ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ホルマリン固定パラフィン包埋標本を表す人間の病気の分子バイオ マーカーの貴重な情報源。実験に基づく cDNA ライブラリの準備プロトコル、最初に新鮮な冷凍 RNA をデザインおよび最適化組織からアーカイブされたマイクロ Rna の解析に格納された 35 歳までをご紹介します。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

-アーカイブ、ホルマリン固定を臨床的に分類 (FFPE) 組織のパラフィン包埋は癌の開発の回顧的な分子研究の核酸を提供できます。後で侵襲性疾患を発症した患者から非侵襲や前癌性病変を使用して、遺伝子発現解析は、癌リスクにし向ける初期の分子変化を識別を助けるかもしれない。FFPE 組織から回復した核酸が深刻な物理的な損傷及びその分析が難しく、一般的に適応アッセイ化学修正を受けているも記載されています。マイクロ Rna (Mirna) ただし、少人数のクラスを表す長期保存に耐えるし、FFPE サンプルの解析に成功するまでのみ 〜 18-24 をまたがる RNA 分子のヌクレオチドが示されています。ここで提案する、3' バーコード相補的 DNA (cDNA) ライブラリの準備のプロトコル堅牢かつ再現性の高いアーカイブを使用する場合に示された最近アーカイブされた組織から抽出した低分子 Rna の解析用に最適化されました。35 年間の臨床標本。このライブラリの準備 (18) までの RNA のサンプルを個別 3' バーコード アダプターで結紮、後続の生化学的酵素の準備のため一緒にプールし、侵害された劣化材料の多重解析に適しています分析する前に。すべての浄化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) サイズ固有選択とバーコード小さな RNA 種の濃縮が可能で行われます。この cDNA ライブラリの準備は、次世代シーケンサー (NGS) のための材料の最適な量を生成する特定の増幅サイクルの決定により、パイロットのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 分の RNA 入力によく合わせられる。このアプローチは、最大 35 年間のアーカイブの標本から劣化した FFPE RNA の使用のために最適化された、NGS の再現性の高いデータを提供します。

Introduction

Mirna がホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 標本1,2,3非常によく保存されています。前作はこれら短い規制非コード鎖 RNA 分子の式 FFPE サンプルからの総 RNA を使用して正常に評価することができ、元の新鮮なと比較した場合の関連する遺伝子発現データを示しています。組織4,5,6,7,8。大型メッセンジャー RNAs は、批判的に FFPE ティッシュの処理 (ホルムアルデヒド、熱、乾燥、)、内因性 RNases、miRNAs (~ 18-24 の小型試験片の年齢によって影響を受けることが示されていると比較した場合ヌクレオチド) の低下に耐性とアーカイブされた標本9の高スループット mRNA 研究をアウトパ フォームする miRNA 発現研究により実証するも、長期的なストレージに弾力性のあるようにするが表示されます。各種マイクロ アレイ技術と最も最近 NGS、大抵小規模解析で行われている、アーカイブの臨床検体を用いた miRNA 発現研究がその 1 つを示したまたは定量的 PCR の試金を多重化これらの試金の1011,12,13,14の最適化後保存 Mirna の発現を評価するために使用します。

MiRNA 発現の調節不全は、さまざまなひと悪性腫瘍の開発に関連付けられている、アーカイブされた標本に注釈を付けることがある潜在的の巨大な供給臨床的に、明らかになるが、これらの小さな RNA分子は、潜在的な癌バイオ マーカー15,16,17,18の有望なソースを表します。NGS などの高速遺伝子発現技術の使用すべての miRNA 議事 PCR および/またはマイクロ アレイ19など対象のテクノロジと比較したときのグローバルな評価を提供することの利点があります。このため、NGS の古いアーカイブされた標本からの Rna の cDNA ライブラリの準備のために最適化された、手頃な価格で、簡単に該当するプロトコル20大規模な回顧的な研究を可能にする最適化を行った。

以前、現代的な商業キット21をアウトパ フォームすることがわかった古いのアーカイブされた標本からの RNA と DNA の別個の回復の同時 RNA/DNA の抽出のプロトコルを設立しました。この抽出のプロトコルを使用すると、時間の延長期間にアーカイブ FFPE 組織からの総 RNA を取得、miRNAs の 35 年間の臨床検体の保存の NGS の cDNA ライブラリの準備を最適化されています。さらに、最近発行された研究はどこ我々 は cDNA ライブラリからその場で臨床的に分類された乳管癌 (DCIS) 標本を作製、示される定量的 PCR によって検証された発現の Mirna がわかりました特定のマイクロ Rna 発現が変化することは、DCIS 乳癌乳癌を発症しない患者から浸潤病変と比較して発症した患者から病変の検出可能性があります。

最適化できない特許/著作権保護されている試薬の使用と同様、商業キット小さな RNA の cDNA ライブラリの準備のため、その中止の可能性のコストを考慮して以前に発行された適応することにしました実験室ベースし、キット無料 3' バーコード cDNA ライブラリ FFPE 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS のプロトコル準備、22のサンプル 18 の同時解析を許可します。このプロトコルは FFPE RNA 試料への適応のために重大だった、外観および技術的な評価のチェックポイントと理想的なステップバイ ステップの手順を提供し、妥協の困難な他の情報源への適用の強い可能性があります。RNA の材料を使用します。元の議定書の適用性 (例えばSYBR 金) 蛍光放射能標識サイズ マーカーを置き換えることによって改善された大きいポリアクリルアミドゲルに結紮図書館の選択時に使用される RNA サイズ マーカーを検出します。最適化されたプロトコルはこの 3' が 18 個々 FFPE RNA 標本にバーコードのアダプターの ligation 依存し、5' アダプター結紮術を受けることに一緒にプール、逆転写とパイロットの PCR 解析合わせた最終的な cDNA の拡大高速シーケンサーの大規模な PCR 増幅、浄化、NGS の前にライブラリ。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. すべての試薬およびプライマーの準備

