回顾性 MicroRNA 排序: 用福尔马林固定石蜡嵌入 RNA 标本补充 DNA 文库制备协议

Genetics

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Summary

福尔马林固定石蜡镶嵌标本是人类疾病分子生物标志物的宝贵来源。在这里, 我们提出了一个基于实验室的 cDNA 文库准备协议, 最初是用新鲜的冷冻 RNA 设计的, 并对35年内储存的 microRNAs 进行了优化分析。

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

–Archived, 临床分类的福尔马林固定石蜡 (FFPE) 组织可以提供核酸的回顾性分子研究癌症的发展。通过使用晚期侵袭性疾病患者的非侵袭性或前恶性病变, 基因表达分析可以帮助识别易患癌症风险的早期分子改变。已经很好的描述, 从 FFPE 组织恢复的核酸发生了严重的物理损伤和化学修饰, 这使得他们的分析困难, 一般需要适应的化验。MicroRNAs (miRNAs), 但是, 它代表了一个小类 RNA 分子跨越只有18–24核苷酸, 已被证明经得起长期储存, 并已成功地分析了 FFPE 样品。在这里, 我们提出了一个 3 ' 条形码互补 DNA (cDNA) 库准备协议, 专门为分析从存档组织提取的小 rna, 最近证明是健壮的和高度重复使用存档临床标本贮存35年。此库准备很好地适应了被破坏/退化材料的多重分析, 其中 RNA 样品 (最多 18) 被结扎与单独 3 ' 条形码适配器, 然后汇集在一起为随后酵素和生化准备在分析之前。所有纯化都是由聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页), 它允许大小特定的选择和充实的条形码小 RNA 品种。这种 cDNA 文库的制备很好地适应了微小的 RNA 输入, 作为一个先导聚合酶链反应 (PCR) 允许确定一个特定的放大周期, 以产生最佳数量的材料, 为下一代测序 ()。这一方法的优化, 以使用退化的 FFPE RNA 的标本归档了长达35年, 并提供了高度重现性的数据。

Introduction

miRNAs 在福尔马林固定石蜡嵌入 (FFPE) 标本中保存得非常好,1,2,3。以往的研究表明, 这些短的监管非编码单链 rna 分子的表达可以成功地评估使用总 RNA 从 FFPE 样本, 并提供相关的基因表达数据时, 与原始新鲜组织4,5,6,7,8。当与大尺寸信使 rna 相比, 这已被证明是严重影响的 FFPE 组织处理 (甲醛, 热, 脱水,), 内源性 RNases, 和年龄的标本, 小规模的 miRNAs (~ 18–24核苷酸) 似乎使它们耐降解和弹性的长期储存, 也证明通过 miRNA 表达研究, 优于高通量 mRNA 研究的存档标本9。miRNA 表达研究使用已存档的临床标本, 主要是在小规模分析中进行的, 证明了单一或多路定量 PCR 检测, 不同类型的微阵列技术, 最近的用于评估保存的 miRNAs 在这些化验的优化后的表达式10,11,12,13,14

鉴于 miRNA 表达的失调与各种人类恶性肿瘤的发展有关, 而且有可能大量提供临床上标注的存档标本, 这已经变得明显, 这些小 RNA分子代表了潜在的癌症标志物的一个有希望的来源15,16,17,18。使用高通量基因表达技术 (如 miRNA) 的优点是, 当与 PCR 和/或微阵列19的目标技术相比较时, 可以对所有的转录记录进行全局评估。由于这个原因, 一个优化的, 负担得起的和易于适用的基因 cDNA 文库的协议, 从较旧的存档标本中制备小 rna 的方法进行了优化, 以实现大规模的回顾性研究20

我们以前建立了一个同时 rna/dna 提取协议, 以分离恢复的 rna 和 dna 从旧的存档标本, 我们发现优于当代商业套件21。利用该提取协议, 从存档的 FFPE 组织中获取总 RNA, 对临床标本中保存的 miRNAs 的基因文库进行了35年的优化制备。此外, 在最近发表的一项研究中, 我们从临床分类导管癌原位(DCIS) 标本中制备了 cDNA 文库, 我们确定了定量 PCR 验证的差异表达 miRNAs, 表明这种特定的 miRNA 表达的变化可能是可检测到 DCIS 病变的患者谁发展乳腺癌时相比, DCIS 病变的病人谁不发展乳腺癌。

考虑到制作小 RNA cDNA 文库的商业套件的成本, 其终止的可能性, 以及使用版权/专利保护的试剂, 无法优化, 我们决定调整以前出版的基于实验室和无试剂盒的 3 ' 条形码 cDNA 文库在 FFPE 标本中存档的小 rna 的制备方案, 允许同时分析18个样本22。该议定书提供了一个理想和稳健的分步程序, 具有视觉和技术评估检查点, 这对于适应 FFPE RNA 标本是至关重要的, 并且具有很强的应用潜力, 可用于其他来源的损害或困难使用 RNA 材料。通过使用荧光 (例如、SYBR 金) 可检测到大型聚丙烯酰胺凝胶上结扎库的放射性标记尺寸标记, 改进了原始协议的适用性。这一优化的协议依赖于 3 ' 条形码适配器结扎18个单独的 FFPE RNA 标本, 然后汇集在一起进行 5 ' 适配器结扎, 反向转录, 和一个先导 PCR 分析, 以量身定制放大最终 cDNA图书馆在大规模的 PCR 放大, 纯化, 并在高通量排序器。

