व्यक्तिगत लार्वा ORNs कार्यात्मक1,10,13विशिष्ट हैं, हमारे प्रतिनिधि डेटा दर्शाता है कि जब ORN:: 7a व्यक्त CsChrimson प्रकाश से उत्तेजित था, वहां था एक जानवरों को नियंत्रित करने की तुलना में चलाने की लंबाई में उल्लेखनीय कमी. इसके विपरीत, जब ORN:: 42a व्यक्त CsChrimson प्रकाश द्वारा उत्तेजित किया गया था, वहां चलाने की लंबाई में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी नियंत्रित करने के लिए जानवरों (चित्रा 3) । सामूहिक डेटा से विश्लेषण ~ 100-120 लार्वा पटरियों से प्राप्त किया गया (n = 8) परीक्षण प्रत्येक जीनोटाइप के लिए प्रदर्शन किया । त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं । जब तक हम केवल एक ही व्यवहार पैरामीटर का वर्णन (लंबाई रन) यहाँ, हम ध्यान दें कि प्रत्येक लार्वा ट्रैक आगे गति के लिए मापदंडों की गणना करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता, पथ वक्रता, और शरीर झुकता1,8,13, 14,15. अधिक इस तरह के कोण शीर्षक के रूप में दिशात्मकता से संबंधित मानकों, रन लंबाई और की ओर चलाने की गति और गंध से दूर अगर एक गंध स्रोत अखाड़ा1,8,13के एक तरफ प्रदान की जाती है प्राप्त किया जा सकता है ।

हमारे विधि ORN सक्रियण के लौकिक पैटर्न को बदलने की क्षमता का प्रदर्शन, हम रोशनी के बीच वैकल्पिक करने के लिए हमारी उत्तेजना विविध बंद और पर । हम ORN में यूएएस-CsChrimson व्यक्त लार्वा का विषय:: 42a (0.04 हर्ट्ज, 1 हर्ट्ज, और लगातार) अवधि पर रोशनी के दौरान प्रकाश उत्तेजनाओं के तीन अलग अस्थाई पैटर्न के लिए । हम तो व्यवहार मानकों कि रोशनी के दौरान बंद → चरण पर और रोशनी के दौरान → बंद चरण में परिवर्तन मापा । हमने पाया है कि ORN के लिए:: 42a, प्रकाश उत्तेजना के विभिंन लौकिक पैटर्न अलग व्यवहार प्रतिक्रियाओं (चित्रा 4) । ऐसे परिवर्तन नियंत्रण लार्वा में स्वीकार्य नहीं थे जो किसी भी ORNs में यूएएस-CsChrimson व्यक्त नहीं करते इन परिणामों को कैसे ORN सक्रियण के लौकिक पैटर्न जानवर व्यवहार में योगदान को समझने के महत्व पर प्रकाश डाला ।