  1. 図 1に示したすべてのプライマーとアダプターを注文します。
  2. それぞれの個々 の結紮でスパイクするカクテル株式キャリブレータを準備します。
    1. RNase フリーの水で 0.5 μ M にキャリア オリゴヌクレオチド (図 1) を再懸濁します。0.5 μ M キャリア オリゴヌクレオチド ソリューションを使用して 100 μ m まで 10 キャリブレータ オリゴヌクレオチド (図 1) を再懸濁します。
    2. 100 μ M カクテル キャリブレータ株式を取得するシリコーンの遠心で 10 キャリブレータのそれぞれの 10 μ L を組み合わせて、-20 ° C で保存する 0.026 nM ソリューションを準備
  3. 50 μ M (図 1) の最終的な集中に RNase フリー水と 20 のユニークな凍結乾燥、adenylated 3' アダプターを希釈します。
    注: 個々 のシリコーン チューブ内の各アダプターから 2.5 μ 因数を準備し、2 年間-80 ° C で保存することをお勧めします。
  4. 脱塩 19 nt 3 を再懸濁します ' アダプターと 24 nt 3' アダプター サイズ マーカー オリゴヌクレオチド 250 ng/ml (図 1)。
  5. RNAse フリー水で 100 μ M の高速液体クロマトグラフィー精製 5' アダプターを再懸濁します。100 に 5' と 3' プライマーを再停止しなさい μ M RNase フリー水 (図 1) を使用しています。
    注: 因数 1-2 実験と-80 ° C でストアに必要な量のすべてのオリゴヌクレオチド
  6. (PAA) ゲル 1% 98.8% ホルムアミドを組み合わせることでローディングの染料 (v/v) 0.5 M Na2H2 EDTA、pH 8.0、および 0.2% ブロモフェノールの青変性ポリアクリルアミドゲルを準備し、-80 ° C で 1 ml を設定
    1. ヌクレアーゼ フリー水 50 mL に Na2H2 EDTA 粉末 18.6 g を追加して 0.5 M Na2H2 EDTA 溶液を準備します。PH 8.0 に到達する NaOH のペレットを追加します。0.5 M Na2H2 EDTA、pH 8.0 原液を取得する 100 mL にボリュームを調整します。
    2. ブロモフェノール別 15 mL チューブに青の 15 mg の重量を量る。ヌクレアーゼ フリー水の 600 μ L を追加します。脱イオン ホルムアミドの 14.25 mL を追加します。0.5 M Na2H2 EDTA、pH 8.0 ソリューションの 150 μ L を追加します。
    3. 因数-80 ° C で 1 mL 因数で 15 mL の PAA の最終的な解決
  7. Agarose のゲル 0.2% ブロモフェノールの青、0.2% キシレンシアノール FF や Na2H2 50 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、20% を組み合わせることでローディングの染料 × 5 を準備 Ficoll 型 400。
    1. 2H2の 1.86 g を再停止しなさい-EDTA はヌクレアーゼ フリー水常温 (RT) マグネチックスターラーで 400 mL のビーカー 50 mL に。PH 8.0 に到達する NaOH のペレットを追加します。50 mM Na2H2 EDTA 溶液を得るために 100 mL に到達するヌクレアーゼ フリー水を追加します。
    2. ブロモフェノール ブルー パウダー 20 mg、キシレン cyanol FF パウダー 20 mg、Ficoll 型 400 粉末 2 g の重量を量るし、50 mM Na2H2 EDTA の 5 mL で再懸濁します。
    3. 渦管の 3 つが含まれている染料や 50 mM Na2H2 EDTA の 5 mL を加えます。5 x agarose のゲルのローディングの染料を混ぜて、1 mL 因数を準備し、-80 ° C で保存

2. 18 の個々 の RNA サンプルを 3' バーコード アダプターを設定します。

  1. 18 RNA 個体を識別 (前検体 100 ケイ化 1.5 mL 遠心チューブにヌクレアーゼ フリー水の 9.5 μ L で ng) と 10 分のために霜に氷のチューブをセットします。
  2. (ATP) なし RNA リガーゼ バッファー新鮮な x 10 を準備します。
    1. ケイ化 1.5 mL 遠心チューブに RNase フリー水の 343 μ L、500 μ L トリス 1 M pH 7.5、1 M MgCl2、50 μ L 20 mg/mL ウシ血清アルブミンの 14 M 2-メルカプトエタノールの 7 μ ・ 100 μ L を組み合わせます。2 遠心チューブをフリックでミックス 2,000 g と RT とのセット アイス x で s。
      注: すべての手順このプロトコルを示す"2 の遠心分離機 s"ベンチトップ遠心管の下にソリューションを収集する RT と 2,000 x g の最高速度で実行されます。
  3. 水 1 ml の DMSO ケイ化 2 mL 遠心チューブに RNase フリー 1 mL を追加することによって 50% 水溶液 DMSO 在庫を準備、アルミ箔にチューブを巻いて、室温保存
  4. ケイ化 1.5 mL 遠心チューブに以下の順番で組み合わせることで氷上で 10 分間準備結紮マスター ミックス 0.026 nM キャリブレータ カクテルを解凍: 40 μ L の RNA リガーゼのバッファーと 200 mL のピペットを使用して 50% 水溶液 DMSO の 120 μ L x 10、10 μ L ピペットを使ったカクテル 0.026 nM キャリブレータの 10 μ L を追加。ミックスは、2 s、およびセットの遠心分離機に 1.5 mL チューブをフリックそれ氷の上。
  5. 優しくのフリック チューブ、2 s、および氷の上の店、遠心分離、18 個別に検体 FFPE RNA サンプルのそれぞれに結紮術マスター ミックスの 8.5 μ L を追加します。
  6. 各 18、3' バーコード アダプターから 2.5 μ 因数を解凍し、20 分のために霜に氷の上に置きます。
    1. 3 μ L ピペットを使用して、対応する FFPE RNA サンプルの RNA および結紮術マスター ミックス (すなわち、9.5 μ L + 8.5 μ L) を含む各アダプターの 1 μ L を転送します。
    2. ピペットの上下に、単に液体に分配していない先端を引き出します。FFPE RNA サンプル間のヒントを変更することを確認します。各管を閉じる、フリックして [ミックス、2 の s とのセットの氷のための遠心分離機。
  7. 1 分の 90 ° C で熱ブロックに 18 のチューブを置くことによって反応を変化させなさい、すぐに氷の上を置きます。
  8. ケイ化新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに水 RNase フリー 10 μ L で切り捨てられた K227Q T4 RNA リガーゼ 2 の 10 μ L に希釈して結紮酵素液を準備します。
  9. 3 μ L ピペットを使用して 18 の RNA のサンプルのそれぞれ 1 μ L 希釈結紮酵素の転送 (ピペットの上下に、各チューブの間ヒントを変更)。氷上 18 を設定し、18 h の一晩インキュベートの 4 ° C の冷たい部屋に設置します。