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Protocol

1. 所有试剂和底漆的制备

  1. 按照图 1中的说明, 订购所有底漆和适配器。
  2. 准备校准鸡尾酒的股票, 这将是在每个单独结扎的尖刺。
    1. 将载波寡核苷酸 (图 1) 并用重悬为0.5 µM, RNase 无水。使用0.5 µM 载波寡核苷酸解决方案, 将10校验和寡核苷酸 (图 1) 并用重悬为100µM。
    2. 将渗离心中的每个校准器的10µL 组合在一起, 获得100µM 鸡尾酒校验仪库存, 并准备 0.026 nM 溶液以存放在-20 摄氏度。
  3. 稀释20独特的, 冻干, adenylated 3 ' 适配器与 RNase 的水, 最终集中50µM (图 1)。
    注: 建议在单个渗管中准备2.5 µL 整除数, 并将其存储在-80 摄氏度, 最多2年。
  4. 并用重悬淡化 19 nt-3 适配器和 24 nt-3 适配器大小标记寡核苷酸为 250 ng/毫升(图 1)。
  5. 并用重悬高效液相色谱纯化 5 ' 适配器至100µM, RNAse 无水。并用重悬 5 ' 和 3 ' PCR 引物到100µM 使用无 RNase 水(图 1)。
    注: 整除所有寡核苷酸的数量为-80 摄氏度的实验和贮存所需的金额。
  6. 将98.8% 甲酰胺、1% (v/v) 0.5 米 Na2H2 EDTA、pH 值8.0 和0.2% 溴酚蓝组合成聚丙烯酰胺变性 (临机) 凝胶负载染料, 并设置1毫升整除数-80 摄氏度。
    1. 在0.5 米 na2H2 edta 溶液中加入18.6 克的 na2H2 edta 粉到50毫升的无核酸酶水。加入氢氧化钠丸, 达到 pH 值8.0。调整音量为100毫升, 以获得0.5 米 Na2H2 EDTA, pH 8.0 库存解决方案。
    2. 在一个单独的15毫升管中重15毫克的溴酚蓝色。添加600µL 的无核酸酶水。加入14.25 毫升的脱电离甲酰胺。添加150µL 0.5 米 Na2H2 EDTA, pH 8.0 溶液。
    3. 整除在1毫升整除数-80 摄氏度的15毫升的临机局最终解决方案。
  7. 用0.2% 溴酚蓝、0.2% 二甲苯蓝 FF、50毫米 Na 2 H 2 EDTA、pH 8.0 和 20% Ficoll Type-400 的组合制备5x 琼脂糖凝胶负载染料.
    1. 并用重悬1.86 克的Na2H2-在室温 (RT) 的磁性搅拌器上, 在400毫升的烧杯中, 核酸酶50毫升的无水的 EDTA。加入氢氧化钠丸, 达到 pH 值8.0。添加无核酸酶水达到100毫升, 以获得50毫米 Na 2 H 2 EDTA 溶液.
    2. 重20毫克溴酚蓝粉, 20 毫克二甲苯蓝 FF 粉, 2 克 Ficoll Type-400 粉, 并用重悬5毫升 50毫米Na 2 H 2 EDTA.
    3. 涡流管含有三染料, 并添加5毫升50毫米 Na2H2 EDTA。混合5x 琼脂糖凝胶加载染料, 准备1毫升整除数, 并存储在-80 摄氏度。

2. 设置 3 ' 条形码适配器结扎18个单独的 RNA 样本

  1. 在1.5 毫升渗离心管中, 确定18个单独的 RNA 标本 (前 aliquoted 在 100 ng, 9.5 µL 核酸酶无水), 并设置冰上的管以解冻10分钟。
  2. 准备 10x RNA 连接酶缓冲 (没有 ATP) 新鲜。
    1. 在1.5 毫升渗离心管, 结合343µL RNase 水, 500 µL 1 M pH 7.5, 100 µL 1 m 氯化镁2, 50 毫克/毫升牛血清白蛋白, 20 µL 7 米14µL。混合通过弹管, 离心机为 2 s 在 2000 x g 和 RT, 并设置在冰上。
      注: 本协议中指示 "2 s 离心机" 的所有步骤均在 RT 台式离心中执行, 最高速度为 2000 x g, 以收集管道底部的解决方案。
  3. 在2毫升渗离心管中加入1毫升的 RNase 水到1毫升的亚砜, 用铝箔包裹管, 并贮存在 RT 中, 制备50% 水基亚砜。
  4. 在冰上解冻 0.026 nM 校准剂鸡尾酒10分钟. 在1.5 毫升渗离心管中结合以下顺序, 准备结扎大师组合:40 µL 10x RNA 连接酶缓冲器和120µL 50% 水中亚砜使用200毫升吸管, 并添加10µL 0.026 nM 校准鸡尾酒使用10µL 吸管。轻拍1.5 毫升管混合, 离心机为2秒, 并设置在冰上。
  5. 添加8.5 µL 结扎主混合到每18个单独 aliquoted FFPE RNA 样品, 轻轻地轻拍管, 离心机 2, 并储存在冰上。
  6. 除霜2.5 µL 整除数从每一个 18, 3 ' 条形码适配器和放在冰上解冻20分钟。
    1. 使用3µL 吸管将每个适配器的1µL 转移到相应的 FFPE rna 样本中, 其中包含 rna 和结扎主混合 (、9.5 µL + 8.5 µL)。
    2. 不要把吸管向上和向下, 简单地放进液体中, 拉出尖端。请务必改变 FFPE RNA 样品之间的提示。关闭每管, 轻拍混合, 离心机 2 s, 并设置在冰上。
  7. 变性反应通过放置18管在一个热块90°c 1 分钟, 然后立即放置在冰上。
  8. 通过稀释10µL 截 K227Q T4 RNA 连接酶2与10µL 无 RNase 的水成新鲜1.5 毫升渗离心管, 准备结扎酶溶液。
  9. 使用3µL 吸管将稀释结扎酶的1µL 转移到18个 RNA 样本中 (不要上下吸液, 并在每管之间改变提示)。设置18结扎冰和地方在4°c 冷室过夜孵化18小时。

