La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

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Summary

Muestras de parafina-encajado formalina-fijos representan una valiosa fuente de biomarcadores moleculares de las enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo de preparación Biblioteca de cDNA en laboratorio, inicialmente diseñado con ARN congelado fresco y optimizado para el análisis de los microRNAs de tejidos almacenan hasta 35 años.

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

– Archivar, clasificar clínicamente formalina-fijo tejidos parafina-encajados de (FFPE) pueden prever ácidos nucleicos estudios moleculares del desarrollo del cáncer. Mediante el uso de no-invasiva lesiones malignas o premalignas en pacientes que posteriormente desarrollan enfermedad invasiva, análisis de expresión génica podrán ayudar a identificar alteraciones moleculares tempranas que predisponen al riesgo de cáncer. Se ha descrito también que los ácidos nucleicos de los tejidos FFPE han sufrido graves daños y modificaciones químicas, que dificultan su análisis y generalmente requiere ensayos adaptados. MicroRNAs (miRNAs), sin embargo, que representan una pequeña clase de moléculas de ARN que abarca sólo a ~ 18-24 nucleótidos, se han demostrado para soportar el almacenamiento a largo plazo y se han analizado con éxito en muestras FFPE. Aquí presentamos un 3' con código de barras ADN (cDNA) Biblioteca preparación Protocolo complementario específicamente optimizado para el análisis de small RNAs extraído de tejidos archivados, que recientemente fue demostrado para ser robusto y altamente reproducible cuando uso de archivada especímenes clínicos almacenados hasta por 35 años. Esta preparación de biblioteca se adapta bien al análisis multiplex de material comprometido/degradados donde las muestras de RNA (hasta 18) ligadas con los adaptadores de código de barras individual de 3' y entonces agruparon para posteriores preparaciones enzimáticas y bioquímicas antes del análisis. Se realizan purificaciones todos por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que permite selecciones específicas de tamaño y riquezas de especies pequeñas de RNA con código de barras. Esta preparación de la biblioteca de cDNA se adapta bien a minuto entradas de RNA, como una reacción en cadena de piloto de la polimerasa (PCR) permite la determinación de un ciclo de amplificación específica para producir cantidades óptimas de material para la secuenciación de próxima generación (NGS). Este enfoque se ha optimizado para el uso de degradados de FFPE de ARN de muestras archivadas de hasta 35 años y proporciona datos NGS altamente reproducibles.

Introduction

miRNAs son notablemente bien conservadas en formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) muestras1,2,3. Trabajo previo ha demostrado que la expresión de estos cortos no codificantes solo trenzado RNA moléculas reguladoras puede ser evaluado con éxito utilizando ARN total de las muestras FFPE y proporcionar datos de expresión de genes relevantes en comparación con el fresco original los tejidos4,5,6,7,8. En comparación con el tamaño grande mensajero RNAs, que han demostrado ser afectados críticamente por FFPE procesamiento de tejido (formaldehído, calor, desecación, etc.), RNasas endógenas y la edad de las muestras, el tamaño pequeño de miRNAs (~ 18-24 nucleótidos) parece hacerlos resistentes al almacenamiento a largo plazo, también se demostró mediante estudios de expresión de miRNA que superan los estudios de mRNA de alto rendimiento en especímenes archivados9y resistente a la degradación. estudios de expresión de miRNA utilizando muestras clínicas archivadas, que en su mayoría se han realizado análisis en pequeña escala, han demostrado que solo o multiplexado ensayos PCR cuantitativos, diferentes tipos de tecnologías microarrays y más recientemente NGS puede utilizarse para evaluar la expresión de miRNAs conservada después de la optimización de estos ensayos10,11,12,13,14.

Dado que la desregulación de la expresión del miRNA se ha asociado con el desarrollo de una variedad de malignidades humanas y que es potencialmente una fuente enorme de clínico anotado muestras archivadas, se ha puesto de manifiesto que estos ARN pequeño las moléculas representan una fuente prometedora de potenciales biomarcadores de cáncer15,16,de17,18. El uso de una tecnología de expresión de gen de alto rendimiento como NGS tiene la ventaja de proporcionar una evaluación global de todas las transcripciones de miRNA en comparación con tecnologías específicas tales como PCR y microarrays de19. Por esta razón, se ha optimizado un protocolo optimizado, asequible y fácilmente aplicable para la preparación de la biblioteca del cDNA de ARNs pequeños de más viejos especímenes archivados para NGS para estudios a gran escala20.

Anteriormente establecimos un protocolo de extracción de ARN/ADN simultánea para recuperación separada de ARN y ADN de ejemplares archivados más viejos, que hemos encontrado para superar a kits comerciales contemporáneo21. Utilizando este protocolo de extracción, para obtener el ARN total de tejidos FFPE archivados durante un período prolongado de tiempo, hemos optimizado la preparación de las bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs conservado en las muestras clínicas de hasta 35 años. Además, en un estudio recientemente publicado donde preparamos las bibliotecas de cDNA de clasificados clínicamente carcinoma ductal en situ muestras (CDIS), identificamos diferencialmente expresado miRNAs que fueron validados por PCR cuantitativa, que indica que cambios de expresión de miRNA específico pueden ser detectables en las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama en comparación con las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama.

Teniendo en cuenta el costo de los kits comerciales para la preparación de pequeñas bibliotecas de cDNA RNA, el potencial de su interrupción, así como el uso de reactivos protegidas por derechos de autor/patentes que no se pueden optimizar, decidimos adaptar previamente publicados en laboratorio y sin kit de 3' barras cDNA biblioteca preparación protocolo para NGS de small RNAs en especímenes FFPE, lo que permite el análisis simultáneo de 18 muestras de22. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso ideal y robusto con puestos de control de evaluación visual y técnico, que eran críticos para la adaptación a las muestras de RNA FFPE, y tiene un gran potencial para su aplicación a otras fuentes de peligro o dificultad utilizar material de RNA. Aplicabilidad del protocolo original fue mejorada mediante la sustitución de marcadores de tamaño radiactivo marcado con fluorescente (p. ej., oro de SYBR) detectable RNA tamaño los marcadores usados durante la selección de bibliotecas ligadas en geles de poliacrilamida grandes. Este protocolo optimizado se basa en la ligación de código de barras adaptadores de 3' a 18 muestras individuales de FFPE ARN, que son luego agruparon para someterse a la ligadura de 5' adaptador, reverso-transcripción y un piloto análisis PCR para amplificación del cDNA final adaptado biblioteca antes de la amplificación, purificación y NGS a gran escala de PCR en un secuenciador de alto rendimiento.