3. 結紮の小さな Rna の精製

  1. 90 ° C で熱ブロックに 1 分の 18 のチューブを置くことによってライゲーション反応を非アクティブ化し、氷の温度が下がるまで少なくとも 2 分に戻ります。
  2. 新鮮なシリル微量遠心チューブに 5 M RNase フリーの NaCl の 26 μ L にグリコーゲンに共有にリンク青色色素の 1 μ L を追加することによって降水量マスター ミックスを準備します。
    1. 18 管のそれぞれに沈殿物マスター ミックスの 1.2 μ L を転送します。18 管のそれぞれに 100% エタノール 63 μ L を追加します。各管を閉じる、フリックして [ミックスは、2 s、および場所の遠心分離機氷のチューブ。ケイ化シングル 1.5 mL チューブにすべて 18 管の内容を結合します。
    2. 管を閉じると、3 回ミックス、遠心 2 s の沈殿物に 60 分間氷の上場所を反転します。
  3. ページの大きい (16 x 20 cm2) 15% のポリアクリルアミドゲルを準備します。
    1. キャスト 2 両面 0.1 cm スペーサー ガラス板 (シラン コーティングに安全な代替と扱われる)。
    2. 50 mL のチューブで TEMED 12 μ AP (9%) の 240 μ L、3 mL のシステム バッファー システム集中 18 mL 希釈システムの 9 mL を組み合わせます。
    3. 30 分間室温で固めるゲルのページ ゲル溶液 30 mL ピペットを使用してガラス板との間の転送、14 も櫛 (0.1 cm 厚) を挿入させ
  4. X g と 4 ° C, 60 分 16,000 でプールを持つ 1.5 mL チューブを遠心します。
  5. 櫛を削除します。きれいな RNase フリー豊富と井戸水井戸の中に到達し強制的にうまく (1 つずつ)、シンク上のアクリルアミド非重合その端に 200 μ L チップとホヤの瓶を使用します。設定、15% ゲル装置ページで Tris ホウ酸 EDTA (TBE) ソリューション、x 0.5 で貯水池を埋めるし、前 450 V で 30 分のためのゲルを実行します。
  6. 遠心分離機からプールを持つ管を回復し、慎重に RNA のペレットを乾燥します。
    1. 1 mL ピペット チップで上清を除去、下部にいくつかの液体を残します。チューブを傾斜し、20 mL のピペットを使用してペレットに触れることがなく残りの上清を削除します。真空の吸引管、ペレットに触れることがなくその終わりを 10 μ L チップ パスツール ピペットを使用しています。
    2. チューブをフリックすることで RNase フリー水の 20 μ L の RNA ペレットを再懸濁します。2 遠心分離機 RT を座って 1 分の 90 ° C ではチューブを設定し、すぐに氷の場所、RNA を再懸濁します、フリックをミックスしてソリューションを読み込み PAA ゲルの 20 μ L を追加します。
  7. (図 2) の両側 2 空井戸を残して新鮮な 0.5 の x TBE、および負荷、はしごサイズ マーカーとゲルの中央に結紮 miRNAs ゲル装置の置換、0.5 x TBE。
  8. 450 V でゲルを実行 (35 mA) 60 分、10 分、クールダウンして 520 V で再実行のための実行を一時停止 (25 mA) 別 60 分 Uncast 15% のガラス板の 1 ページ。
  9. 軽くスプレーをガラス板の上に座ってゲル TBE, せ x 0.5 mL の 25 に蛍光色素溶液 (10 μ L) で、それは暗闇の中で 5 分のためのフラット座る。
  10. 青い光 transilluminator のゲルのガラスを置き、両方の 19 を合わせ nt と結紮 Rna (図 2) の切除を直接定規を用いて 24 nt サイズ マーカー。ゲルを切除します。
  11. フラグメントのゲルのスライス、1.5 mL のシリル微量遠心チューブにしっかりと配置されているため、0.5 mL チューブに摘出したゲルを配置します。ルートを再懸濁します 3 分の 16,000 × g で遠心分離機の 400 mM の NaCl 水溶液の 300 μ L で断片化されたゲル、チューブを閉じてパラフィン フィルムでシールします。
  12. 一晩インキュベート (16-17 h) の 4 ° C の低温室内で 1,100 rpm で thermomixer の撹拌にチューブを設定します。

4. 5' アダプターの結紮

  1. ソリューションを転送し、5 μ m のフィルターに断片化されたゲル チューブのケイ化 1.5 mL チューブに座っているパラフィン フィルム シール、g および RT x 2,300 で 5 分間遠心
  2. フィルタ リング ソリューションに 100% のエタノールの 950 μ L を追加、チューブを閉じるを混ぜて、2 の遠心分離機に反転 s、パラフィン フィルム、チューブをシールし、1 h の氷の上を設定します。
  3. 手順 3.3 で説明したページのゲル 12% を準備が 12.6 mL の希釈、濃縮、3 mL のバッファーの 14.4 ミリリットル、240 μ L の AP と 12 μ L TEMED の 50 mL チューブに結合します。12% を事前実行 450 V で 30 分間ページのゲル (~ 35 mA) 0.5 で x TBE。
  4. 4 ° C で 60 分 16,000 x g で精製された小さな RNA 溶液を遠心分離します。
  5. 慎重に 1 mL ピペットを使用してソリューションの一括削除し、200 mL のピペットを使用してペレットに触れることがなく残りのソリューションを削除する上澄みをピペットします。
  6. それに触れることがなく、ペレットを乾燥 10 mL 先端が真空フラスコに接続されている、端にパスツール ピペットを使用して、慎重に。
  7. 上下、ピペッティングすることがなく水の RNase フリーの 9 μ L でペレットを再懸濁しますが、2 s と氷のチューブの遠心分離機管を軽くフリックすることで。
  8. 1 M トリス pH 7.5 の 500 μ L を用いて RNA リガーゼのバッファー (ATP) と新鮮な x 10 の準備、100 μ L 1 M MgCl2、20 mg/mL の 50 μ L のアセチル化 BSA、10 mM ATP、2-メルカプトエタノールの 7 μ L の 200 μ L 14 M、と RNase フリー水の 143 μ L。
  9. チューブをフリック (ATP) と RNA リガーゼ バッファー x 10 をミックスし、2 の遠心分離機管の下部にソリューションを収集する s。
  10. 設定 5' アダプター結紮 (ATP) と RNA リガーゼ バッファー x 10 の 2 μ L 追加で 100 μ M 5' アダプター、および 6 μ L 50% 水溶液 DMSO 9 μ L、3' バーコード小さな RNA 溶液を 1 μ L。
  11. ミックスは、2 の遠心分離機を軽くはじくソリューションを収集するために s 管を配置は、1 分の 90 ° C で熱ブロックと、少なくとも 2 分間氷に戻る。
  12. T4 RNA リガーゼ 1 ソリューションに 2 μ L を追加 (はないピペット上下)、チューブ、2 s、および浮遊管ラック 60 分 37 ° C の水浴中に座るのための遠心分離機をフリックします。
  13. 19 nt 3 の 2 つを同時に設定 'アダプターと 5' アダプター、および 24 の nt 3 間 2 つを' アダプターと 5' アダプター。
    1. 19nt 3 の 2 μ L を組み合わせて ' アダプター (250 ng/μ L) または 24 nt 3' アダプター (250 ng/μ L): 2 μ L、5' アダプター (100 μ M)、2 μ L の RNA リガーゼのバッファー (ATP) x 10 の 50% 水溶液 DMSO、RNase フリーの水の 6 μ L の 6 μ L、とケイ化 1.5 mL 遠心チューブに T4 RNA リガーゼ 1 の 2 μ L。
    2. フリックをミックス、2 s、およびセットの遠心分離機管チューブ 37 ° C, 60 分で。
  14. PAA 変性バッファーの 20 μ L を加えるすべてを (19nt 3 と 2 を小さな Rna を精製 'アダプター、および 24nt 3 と 2 を' アダプター)。
    1. 2 遠心チューブをフリックでミックス s、インキュベート管 90 ° c 1 分転送熱ブロックと氷にすべての管および梯子 (はしごの PAA の 20 μ L で 3 mL) を準備します。
  15. 中古実行ゲル装置の上部の貯水池を空に 12% のゲルをページし、(井戸は長い、細い先端のピペットを空に) 井戸のレベルの下の新鮮な 0.5 x TBE ソリューションを追加します。
    1. 図 3で説明したように細いピペット先端とサンプルをロードします。
    2. ゲルの上に個々 の井戸を埋めるに使用新鮮な 0.5 x TBE。
    3. 新鮮な 0.5 を追加井戸と開始 12% の電気泳動の上貯水池へ x TBE 450 V で 60 分のページ (~ 35 mA)。
    4. ゲルをクールダウン 10 分の発電機を離れて転換によって実行を一時停止します。発電機を再起動し、520 V で 60 分のためのゲルを実行 (〜 25 mA)。
  16. 発電機を停止、シンク、上記装置を反転、貯水池を空に、12% の uncast ガラス板の 1 ページ。
  17. 25 mL 0.5 の蛍光色素の 10 μ L をゲルをスプレー、ゲルのフラット ガラスに座る x TBE、5 分は青色光 transilluminator のゲルとガラスを置くために暗闇の中でインキュベートし、両方の 19 を合わせ nt と両方 24 nt サイズ マーカーと結紮の小さな Rna (図 3) の切除を指示するための定規。
    1. ゲルを切除し、0.5 mL ゲル ブレーカー チューブに摘出したゲルの部分を転送します。ケイ化 1.5 mL 遠心チューブにセットし、パラフィン フィルムで固定ゲル ブレーカー チューブのキャップを閉じます。ゲル ブレーカー チューブを削除、300 mm NaCl、300 μ L、100 μ M 3' PCR プライマーの 1 μ L を 1.5 mL チューブに押しつぶされたゲル部分に追加します。
    2. 冷蔵室で一晩 4 ° C で 1,100 rpm で thermomixer の撹拌にパラフィン フィルム チューブ (17-18 h) をシールします。