3. 结扎小 rna 的纯化

  1. 在90摄氏度的热量块上放置18管1分钟, 然后恢复到冰至少2分钟, 以降温, 使结扎反应停用。
  2. 通过添加1µL 的蓝色染料共价键链接到糖原到26µL 5 米 RNase 无盐的氯化钠成一个新鲜的渗离心管, 准备沉淀大师混合。
    1. 转移1.2 µL 的沉淀大师混合到每一个18管。在18管中添加63µL 100% 乙醇。关闭每管, 轻拍混合, 离心机2秒, 并把管子放在冰上。将所有18管的内容合并为一个1.5 毫升的渗管。
    2. 关闭管, 反转三次混合, 离心机为2秒, 并放置在冰上60分钟沉淀。
  3. 准备一大 (16 x 20 厘米2) 15% 聚丙烯酰胺凝胶页。
    1. 铸造两个渗玻璃板 (处理与一个安全的替代硅烷涂层) 与0.1 厘米垫片。
    2. 结合9毫升的系统稀释剂, 18 毫升的系统浓缩, 3 毫升的系统缓冲器, 240 µL 的 APS (9%), 12 µL 的 TEMED 在50毫升管。
    3. 用30毫升的吸管在玻璃板之间转移页面凝胶溶液, 插入 14-井梳 (0.1 厘米厚), 让凝胶在 RT 上凝固30分钟。
  4. 离心1.5 毫升管与汇集结扎在 1.6万 x g 和4°c 为60分钟。
  5. 取下梳子。用带有200µL 尖端的喷瓶在井内 RNase, 并在水槽上方用力将不聚合的丙烯酰胺挤出 (一次井), 用无水的清水清洁水井。在凝胶装置上设置15% 页, 用0.5x 三硼酸 EDTA 溶液填充储层, 并在 450 v 前运行凝胶30分钟。
  6. 从离心机中回收结扎的管, 并仔细干燥 RNA 颗粒。
    1. 用1毫升的吸管尖去掉上清, 但在底部留一些液体。倾斜的管和使用20毫升吸管去除剩余的上清, 不接触颗粒。真空吸入管使用一个巴斯德吸管与10µL 尖端在它的末端, 不接触颗粒。
    2. 并用重悬在20µL 的 RNase 水中通过弹管将 RNA 颗粒释放出来。添加20µL 凝胶加载溶液并用重悬 RNA, 轻拍混合, 离心机 2 sat, 并设置在90ºC 1 分钟, 然后立即放置在冰上的管。
  7. 更换0.5x 的凝胶装置与新鲜 0.5x, 并加载梯子, 大小标志, 并结扎 miRNAs 在中心的凝胶, 留下 2-空井两侧 (图 2)。
  8. 在 450 v (35 mA) 上运行凝胶60分钟, 暂停运行10分钟降温, 并再次运行在 520 V (25 mA) 为另一个60分钟 Uncast 15% 页通过删除其中一个玻璃板材。
  9. 用荧光染料溶液 (10 µL) 在25毫升0.5x 的玻璃板上轻轻喷洒凝胶, 让它在黑暗中坐平5分钟。
  10. 将玻璃与凝胶放在蓝光 transilluminator 上, 并将 19 nt 和 24 nt 大小标记与标尺对齐, 以指示结扎的小 rna (图 2) 的切除。把凝胶。
  11. 将切除后的凝胶放在0.5 毫升管中, 设计成碎片凝胶切片, 安全地放置在1.5 毫升渗离心管中。离心机以 1.6万 x g 为3分钟在 RT. 并用重悬用300µL 400 毫米 NaCl 溶液的碎片凝胶, 关闭管, 并用石蜡膜密封。
  12. 在4摄氏度寒冷的房间里, 用 1100 rpm 的 thermomixer 在一夜间孵化 (16-17 小时) 上设置管。

4. 结扎 5 ' 适配器

  1. 将溶液和零碎的凝胶转移到一个5µm 过滤管, 坐在1.5 毫升渗管, 密封与石蜡膜, 和离心机为5分钟在 2300 x g 和 RT。
  2. 将950µL 100% 乙醇添加到过滤溶液中, 关闭管, 倒置搅拌, 离心机为2秒, 用石蜡膜封管, 并在冰上设置 1 h。
  3. 准备12% 页凝胶如步骤3.3 所述, 但结合12.6 毫升稀释剂, 14.4 毫升精矿, 3 毫升的缓冲, 240 µL APS, 12 µL 的 TEMED 成50毫升管。预运行12% 页凝胶30分钟 450 V (35 mA) 在0.5x。
  4. 离心纯化的小 RNA 溶液在 1.6万 x g 60 分钟在4°c。
  5. 小心地用1毫升吸管取出上清液, 去除溶液的大部分, 使用200毫升的吸管除去剩余的溶液, 而不接触颗粒。
  6. 使用一个巴斯德吸管与一个10毫升尖端连接到一个真空瓶, 仔细干燥的颗粒, 而不接触它。
  7. 并用重悬在9µL 无吹打的 RNase 水中的颗粒, 但通过轻轻地弹管, 离心机为2秒, 并设置在冰上的管。
  8. 将 10x RNA 连接酶缓冲器 (用 ATP) 新鲜地结合500µL 1 米三 pH 7.5, 100 µL 1 米 MgCl2, 50 µL 20 毫克/毫升乙酰 BSA, 200 µL 10 毫米 ATP, 7 µL 2-巯基乙醇 m和143µL 的 RNase 水。
  9. 通过弹管将 10x RNA 连接酶缓冲器 (与 ATP) 混合, 并将 2 s 离心机收集到管子底部的溶液。
  10. 设置 5 ' 适配器结扎通过增加2µL 10x RNA 连接酶缓冲 (与 ATP), 1 µL 100 µM 5 ' 适配器和6µL 50% 水中亚砜到9µL, 3 ' 条形码小 RNA 解答。
  11. 轻弹管混合, 2 s 离心机收集解决方案, 将管放在90摄氏度的散热块上1分钟, 再放在冰上至少2分钟。
  12. 添加2µL 的 T4 RNA 连接酶1入溶液 (不向上和向下), 轻拍管子, 离心机为 2 s, 并且坐管子在漂浮架在37°c 水浴为60分钟。
  13. 同时, 在 19 nt-3 适配器和 5 ' 适配器之间设置两个结扎, 24 nt-3 适配器和 5 ' 适配器之间有两个结扎。
    1. 将2µL 19 nt 3 ' 适配器 (250 ng/µL) 或 24 nt-3 ' 适配器 (250 ng/µL) 合并为: 2 µL 5 ' 适配器 (100 µM), 2 µL 10x RNA 连接酶缓冲器 (与 ATP), 6 µL 50% 水中亚砜, 6 µL 无 RNase 水和2µL 的 T4 RNA 连接酶1在1.5 毫升渗离心管。
    2. 轻拍管子混合, 离心机为 2 s, 并且设置管子在37°c 为60分钟。
  14. 在所有结扎 (纯化的小 rna, 2 结扎与 19 nt 3 ' 适配器, 2 结扎与 24 nt-3 ' 适配器) 中添加20µL 的临时变性缓冲器。
    1. 混合通过弹管, 离心机为 2, 并孵化管在一个热块90°c 1 分钟. 将所有管子转移到冰上, 并准备一个梯子 (3 毫升的梯子与20µL 的临时机场)。
  15. 用预运行的12% 页凝胶清空凝胶装置的上部储层, 并在井的水平以下添加新鲜的0.5x 溶液 (水井用长而薄的针尖吸管倒空)。
    1. 图 3所述, 用细吸管尖加载示例。
    2. 使用新鲜的 0.5x, 以填补个人水井的顶部的凝胶。
    3. 将新鲜的0.5x 到水井上的水库, 并开始12% 页电泳60分钟 450 V (35 mA)。
    4. 通过关掉发电机10分钟来暂停运行, 使凝胶降温。重新启动发电机, 并运行凝胶60分钟在 520 V (~ 25 mA)。
  16. 停止发电机, 通过反转水槽上方的设备, 清空水库, 并 uncast 12% 页, 删除其中一个玻璃板。
  17. 坐在玻璃与凝胶平, 喷雾凝胶与10µL 的荧光染料在25毫升 0.5x, 并在黑暗中孵化5分钟. 将玻璃与凝胶放在蓝光 transilluminator 上, 并将 19 nt 和 24 nt 大小标记同时对齐。指示结扎小 rna (图 3) 切除的标尺。
    1. 将凝胶和将切除后的凝胶片转移到0.5 毫升的凝胶断路器管中。关闭凝胶断路器管帽, 设置为1.5 毫升渗离心管, 并确保与石蜡膜。除去凝胶断路器管, 加入300µL 300 毫米氯化钠, 1 µL 100 µM 3 ' PCR 底漆的粉碎凝胶件在1.5 毫升管。
    2. 在一个寒冷的房间里, 在 1100 rpm 4 摄氏度的 thermomixer 上, 用石蜡膜封住管子, 在一夜 (17–18 h) 处进行搅拌。