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Protocol

1. preparación de los reactivos e imprimaciones

  1. Ordenar todos los cebadores y adaptadores como se describe en la figura 1.
  2. Preparar el calibrador stock cóctel, que se enriquecieron en la ligadura de cada individuo.
    1. Resuspender el oligonucleótido portador (figura 1) a 0,5 μm con agua libre de ARNasa. Resuspender los oligonucleótidos calibrador 10 (figura 1) a 100 μm usando la solución de oligonucleótidos 0,5 μm portador.
    2. Combinar 10 μl de cada uno de los 10 calibradores en una microcentrífuga siliconado para obtener un stock de calibrador cóctel 100 μm y preparar una solución de nM 0.026 para almacenar a-20 ° C.
  3. Diluir los adenylated única, liofilizada, 20 3' adaptadores con agua libre de ARNasa a una concentración final de 50 μm (figura 1).
    Nota: Se recomienda preparar alícuotas μl 2,5 de cada adaptador de tubos de siliconado individuales y almacenarlas a-80 ° C hasta por 2 años.
  4. Resuspender el nt-19 3 desalado ' adaptador y 24 nt-3' oligonucleótidos de marcador de tamaño de adaptador a 250 ng/mL (figura 1).
  5. Resuspender el HPLC purificada 5' adaptador de 100 μm con agua libre de ARNasa. Resuspender los cebadores PCR de 5' y 3' a 100 μm con agua libre de ARNasa (figura 1).
    Nota: Alícuota oligonucleótidos todos en cantidades necesarias para los experimentos 1 y 2 y tienda a-80 ° C.
  6. Preparar la poliacrilamida desnaturalizantes (PAA) gel colorante de carga combinando 98.8% formamida, 1% (v/v) 0.5 M de Na2H2 EDTA, pH 8.0 y azul de bromofenol 0,2% y establecer alícuotas de 1 mL a-80 ° C.
    1. Preparar la solución de EDTA de 0,5 M Na2H2 agregando 18,6 g de Na2H2 EDTA polvo para 50 mL de agua libre de nucleasa. Añadir NaOH pellets para llegar a pH 8.0. Ajustar el volumen a 100 mL para obtener 0,5 M Na2H2 EDTA, solución pH 8.0.
    2. Pesan 15 mg de bromofenol azul en un tubo separado 15 mL. Añadir 600 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 14,25 mL de formamida desionizada. Añadir 150 μL de 0,5 M Na2H2 EDTA, solución pH 8.0.
    3. Alícuota de la solución final de la PAA de 15 mL en alícuotas de 1 mL a-80 ° C.
  7. Preparar el 5 x tinte de carga mediante la combinación de azul de bromofenol 0,2% 0,2% xileno cyanol FF, EDTA 50 mM Na2H2 , pH 8.0 y 20% de gel de agarosa tipo Ficoll-400.
    1. Resuspender 1,86 g de Na2H2-EDTA en 50 mL de agua libre de nucleasas en un vaso de precipitados de 400 mL en un agitador magnético a temperatura ambiente (RT). Agregar pastillas de NaOH para alcanzar un pH de 8.0. Añadir agua libre de nucleasa para llegar a 100 mL para obtener una solución de EDTA Na2H2 de 50 mM.
    2. Pesar 2 g de polvo de tipo Ficoll-400, 20 mg de azul de bromofenol en polvo y 20 mg de xileno cyanol FF polvo y resuspender en 5 mL de 50 mM de Na2H2 EDTA.
    3. Mezclar el tubo que contiene tres tintes y añadir 5 mL de 50 mM Na2H2 EDTA. Mezclar el tinte 5 carga de gel de x agarose, preparar alícuotas de 1 mL y guardar a-80 ° C.

2. establecer 3' barras adaptador trompas con 18 muestras individuales de ARN

  1. Identificar 18 muestras individuales de RNA (pre-aliquoted en 100 ng en 9,5 μl de agua libre de nucleasas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado) y coloque los tubos en hielo para descongelar durante 10 minutos.
  2. Prepare los 10 x fresco ARN ligasa Buffer (sin ATP).
    1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado, combinan 343 μl de agua libre de ARNasa, 500 μl de Tris 1 M pH 7,5, 100 μl de 1 M de MgCl2, 50 μl de 20 mg/mL de seroalbúmina bovina y 7 μl de 14 M 2-Mercaptoetanol. Mix de sacudiendo el tubo, centrifugar durante 2 s a 2.000 x g y RT y el hielo.
      Nota: Todos los pasos de este protocolo que indican "centrífuga de 2 s" se realizan en una microcentrífuga de sobremesa en RT y una velocidad máxima de 2.000 x g para recoger soluciones en la parte inferior de los tubos.
  3. Preparar 50% stock acuosa de DMSO añadiendo 1 mL de libre de Rnasa agua a 1 mL de DMSO en un tubo de microcentrífuga de 2 mL siliconado, envuelva el tubo en papel aluminio y almacenar a TA.
  4. Descongelar el 0,026 nM calibrador cóctel en hielo durante 10 minutos Prepare la mezcla maestra de ligadura combinando en el siguiente orden en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado: 40 μl de 10 x Buffer de ARN ligasa y 120 μl de DMSO acuosa 50% con una pipeta de 200 mL , y añadir 10 μl de calibrador de nM 0.026 coctel utilizando una pipeta de 10 μl. Quitar el tubo de 1,5 mL para mezclar, centrifugar durante 2 s y establecer que en el hielo.
  5. Añadir 8,5 μl de ligadura Master Mix a cada una de las 18 muestras de ARN FFPE individualmente alícuotas, chasquear suavemente los tubos, centrifugar durante 2 s y el almacén en el hielo.
  6. Descongelación 2,5 alícuotas de μl de cada uno de los adaptadores de código de barras 3' 18 y coloque en hielo para descongelar durante 20 minutos.
    1. Utilice una pipeta de 3 μl a 1 μl de cada adaptador de transferencia a las muestras de RNA FFPE correspondientes que contiene RNA y ligadura de Master Mix (es decir, 9,5 μl + 8,5 μl).
    2. No pipetee hacia arriba y hacia abajo, simplemente dispensar en el líquido y tire de la punta. Asegúrese de cambiar consejos entre las muestras de RNA FFPE. Cierre cada tubo, flick para mezclar, centrifugar durante 2 s y el hielo.
  7. Desnaturalizar las reacciones mediante la colocación de los tubos de 18 en un bloque de calor a 90 ° C por 1 min y luego colocar inmediatamente en hielo.
  8. Preparar la ligadura enzima solución diluyendo 10 μl de truncado K227Q T4 RNA ligasa 2 con 10 μl de ARNasa-sin agua en un tubo de microcentrífuga 1.5ml fresco siliconado.
  9. Usar una pipeta de 3 μL para transferir 1 μl de la enzima diluida la ligadura a cada una de las 18 muestras de RNA (no pipetear arriba y abajo y cambiar consejos entre cada tubo). El 18 trompas en hielo y colocar en una habitación fría de 4 ° C para una incubación durante la noche de 18 h.