5. 逆のトランスクリプションの 5' 結紮および 3' バーコード小さな Rna を精製

  1. Thermomixer とフィルターからチューブを取得は、5 μ M のフィルター チューブを備えたソリューションを浄化します。
    1. 1.5 mL に挿入される 5 μ M フィルター チューブに液を移す 1 mL ピペットの使用は、RNase フリー コレクション チューブをケイ化。2,300 g および RT × 3 分の管を遠心分離します。
    2. フィルター チューブを破棄し、フィルタ リング ソリューションを含む 1.5 mL 容マイクロ コレクションの管に 100% のエタノールの 950 μ L を追加します。ミックスは、2 s と 60 分 16,000 x g と 4 ° C 1 時間でチューブを遠心分離によって餌の RNA の沈殿物のための氷の上の場所のための遠心チューブを反転します。
  2. RNA の沈殿を乾燥させます。
    1. キャップを開き、下部にいくつかの液体を残して 1 mL ピペットで上澄みを慎重に削除します。
    2. 20 μ L ピペットを使用して、ペレットに触れることがなくすべての残りの上清を削除します。ペレットの反対側に座っている任意のソリューションを許可するようにチューブを傾けます。
    3. 上清を吸引し、真空を使用してペレットを乾燥 10 mL フィルター ピペット先端をパスツール ピペットを使用します。
  3. RNase フリー水の 5.6 μ L の RNA ペレットを再懸濁します。
    1. RNase フリー 5.6 μ L にバッファー、10 x deoxynucleotide 三リン酸 (dNTPs) (各 2 mM)、4.2 μ L およびジチオトレイトール (DTT) の 1.5 μ L x 5 の 3 μ L を追加することによって 15 分セット逆転写反応を氷の上逆のトランスクリプション試薬を解凍します。再懸濁のペレット。
    2. 軽くフリックの反応をミックスして 2 の遠心分離機管のソリューションを収集します。まさに 30 s と 50 ° C で thermomixer に直接振込み 90 ° C で熱ブロック上の反応を設定します。
    3. 温度を均一にして 2 分間 thermomixer にチューブを残します。ソリューション、ミックス、軽くフリックとチューブがすぐに 50 ° C、30 分で thermomixer にバックアップ セットに直接逆転写酵素の 0.75 μ L を追加します。
  4. 30 分後に、逆のトランスクリプションを停止する 1 分 95 ° C で熱ブロックにチューブを転送します。逆のトランスクリプションに直接 RNase フリー水の 95 μ L を追加、ミックスするチューブをフリックし、2 分間氷の上に直接設定します。
  5. CDNA のストック ライブラリ、ライブラリの ID を持つチューブにラベルを付ける