5. 5 ' 结扎和 3 ' 条形码纯化小 rna 的反向转录

  1. 从 thermomixer 中回收管, 过滤器用5µM 滤管净化溶液。
    1. 使用1毫升吸管将溶液转移到5µM 过滤管插入到1.5 毫升渗 RNase 免费收集管。离心管3分钟, 在 2300 x g 和 RT。
    2. 丢弃过滤管并将950µL 100% 乙醇添加到含有过滤溶液的1.5 毫升离心收集管中。倒置管混合, 离心机为2秒, 并放置在冰上60分钟. 通过离心管在 1.6万 x g 和4°c 为 1 h 沉淀 RNA 颗粒。
  2. 把 RNA 颗粒干干。
    1. 打开瓶盖, 用1毫升的吸管小心地取出上清, 留下一些液体在底部。
    2. 使用20µL 吸管去除所有剩余的上清, 不接触颗粒。倾斜管, 使任何解决方案坐在对面的颗粒。
    3. 使用一个巴斯德吸管与10毫升未过滤的吸管尖端吸入上清和干燥颗粒使用真空。
  3. 并用重悬在5.6 µL 的 RNase 水中 RNA 颗粒。
    1. 在冰上解冻反向转录试剂15分钟. 通过添加3µL 5x 缓冲器, 4.2 µL 10x 核苷酸三磷酸 (dNTPs) (每2毫米), 1.5 µL dithiothreitol (德勤) 到5.6 µL 无 RNase, 设置反向转录反应。悬浮丸。
    2. 轻轻地拍打管子, 混合反应, 2 s 离心机收集溶液。在90摄氏度的热块上设置反应, 然后直接转移到 thermomixer 50 摄氏度。
    3. 把管子放在 thermomixer 上2分钟, 使温度均衡。将0.75 µL 的反向转录酶直接加入溶液中, 轻轻地搅拌, 然后将管子 thermomixer 在50摄氏度, 立即将其设置为30分钟。
  4. 30分钟后, 将管子转到95摄氏度的散热块上, 以停止反向转录。将95µL 的无 RNase 水直接添加到反向转录, 轻轻地将管混合, 并将其直接放在冰上2分钟。
  5. 用 cDNA 存储库和库 ID 标记管。