3. purificación de los RNAs pequeños ligados

  1. Desactivar las reacciones de ligadura colocando los 18 tubos para 1 minuto en un bloque de calor a 90 ° C y luego volver a hielo por al menos 2 min enfriar.
  2. Preparar la mezcla maestra de precipitación mediante la adición de 1 μl de colorante azul covalente a glucógeno a 26 μl de NaCl 5 M libre de ARNasas en un tubo de microcentrífuga siliconado fresco.
    1. Transferencia de 1,2 μl de la mezcla maestra de precipitación en cada uno de los tubos de 18. Añadir 63 μl de etanol al 100% a cada uno de los tubos de 18. Cierre cada tubo, flick para mezclar, centrifugar durante 2 s y el lugar de los tubos en hielo. Combinar el contenido de todos los tubos de 18 en un tubo de 1.5ml solo siliconado.
    2. Cerrar el tubo, invertir tres veces para mezclar, centrifugar por 2 s y el lugar en el hielo durante 60 min precipitar.
  3. Preparar un gel de poliacrilamida al 15% (16 x 20 cm2) gran página.
    1. Dos molde siliconado placas de vidrio (tratadas con una alternativa segura a las capas de silano) con espaciadores de 0,1 cm.
    2. Se combinan 9 mL de diluyente de sistema, 18 mL de concentrado de sistema, 3 mL de tampón del sistema, 240 μl de APS (9%) y 12 μl de TEMED en un tubo de 50 mL.
    3. La página gel solución entre placas de cristal utilizando una pipeta de 30 mL, coloque un peine bien 14 (0,1 cm de grosor) y que el gel solidifique a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  4. Centrifugar el tubo de 1,5 mL con las trompas agrupados en 16.000 x g y 4 ° C durante 60 minutos.
  5. Retire el peine. Limpie los pozos abundantemente con agua libre de ARNasa usando un frasco rociador con una punta de 200 μL al final para acceder al interior de los pozos y fuerza de acrilamida no polimerizada (un bien a la vez) sobre un fregadero. Establece el 15% página sobre un aparato de gel, los embalses se llenan de 0,5 x solución de Tris borato EDTA (TBE) y funcionamiento previo el gel por 30 min a 450 V.
  6. Recuperar el tubo con trompas combinados de la centrifugadora y seque cuidadosamente el pellet de RNA.
    1. Quite el sobrenadante con una pipeta de 1 mL sino dejar un poco de líquido en la parte inferior. Incline el tubo y utilice una pipeta de 20 mL para retirar el sobrenadante restante sin tocar el sedimento. Vacío de succión del tubo utilizando una pipeta Pasteur con una punta de 10 μL en su extremo, sin tocar el sedimento.
    2. Resuspender el precipitado de RNA en 20 μl de agua libre de ARNasa por agitando el tubo. Añadir 20 μl del gel PAA cargar solución para Resuspender el ARN, flick para mezclar, centrifugar durante 2 RT, sentó y fija el tubo a 90 º c por 1 min y luego coloca inmediatamente en hielo.
  7. X TBE reemplazar el 0.5 del aparato del gel fresco 0,5 x TBE y carga la escalera, de marcadores de tamaño y miRNAs ligados en el centro del gel, dejando pozos 2-vacío en ambos lados (figura 2).
  8. Correr el gel a 450 V (35 mA) de 60 minutos, hacer una pausa en el plazo de 10 minutos se enfríe y vuelva a ejecutar a 520 V (25 mA) para otro 60 min Uncast 15% página quitando una de las placas de vidrio.
  9. Rocíe ligeramente el gel en la placa de vidrio con la solución colorante fluorescente (10 μl) en 25 mL de 0,5 x TBE y deje sentarse plano por 5 min en la oscuridad.
  10. Ponga el vaso con el gel en un transiluminador de luz azul y alinear ambos 19 nt y marcadores de tamaño nt 24 con una regla para dirigir la supresión de los RNAs pequeños ligados (figura 2). Suprimir el gel.
  11. Coloque el gel suprimido en un tubo de 0,5 mL, diseñado a rodajas de gel, colocados de manera segura en un tubo de microcentrífuga siliconado de 1,5 mL. Centrifugar a 16.000 x g durante 3 min a RT. Resuspender el gel fragmentado con 300 μL de solución de NaCl de 400 mM, cierre el tubo y sellar con la película de parafina.
  12. Coloque el tubo en agitación en un Termomezcladores a 1.100 rpm en cuarto frío de 4 ° C para una incubación durante la noche (16-17 h).

4. ligadura del adaptador 5'

  1. La solución y gel fragmentada a un filtro de 5 μm tubo sentado en un tubo de 1,5 mL siliconado, sellar con la película de parafina y centrifugar durante 5 min a 2.300 x g y RT.
  2. Añadir a 950 μl de etanol al 100% a la solución filtrada, cerrar el tubo, invierta para mezclar, centrifugar durante 2 s, sellar el tubo con la película de parafina y en hielo durante 1 hora.
  3. Preparar una página de gel como se describe en el paso 3.3 el 12%, pero combinar 12,6 mL de diluyente, 14,4 mL de concentrado, 3 mL de tampón, 240 μl APS y 12 μl de TEMED en un tubo de 50 mL. Funcionamiento previo el 12% gel página durante 30 min a 450 V (~ 35 mA) en 0.5 x TBE.
  4. Centrifugue la solución purificada de RNA pequeño a 16.000 x g durante 60 min a 4 ° C.
  5. Pipetee cuidadosamente hacia fuera el sobrenadante con una pipeta de 1 mL para eliminar la mayor parte de la solución y utilice una pipeta de 200 mL para eliminar la solución restante, sin tocar el sedimento.
  6. Utilizando una pipeta Pasteur con una punta de 10 mL en su extremo conectado a un frasco de vacío, seque cuidadosamente el sedimento sin tocarlo.
  7. Resuspender el precipitado en 9 μl de agua libre de ARNasa sin pipeteo arriba y abajo, pero por sacudiendo ligeramente el tubo, centrifugar durante 2 s y establecer el tubo en hielo.
  8. Preparar 10 x fresco ARN ligasa Buffer (con ATP) mediante la combinación de 500 μl de 1 M Tris pH 7,5, acetilado de 100 μl de 1 M de MgCl2, 50 μl de 20 mg/mL BSA, 200 μL de 10 mM ATP, 7 μl de 2-Mercaptoetanol 14 M y 143 μl de agua libre de ARNasa.
  9. Mezcle 10 x Buffer de RNA ligasa (con ATP) sacudiendo el tubo y centrifugar durante 2 s para recoger la solución en la parte inferior del tubo.
  10. Establecer la ligadura 5' adaptador por añadir 2 μl de 10 x Buffer de RNA ligasa (con ATP), 1 μl de 100 μm 5' adaptador y 6 μl 50% DMSO acuosas a la 9 μl, 3' con código de barras pequeño RNA solución.
  11. Película el tubo suavemente para mezclar, centrifugar durante 2 s para recoger la solución, coloque el tubo en un bloque de calor a 90 ° C por 1 min y en hielo durante al menos 2 minutos.
  12. Añadir 2 μl de T4 RNA ligasa 1 en la solución (no pipetear arriba y abajo), mueva el tubo, centrifugar durante 2 s y sientan el tubo flotante estante en un baño de agua de 37 ° C durante 60 minutos.
  13. Al mismo tiempo, establecer dos trompas entre el nt-19 3' adaptador y el adaptador de 5' y dos trompas entre el nt-24 3' adaptador y el adaptador de 5'.
    1. Combinar 2 μl de la 19nt-3' adaptador (250 ng/μL) o nt-24 3' adaptador (250 ng/μL) con: 2 μl del 5' adaptador (100 μm), 2 μl de 10 x Buffer de RNA ligasa (con ATP), 6 μl de DMSO acuosas de 50%, 6 μl de agua libre de ARNasa y 2 μl de T4 RNA ligasa 1 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado.
    2. Los tubos para mezclar, centrifugar durante 2 s y el conjunto de la película los tubos a 37 ° C durante 60 minutos.
  14. Añadir 20 μl de tampón de desnaturalización del PAA a los trompas (purificada small RNAs, 2 trompas con 19nt-3' adaptador y 2 trompas con 24nt-3' adaptador).
    1. Mix de chasquear los tubos, centrifugar durante 2 s, incubar los tubos en un bloque de calor a 90 ° C durante 1 minuto transferencia todos los tubos de hielo y preparar una escalera (3 mL de escalera con 20 μl de PAA).
  15. Vaciar el depósito superior del aparato del gel con el funcionamiento previo 12% PAGE gel y fresca solución x TBE 0.5 por debajo del nivel de los pozos (los pozos se vacían con una pipeta de punta larga y fina).
    1. Cargar las muestras con una pipeta fina, como se describe en la figura 3.
    2. Uso fresco 0.5 x TBE para llenar los pozos en la parte superior del gel.
    3. Añadir fresco 0.5 x TBE al embalse por encima de los pozos y comenzar la electroforesis del 12% Página durante 60 min a 450 V (~ 35 mA).
    4. Detener el funcionamiento apagando el generador durante 10 minutos enfriar el gel. Reiniciar el generador y el gel durante 60 min en 520 V (~ 25 mA).
  16. Pare el generador, vaciar los embalses invirtiendo el aparato encima de un fregadero y uncast 12% Página quitando una de las placas de vidrio.
  17. Sentarse el vidrio con el plano de gel, spray gel con 10 μl de colorante fluorescente en 25 mL 0.5 x TBE, incubar en la oscuridad para 5 minutos poner el vidrio con el gel en un transiluminador de luz azul y alinear ambos 19 nt y ambos los 24 nt tamaño marcadores con una regla para dirigir la supresión de los RNAs pequeños ligados (figura 3).
    1. Suprimir el gel y transferencia de la pieza extirpada gel en un tubo de 0,5 mL gel interruptor. Cierre la tapa del tubo del interruptor gel, set en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado y seguro con la película de parafina. Retire el tubo del gel de interruptor, añada 300 μL de 300 mM de NaCl y 1 μl de 100 μm 3' PCR primer a las piezas de gel machacado en un tubo de 1,5 mL.
    2. Sellar el tubo con la película de parafina en agitación en un Termomezcladores a 1.100 rpm a 4 ° C, durante la noche (17 a 18 h) en una cámara fría.