6. パイロット PCR や大規模な PCR 増幅

  1. RNase フリー水の 304 μ L 追加で新鮮な 10 x PCR のバッファー、2 M の KCl、1 M トリス ph 8.0、50 μ L の 125 μ L の準備 1 M MgCl2の 10 μ L、5 μ L 1 M 2-メルカプトエタノール シリル微量遠心チューブに 1% トリトン X-100, と 6 μ の、室温維持と
  2. RNase フリー水 67 μ、10 μ L の PCR のバッファー、10 x dNTPs、0.5 μ L の PCR プライマー 5' 100 μ M、100 μ M 3' PCR プライマーの 0.5 μ L、cDNA ストック ライブラリの 10 μ L の 10 μ L x 10 50 2 μ L を組み合わせることによってパイロット PCR 反応を組み立てる x Taq ポリメラーゼ。
    1. 設定 2 PCR サイクル、たちに次のように: 45 1:94 ° C のファイル s、85 ° C、50 s、および 60 のための 72 ° C 4 ° C で 10 サイクルの s を保持ファイル 2:94 ° C 45 s、85 ° C、50 s、および 60 のための 72 ° C 2 サイクルの s が 4 ° C で保持たちのパイロット PCR 反応を設定し、ファイル 1 を開始します。
    2. ファイルの末尾に 1、PCR チューブを開くと 20 μ L ピペットを使用して、転送 12 μ L 5 x の 3 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブにパイロット PCR の反作用からゲルのローディングの染料、上下にピペッティングで混ぜる、管を閉じる、次のラベルを「10 サイクル」。
    3. パイロット PCR チューブを閉じて、たちのファイル 2 を開始します。ファイルの末尾に 2、PCR チューブを開くと 20 mL のピペットを使用してゲル読み込み染料 × 5 の 3 μ L で 1.5 mL 遠心チューブにソリューションの 12 μ L を転送してラベルを「12 サイクル」。
    4. 6.2.2 と 6.2.3 PCR サイクル 14、16、18、20 でパイロット PCR の反作用から 12 μ L の PCR の製品を収集するための手順に記載されている手順を繰り返します。12 μ L の PCR 因数のそれぞれにゲルのローディングの染料 × 5 の 3 μ L を追加し、20 nt はしご梯子の 3 μ L と RNase フリー水の 9 μ L を含みます。
  3. 0.5 と 2.5% の agarose のゲルの準備 x TBE。
    1. きれいなビーカーの agarose の 2.5 グラムの重量を量るし、0.5 100 mL を追加 x TBE。熱ソリューション電子レンジで沸騰するまで。Agarose をミックス、臭化エチジウム (10 Mg/ml) の 4 μ L を追加し、ソリューションをテープで両端に閉鎖、7 × 10 cm2の電気泳動トレイに転送するボトルを旋回、電子レンジからソリューションを削除します。
    2. 8 よく櫛を設定して、ルート転送 0.5 でいっぱい電気泳動装置に凝固アガロースゲルで固める agarose のゲルをように x TBE。
  4. はしごと PCR agarose のゲルにサンプルをロードし、120 V で 30 分間それを実行します。
  5. 最適な PCR のサイクル (図 4 a) を識別するために UV ボックスにゲルを評価します。
    メモ: 予想される PCR バンドのサイズは、図 4 bに示されています。
    1. それぞれ、さまざまな坑井の 2 つの PCR バンドを観察 (上部バンド: DNA ライブラリ、下のバンド: プライマー二量体)。
    2. CDNA ライブラリが表示される、プライマー二量体は、ほとんどがサイクルを選択して cDNA 増幅の適切な PCR のサイクルを指定する観測可能なオブジェクト。
      注: 一般に、適切な PCR のサイクルは 12-16 サイクル間が選択されます。図 4 aにこのライブラリの適切な PCR のサイクルは 14 です。
  6. Agarose のゲルのライブラリの浄化のための大規模な PCR の反作用 (6 x 100 μ L) を設定します。
    1. 次のステップ 6.1 PCR バッファー x 10 の新鮮なチューブを準備します。
    2. RNase フリー水、10 x PCR バッファー、65 μ 10 x dNTPs 5' PCR プライマー、3.25 μ L の PCR プライマー 3' とミックスする上下ピペッティングの 3.25 μ L の 65 μ L の 435.5 μ L を組み合わせることにより、1.5 mL チューブの大規模な PCR マスター ミックスを準備します。
    3. 6 0.5 mL PCR チューブ PCR マスター ミックス 88 μ に転送します。ストック ライブラリ (氷に保存) の cDNA の 10 μ L を転送 6 PCR チューブのそれぞれに 50 x Taq ポリメラーゼの 2 μ L を追加し、ミックスにピペットします。
    4. RNase フリー水、10 x PCR バッファーの 10 μ L、10 x dNTPs の 10 μ L、5' PCR プライマーの 0.5 μ L、0.5 μ L の PCR プライマー 3'、50 x Taq ポリメラーゼとミックスするピペット 2 μ L の 77 μ L を組み合わせることにより否定的な PCR の反作用の管を準備します。
    5. PCR のサイクルは、6.2.1 の手順に従って、最適な増幅サイクル数を設定を使用してたちに PCR チューブを配置します。0.5 を使用して 2.5% の agarose のゲルの準備 x TBE、6.3 の手順で説明されているようです。
  7. PCR 増幅後ゲルのローディングの染料 × 5 の 3 μ L を含む六つの 1.5 mL 遠心チューブに各 PCR チューブから 9 μ L を転送します。
    1. RNase フリーの水と追加 3 μ L ゲル 1.5 mL チューブにローディングの染料の 9 μ L にはしごの 3 mL を組み合わせることにより 20 nt はしごを準備します。
    2. はしご、否定的な PCR の制御、および 6 の PCR の製品 agarose のゲルにロードし、120 V で 30 分のためのゲルを実行します。
    3. UV ボックス (画像を取る) の車線の間の PCR の拡大の均一性を確認します。
    4. 5 M の NaCl の 27 μ L、100% のエタノールの 950 μ L 2 ケイ化 1.5 mL 遠心チューブ (3 x 91 μ L) に結合 3 PCR 反応を追加します。ミックス、PCR の製品の沈殿物に一晩-20 ° C でそれらを設定してチューブを反転します。

7. cDNA ライブラリの浄化と評価

  1. 4 ° C で 60 分 16,000 x g での PCR の反作用で両方のチューブを遠心分離します。
  2. 1 mL ピペットで上澄みを除去し、傾斜面の上にペレットと低い側に液体チューブと浴槽を魔法瓶に接続されているパスツール ピペットを使用して、パスツール ピペットの終わりに 10 mL の先端で液体を吸引し、。
  3. PmeI ダイジェストを設定します。
    1. ヌクレアーゼ フリー水 17.5 μ L で PCR ペレットを再懸濁し、2 番目の PCR ペレットを再懸濁のペレットを転送します。バッファー x 10 の 2 μ L と PmeI 酵素の 0.5 μ L を追加し、37 ° C で 2 時間水浴のダイジェストに設定
    2. 0.5 を使用して 2.5% の agarose のゲルの準備 x TBE (ステップ 6.3)。ゲルのローディングの染料 × 5 の 6 μ L をダイジェストに追加します。Agarose のゲルの 2 つの隣接する井戸各ダイジェスト 13 μ に転送、最後井 20 nt のサイズの梯子をロードし、(図 4)、90 分の 150 V でゲルを実行します。
    3. UV ボックスにゲルからアッパーの PCR バンドを消費税、重量を量られたたて 1.5 mL 遠心チューブにゲル部分を転送し、規模でゲル部分の重量を量る。
  4. 製造元の指示、次ゲル抽出キットを使用して摘出した PCR 増幅 cDNA ライブラリを浄化します。DNA 定量アッセイと楽器、メーカーの指示に従って使用して cDNA ライブラリを定量化します。
  5. サイズとバイオアナライザー (図 5) の高感度 DNA チップで cDNA ライブラリの純度を評価します。高スループット システムを用いた cDNA ライブラリーをシーケンスします。FASTQ データ ファイルをアダプターのトリミングおよび miRNA シーケンスを識別する人間のゲノムに合わせの RNAworld パイプラインに転送します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