6. pcr 和大尺度 pcr 扩增

  1. 通过添加304µL 的 RNase 水, 制备新鲜的 10x PCR 缓冲液, 125 µL 2 米氯化钾, 50 µL 1 米三 pH 8.0, 10 m 氯化镁1, 2 µL 5 海卫 X-100, 1% 米6µL 在巯基乙醇渗管中的1米µL, 并保持在 RT。
  2. 结合67µL 的无 RNase 水, 组装先导 PCR 反应, 10 µL 10x PCR 缓冲液, 10 µL 10x dNTPs, 0.5 µL 100 µM 5 ' pcr 底漆, 0.5 µL 100 3 ' pcr 底漆, 10 µM 的 cDNA 库, 2 µL 的50x µL 聚合酶。
    1. 在 thermocycler 上设置两个 PCR 循环, 如下所示: 文件 1:94 °c 为四十五年代, 50 °c 八十五年代和72°c 为六十年代为10个周期, 举行在4°c;文件 2:94 °c 为四十五年代, 50 °c 八十五年代和72°c 为六十年代为2个周期, 举行在4°c。建立 thermocycler 的 PCR 反应并启动文件1。
    2. 在文件1末尾, 打开 pcr 管, 并使用20µL 吸管, 将12µL 从先导 pcr 反应转化为1.5 毫升离心管, 含3µL 5x 凝胶加载染料, 混合吹打上下, 关闭管, 并将其标记为 "10 循环"。
    3. 关闭先导 PCR 管, 并在 thermocycler 上启动文件2。在文件2的末尾, 打开 PCR 管, 并使用20毫升吸管将12µL 溶液转移到1.5 毫升离心管与3µL 的5x 凝胶加载染料, 并将其标记为 "12 循环"。
    4. 重复步骤6.2.2 和6.2.3 中描述的步骤, 从 pcr 周期14、16、18和20中的 pcr 反应中收集12µL pcr 产品。添加3µL 的5x 凝胶加载染料的每一个12µL PCR 整除数, 并到 20 nt 梯子包含3µL 的梯子和9µL 无 RNase 水。
  3. 准备2.5% 琼脂糖凝胶与0.5x。
    1. 在干净的烧杯中重2.5 克琼脂糖, 加入100毫升的0.5x。用微波炉加热溶液, 直到沸腾。从微波炉中取出溶液, 旋转瓶子混合琼脂糖, 加入 4 ul 的溴溴 (10 毫克/毫升), 并将溶液转移到 7 x 10 厘米2电泳托盘, 两端都用胶带闭合。
    2. 设置一个8井梳, 让琼脂糖凝胶固化在 RT. 将凝固的琼脂糖凝胶转化为填充0.5x 的电泳装置。
  4. 在琼脂糖凝胶上装载梯子和 PCR 样品, 并在 120 v 上运行30分钟。
  5. 评估 UV 盒上的凝胶以确定最佳 PCR 周期 (图 4A)。
    注意: 预期的 PCR 波段的大小显示在图 4B中。
    1. 观察两个不同井的 PCR 波段 (上部带: DNA 文库, 下带: 底漆脂肪酸)。
    2. 通过选择 cdna 文库可见的周期来确定 cdna 放大的适当 PCR 周期, 但底漆脂肪酸几乎看不到。
      注意: 一般情况下, 在12–16周期之间选择适当的 PCR 循环。在图 4A上, 此库的适当 PCR 周期为14。
  6. 建立了大尺度 PCR 反应 (6x 100 µL), 用于琼脂糖凝胶库的纯化。
    1. 在步骤6.1 之后, 准备一个新的 10x PCR 缓冲管。
    2. 结合435.5 µL RNase 水, 65 µL 10x pcr 缓冲器, 65 µL 10x dNTPs, 3.25 µL 5 ' pcr 底漆, 3.25 µL 3 ' pcr 底漆, 并吹打上下混合, 制备出1.5 毫升管中的大型 PCR 主组合。
    3. 将 pcr 大师组合的88µL 转移到六0.5 毫升 pcr 管中。转移10µL 的 cDNA 储存库 (储存在冰上), 添加2µL 50x Taq 聚合酶到每一个 6 PCR 管, 和吸管混合。
    4. 用77µL RNase 水、10µL pcr 缓冲器、10µL 10x dNTPs、0.5 µL 5 ' pcr 底漆、0.5 µL 3 ' pcr 底漆、2µL 的 50x Taq 聚合酶和吸管混合, 制备阴性 pcr 反应管。
    5. 使用步骤6.2.1 中描述的 pcr 循环将 pcr 管放入 thermocycler 中, 并设置最佳放大周期数。按照步骤6.3 中的描述, 用0.5x 的方法制备2.5% 琼脂糖凝胶。
  7. pcr 扩增后, 将9µL 从每一个 pcr 管转化为六1.5 毫升离心管, 含有3µL 的5x 凝胶负载染料。
    1. 通过将3毫升的梯子组合成9µL 的 RNase 水, 并将3µL 凝胶负载染料添加到1.5 毫升管中, 准备 20 nt 梯子。
    2. 将梯子、阴性 pcr 控制和 6 pcr 产品加到琼脂糖凝胶上, 在 120 v 上运行凝胶30分钟。
    3. 验证在 UV 盒上的车道上的 PCR 放大的均匀性 (取一个图像)。
    4. 将 3 PCR 反应组合成两个1.5 毫升的渗离心管 (3x 91 µL), 添加27µL 5 米氯化钠和950µL 100% 乙醇。反转管混合, 并设置在-20 °c 过夜, 以沉淀 PCR 产品。

7. cDNA 文库的纯化和评价

  1. 离心两管与 PCR 反应在 1.6万 x g 60 分钟在4°c。
  2. 用1毫升的吸管取出上清液, 然后将试管与上侧的小球和下部的液体倾斜, 然后使用一个巴斯德吸管连接到带有浴缸的真空瓶, 并在巴斯德吸管的末端吸出10毫升尖端的液体。
  3. 建立 PmeI 文摘。
    1. 并用重悬17.5 µL 的 pcr 球团之一, 核酸酶游离水, 并将悬浮颗粒转移到第二 pcr 球团。添加2µL 10x 缓冲和0.5 µL 的 PmeI 酶, 并设置在水浴中的消化2小时37°c。
    2. 用 0.5x (步骤 6.3) 制备2.5% 琼脂糖凝胶。添加6µL 的5x 凝胶加载染料到文摘。将每个摘要的13µL 转移到琼脂糖凝胶的两个相邻井中, 在末端井上装载 20 nt 大小的梯子, 并在 150 V (图 4D) 上运行90分钟的凝胶。
    3. 在 UV 盒上从凝胶上将上面的 PCR 带上, 将凝胶件转移到刚重1.5 毫升的离心管中, 并在鳞片上称量凝胶片。
  4. 在制造商的指导下, 使用凝胶萃取试剂盒纯化已切除的 PCR 扩增 cDNA 文库。按照制造商的指示, 使用 DNA 定量分析和仪器量化 cDNA 文库。
  5. 使用 Bioanalyzer 上的高灵敏度 DNA 芯片评估 cDNA 文库的大小和纯度 (图 5)。使用高通量系统对 cDNA 库进行序列处理。将 FASTQ 数据文件传输到 RNAworld 管道以进行适配器修整, 并将其与人类基因组对齐, 以确定 miRNA 序列。