5. reversa de la transcripción del 5' ligada y 3' con código de barras pequeño RNAs purificados

  1. Recuperar el tubo del filtro y Termomezcladores purificar la solución con un tubo de filtro de 5 μm.
    1. Uso una pipeta de 1 mL para transferir la solución a un tubo de filtro de 5 μm insertado en un 1.5 mL silicona tubo de la colección libre de Rnasa. Centrifugar el tubo durante 3 min a 2.300 x g y RT.
    2. Desechar el tubo del filtro y agregar 950 μl de etanol al 100% para el tubo de colección de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene la solución filtrada. Invertir el tubo para mezclar, centrifugar durante 2 s y el lugar en el hielo para precipitado de RNA de pellets por centrifugación del tubo a 16.000 x g y 4 ° C por 1 h de 60 min.
  2. Secar el pellet de RNA.
    1. Abra la tapa y retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de 1 mL, dejando un poco de líquido en la parte inferior.
    2. Use una pipeta de 20 μl para quitar todo el sobrenadante restante sin tocar el sedimento. Inclinar el tubo para dejar cualquier solución en el lado opuesto de la pelotilla.
    3. Utilice una pipeta Pasteur con una pipeta sin filtrar 10 mL para aspirar el sobrenadante y secar el pellet con un vacío.
  3. Resuspender el precipitado de RNA en 5.6 μl de agua libre de ARNasa.
    1. Descongelar los reactivos de transcripción inversa en el hielo durante 15 min conjunto hasta una reacción reversa de la transcripción mediante la adición de 3 μl de 5 x Buffer, μl 4,2 de 10 x deoxynucleotide trifosfato (dNTPs) (cada 2 mM) y 1,5 μl de Ditiotreitol (DTT) a la 5.6 μl de ARNasa-libre resuspendido.
    2. Mueva suavemente el tubo para mezclar la reacción y centrifugar durante 2 s para recoger la solución. Establecer la reacción en un bloque de calor a 90 ° C exactamente 30 s y luego transfiera directamente a Termomezcladores a 50 ° C.
    3. Dejar el tubo en el Termomezcladores de 2 minutos para que la temperatura iguala. Añadir 0,75 μl de la enzima de la transcripción inversa directamente en la solución, flick suavemente para mezclar y el tubo de nuevo Termomezcladores a 50 ° C por 30 min inmediatamente.
  4. Después de 30 min, transferir el tubo a un bloque térmico a 95 ° C durante 1 minuto detener la transcripción inversa. Agregue 95 μl de agua libre de ARNasa directamente a la transcripción inversa, quitar el tubo para mezclar y directamente en hielo durante 2 minutos.
  5. Etiquetar el tubo con el cDNA biblioteca Stock y biblioteca ID.