18 の個々 の FFPE RNA サンプルの合計方法ここで説明したよう (100 各 ng) 3' adenylated バーコード T4 のオリゴヌクレオチド ligation 一晩を受ける個別のチューブでセットアップされました。次の日、酵素反応熱非アクティブ化、結合し、単管に析出します。RNA の餌を再停止し、変性ポリアクリルアミドゲル (ページ) ページのゲルの隣接する井戸で移行 RNA オリゴヌクレオチド サイズ マーカーを使用して、適切なサイズ 3' バーコードを選択する、15% の結紮の RNA 分子を分離低分子 Rna (図 2)。摘出したゲルの部分は結紮の RNA 分子を溶出する NaCl 水溶液を一晩で孵化します。次の日は溶離された RNA の沈殿し、5' アダプター結紮を行います。5' アダプター結紮小さな RNA 分子が、移行し、もう一度移行した RNA サイズ マーカー オリゴヌクレオチドを許可する小さい Rna のサイズ切除 3' バーコード オリゴヌクレオチドと 5' アダプター (の両方を含む 12% アクリルアミドのゲルの分離図 3)。摘出したゲルは RNA の溶出を許可する食塩で夜通し孵化します。次の日、結紮の小さな RNA 分子が沈殿、ペレット、RNase フリー水、逆のトランスクリプション; 続いてで再停止されます。cDNA 分子の因数は、パイロットの PCR の反作用 (図 4 a) を受けます。CDNA ライブラリの同じ入力を使用して大規模な PCR の反作用を設定し、すべての反応が十分に PCR によって増幅される (図 4 b)、プール前に、一晩エタノールの沈殿物であることを確認する 2.5% の agarose のゲルで評価。次の日、18 のユニークな FFPE RNA 標本のすべての 18 の個別のライブラリを含む増幅 cDNA ライブラリは、2.5% の agarose のゲルとトップ PCR バンド、nt を摘出し、精製した 100 で実行している (図 4) に移行されます。CDNA ライブラリ精製し、精製 PCR の製品はプライマー二量体の過剰または PCR の反作用の他の副産物に含まれていないことを決定する高感度 DNA チップ (図 5) に評価されます。PCR の製品は、高スループット シーケンス システムに分析されます。アダプター トリミングと 18 標本のそれぞれの 18 の個々 のファイルの生成は、RNAworld パイプラインを使用して実行されます (アクセスされた博士によって私たちに提供された)。FFPE RNA 標本の miRNA の内容を評価する統計解析を行い。

これを検証する手順、新鮮な一致に最適化された冷凍 FFPE 乳房の腫瘍の標本を用いて解析 (図 6)。2 同じようなプロシージャの感度を評価し、一致した FFPE アーカイブ miRNA 表情違い 2 つ新鮮凍結組織間識別はでも検出できる場合を決定する選択された浸潤性膵管癌 (IDC) 乳がんRNA の標本。この実験のため合計 2 新鮮な冷凍と一致する 2 つの FFPE RNA サンプルから得られた rna の品質評価 (図 6 a)。予想通り、一致した新鮮な冷凍 Rna (1 と 3、レーンとレーン 2 と 4 の比較) と比較した場合、RNA のサイズと FFPE 標本の品質がひどく減少しました。4 年 (侵襲乳房がん 1、(IBC1)) の RT でアーカイブされた FFPE RNA の 1 つおよび他は RT で 8 年間 (IBC2)、アーカイブいたされた新鮮な冷凍対応は-80 ° C で保存されていた間4 つの個々 の RNA 標本分析 4 個別バーコードと分布図 6Bにプロットが表示されますを読む miRNA を用いて単一のライブラリで。2 つの上部パネルは miRNA 式 2 つの新鮮な冷凍腫瘍 Rna 特定 FFPE RNA 試料対応関係を表示します。プロット間新鮮な一致冷凍と FFPE Mirna を示す標本別々 に処理 (FFPE 対冷凍) で検出された Mirna の間高い相関が見られるよう、cDNA ライブラリの準備が良い再現性を提供しています。2 つ下のパネルでは、miRNA 発現データ 2 つの異なる冷凍腫瘍からと 2 つの異なる FFPE 腫瘍間の相関関係を表示します。図 6で示したように、miRNA 式の違いが 2 つの新鮮な冷凍腫瘍間に識別された 2 つの一致した FFPE の腫瘍の標本の間検出差と相関した.意義 miRNA の表現の違いが検出された両方の新鮮な冷凍と FFPE 腫瘍。

さらにこのアプローチの感度を評価する 12 アーカイブ FFPE 標本と 4 の新鮮冷凍 RNA 標本から miRNA 発現データが使用された (図 6)。16 の異なる RNA 標本が個別に 3' バーコードとすべて 1 つの cDNA ライブラリの準備のために使用します。このライブラリが含まれている 2 つの乳房細胞株、MCF10A で使用される RNA サンプル (通常のような細胞株) と、MCF7 (胸の癌細胞株) RNA 新鮮な細胞およびそのアーカイブ FFPE 対応23、一致から新鮮凍結と FFPE RNA サンプル2 つの乳癌からのサンプル (IBC1、図 6Aおよび6Bで IBC2) を独立して分析し、新鮮凍結を一致や FFPE RNA サンプル通常頸部検体 (Cx)。また、通常 (通常 Br1、通常 Br2 と通常 Br3) と対応する新鮮な冷凍せず癌乳房組織 (IBC 5、IBC の 6、および IBC 7) からアーカイブされた FFPE 標本を分析しました。新鮮な関係なく、ヒートマップに観測された冷凍または FFPE RNA の起源、miRNA 発現プロファイルの同じセル (MCF10 または MCF7) または同じ組織 (IBC1、IBC2、または Cx) 一緒にクラスター化します。さらに、前述の教師なしクラスターで、左から右、普通の乳房細胞や組織の乳腺腫瘍と腫瘍細胞中一緒にクラスター化クラスター右側。異なるマイクロ Rna 発現プロファイルを表示するには、子宮頸部の組織は、ヒートマップの右側にクラスター化されました。

それは最適化された cDNA ライブラリの準備のプロトコルが適用されるかどうかを定めるように努めたが臨床的にアーカイブした FFPE 標本のほとんどには新鮮な冷凍対応がありませんが、異なるストレージ期間後取得できることを考えると、ますますより古い FFPE 標本で再現。図 718、20、22、27、アーカイブ FFPE 組織からのマイクロ Rna 発現プロファイルに表示されるは、30 と 35 年が得られました。最適化された同時 RNA/DNA 手順21を使用して RNA を抽出し、個々 の FFPE 検体から四つ子 RNA 因数を同じ日に調製し、ライブラリの準備の前に-80 ° C で保存します。9 異なる FFPE 標本の合計は、同じライブラリ内で別のバーコード オリゴヌクレオチド (合計 18 バーコード)、それぞれの個々 の RNA の因数を結紮、重複して分析しました。この実験は、2 つの連続した週間 (第 1 週と第 2 週) の間に繰り返されました。これは、1 週間間隔で 2 つの異なるライブラリと 1 つのライブラリ内で 2 つの異なるバーコードを使用して同じ RNA の片の cDNA ライブラリの準備再現性評価できました。図 7に, 相関係数残った試料やライブラリの準備の週の年齢に関係なく 0.96 上したがって、最適化された cDNA ライブラリの準備のプロトコルはアーカイブ時間に関係なく FFPE 標本の再現性の高い分析のため堅牢なツールを提供しています、たとえば、樹齢 35 年アーカイブ FFPE RNA (胸 #9 参照) 高再現性のある対策を表示(乳がん #3 参照) 20 歳 FFPE RNA サンプルで注意されるそれらと等価です。