Figure 1
चित्र 1 : व्यवहार क्षेत्र और लार्वा रेंगने मध्यम । (क) काले बॉक्स व्यवहार क्षेत्र के सामने देखें । क्षेत्र के खुले दरवाजे एक सीसीडी कैमरा बॉक्स की छत से निलंबित कर दिया पता चलता है । (ख) लाल एलईडी प्रकाश optogenetic उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया स्ट्रिप्स युक्त एक धातु मंच के नीचे देखने के लिए सीसीडी कैमरे के आसपास मुहिम शुरू की है । (ग) लार्वा क्रॉलिंग माध्यम परख में इस्तेमाल के शीर्ष दृश्य । रिकॉर्डिंग लार्वा आंदोलन की शुरुआत करने से पहले, ~ 20 धोया लार्वा एक 22 सेमी x 22 सेमी पेट्री डिश 1.5% agarose के साथ स्तरित के केंद्र के साथ रखी जाती है । लार्वा युक्त पेट्री डिश को सीसीडी कैमरे के अंतर्गत एरेना के केंद्र में और दो इंफ्रा-रेड LED लाइट स्ट्रिप्स के बीच में रखा गया है जो कैमरे के लिए एक प्रकाश स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Optogenetics सेटअप. एक क optogenetics सेटअप के लिए इलेक्ट्रॉनिक व्यवस्था दिखा । संक्षेप में, एलईडी लाइट (630 एनएम) स्ट्रिप्स श्रृंखला और तारों में स्ट्रिप्स से जुड़े रहे हैं एक optocoupler में खिलाया जाता है एक रास्पबेरी PI b माइक्रोप्रोसेसर से जुड़ा. दोनों एलईडी प्रकाश स्ट्रिप्स और optocoupler एक बिजली की आपूर्ति के द्वारा संचालित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : लार्वा व्यवहार पर व्यक्तिगत ORNs के प्रकाश सक्रियण का प्रभाव. ORN में CsChrimson व्यक्त लार्वा की लंबाई भागो:: 7a और ORN:: 42a प्रकाश सक्रियण पर लार्वा नियंत्रण की तुलना में अलग ढंग से प्रभावित थे । प्रत्येक बार औसत री ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है (n = 8) । ORN जब लार्वा की लंबाई भागो:: 7a था सक्रिय नियंत्रण से काफी कम था । ORN जब लार्वा की लंबाई भागो:: 42a था सक्रिय नियंत्रण से काफी अधिक था । सलाखों मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व (एन = 8, छात्र टी परीक्षण; "*" p < 0.05 है, "* *" p < 0.001) है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : लार्वा व्यवहार पर ORN सक्रियण के विभिंन लौकिक पैटर्न का प्रभाव । (क) ORNs को सक्रिय करने के लिए प्रयुक्त उत्तेजनाओं के तीन लौकिक पैटर्न । उत्तेजना एक: 1 मिनट लगातार प्रकाश के दौरान, उत्तेजना बी: 0.04 हर्ट्ज प्रकाश उत्तेजना, उत्तेजना सी: 1 हर्ट्ज प्रकाश उत्तेजना मिनट 2 में अवधि पर एलईडी के दौरान । (ख) लार्वा एक में वर्णित प्रकाश उत्तेजनाओं के तीन भिन्न प्रतिमानों के अधीन किए गए थे. प्रत्येक बिंदु लार्वा व्यवहार में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है, प्रकाश उत्तेजनाओं के प्रत्येक पैटर्न के तहत, जब प्रकाश सक्रियण पर से बंद करने के लिए स्विच है । में बदलें ' लंबाई भागो ' (av. रन लंबाई (बंद)-av. run लंबाई (पर)) X-अक्ष पर प्लॉट है । ' रन गति ' में बदलें (ए वी. रन गति (बंद)-av. run गति (पर)) Y-अक्ष पर प्लॉट है । बाएँ ग्राफ (ग्रे डॉट्स) नियंत्रण लार्वा से माप का प्रतिनिधित्व करता है और सही ग्राफ (लाल डॉट्स) ORN में CsChrimson व्यक्त लार्वा से माप का प्रतिनिधित्व करता है:: 42a. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Final Code PDF
वाक्यविंयास की पूरक फ़ाइल: सरल Matlab कोड (' Tracklarva ') का एक सेट है कि आसानी से उपयुक्त परिस्थितियों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम एक विधि है कि घ्राण न्यूरॉन्स के एक साथ optogenetic सक्रियण के जवाब में Drosophila लार्वा व्यवहार की माप के लिए अनुमति देता है वर्णित है । पहले वर्णित लार्वा ट्रैकिंग विधियां1,8 ORNs को सक्रिय करने के लिए विभिंन गंध वितरण तकनीक का उपयोग करें । हालांकि, इन विधियों या तो विशिष्टता या ORN सक्रियण के लौकिक पैटर्न के लिए नियंत्रित नहीं कर सकते । हमारी विधि ORN सक्रियण के और अधिक सटीक नियंत्रण के लिए गंध उत्तेजनाओं के बजाय प्रकाश उत्तेजनाओं का उपयोग करके इन घाटे पर काबू ।

के लिए व्यवहार क्षेत्र बनाने की जरूरत सामग्री आसानी से स्थानीय हार्डवेयर की दुकान पर प्राप्त किया जा सकता है और विधानसभा में ंयूनतम प्रयास की आवश्यकता है । optogenetics मॉड्यूल तैयार करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक्स की जरूरत भी आसानी से उपलब्ध है और निर्माण कर रहे हैं । यहां वर्णित विधि लाल बत्ती का उपयोग करता है एक लाल-शिफ्ट चैनल rhodopsin (CsChrimson) विशिष्ट ंयूरॉंस में व्यक्त सक्रिय । इसी ORN सक्रियण के जवाब में परिणामस्वरूप लार्वा व्यवहार एक सीसीडी कैमरे का उपयोग कर दर्ज की गई है और कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर है कि यहां प्रदान की जाती है का उपयोग कर मापा । हमारे विधि शोधकर्ताओं कई सवाल है कि संभव से पहले नहीं थे के जवाब पूछने के लिए अनुमति देता है: 1) क्या है पशु एक गंध की ओर नेविगेट करने की क्षमता पर अलग घ्राण उत्तेजना पैटर्न का प्रभाव है? 2) पर केंद्र और ऑफ सेंटर नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं के समान स्तनधारी रेटिना16में, वहां ORNs कि ORNs उत्तेजनाओं में वृद्धि करने के लिए प्रतिक्रिया के अलावा घ्राण उत्तेजनाओं में एक कमी करने के लिए विशेष रूप से प्रतिक्रिया कर रहे हैं? अंत में, हमारे विधि घ्राण सर्किट में बहाव न्यूरॉन्स के प्रभाव को मापने सहित भविष्य अनुप्रयोगों की एक किस्म की अनुमति देता है (पीएन और LNs) नेविगेशन लार्वा करने के लिए.