6. piloto de PCR y amplificación de la polimerización en cadena a gran escala

  1. Se prepara fresca 10 x PCR buffer por adición 304 μl de agua libre de ARNasa, 125 μl de 2 M de KCl, 50 μl de 1 M Tris pH 8.0, 10 μl de 1 M de MgCl2, 5 μl de 1% Tritón X-100 y 6 μl de 2-Mercaptoetanol de 1 M en un tubo de microcentrífuga siliconado y mantener a TA.
  2. Montar la reacción de PCR piloto combinando 67 μl de agua libre de ARNasa, 10 μl de 10 x PCR Buffer, 10 μl de 10 x dNTPs, 0.5 μl de 100 μm 5' PCR primer, 0.5 μl de 100 μm 3' PCR primer, 10 μl de cDNA biblioteca Stock y 2 μl de 50 x Taq polimerasa.
    1. Configurar dos PCR ciclos en un termociclador como sigue: archivo 1: 94 ° C por 45 s, 50 ° C 85 s y 72 ° C durante 60 s para 10 ciclos, mantener a 4 ° C; Archivo 2: 94 ° C por 45 s, 50 ° C para la 85 s y 72 ° C durante 60 s durante 2 ciclos, mantener a 4 ° C. Configurar la reacción de PCR de piloto en el termociclador y empezar a 1 archivo.
    2. En el final del archivo 1, abra el tubo PCR, y usando una pipeta de 20 μl, transferir 12 μl de la reacción de PCR de piloto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 3 μl de 5 x gel carga colorante, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo, cierre el tubo y asígnele la etiqueta "10 ciclos".
    3. Cierre el tubo de PCR de piloto y empezar el archivo 2 en un termociclador. En el final del archivo 2, abrir el tubo PCR y utilizar una pipeta de 20 mL para transferir 12 μl de la solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 3 μl de 5 x gel colorante de carga y etiquételo "12 ciclos".
    4. Repita los pasos descritos en los pasos 6.2.2 y 6.2.3 para recoger los productos PCR 12 μl de la reacción de PCR de piloto en ciclos PCR 14, 16, 18 y 20. Agregar 3 μl de 5 x carga de gel colorante a cada una de las alícuotas PCR 12 μl y a la escalera 20 de nt que contiene 3 μl de escalera y 9 μl de agua libre de ARNasa.
  3. Preparar un gel de agarosa al 2,5% con 0.5 x TBE.
    1. Pesar 2,5 g de agarosa en un vaso limpio y añadir 100 mL de 0.5 x TBE. Calentar la solución en el microondas hasta que hierva. Retirar la solución del microondas, agitar la botella para mezclar la agarosa, añadir 4 μL de bromuro de etidio (10 mg/mL) y transferir la solución a una bandeja de electroforesis2 7 x 10 cm, cerrada en ambos extremos con cinta.
    2. Establecer un peine de 8 pozos y permitir que el gel de agarosa a solidificar en la transferencia de RT. gel de la agarosa solidificada en un aparato de electroforesis llenado de 0.5 x TBE.
  4. Cargue la escalera y las muestras PCR en el gel de agarosa y correr durante 30 min a 120 V.
  5. Evaluar el gel en una caja de la UV para identificar el ciclo óptimo de PCR (Figura 4A).
    Nota: El tamaño de las bandas PCR esperados se muestra en la Figura 4B.
    1. Observar las dos bandas PCR en cada uno de los diferentes pozos (banda superior: biblioteca de ADN, banda inferior: dímeros de cartilla).
    2. Identificar el adecuado ciclo PCR para la amplificación de cDNA por seleccionar el ciclo donde la biblioteca de cDNA es visible, pero los dimeros de primer apenas observable.
      Nota: Generalmente, se selecciona el adecuado ciclo PCR entre 12-16 ciclos. En la Figura 4A, el adecuado ciclo PCR para esta biblioteca es 14.
  6. Establecer las reacciones de polimerización en cadena a gran escala (6 x 100 μL) para la purificación de biblioteca del gel de agarosa.
    1. Preparar un fresco tubo de 10 x PCR Buffer siguiente paso 6.1.
    2. Preparar la mezcla de PCR Master a gran escala en un tubo de 1,5 mL combinando 435.5 μl de agua libre de ARNasa, 65 μl de tampón de x PCR 10, 65 μl de 10 x dNTPs, 3.25 μl de 5' cartilla de PCR, 3.25 μl de PCR primer de 3' y pipeteo arriba y abajo para mezclar.
    3. Transferir 88 μl PCR Master Mix en seis tubos PCR de 0,5 mL. Transferir 10 μl de cDNA biblioteca Stock (almacenado en hielo), añadir 2 μl de la polimerasa x Taq 50 en cada uno de los 6 tubos PCR y pipeta para mezclar.
    4. Preparar un tubo de reacción de PCR negativo combinando 77 μl de libre de Rnasa agua, 10 μl de tampón de x PCR 10, 10 μl de 10 x dNTPs, 0.5 μl de 5' primer PCR, 0,5 μl de la cartilla PCR de 3' y 2 μl de 50 x Taq polimerasa y pipeta para mezclar.
    5. Colocar los tubos PCR en el termociclador con el ciclo PCR se describe en el paso 6.2.1 y establecer el número óptimo de ciclos de amplificación. Preparar un gel de agarosa al 2,5% con 0,5 x TBE, como se describe en el paso 6.3.
  7. Después de la amplificación por PCR, transferir 9 μl de cada tubo PCR en seis tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 3 μl de 5 x gel colorante de carga.
    1. Preparar 20 escalera nt combinando 3 mL de escalera en 9 μl de agua libre de ARNasa y agregar gel de 3 μl carga de tinte en un tubo de 1,5 mL.
    2. Carga de la escalera, control negativo de PCR y 6 productos de la PCR en el gel de agarosa y correr el gel por 30 min a 120 V.
    3. Verificar la uniformidad de las amplificaciones de PCR entre los carriles en una caja de UV (tomar una imagen).
    4. Combinar 3 reacciones de PCR en dos tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado (μL 3 x 91), agregar 27 μl de 5 M NaCl y 950 μl de etanol al 100%. Invierta los tubos para mezclar y ajustar a-20 ° C durante la noche para precipitar los productos PCR.

7. cDNA biblioteca purificación y evaluación

  1. Centrifugar los tubos con las reacciones de PCR a 16.000 x g durante 60 min a 4 ° C.
  2. Quite el sobrenadante con una pipeta de 1 mL, luego incline el tubo con el diábolo en la parte superior y el líquido en la parte inferior y utilice una pipeta Pasteur conectada a un matraz de vacío con una bañera y aspirar cuidadosamente el líquido con una punta de 10 mL en el extremo de la pipeta de Pasteur.
  3. Configurar el PmeI digest.
    1. Suspender uno de los pellets PCR con 17.5 μl de agua libre de nucleasas y resuspendido de transferencia a la segunda pastilla PCR. Añadir 2 μl de 10 x Buffer y 0,5 μl de enzima PmeI y el resumen en un baño de agua durante 2 h a 37 ° C.
    2. Preparar un gel de agarosa al 2,5% con 0.5 x TBE (paso 6.3). Añadir 6 μl de 5 x tinte gel carga la digestión. Transfiera 13 μl de cada Resumen en dos pozos adyacentes del gel de agarosa, la escalera de tamaño nt 20 en los pozos de la final de la carga y ejecutar el gel durante 90 minutos a 150 V (figura 4).
    3. Suprimir las bandas PCR superiores del gel en la caja de la UV, transferir las piezas de gel en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL recién pesado y pesar las piezas de gel sobre una escala.
  4. Purificar la biblioteca de cDNA amplificado PCR suprimida usando un kit de extracción de gel siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuantificar la biblioteca del cDNA usando un análisis de cuantificación de ADN y el instrumento, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. Evaluar el tamaño y la pureza de la biblioteca de ADNc con un chip de ADN de alta sensibilidad en un equipo Bioanalyzer (figura 5). Secuencia de la biblioteca de cDNA utilizando un sistema de alto rendimiento. Transferir el fichero FASTQ a la tubería de RNAworld para el ajuste del adaptador y alineación para el genoma humano para identificar las secuencias de miRNA.

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Representative Results

Como se describe en el método, un total de 18 muestras individuales de ARN FFPE (100 ng cada) se colocan en tubos separados a 3' adenylated con código de barras del oligonucleótido T4 la ligadura durante la noche. Al día siguiente, las reacciones enzimáticas son desactivados por calor combinadas y precipitadas en un solo tubo. Se resuspendió el pellet de RNA y las moléculas de ARN ligadas están separadas en un gel de poliacrilamida (PAGE), donde se utilizan marcadores de RNA del oligonucleótido tamaño que migró en pozos adyacentes del gel página, seleccionar el tamaño adecuado de 3' con código de barras que desnaturaliza un 15% RNAs pequeños (figura 2). La pieza de gel suprimido se incuba en una solución de NaCl durante la noche para eluir las moléculas de ARN ligadas. Al día siguiente, el RNA eluído se precipita, y se realiza una ligadura de adaptador de 5'. Entonces, el 5' adaptador ligada pequeñas moléculas de ARN son migradas y separadas en un gel de acrilamida de 12%, donde otra vez migrados RNA tamaño marcadores oligonucleótidos permiten supresión de tamaño de los RNAs pequeños que contengan el código de barras oligonucleótidos de 3' y 5' adaptador ( Figura 3). El gel suprimido se incuba durante la noche en una solución de NaCl para permitir la elución del ARN. Al día siguiente, las moléculas de ARN pequeño ligadas se precipitan, y el pellet se resuspendió en agua libre de ARNasa, seguido por el reverso-transcripción; una alícuota de las moléculas de ADNc somete a una reacción de PCR piloto (Figura 4A). Grandes reacciones de PCR utilizando la misma entrada de las bibliotecas del cDNA son establecer y evaluar en un gel de agarosa 2,5% para verificar que todas las reacciones fueron adecuadamente PCR amplificada (Figura 4B), antes de la puesta en común y la precipitación de etanol. Al día siguiente, la biblioteca de cDNA amplificado que contiene todas las bibliotecas individuales de 18 para los 18 ejemplares únicos de FFPE ARN, se migra en un gel de agarosa al 2,5% y la PCR banda superior, funcionando a 100 nt es suprimida y purificada (figura 4). La purificación de la biblioteca de cDNA entonces se evalúa en un chip de ADN de alta sensibilidad (figura 5) para determinar que el producto PCR purificado no contenga un exceso de dímeros de primer o de otros subproductos de la reacción de PCR. El producto PCR entonces se analiza en un sistema de secuenciación de alto rendimiento. El ajuste del adaptador y la generación de 18 archivos individuales para cada una de las 18 muestras se realizan utilizando la tubería RNAworld (acceso por Dr. Thomas Tuschl fue proporcionado a nosotros). Análisis bioestadístico entonces se realizan para evaluar el contenido de miRNA de las muestras de RNA FFPE.