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Representative Results

如本方法所述, 共有18个单独的 FFPE RNA 样本 (每100个) 被设置在单独的管中, 接受 3 ' adenylated 条形码寡核苷酸 T4 结扎过夜。第二天, 酶反应是热停用, 组合, 并沉淀在一个单一的管。rna 颗粒是悬浮和结扎 rna 分子分离在15% 变性聚丙烯酰胺凝胶 (页), 其中 RNA 寡核苷酸大小标记迁移在相邻的水井的页面凝胶, 用于选择适当大小的 3 ' 条形码小 rna (图 2)。切除后的凝胶片在 NaCl 溶液中孵化, 洗脱结扎的 RNA 分子。第二天, 洗脱 RNA 沉淀, 并执行 5 ' 适配器结扎。然后, 5 ' 适配器结扎小 RNA 分子迁移和分离在12% 丙烯酰胺凝胶, 再次迁移 RNA 大小标记寡核苷酸允许大小切除的小 rna 包含 3 ' 条形码寡核苷酸和 5 ' 适配器 (图 3)。该切除凝胶是在一夜之间的 NaCl 溶液孵化, 以允许洗脱的 RNA。第二天, 结扎的小 RNA 分子沉淀, 颗粒在无 RNase 水中悬浮, 其次为反转转录;整除的 cDNA 分子经历了一个先导性 PCR 反应 (图 4A)。使用同一输入的 cDNA 文库的大型 pcr 反应建立和评估2.5% 琼脂糖凝胶, 以验证所有反应是充分 PCR 扩增 (图 4B), 在池和隔夜乙醇沉淀之前。第二天, 放大 cDNA 库包含所有18个单独的图书馆为18个独特的 FFPE RNA 标本, 迁移到2.5% 琼脂糖凝胶, 和最高 PCR 波段, 运行在 100 nt 是切除和纯化 (图 4C)。然后在高灵敏度的 DNA 芯片 (图 5) 上对 cDNA 文库进行纯化, 以确定纯化的 pcr 产物不含过量的底漆脂肪酸或 pcr 反应的其他副产品。然后在高通量测序系统上对 PCR 产物进行分析。适配器修剪和生成18个单独的文件为每一个18标本使用 RNAworld 管道 (访问是提供给我们的托马斯博士 Tuschl)。然后进行 Biostatistical 分析, 评价 FFPE RNA 标本的 miRNA 含量。

为了验证这个优化的过程, 匹配的新鲜冰冻和 FFPE 乳腺肿瘤标本用于分析 (图 6)。选择了两种类似的侵袭性导管乳腺癌 (IDC) 肿瘤, 以评估该程序的敏感性, 并确定两个新鲜冰冻组织之间发现的 miRNA 表达差异是否也可以在匹配的存档 FFPE 中检测到。RNA 标本。在本实验中, 对2新鲜冷冻的总 RNA 的质量和匹配的两个 FFPE rna 样本进行了评估 (图 6A)。正如预期的, 与匹配的新鲜冷冻 rna 相比, FFPE 标本的 RNA 大小和质量严重下降 (比较车道1和 3, 车道2和 4)。其中一个 FFPE RNA 已存档在 rt 4 年 (侵袭性乳腺癌 1, (IBC1)), 另一人已存档在 rt 8 年 (IBC2), 而新鲜冰冻对应储存在-80 摄氏度。在单个库中分析了四个单独的 RNA 样本, 使用了4个单独的条形码, 并且 miRNA 读取分布图显示在图 6B中。两个顶部板显示两个新鲜的冰冻肿瘤 rna 和它们的特异 FFPE RNA 标本 miRNA 表达的相关性。配对新鲜冷冻和 FFPE miRNAs 之间的地块表明, cDNA 文库的制备提供了良好的重现性, 因为在不同的标本中检测到的 miRNAs 之间可以观察到较高的相关性 (冷冻 vs FFPE)。两个较低的面板显示 miRNA 表达数据之间的关系, 两个不同的冰冻肿瘤和两个不同的 FFPE 肿瘤。如图 6C所示, 两个新鲜冰冻肿瘤之间发现的 miRNA 表达差异与两个匹配的 FFPE 肿瘤标本之间检测到的差异相关。新鲜冰冻和 FFPE 肿瘤均可检测 miRNA 表达差异的意义。

为了进一步评估这种方法的敏感性, 使用了来自12个存档 FFPE 标本和4个新鲜冰冻 RNA 标本的 miRNA 表达数据 (图 6D)。16种不同的 RNA 标本分别为 3 ' 条形码, 全部用于制备单个 cDNA 文库。该库中使用的 rna 样本包括两个乳腺细胞系, MCF10A (正常样细胞线) 和 MCF7 (乳腺癌细胞系) 与 RNA 从新鲜细胞和他们的存档 FFPE 对应23, 匹配新鲜冷冻和 FFPE RNA 样品从两个乳腺癌样本独立分析 (IBC1 和 IBC2 在图 6A6B), 并匹配新鲜冰冻和 FFPE RNA 样本从正常宫颈标本 (Cx)。此外, 存档的 FFPE 标本从正常的 (正常 Br1, 正常 Br2, 正常 Br3) 和癌症乳房组织 (ibc 5, ibc 6, 和 ibc 7), 没有他们新鲜冰冻对应的分析。正如观察到的热图, 无论新鲜冰冻或 FFPE RNA 起源, miRNA 表达谱的同一细胞 (MCF10 或 MCF7), 或相同的组织 (IBC1, IBC2, 或 Cx) 聚集在一起。此外, 正如在无监督的群集上指出的, 从左到右, 正常的乳房细胞和组织聚集在一起, 而乳腺肿瘤和肿瘤细胞聚集在右侧。宫颈组织显示不同的 miRNA 表达谱, 聚集在热图的右侧。

考虑到大多数临床存档的 FFPE 标本没有新鲜冰冻的对应, 但它们可以在不同贮存期后检索, 因此寻求确定最佳 cDNA 文库准备协议是否适用, 并重现与越来越老的 FFPE 标本。如图 7所示, 获得了存档了18、20、22、27、30和35年的 FFPE 组织中的 miRNA 表达式配置文件。rna 被提取使用优选的同时 rna 或脱氧核糖核酸做法21和皮带 RNA 整除数从每个单独 FFPE 标本在同一天被准备了并且存放了在-80 °c 在图书馆准备之前。共对9种不同的 FFPE 标本进行了重复分析, 其中每个 RNA 整除在同一图书馆内以不同的条形码寡核苷酸 (18 码总) 结扎。这项实验在连续两周 (1 周和2周) 重复进行。这允许在单个库中使用两个不同的条形码, 并在两个不同的库之间用一周时间间隔来评估 cDNA 文库的制备重现性。正如在图 7中所观察到的, 无论标本的年龄或库准备周如何, 相关系数仍保持在0.96 以上;因此, 优化的 cDNA 文库准备协议为 FFPE 标本的重现性分析提供了强有力的工具, 无论其存档时间如何, 例如, 35 岁的存档 FFPE RNA (见乳房 #9) 显示高重现性措施相当于20岁的 FFPE RNA 样本 (见乳房 #3)。