जबकि हमारे विधि के लिए कई फायदे हैं, हम कुछ सीमाओं को स्वीकार करते हैं । यह स्पष्ट नहीं है कि एकाग्रता प्रभाव odorants के साथ मनाया आसानी से इस प्रणाली का उपयोग कर दोहराया जा सकता है । जबकि हमारे वर्तमान सेटअप इस की अनुमति नहीं है, optogenetics मॉड्यूल आसानी से बढ़ या प्रकाश उत्तेजना की तीव्रता में कमी को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । भविष्य में, हम देखते है कि प्रकाश उत्तेजना की तीव्रता बदलती odorants के एकाग्रता प्रभाव नकल की जांच करेंगे । सरल मक्खी आनुवंशिक तकनीक ORNs के सभी 21 जोड़े में CsChrimson व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (Orco-Gal4 का उपयोग) या ORNs की एक जोड़ी में (व्यक्तिगत या-Gal4s का उपयोग करके). हालांकि, जटिल आनुवंशिकी को ' 1 < n < 21 ' न्यूरॉन्स में CsChrimson व्यक्त करने की आवश्यकता होगी । इस के कारण, यह गंध मिश्रण के साथ मनाया प्रभाव को दोहराने के लिए मुश्किल होगा, जहां मिश्रण के व्यक्तिगत घटकों को एक से अधिक ORN से प्रतिक्रिया बटोरना । हालांकि लार्वा नौवहन व्यवहार के लिए एक कम आयामी व्यवहार माना जाता है, हम स्वीकार करते है कि हमारे लार्वा ट्रैकिंग कार्यक्रम आगे पशु मुद्रा के आधार पर अतिरिक्त व्यवहार वर्णनकर्ता पर विचार करके भविष्य में सुधार किया जा सकता है (उदा सिर बदल जाता है की संभावना, शरीर झुकता आदि)8,17। हमारे अध्ययन के लार्वा में पहले आदेश संवेदी ंयूरॉंस के लिए प्रतिबंधित किया गया था । आगे की जांच की आवश्यकता है इससे पहले कि हमारे विधि दूसरे क्रम प्रक्षेपण ंयूरॉंस और स्थानीय ंयूरॉंस कि मस्तिष्क पालि क्षेत्र में एंबेडेड है के लिए लागू किया जा सकता है18ब्रेन ।

संक्षेप में, हमारे विधि में हर ORN के समारोह को काटना करने की क्षमता प्रदान करता है, जो Drosophila लार्वा के सरल, परितंत्रीय घ्राण सर्किट में होता है । ऐसा करने से, हमारे विधि का वर्णन कैसे गंध संकेतों अलग व्यवहार outputs में अनुवाद कर रहे है और अधिक सटीक गणना मॉडल के विकास को सक्षम करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

इस काम को स्टार्टअप फंड्स ने नेवादा, रेनो यूनिवर्सिटी से और नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ के NIGMS द्वारा ग्रांट नंबर P20 GM103650 के तहत सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Video camera to capture larval movement
CCD Camera  Edmund Optics 106215
M52 to M55 Filter Thread Adapter Edmund Optics 59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses  Edmund Optics 59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass Filter Edmund Optics 46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2B RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supply newegg.com 9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relay amazon.com 6454319
630nm Quad-row LED strip lights environmentallights.com red3528-450-reel
850nm LED strips environmentallights.com wp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
Matlab Mathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04 Nubuntu https://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylic Home Depot MC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly food Genesee Scientific 66-112
Agarose powder Genesee Scientific 20-102
22cm X 22cm square petri-dish VWR Inc. 25382-327
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
All trans-retinal Sigma-Aldrich R2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center 55134
Orco-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 26818
Or42a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 9970
Or7a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 23907

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References

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