Para validar esta optimizado procedimiento, emparejado frescos congelados y especímenes de tumor de pecho FFPE fueron utilizados para el análisis (figura 6). Similares de dos tumores de mama ductal invasivo carcinoma (IDC) fueron seleccionados para evaluar la sensibilidad del procedimiento y determinar si las diferencias de expresión de miRNA identificadas entre los dos tejidos frescos congelados también se podían detectar en el emparejado archivado FFPE Muestras de RNA. Para este experimento, la calidad del total de RNA Obtenido de los 2 fresco congelado y las muestras de RNA FFPE dos emparejadas fue evaluada (figura 6A). Como se anticipó, el tamaño de la RNA y la calidad de los ejemplares FFPE fue disminuida seriamente en comparación con los RNAs congelados frescos emparejados (Comparar con calles 1 y 3 y los carriles 2 y 4). Uno de los ARN FFPE ha archivado a temperatura ambiente durante 4 años (mama invasivo cáncer 1, (IBC1)) y el otro había sido archivado en RT durante 8 años (IBC2), mientras que las contrapartes congeladas frescas habían sido almacenadas a-80 ° C. Las cuatro muestras individuales de RNA se analizaron en una sola biblioteca, 4 códigos de barras individuales y miRNA leer distribución de parcelas se muestran en la Figura 6B. Los dos paneles principales Mostrar correlación de expresión de miRNA entre el tumor congelado fresco de dos RNAs y sus contrapartes de espécimen de FFPE ARN específicos. Las parcelas entre emparejado frescos congelados y miRNAs FFPE indican que la preparación de la biblioteca de cDNA ofrece una buena reproducibilidad, como se puede observar una alta correlación entre los miRNAs detectado en muestras procesadas de forma diferente (congelados vs FFPE). Los dos paneles inferiores muestran la correlación entre datos de expresión de miRNA de los dos tumores congelados diferentes y entre los dos tumores FFPE diferentes. Como se indica en la figura 6, las diferencias de expresión de miRNA identificadas entre los dos tumores congelados frescos se correlacionaron con las diferencias detectadas entre los dos especímenes de tumor FFPE emparejados. Diferencias de expresión de miRNA significado eran perceptibles tanto en fresco como congelado y tumores FFPE.

Para evaluar la sensibilidad de este método, se utilizaron datos de expresión de miRNA de 12 muestras archivadas de FFPE y 4 muestras de RNA congeladas frescas (figura 6). Las 16 muestras diferentes de RNA fueron individualmente 3' con código de barras y todo, para la preparación de una biblioteca de cDNA solo. Las muestras de RNA utilizadas en esta biblioteca incluida dos mama las líneas celulares, el MCF10A (línea celular normal-como) y el MCF7 (línea celular de cáncer de mama) con muestras de FFPE RNA y RNA de células frescas y sus archivados FFPE homólogos23, emparejado fresco congelado lo dos de cáncer de mama muestras analizaron en forma independiente (IBC1 y IBC2 en la figura 6A y 6B) y emparejado fresco congelado y muestras de FFPE RNA de muestras cervicales normales (Cx). Además, los especímenes FFPE de normal (normal Br1, Br2 normal y Br3 normal) y cáncer mama los tejidos (5 IBC, IBC 6 y 7 de IBC), sin sus contrapartes congeladas frescas eran analizados. Como se observa en el heatmap, independientemente de fresco congelado o ARN FFPE origen, perfiles de expresión de miRNA de las células del mismo (MCF10 o MCF7), o los mismos tejidos (IBC1, IBC2 o Cx) agrupados. Además, como se señaló en el cluster sin supervisión, de izquierda a derecha, las células de mama normales y tejidos agrupados mientras que tumores de mama y las células tumorales agrupan a la derecha. El tejido del cuello uterino, que muestra un perfil de expresión de miRNA diferentes, agrupados en la derecha del mapa de calor.

Teniendo en cuenta que la mayoría de los especímenes FFPE clínicamente archivados no tiene contrapartes congeladas frescas pero que puede ser obtenidos después de la duración del almacenamiento de información diferentes, se intentó determinar si el protocolo de preparación de biblioteca de cDNA optimizado era aplicable y reproducible con cada vez mayores muestras FFPE. Como se muestra en la figura 7, perfiles de expresión de miRNA de tejidos FFPE archivados para 18, 20, 22, 27, 30 y 35 años fueron obtenidos. El RNA se extrajo utilizando el ARN/ADN simultánea optimizado procedimiento21, y alícuotas de RNA cuadrúpedo de cada muestra individual de FFPE fueron preparados el mismo día y almacenados a-80 ° C antes de la preparación de la biblioteca. Un total de 9 diferentes FFPE muestras se analizaron por duplicado, donde cada individuo alícuota de RNA fue ligada con código de barras diferentes oligonucleótidos (18 códigos de barras total), dentro de la misma biblioteca. Este experimento fue repetido durante dos semanas consecutivas (semana 1 y semana 2). Esto permitió evaluar la reproducibilidad de preparación de biblioteca de cDNA con las mismas muestras de RNA utilizando dos códigos de barras diferentes en una sola biblioteca y entre dos bibliotecas diferentes con un intervalo de una semana. Como se observa en la figura 7, el coeficiente de correlación permanecía por encima de 0.96 independientemente de la edad de la muestra o la semana de preparación de biblioteca; por lo tanto, el protocolo de preparación de biblioteca de cDNA optimizado proporciona una robusta herramienta para análisis reproducibles de muestras FFPE independientemente de su tiempo de archivo de, por ejemplo, el ARN de FFPE archivados de 35 años de edad (ver mama #9) muestran alta medidas reproducibles equivalente a las mencionadas con las muestras de RNA FFPE de 20 años de edad (ver mama #3).