Figure 1
图 1: 寡核苷酸.本文介绍了所有的寡核苷酸序列、相应的化学修饰和在本协议中使用的浓度。化学修饰的类型在修改框和寡核苷酸序列中显示的缩写修改中描述。校准剂鸡尾酒显示10个单独 RNA 寡核苷酸校准器名单, 在包含载体寡核苷酸 (0.5 µM) 的解决方案中悬浮。十八 3 ' 条形码寡核苷酸适配器是详细的灰色阴影在条形码的序列。详细介绍了 5 ' 适配器的 RNA 序列, 以及 3 ' pcr 和 5 ' pcr 引物的 DNA 序列。提供了两个大小标记寡核苷酸的 RNA 序列, 即协议中引用的 19 nt-3 适配器和 24 nt-3 适配器大小标记。所有的 DNA 和 RNA 寡核苷酸都是商业购买。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 页面纯化 3 ' 条形码 RNA 样品.在共用和沉淀18条形码 rna 样品后, 悬浮 rna 颗粒通过电泳在15% 丙烯酰胺凝胶上迁移和分离 (见 8)。红色正方形突出了包含 3 ' 条形码 microRNAs 的区域, 它被切除与手术刀刀片并且转移入一个核酸酶无渗离心管。共有四口井, 其中两个包含 19 nt-3 适配器和两个包含 24 nt-3 ' 适配器是设置了一个很好的, 在图书馆的每一侧 (见水井 5, 6, 10, 11, 分别)。作为测试 T4 RNA 连接酶1和为净化的结扎尺寸标记将完成第二天, 结扎反应包含 19 nt-3 ' 适配器大小标记与 5 ' 适配器和 24 nt-3 ' 适配器大小标记与 5 ' 适配器运行在井2d 3, 分别。黄色方块显示的切除带代表结扎大小标记 RNA 寡核苷酸与 5 ' 适配器。这些带被纯化, 沉淀, 并运行在12% 页净化 (请参见下面的图 3 )。井1和13包含 20 nt 大小梯子, 帮助确定被结扎的产品的预期的大小。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 在 5 ' 适配器结扎后净化库的页面纯化.纯化的 RNA 库被结扎与 5 ' 适配器和预期的产品大小被切除从12% 页使用结扎大小标记 (参见红色正方形)。T4 rna 结扎的产品在 19 nt-3 ' 适配器和 5 ' 适配器 (井4和 9) 之间, 并且24个 nt-3 ' 适配器和 5 ' 适配器 (井5和 10) 之间平行地运行, 在包含 RNA 图书馆的井的每边。最高波段 (见白星号) 是 5 ' 适配器结扎的产品, 并用作用于包含 5 ' 适配器结扎 RNA 库的凝胶带切除的指南。在上一页上提纯的结扎尺寸标记结扎产品, 运行在3井。如在水井1和12中所观察到的, 20 nt 大小的梯子也被运行以验证 RNA 库的预期大小。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 初步 PCR 和大规模放大 cDNA 文库.用2.5% 琼脂糖凝胶在溴溴化物的存在下, 对 PCR 产物的大小和配比进行了评价。(A) 在条形码 RNA 库的反向转录后, 使用 5 ' 和 3 ' pcr 引物在单一的 pcr 反应中放大了 cDNA 文库的整除。整除数的 PCR 反应得到了 10, 12, 14, 16, 18 和20循环和迁移在一个2.5% 琼脂糖凝胶。在井1和7之间观察, cDNA 库和适配器脂肪酸的存在是指数可见的 (参见绿色矩形)。对于该文库, 选择用于扩增 cDNA 文库的 PCR 循环为15。(B) 此示意图显示了不同的寡核苷酸的位置和长度, 以及由此产生的 RNA 和 DNA 产品, 它们可在页面上和琼脂糖凝胶上识别。(C) 对6种大型 PCR 反应 (在A中确定) 的整除数分别在2.5% 琼脂糖凝胶上进行了分析 (见水井3至 8)。这两种类型的 PCR 产品, 即图书馆 (上带) 和引物脂肪酸 (下带) 是可见的在这个凝胶 (见绿色矩形)。无 cDNA 的空白 pcr 反应不显示 pcr 放大 (参见井 2)。20 nt 大小的梯子允许验证产品尺寸 (见 1)。(D) 在蓝色光 transilluminator 上的凝胶图像, 包含聚合 PCR 反应的2.5% 琼脂糖凝胶在两个相邻的井中运行。观察到, 两个井中最高的波段是在预期的库大小内, 适配器二聚体带位于下面。用凝胶萃取试剂盒对上 PCR 带进行切除纯化。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 对纯化 PCR 扩增 DNA 库的评估.采用高灵敏度的 DNA 芯片对微流体平台进行 PCR 扩增 cDNA 文库的小整除 (1 µL) 分析。(A) 此面板显示用于校准仪器的尺寸标记的迁移。(B) 此面板显示纯化 PCR 扩增 cDNA 文库的迁移。最高峰值以100的 bp (见星号) 的大小来衡量, 并代表 cDNA 文库。该仪器对 72 bp 的小峰进行了评估, 表示底漆适配器脂肪酸。基于微流体平台检测到的 100 bp 峰值显示了扩增 cDNA 文库的估计大小, 其中包含18个单独的条形码 RNA 样本, 用于随后的高通量测序系统。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 使用匹配的新鲜冷冻和福尔马林固定石蜡嵌入标本的 cDNA 文库制备和下一代测序.(A) 从匹配的新鲜冰冻和 FFPE 侵袭性导管癌 (IDC) 肿瘤中提取的总 rna, 在一个基于微流体的平台上对总 rna 芯片进行了分析。(B) 匹配的新鲜冷冻和 FFPE 标本 (IBC 1 和 IBC2) 的总 RNA 接受了 cDNA 文库准备协议, 绘制了 miRNA 测序数据。(C) DifferentialmiRNA IBC1/IBC2 标本之间的表达, 以及冷冻和 FFPE 配对样品之间的相关性。miRNA 表达式以每百万 (CPM) 的对数计数显示, 从高到低读取 (红色到蓝色)。两个组织对的表达差异的意义, 每 miRNA, 是显示的灰色圆圈, 高和低表达 miRNAs 确定在新鲜和 FFPE 样品。(D) 从乳腺细胞系的新鲜和 FFPE rna 标本 (MCF10A 和 MCF7)、人侵袭性乳腺癌 (IBC 1 和 IBC2)、宫颈组织 (Cx)、存档正常乳腺组织 (正常 Br1、正常 Br2 和正常 Br 3) 中提取的总 rna, 以及归档侵袭性乳腺癌 (ibc 5, ibc 6 和 IBC7) 在同一运行中接受了 cDNA 文库的准备。在库中检测到的 miRNAs 数据将显示在热映射配置中。此数字已从 Loudig et . 中进行了修改。20请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 使用较旧的存档 FFPE 标本进行复制的 cDNA 库准备和 miRNA 表达式相关性.总 RNA 从 18, 20, 22, 27, 30 和35年老归档的 FFPE 乳房组织标本接受了我们优选的 cDNA 文库准备协议。从9种不同的 FFPE 标本中复制 RNA 样本, 用不同的 3 ' 条形码寡核苷酸结扎, 并在1周 (w1) 的同一图书馆内进行分析。同样的实验在一周的时间间隔内重复 (2 周或 w2)。重复 miRNA 表达数据的重现性措施在同一存档的 RNA 标本之间显示在 heatmaps 和相关系数评估在0.93 和0.99 之间。此数字已从 Loudig et . 中进行了修改。20请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