Figure 1
図 1: オリゴヌクレオチド。すべてのオリゴヌクレオチド シーケンス、対応する化学修飾およびこのプロトコルで使われる濃度を説明します。化学修飾の種類は、変更ボックスとオリゴヌクレオチド シーケンスに表示される省略形の変更のとおりです。カクテルのキャリブレータ 10 各 RNA オリゴヌクレオチド キャリブレータ、キャリア オリゴヌクレオチド (0.5 μ M) を含む溶液で再停止されるのリストが表示されます。18 3' バーコードのオリゴヌクレオチドのアダプター グレー シェーディング バーコードのシーケンスに詳述されています。5' アダプターの RNA シーケンスおよび 3' PCR および 5'、PCR のプライマーの dna 塩基配列が記載されています。すなわち 19 nt - 3 プロトコルで参照される 2 つのサイズのマーカー オリゴヌクレオチドの RNA シーケンス ' アダプターと 24 nt 3' アダプター サイズ マーカーが提供されます。すべての RNA そして DNA のオリゴヌクレオチド市販購入しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 3' バーコード RNA サンプルのページ浄化します。(よく 8 参照) ゲルのプールと 18 バーコード RNA サンプル、RNA ペレットを再懸濁が移行および 15% アクリルアミド電気泳動による分離を沈殿させる後。赤の広場は、3' バーコード マイクロ Rna、メスの刃で摘出され、ヌクレアーゼ フリー シリル微量遠心チューブに転送を含む領域を強調表示します。19 nt 3 を含む 2 つの 4 つの井戸の合計 'アダプターと 2 つの 24 の nt 3 を含む' アダプターはライブラリのそれぞれの側にも離れて設定されていた (見なさい井戸 5、6、10、11、それぞれ)。次の日、19 nt 3 を含むライゲーション反応に完成品マーカー テスト T4 RNA リガーゼ 1 および結紮サイズの浄化用として '5' アダプターと 24 nt 3 アダプター サイズ マーカー' 5' アダプターとアダプターのサイズのマーカーは井戸 2 で実行した、d 3、それぞれ。黄色の四角は、結紮サイズ マーカー RNA オリゴヌクレオチド 5' アダプターを表す摘出バンドを表示します。これらのバンドの精製、沈殿、およびページ精製時に 12% で実行 (以下の図 3を参照)。井戸 1 と 13 は、結紮の製品の予想されるサイズを確認を助けた 20 nt サイズはしごを含んでいます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 5' アダプター結紮術後に精製されたライブラリのページ浄化します。浄化された RNA ライブラリ 5' アダプターと結紮し、予想される製品サイズを 12% から摘出した結紮のサイズのマーカー (赤い正方形を参照してください) を使用してページします。19 nt 3 間 T4 RNA の製品 ' アダプターと 5' アダプター (4 と 9 の井戸) と 24 nt 3' アダプターと 5' アダプター (ウェルズ 5 および 10) も含む RNA ライブラリのそれぞれの側に並列で実行されました。最高のバンド (白アスタリスク参照) 5' アダプター結紮の製品、5' を含むゲルのバンド切除のガイドとして使用されるアダプター結紮 RNA ライブラリ。前のページで精製した結紮サイズ マーカー結紮製品は、よく 3 で実行されます。1 と 12 の井戸で観測された 20 の nt のサイズの梯子はまた RNA ライブラリの予想サイズを検証する実行。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: パイロット PCR と cDNA ライブラリの大規模な増幅します。サイズおよび PCR の製品の比率は、ethidium 臭化物の存在下で 2.5% の agarose のゲルに評価されました。(A) cDNA ライブラリのバーコード RNA ライブラリの逆のトランスクリプションの単一のパイロット PCR 反応で 5' と 3' プライマーを使用して増幅された後。パイロットの PCR の反作用の因数は、10、12、14、16、18 年、20 サイクルで得られ、2.5% の agarose のゲルに移行します。井戸 1 と 7 間, cDNA ライブラリとアダプター二量体の存在は指数関数的に観察可能な (緑の四角形を参照してください)。このライブラリの cDNA ライブラリの増幅用に選択された PCR のサイクルは 15 だったこの回路図 (B) には、位置と種類のオリゴヌクレオチドのページと agarose のゲル上で特定の結果の RNA と DNA の製品長さが表示されます。(C) ( Aで識別される) 6 大規模な PCR の反作用の因数を 2.5% アガロースゲルの個別に行ったゲル (ウェルズ 3 に 8 を参照)。PCR の製品の 2 つのタイプは、すなわちにライブラリ (上部バンド) およびプライマー二量体 (より低いバンド) は、このゲル (を参照してください緑四角形) に表示されます。CDNA せず空白の PCR の反作用は PCR の拡大表示されません (よく 2 参照)。20 nt のサイズの梯子では、(よく 1 参照) 製品サイズの検証ことができます。(D) ゲルのプールされた PCR の反作用を含むゲルの 2.5% の agarose の青い光の transilluminator 上のイメージは、2 つの隣接する井戸で走った。両方の井戸で最高のバンドが期待されるライブラリ サイズ観察、およびアダプター ダイマー バンドは下にあります。アッパーの PCR バンドは摘出され、ゲル抽出キットで精製します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 精製 PCR による増幅 DNA ライブラリ。PCR 増幅 cDNA ライブラリの小さい因数 (1 μ L) のマイクロ ベースのプラットフォームに高感度 DNA チップを用いています。(A) このパネル、計器の校正用サイズ マーカーの移行が表示されます。(B) このパネルには、精製 PCR 増幅 cDNA ライブラリの移行が表示されます。100 のサイズで最も高いピークの測定 bp (アスタリスクを参照)、cDNA ライブラリを表します。72 で評価小ピーク計測器によって bp プライマー アダプター二量体を表します。100 bp ピーク検出マイクロ ベース プラットフォームを明らかに高スループット シーケンス システムのそれに続く NGS の 18 の個別のバーコード RNA 標本を含んでいる増幅 cDNA ライブラリの推定サイズ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: cDNA ライブラリの準備、次世代シーケンサーを使用して埋め込まれた新鮮な冷凍とホルマリン固定パラフィン包埋試料を一致します。(A) 総 RNA 抽出から一致新鮮凍結、マイクロ ベース プラットフォームの総 RNA チップに FFPE 浸潤性膵管癌 (IDC) 腫瘍を分析しました。(B) 総 RNA マッチした新鮮なから冷凍と FFPE 標本 (IBC 1 および IBC2) を受けた cDNA ライブラリの準備のプロトコルおよび miRNA 配列データをプロットしました。(C) IBC1/IBC2 標本と相関の間 DifferentialmiRNA 式間冷凍 FFPE サンプルのペア。miRNA 式あたりのログ数に表示されます百万 (CPM)、高低の読み取り (赤、青の色) から。MiRNA、ごとに、2 つの組織ペア違い式の意義が新鮮と FFPE サンプルで挙げた高と低発現 miRNAs 灰色の円で表示されます。(D) 総 RNA の一致した新鮮で乳癌細胞ライン (MCF10A と MCF7) ひと浸潤性乳癌 (IBC 1 および IBC2)、子宮頸のティッシュ (Cx) の FFPE RNA 標本から抽出されたアーカイブ (通常 Br1、通常 Br2 と通常の Br 3) 正常乳房組織と(IBC 5、IBC の 6、および IBC7) アーカイブされた侵略的な乳癌は、同じ実行中 cDNA ライブラリの準備を施行しました。ライブラリで検出された Mirna の NGS データは、ヒート マップの構成に表示されます。この図は、Loudigから変更されています。20この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 古いを使用してレプリケートの cDNA ライブラリ準備および miRNA 発現相関アーカイブ FFPE 標本。18、20、22、27、30、35 歳アーカイブ FFPE 乳房組織標本からの総 RNA は、最適化された cDNA ライブラリの準備のプロトコルを施行しました。9 異なる FFPE 標本からレプリケートの RNA のサンプルは、異なる 3' バーコード オリゴヌクレオチドと結紮され、同じライブラリ内で週 1 (w1) を分析し。1 週間間隔 (週 2 または w2) 内で同じ実験を繰り返した。相関係数 0.99 0.93 と評価されると、ヒートマップなどで同じアーカイブされた RNA 標本間の重複した miRNA 発現データの再現性対策が表示されます。この図は、Loudigから変更されています。20この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