Figure 1
Figura 1: oligonucleótidos. Todas las secuencias de oligonucleótidos, sus correspondientes modificaciones químicas y concentraciones utilizadas en este protocolo se describen. Los tipos de modificaciones químicas se describen en el cuadro de modificación y las modificaciones abreviadas aparece en las secuencias del oligonucleótido. El calibrador cóctel muestra la lista de los 10 calibradores de oligonucleótidos de RNA individuales que fueron suspendidas en una solución que contiene el oligonucleótido de portador (0,5 μm). Se detallan los dieciocho 3' barras adaptadores oligonucleótidos con sombreado gris sobre secuencia de barras. Se detallan la secuencia del RNA del adaptador de 5' y las secuencias de ADN de las 3' PCR y 5' PCR primers. Las secuencias de RNA de los oligonucleótidos de marcador de dos tamaño, es decir, se hace referencia en el protocolo como nt-19 3' adaptador y 24 nt-3' marcadores de tamaño del adaptador, se proporcionan. Los oligonucleótidos de ADN y ARN fueron comprados comercialmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: purificación de la página de las muestras de código de barras RNA 3'. Después de pooling y precipitando las 18 muestras de código de barras RNA, resuspendido RNA es emigrado y separados por electroforesis en una 15% de acrilamida del gel (ver 8 bien). La Plaza Roja se destaca el área que contiene el 3' microRNAs con código de barras, que fue suprimidas con una hoja de bisturí y transferidos a un tubo de microcentrífuga siliconado libre de nucleasas. Un total de cuatro pozos, dos que contienen el nt-19 3' adaptador y dos que contienen el nt-24 3' fue juego de adaptadores de un bien ausente, a cada lado de la biblioteca (véase wells 5, 6, 10 y 11, respectivamente). Como una prueba de la ligasa de T4 RNA 1 y para la purificación del tamaño ligado marcadores que terminó al día siguiente, las reacciones de ligadura que contiene el nt-19 3' marcador de tamaño del adaptador con el adaptador de 5' y la nt-24 3' marcador de tamaño del adaptador con el adaptador de 5' se ejecute en los pozos 2 un D3, respectivamente. Los cuadrados amarillo muestran las bandas suprimidas representando los oligonucleótidos de RNA marcador de tamaño ligados con el adaptador de 5'. Estas bandas son purificadas, precipitadas y ejecutar durante en el 12% depuración de la página (ver figura 3 más abajo). Pozos 1 y 13 contiene la escala de tamaño 20 de nt, que ayudó a confirmar los tamaños esperados de los productos ligados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: purificación de la página de la biblioteca purificada después de la ligadura del adaptador de 5'. La biblioteca de RNA purificada fue ligada con el adaptador de 5' y el tamaño del producto esperado fue suprimido desde el 12% página usando los marcadores ligados tamaño (véase cuadrado rojo). Los productos de las trompas del RNA T4 entre el nt-19 3' adaptador y el adaptador de 5' (pozos 4 y 9) y entre el nt-24 3' adaptador y el adaptador de 5' (pozos de 5 y 10) se ejecutan en paralelo, a cada lado del pozo que contiene la biblioteca de RNA. Las bandas más altas (ver asteriscos blancos) son los productos de la ligadura 5' adaptador y utiliza como guía para la supresión de la banda de gel que contiene el 5' adaptador ligarse biblioteca de RNA. Los productos de ligadura de marcador de tamaño de ligadura que purificado en la página anterior se ejecutan en el pozo 3. Como se observa en los pozos 1 y 12, la escalera de tamaño nt 20 también se ejecutó a validar el tamaño esperado de la biblioteca de RNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: piloto PCR y amplificación a gran escala de la biblioteca del cDNA. Se evaluaron el tamaño y la proporción de los productos PCR en un gel de agarosa 2,5% en presencia de bromuro de etidio. (A) después de reversa de la transcripción de la biblioteca de código de barras RNA, una alícuota de la biblioteca de cDNA se amplificó utilizando los cebadores PCR de 5' y 3' en una sola reacción de PCR piloto. Alícuotas de las reacciones de PCR piloto fueron obtenidos en ciclos de 10, 12, 14, 16, 18 y 20 y migrar en gel de agarosa al 2,5%. Como se observa entre 1 y 7 pozos, la presencia de los dímeros de cDNA biblioteca y adaptador fue exponencialmente observable (ver rectángulos verdes). Para esta biblioteca, el ciclo PCR para la amplificación de la biblioteca de cDNA fue 15. (B) este esquema muestra la posición y longitud de los oligonucleótidos diferentes y los productos resultantes de la RNA y DNA, que son identificables en los geles de la página y agarosa. (C) alícuotas de las 6 reacciones de polimerización en cadena a gran escala (identificadas en A) se analizaron por separado en una agarosa 2,5% gel (véase wells 3 a 8). Los dos tipos de productos de la PCR, es decir, la biblioteca (banda superior) y los dímeros de primers (banda inferior) son visibles en este gel (véase verdes rectángulos). La reacción de PCR en blanco sin cDNA no muestra ninguna amplificación por PCR (ver 2 bien). La escalera de tamaño 20 de nt permite la verificación de los tamaños del producto (véase pozo 1). Gel (D) imagen en un transiluminador de luz azul de la agarosa 2,5% gel que contienen las reacciones de PCR combinadas funcionó en dos pozos adyacentes. Como se observa, la banda más alta en ambos pocillos está dentro del tamaño esperado de la biblioteca y la banda de dímero de adaptador se encuentra a continuación. Las bandas superiores de PCR fueron suprimidas y purificadas con un kit de extracción de gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: evaluación de la PCR purificada amplificado biblioteca ADN. Una pequeña alícuota (1 μl) de la biblioteca de cDNA amplificado PCR es analizada mediante un chip de ADN de alta sensibilidad en una plataforma basada en microfluídica. (A) este panel muestra la migración de los marcadores de tamaño para la calibración del instrumento. (B) este panel muestra la migración de la biblioteca de cDNA amplificado PCR purificada. El pico más alto se medirá a un tamaño de 100 bp (ver asterisco) y representa la biblioteca de cDNA. El pequeño pico evaluado en 72 bp por el instrumento representa los dimeros de primer adaptador. El pico de bp 100 había detectado por microfluídica basada plataforma revela el tamaño estimado de la biblioteca de cDNA amplificado, que contiene a 18 muestras de RNA con código de barras individual para NGS posterior en un sistema de secuenciación de alto rendimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: preparación de biblioteca de cDNA y el uso de la secuenciación de próxima generación emparejado muestras de parafina fresca congelada y fijados con formol incorporado. (A) ARN Total extraído de emparejado fresco congelado y tumores de carcinoma ductal infiltrante (IDC) FFPE se analizó en un chip de RNA total en una plataforma de microfluídica basada. (B) ARN Total de fresco emparejado muestras FFPE (IBC 1 y IBC2) y congelados experimentaron el protocolo de preparación de biblioteca de cDNA y se trazaron los datos de la secuencia de miRNA. (C) expresión de la DifferentialmiRNA entre IBC1/IBC2 muestras y correlación entre congelado y FFPE muestras. expresión de miRNA se muestra en el conteo de registro por millones (CPM), de alta a baja Lee (rojo al color azul). La significación de la diferencia de expresión entre los pares de dos tejidos, por miRNA, se muestra por los círculos grises, con alta y baja expresión miRNAs identificado en muestras FFPE y fresco. (D) ARN Total extraído de fresco emparejado y ejemplares de FFPE ARN de la célula líneas MCF10A y MCF7, mama invasivo cáncer (IBC 1 y IBC2), cervical tejido mamario (Cx), archivados los tejidos de la mama normal (normal Br1, Br2 normal y normal 3 Br), y cáncer de mama invasivo archivados (5 de IBC, IBC 6 y IBC7) experimentó la preparación de la biblioteca de cDNA en el mismo recorrido. Los datos NGS de miRNAs detectados en las bibliotecas se muestran en una configuración de mapa de calor. Esta figura ha sido modificada de Loudig et al. 20 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: cDNA biblioteca preparación y miRNA expresión correlación entre repeticiones usando mayores archiva muestras FFPE. ARN total de 18, 20, 22, 27, 30 y 35 años archivados FFPE mama los especímenes del tejido experimentó nuestro protocolo de preparación de biblioteca de cDNA optimizado. Replicadas muestras de RNA de 9 diferentes muestras FFPE ligadas con diferentes 3' barras de oligonucleótidos y analizadas dentro de la misma biblioteca en la semana 1 (w1). El mismo experimento fue repetido dentro de un intervalo de una semana (semana 2 o w2). Medidas de reproducibilidad de los datos de expresión de miRNA duplicados entre las mismas muestras archivadas de RNA se muestran en los heatmaps y con coeficientes de correlación evaluados entre 0,93 y 0,99. Esta figura ha sido modificada de Loudig et al. 20 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Un protocolo de preparación de biblioteca de cDNA altamente reproducible y robusto para NGS de small RNAs en muestras de ARN FFPE se presenta en el presente Protocolo, que es una versión modificada y optimizada del procedimiento descrito por Hafner et al. 22

Todos los pasos de este protocolo han sido optimizados para el uso con mayores archivado y comprometido ARN total recuperado de muestras FFPE. El paso fundamental de este protocolo, para el procesamiento de pequeñas cantidades de ARN FFPE, reside en la puesta en común de todas las muestras de RNA (es decir, 18 100 ng ARN FFPE muestras individuales) después de trompas individuales con los adaptadores de código de barras único 3' 18. Este paso crítico permite que las 18 muestras de ARN FFPE uniformemente a todos posterior bioquímicos y enzimáticos pasos necesarios para la preparación de la pequeña biblioteca de cDNA RNA. Además, este paso maximiza la cantidad de RNA en las precipitaciones y gel purificaciones realzando el efecto portador de las pequeñas moléculas de ARN y facilitando la observación de la pelotilla y gel selecciones. Otra característica clave de este protocolo, que además destaca su versatilidad al trabajar con pequeñas cantidades de ARN FFPE, es que un piloto reacción de PCR se utiliza para identificar el ciclo de amplificación óptima de la biblioteca de cDNA. Este paso también proporciona penetraciones en la dinámica de la ampliación de la biblioteca frente a amplificación de dímero de cartilla, que es esencial cuando se prepara la reacción de polimerización en cadena a gran escala y la pequeña biblioteca de RNA sobre la agarosa de la purificación del gel. Los datos agregados a este protocolo demuestran la reproducibilidad de este enfoque entre emparejado congelados y FFPE especímenes y también destaca su aplicabilidad a ARN FFPE mayores muestras de especímenes archivados hasta 35 años.

Este protocolo fue modificado de su versión original, por lo que se optimiza para la preparación de pequeñas bibliotecas de RNA de menor calidad y cantidad de ARN FFPE químicamente modificado y comprometido. Uno de los aspectos de este procedimiento que fue modificado para ligar con éxito y amplificar pequeños RNAs de especímenes FFPE se relaciona con la cantidad de calibrador coctel añadió durante la inicial 3' con código de barras adaptador la ligadura, para que la entrada se redujo a 0.026 nM para evitar competencia con la ligadura de baja abundancia RNAs pequeños presentan en las muestras de RNA FFPE. Otra importante modificación al procedimiento original era la extirpación de todos tamaño etiquetados radiactivo-marcadores utilizados durante la selección de los RNAs pequeños ligados en los geles de la página. Uso de estos marcadores radiactivos de tamaño no sólo limita la aplicabilidad de este enfoque a laboratorios certificados para el uso de radio-isótopos pero prevenido también observación de los productos de RNA en los geles. En cambio, este protocolo optimizado, marcadores de tamaño son ejecutar en pozos adyacentes a la biblioteca, en el gel de la página y visualizar directamente con un colorante fluorescente para la supresión de los RNAs pequeños ligados. Importante, el tinte fluorescente es rociar ligeramente sobre el gel para evitar la difusión de los productos de RNA y entonces visualizar en una caja de luz azul. Posteriormente, como medida de precaución y para mejorar la difusión de los RNAs pequeños ligados contenida en los fragmentos de gel página suprimidos, romper el gel tubos se utilizan para triturar uniformemente el gel antes de la incubación en una solución de NaCl durante la noche a 4 ° C bajo agitación. Todos estos pasos fueron cuidadosamente evaluados para trabajar con cantidades más pequeñas de material.

Este protocolo fue aplicado a muestras de ARN FFPE de diferentes fuentes (órganos e instituciones) que habían sido almacenadas para diferentes cantidades de tiempo. Los análisis revelaron la alta reproducibilidad de la secuenciación de pequeños RNAs de ejemplares frescos y congelados, cuando utilizando esta optimizado el procedimiento. Análisis adicionales mayores muestras de FFPE archivado, almacenada hasta 35 años, demostraron mayor aplicabilidad amplia del protocolo para muestras clínicas. El requisito mínimo de entrada FFPE RNA de muestras FFPE mostró ser 100 ng. Este requisito bajo permite la aplicabilidad del presente Protocolo para una variedad de lesiones de diferentes tamaños y la disponibilidad, pero no permitiría que el análisis de célula FFPE ARN. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que esta optimizado el protocolo también ha sido utilizado con ARN total extraído de circulación exosomas con entradas de menos de 1 ng y ha demostrado que proporcionan perfiles de expresión de RNA de pequeño altamente reproducibles (datos no mostrados). Esta entrada indica que small RNAs en muestras de FFPE, aunque representativa del tejido fresco original, están presentes en mucho menor proporción que en ARN total de circulación exosomas.

En trabajos recientes, donde este protocolo optimizado fue aplicado a muestras de DCIS FFPE clínicamente clasificadas, se encontró que se pudieran validar las diferencias de expresión de miRNA identificadas por NGS de la biblioteca de cDNA por PCR cuantitativa. Este trabajo demostró la factibilidad del uso de las lesiones de CDIS de los tejidos de diferentes instituciones para estudios a gran escala [20]. Este estudio también destacó la robustez de esta preparación de biblioteca de cDNA cuando se realiza en distintos momentos (a intervalos de varias semanas), sin comprometer la reproducibilidad y la sensibilidad del ensayo.

Teniendo en cuenta la gran cantidad de ejemplares clínicamente clasificados de FFPE archivados, este protocolo optimizado proporciona una robusta herramienta para la preparación de las bibliotecas de cDNA en análisis retrospectivos a gran escala y para la potencial identificación de biomarcadores miRNA asociados con cáncer desarrollo21.

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Disclosures

Los autores desean revelar que una publicación que contiene algunos de los datos presentados en este manuscrito fue publicada en la revista internacional de Ciencias moleculares por Loudig et al. 21.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Thomas Tuschl, jefe del laboratorio de biología molecular de RNA, así como los miembros de su laboratorio por su apoyo y por compartir la tecnología desarrollada en su laboratorio, proporcionando acceso a la tubería de RNAworld. También agradecemos a Dr. Markus Hafner para compartir su Protocolo y proporcionar descripciones detalladas sobre todos los pasos bioquímicos y enzimáticos utilizados en su procedimiento inicial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

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References

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