本文提出了一种高重现性和健壮性的 cDNA 文库制备方法, 用于在 FFPE RNA 标本中存档的小 rna, 该协议是 Hafner et . 所描述的程序的修改和优化版本。22

本协议的所有步骤都已经过优化, 可用于从 FFPE 标本中恢复的较旧的存档和已损坏的总 RNA。该协议的关键步骤, 用于处理少量的 FFPE rna, 驻留在与18唯一3条形码适配器单独结扎后的所有 rna 样本 (, 18 个单独的 100 ng FFPE RNA 样本) 的集合中。这一关键步骤允许 18 FFPE rna 样本一致接受所有后续的生物化学和酶步骤, 以准备小 RNA cDNA 文库。此外, 这一步通过提高小 RNA 分子的载体效应和促进颗粒观察和凝胶选择, 使降水和凝胶纯化的 RNA 数量最大化。该协议的另一个主要特点是, 在使用少量 FFPE RNA 时进一步强调了它的通用性, 即采用 PCR 反应来确定 cDNA 文库的最佳放大周期。这一步骤还提供了对图书馆扩增与底漆二聚体放大的动态的洞察, 这在制备大尺度 PCR 反应和纯化琼脂糖凝胶上的小 RNA 库方面是至关重要的。添加到本协议中的数据表明了这种方法在匹配的冷冻和 FFPE 标本之间的重现性, 同时也突出了它对较早的 FFPE RNA 样品的适用性, 这些标本存档了长达35年。

该协议是从其原始版本修改, 因此, 它是为制备小 RNA 库, 由低质量和数量的化学修饰和损害 FFPE rna。这一程序的一个方面被修改, 以成功地结扎和放大的小 rna 从 FFPE 标本是在 3 ' 条形码适配器结扎期间校准器鸡尾酒的数量, 其中输入减少到 0.026 nM, 以防止与低 abundancy 小 rna 结扎的竞争在 FFPE RNA 样品存在。对原程序的另一项重要修改是清除在页面凝胶上选择结扎的小 rna 时使用的所有放射性标记尺寸标记。这些核素大小标记的使用不仅限制了这种方法对使用无线电同位素认证的实验室的适用性, 而且也阻止了对凝胶上的 RNA 产品的观察。相反, 在这个优化的协议中, 大小标记在与库相邻的井中运行, 在页上凝胶上, 并直接与荧光染料可视化, 直接切除结扎的小 rna。重要的是, 荧光染料轻轻喷洒在凝胶上, 以防止 RNA 产品的扩散, 然后在一个蓝色的灯箱上形象化。随后, 作为预防措施和改善被结扎的小 rna 被包含在切除的页凝胶片断的扩散, 凝胶断路器管被用来均匀粉碎凝胶之前, 在一个 NaCl 溶液孵化过夜, 在4摄氏度下搅拌。所有这些步骤都经过仔细评估, 以使用少量的材料。

该协议适用于不同来源 (器官和机构) 的 FFPE RNA 样本, 这些样品已经储存了不同的时间。分析表明, 在使用这种优化过程中, 新鲜和冰冻标本对小 rna 的测序具有很高的重现性。使用保存长达35年的较旧的存档 FFPE 标本进行的额外分析进一步证明了该议定书对临床标本的广泛适用性。FFPE 标本的最小 FFPE RNA 输入要求被证明是 100 ng。这种低要求允许本协议适用于不同大小和可用性的各种病变, 但不允许对单细胞 FFPE RNA 进行分析。然而, 重要的是要注意的是, 这个优化的协议也被用于从循环外来体提取的总 RNA 与小于 1 ng 的输入, 并显示提供高度可重现的小 RNA 表达谱 (没有显示的数据)。这一低输入表明, FFPE 样品中的小 rna 虽然是原始新鲜组织的代表, 但比循环外来体中的总 RNA 存在的比例要低得多。

在最近的研究中, 将此优化的协议应用于临床分类 DCIS FFPE 标本, 发现通过定量 PCR 技术可以验证 cDNA 文库中的 miRNA 表达差异。这项工作表明, 使用 DCIS 病变的存档组织从不同的机构进行大规模的回顾性研究 [20]。这项研究还强调了这种 cDNA 文库在不同时间 (几周的间隔时间) 进行的健壮性, 而不影响化验的重现性和敏感性。

考虑到大量临床分类存档的 FFPE 标本, 该优化协议为在大规模回顾性分析中制备 cDNA 文库和 miRNA 生物标志物的潜在鉴定提供了有力的工具。与癌症发展相关的21

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Disclosures

作者希望披露一份载有本手稿中的一些数据的出版物是在《国际分子科学杂志》上发表的, Loudig et21

Acknowledgments

我们感谢 Tuschl 博士, RNA 分子生物学实验室的主任, 以及他的实验室成员的支持和分享在他的实验室开发的技术, 并提供进入 RNAworld 管道。我们还感谢马库斯. Hafner 博士分享他的协议, 并详细描述了他的最初程序中使用的所有生化和酶步骤。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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