・ ハフナーによって記述されたプロシージャの変更および最適化されたバージョンは、このプロトコルの FFPE RNA 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS の高再現性と堅牢な cDNA ライブラリの準備のプロトコルを表示します。22

このプロトコルのすべてのステップは、古いアーカイブと侵害された総 RNA FFPE の標本から回復を使用するため最適化されています。FFPE RNA の少量を処理するため、このプロトコルの重要なステップは、18 のユニークな 3' バーコード アダプター個々 を後すべての RNA のサンプル (すなわち, 18 各 100 ng FFPE RNA サンプル) のプールに存在します。この重要なステップは、18 FFPE RNA サンプルを均一に受ける以降すべて生化学的および酵素の手順小さな RNA の cDNA ライブラリーの作製に必要なすることができます。さらに、この手順を最大限に降水を受ける RNA の量とゲル精製小さな RNA 分子のキャリア効果を高めるとともに、促進することにより観測をペレットしゲルの選択。さらに FFPE RNA の少量を使用する場合、その汎用性を強調、パイロット PCR の反作用を使用して cDNA ライブラリの最適な増幅サイクルを識別することは、この議定書のもう一つ重要な機能。この手順は、プライマー二量体増幅は、大規模な PCR の反作用を準備し、アガロースゲルの小さな RNA 図書館を浄化ゲルは、重要な対ライブラリ増幅の原動力に洞察力を提供します。このプロトコルに追加されたデータは、このアプローチの間の再現性一致冷凍と FFPE 標本とも古い FFPE RNA への適用サンプル標本からハイライトまで 35 年間のアーカイブを示します。

このプロトコルは、化学的に変更および妥協の FFPE RNA の量と質の低いから作られた小さな RNA ライブラリの準備のために最適化されているので、元のバージョンから変更されました。この手順を正常に縛るし、FFPE の標本からの Rna を増幅する変更の 1 つの側面は、キャリブレータ カクテル入力が 0.026 に減った初期 3' バーコード アダプター結紮、急激に上昇の量に関係を防ぐために nM低 abundancy の結紮との競争 FFPE RNA サンプルに存在する低分子 Rna。元のプロシージャを別の重要な変更すべての放射能標識サイズのマーカーがページのゲルで結紮小さい RNAs の選択時に使用の除去であった。これらの標識のサイズ マーカーの使用は、放射性同位元素の使用、ゲルの RNA プロダクトのまた防がれた観測のための認定研究所にだけではなくこのアプローチの適用を制限しました。代わりに、この最適化されたプロトコルは、サイズ マーカーがページのゲル上のライブラリに隣接する井戸で実行、切除結紮の小さな Rna を直接に蛍光色素を直接可視化します。重要なは、蛍光色素を RNA 製品の拡散を防ぐためにゲルの軽くスプレーして、青いライト ボックス上で可視化します。その後、切除のページ ゲルのフラグメントに含まれている結紮小さい RNAs の拡散を改善し、予防の測定としてゲル ブレーカー チューブは、NaCl 水溶液撹拌下の 4 ° C で一晩で孵化する前にゲルを均一に粉砕に使用されます。少量の材料で動作するようにこれらすべての手順を慎重に行った。

このプロトコルは、さまざまな量の時間のために保存されていたさまざまなソース (臓器や機関) から FFPE RNA サンプルに適用されました。分析では、これを使用して手順を最適化するとき、生鮮・冷凍の標本からの Rna をシーケンスの高再現性を明らかにしました。35 年間保存、アーカイブの古い FFPE 標本を使用して追加の解析はさらに臨床検体へのプロトコルの広大な適用性を示した。FFPE 標本の最小の FFPE RNA 入力要件示された 100 ng。この低要件により、様々 な異なるサイズと可用性の病変にこの議定書の適用が、単一細胞 FFPE RNA の解析は許可しません。注意することが重要だ、しかし、これはプロトコルを最適化されているまた使用されています 1 未満の入力を持つエクソソームを循環から抽出されたトータル RNA と ng、再現性の高い小さな RNA 発現プロファイル (示されていないデータ) を提供するために表示されます。この低入力ことを示唆 FFPE サンプルの低分子 Rna が元の新鮮な組織の代表的なエクソソームを循環から総 RNA でより多くのより低い割合で存在します。

近作、DCIS FFPE 標本に臨床的に分類するためこの最適化されたプロトコルを適用した cDNA ライブラリの NGS によって識別される miRNA 表現違いを量的な PCR によってだったことを分られました。この作業は、大規模な回顧的研究 [20] 別の機関からアーカイブされた組織からの浸潤病変を使用しての可能性を示した。本研究では、再現性とアッセイの感度を損なうことがなく (数週の間隔) で異なる時間に実行するときはこの cDNA ライブラリの準備の堅牢性も強調表示されます。

臨床的に分類されたアーカイブされた FFPE 標本の広大な量を考慮してこの最適化されたプロトコルを提供します強力なツール大規模レトロスペクティブ解析における cDNA ライブラリの準備のためマイクロ Rna バイオ マーカーの潜在的な識別のため21癌の開発に関連付けられています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らはこの原稿で提示されたデータの一部を含むパブリケーションが Loudigによって分子科学の国際ジャーナルに掲載されたを開示を希望します。21

Acknowledgments

博士トーマスされた、RNA の分子生物学の実験室の頭部だけでなく、彼らのサポートのため、彼の実験室および RNAworld パイプラインにアクセスを提供する技術を共有するため彼の研究室のメンバーに感謝いたします。我々 はまた、彼のプロトコルを共有し、彼の最初の手順で使用されているすべての生化学的および酵素の手順に関する詳細な説明を提供するため博士マーカス ・ ハフナーを感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10, (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8, (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7, (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58, (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42, (12), 1911-1922 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics