Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

Genetics

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Summary

Fixada em formol parafina espécimes representam uma fonte valiosa de biomarcadores moleculares de doenças humanas. Aqui nós apresentamos um protocolo de preparação de biblioteca de base laboratorial do cDNA, inicialmente projetado com RNA congelado fresco e otimizado para a análise de microRNAs arquivados de tecidos armazenados até 35 anos.

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

-Arquivada, clinicamente classificados fixada em formol parafina os tecidos (FFPE) podem fornecer ácidos nucleicos para retrospectivos estudos moleculares de desenvolvimento de câncer. Por meio de lesões pré-malignas ou não-invasiva de pacientes que mais tarde desenvolvem doença invasiva, análises de expressão de gene podem ajudar a identificar cedo alterações moleculares que predispõem ao risco de câncer. Tem sido bem descrito que ácidos nucleicos recuperados de tecidos FFPE sofreram graves danos físicos e modificações químicas, que dificultam a sua análise e geralmente requer ensaios adaptados. MicroRNAs (miRNAs), no entanto, que representam uma pequena classe de moléculas de RNA, abrangendo apenas até ~ 18-24 nucleotídeos, foram mostrados para suportar o armazenamento a longo prazo e foram analisadas com sucesso em amostras FFPE. Aqui apresentamos um 3' código de barras complementares DNA (cDNA) biblioteca preparação protocolo otimizado especificamente para a análise de pequenos RNAs extraído de tecidos arquivados, que recentemente foi demonstrada para ser robusto e altamente reprodutível quando usando arquivados amostras clínicas armazenadas por até 35 anos. Esta preparação da biblioteca está bem adaptada à análise do material comprometido/degradado onde amostras do RNA (até 18) são ligadas com adaptadores de código de barras individual 3' e depois agrupadas para preparações enzimáticas e bioquímicas subsequentes multiplex antes da análise. Todas purificações são executadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), que permite seleções de tamanho específico e avanços de código de barras pequenas espécies de RNA. Esta preparação de biblioteca de cDNA é bem adaptada ao minutos entradas de RNA, como um piloto cadeia da polimerase (PCR) permite a determinação de um ciclo de amplificação específica produzir quantidades ideais de material para o sequenciamento de próxima geração (NGS). Esta abordagem foi otimizada para o uso do RNA de FFPE degradadas das amostras arquivadas por até 35 anos e fornece dados NGS altamente reprodutíveis.

Introduction

os miRNAs são notavelmente bem conservados no fixada em formol parafina (FFPE) espécimes1,2,3. Trabalhos anteriores têm demonstrado que a expressão destas curtas reguladoras não-codificantes único encalhado RNA moléculas pode ser avaliada com êxito usando o RNA total das amostras FFPE e fornecer dados da expressão do gene relevante quando comparado com o original fresh tecidos4,5,6,7,8. Quando comparado aos RNAs Mensageiro de grande porte, que foram mostrados para ser afectados criticamente por FFPE processamento do tecido (formaldeído, calor, desidratação, etc.), RNases endógenas e a idade dos espécimes, o tamanho pequeno de miRNAs (~ 18 – 24 nucleotídeos) aparece para torná-los resistentes à degradação e resiliente para armazenamento a longo prazo, também demonstrado através de estudos de expressão de miRNA que superam os estudos de mRNA do elevado-throughput em espécimes arquivados9. estudos de expressão de miRNA utilizando amostras clínicas arquivadas, que na sua maioria foram realizadas em análises em pequena escala, tem demonstrado esse single ou multiplexado ensaios PCR quantitativos, diferentes tipos de tecnologias de microarray e mais recentemente NGS pode ser utilizada para avaliar a expressão de miRNAs preservadas após a otimização desses ensaios10,11,12,13,14.

Dado que o dysregulation do miRNA expressão tem sido associada com o desenvolvimento de uma variedade de neoplasias malignas humanas e que há potencialmente um enorme suprimento de clinicamente anotada espécimes arquivados, tornou-se aparente que estes pequenos RNA moléculas representam uma fonte promissora de câncer potenciais biomarcadores15,16,17,18. O uso de uma tecnologia de expressão do gene de alto rendimento como NGS tem a vantagem de fornecer uma avaliação global de todas as transcrições de miRNA quando comparado a tecnologias específicas como PCR e/ou microarrays19. Por esta razão, um protocolo otimizado, acessível e facilmente aplicável para preparação de biblioteca de cDNA de RNAs pequeno de espécimes arquivados mais velhos para NGS foi otimizado para permitir estudos retrospectivos em grande escala20.

Anteriormente, nós estabelecemos um protocolo de extração de RNA/DNA simultâneo para recuperação separado de RNA e DNA de espécimes arquivados mais velhos, que encontramos outperform contemporânea jogos comerciais21. Usando este protocolo de extração, para obter o RNA total de tecidos FFPE arquivados por longo período de tempos, nós aperfeiçoamos a preparação de bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs preservados em amostras clínicas por até 35 anos. Além disso, em um estudo publicado recentemente, onde preparamos bibliotecas de cDNA de carcinoma ductal clinicamente classificada em situ espécimes (DCIS), identificamos os miRNAs diferencialmente expressos que foram validados por PCR quantitativo, que indicou que mudanças de expressão de miRNA específico podem ser detectáveis em lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que desenvolvem câncer de mama quando comparadas às lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que não desenvolvem câncer de mama.

Considerando o custo de kits comerciais para preparação de pequenas bibliotecas de cDNA de RNA, o potencial de sua interrupção, bem como a utilização de reagentes protegidos por direitos autorais/patente que não pode ser otimizado, decidimos adaptar um anteriormente publicados baseado em laboratório e sem kit de 3' código de barras do cDNA biblioteca preparação protocolo para NGS de RNAs pequeno Arquivado em espécimes FFPE, permitindo a análise simultânea de 18 amostras de22. Este protocolo fornece um procedimento passo a passo ideal e robusto com pontos de verificação visual e técnicas de avaliação, que foram fundamentais para a adaptação aos espécimes FFPE RNA, e tem um forte potencial para aplicação em outras fontes de comprometido ou difícil usar material de RNA. Aplicabilidade do protocolo original foi melhorada substituindo tamanho marcado radioactivamente marcadores fluorescentes (por exemplo, SYBR Gold) marcadores de tamanho de RNA detectáveis usados durante a seleção das bibliotecas ligadas na grande gel de poliacrilamida. Este protocolo otimizado depende a ligadura dos adaptadores de código de barras 3' para 18 amostras de RNA FFPE individuais, que são então agrupados para se submeter a 5' ligadura de adaptador, reverso-transcrição e uma análise PCR piloto para adaptados a amplificação do cDNA final biblioteca antes da amplificação do PCR em grande escala, purificação e NGS em um sequenciador de alto rendimento.

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Protocol

1. preparação de todos os reagentes e Primers

  1. Ordenar todos os primers e adaptadores conforme descrito na Figura 1.
  2. Prepare o calibrador estoque cocktail, que vai ser cravado em cada Ligadura individual.
    1. Ressuspender do oligonucleotide transportadora (Figura 1) para 0,5 µM com água livre de RNase. Resuspenda os oligonucleotides de calibrador (Figura 1) 10 a 100 µM usando a 0,5 µM portador do oligonucleotide solução.
    2. Combine 10 µ l de cada um dos 10 calibradores numa microcentrifuga siliconizado para obter um estoque de cocktail Calibrador 100 µM e preparar uma solução de nM 0.026 para armazenar a-20 ° C.
  3. Dilua os adenylated original, liofilizado, 20 3' adaptadores com água livre de RNase a uma concentração final de 50 µM (Figura 1).
    Nota: É aconselhável preparar 2,5 alíquotas µ l de cada adaptador em tubos individuais siliconizados e armazená-los a-80 ° C por até 2 anos.
  4. Ressuspender o demolhado 19 nt-3' adaptador e nt-24 3' oligonucleotides de marcador de tamanho de adaptador para 250 ng/mL (Figura 1).
  5. Ressuspender o HPLC purificada 5' adaptador de 100 µM com água livre de RNAse. Resuspenda os primers PCR 5' e 3' a 100 µM usando água livre de RNase (Figura 1).
    Nota: Alíquota todos os oligonucleotides em quantidades necessárias para 1 – 2 experiências e loja a-80 ° C.
  6. Preparar a poliacrilamida desnaturação (PAA) gel carregando tintura combinando formamide 98,8%, 1% (v/v) 0,5 M nd2H2 EDTA, pH 8.0 e azul de bromofenol 0,2% e definir alíquotas de 1ml a-80 ° C.
    1. Prepare a solução de EDTA 0,5 M nd2H2 adicionando 18,6 g de pó de EDTA at2H2 a 50 mL de água livre de nuclease. Adicione NaOH pelotas para atingir pH 8.0. Ajuste o volume a 100 mL para obter 0,5 M nd2H2 EDTA, solução pH 8.0.
    2. Pesa 15 mg de bromofenol em um tubo de 15ml separado. Adicione 600 µ l de água livre de nuclease. Adicione 14,25 mL de formamida deionizada. Adicione 150 µ la 0,5 M nd2H 2 do EDTA, solução de pH 8.0.
    3. Alíquota da solução final do PAA de 15 mL em alíquotas de 1 mL a-80 ° C.
  7. Preparar o 5 x tintura de carregamento através da combinação de azul de bromofenol 0,2%, 0,2% de xileno cianol FF, 50mm Na2H2 EDTA, pH 8,0 e 20% de gel de agarose tipo Ficoll-400.
    1. Resuspenda 1,86 g de at2H2-EDTA em 50 mL de água livre de nuclease num copo de 400 mL em um agitador magnético, à temperatura ambiente (RT). Adicione NaOH pelotas para atingir um pH 8.0. Adicione água livre de nuclease para chegar a 100 mL, para obter uma solução de EDTA at2H2 de 50mm.
    2. Pesar 2 g de pó de tipo Ficoll-400, 20 mg de pó de FF do xileno cianol e 20 mg de pó de azul de bromofenol e ressuspender em 5 mL de 50mm Na2H2 o EDTA.
    3. Vortex o tubo contendo três corantes e adicionar 5 mL de 50mm Na2H2 o EDTA. Misturar a tintura de 5 x agarose gel de carregamento, alíquotas de 1 mL de preparar e armazenar a-80 ° C.

2. configurar a 3' Barcoded adaptador ligadura com 18 amostras de RNA individuais

  1. Identificar 18 espécimes de RNA (pre-aliquotadas em 100 ng em 9,5 µ l de água livre de nuclease em tubos de 1,5 mL siliconizado microcentrifuga) e definir os tubos em gelo descongelar por 10 min.
  2. Prepare o 10x fresco de RNA Ligase Buffer (sem ATP).
    1. Em um tubo de 1,5 mL siliconizado microcentrifuga, combine 343 µ l de água livre de RNase, 500 µ l de Tris 1 M pH 7,5, 100 µ l de 1m MgCl2, 50 µ l de 20 mg/mL de albumina de soro bovino e 7 µ l de 14m 2-Mercaptoetanol. Mix por agredir o tubo, centrífuga para 2 s em 2.000 x g e RT e definir em gelo.
      Nota: Todas as etapas neste protocolo que indicam "centrifugador para 2 s" são executadas numa bancada microcentrifuga RT e uma velocidade máxima de 2.000 x g para buscar soluções para o fundo do tubo.
  3. Preparar estoque de DMSO aquosa 50% adicionando 1 mL de RNase-livre água 1 ml de DMSO em um tubo de microcentrifugadora 2ml siliconizado, enrole o tubo em papel alumínio e armazene a RT
  4. Degele o coquetel de Calibrador 0.026 nM no gelo durante 10 min. Prepare a ligadura Master Mix combinando na seguinte ordem em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado: 40 µ l de 10 x RNA Ligase Buffer e 120 µ l de 50% de DMSO aquosa com uma pipeta de 200 mL , e adicionar 10 µ l de Calibrador de nM 0.026 cocktail usando uma pipeta de 10 µ l. Agite o tubo de 1,5 mL, misturar, centrifugue durante 2 s e conjunto-o em gelo.
  5. Adicione 8,5 µ l de ligadura Master Mix para cada uma das 18 amostras do RNA FFPE individualmente aliquotadas, agite suavemente os tubos, centrífuga para 2 s e a loja no gelo.
  6. Degele o 2,5 alíquotas µ l de cada um dos 18, 3' barcoded adaptadores e colocá-los no gelo descongelar por 20 min.
    1. Utilize uma pipeta de 3 µ l para transferir 1 µ l de cada adaptador para as amostras de RNA FFPE correspondentes contendo RNA e ligadura Master Mix (ou seja, 9,5 µ l + 8,5 µ l).
    2. Não pipetar para cima e para baixo, simplesmente dispensar no líquido e puxe a ponta para fora. Certifique-se de mudar dicas entre amostras do RNA FFPE. Feche cada tubo, agite para misturar, centrífuga para 2 s e definir no gelo.
  7. Desnaturar as reações, colocando os 18 tubos em um bloco de calor a 90 ° C por 1 min e coloque imediatamente no gelo.
  8. Prepare a solução de enzima ligadura por diluição 10 µ l de truncado K227Q T4 RNA Ligase 2 com 10 µ l de RNase-livre água em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado.
  9. Usar uma pipeta de 3 µ l para transferir 1 µ l da enzima ligadura diluídos em cada uma das 18 amostras do RNA (não Pipetar para cima e para baixo e trocar dicas entre cada tubo). Definir a 18 ligadura no gelo e colocar em um quarto frio de 4 ° C para uma incubação durante a noite de 18 h.

3. purificação do RNAs pequeno ligado

  1. Desactivar as reações de ligadura, colocando os 18 tubos por 1 min em um bloco de calor a 90 ° C e depois voltar para o gelo pelo menos 2 min refrigerar para baixo.
  2. Prepare a precipitação Master Mix, acrescentando 1 µ l de corante azul covalentemente ligado à glicogênio para 26 µ l de NaCl 5 M RNase-livre em um tubo de fresco microcentrifuga siliconizado.
    1. Transferi 1,2 µ l do Master de precipitação Mix em cada um dos 18 tubos. Adicione 63 µ l de etanol 100% para cada um dos 18 tubos. Feche cada tubo, agite para misturar, centrifugue durante 2 s e lugar os tubos em gelo. Combine o conteúdo de todos os 18 tubos em um tubo único 1,5 mL siliconizado.
    2. Fechar o tubo, inverter a três vezes a mistura, centrífuga para 2 s e lugar no gelo por 60 min precipitar.
  3. Prepare um gel de poliacrilamida de 15% (16 x 20 cm2) grande para página.
    1. Dois expressos siliconizado placas de vidro (tratadas com uma alternativa segura para revestimentos de silano) com espaçadores de 0,1 cm.
    2. Combine a 9 mL de diluente de sistema, 18 mL de concentrado de sistema, 3 mL de tampão de sistema, 240 µ l de APS (9%) e 12 µ l de TEMED em um tubo de 50 mL.
    3. Transferir a solução de gel de página entre as placas de vidro com uma pipeta de 30 mL, inserir um pente 14-poço (0,1 cm de espessura) e deixe o gel solidificar no RT por 30 min.
  4. Centrifugar o tubo de 1,5 mL com a ligadura em pool em 16.000 x g e 4 ° C por 60 min.
  5. Remova o pente. Limpe os poços abundantemente com água livre de RNase usando uma garrafa de água com uma ponta de 200 µ l em sua extremidade para alcançar dentro dos poços e forçar a acrilamida não-polimerizada (um bem cada vez) uma lava-louças. Definir o 15% página sobre um aparelho de gel, encher os reservatórios com 0.5 x solução de Tris-borato EDTA (TBE) e pre-funcione o gel por 30 min a 450 V.
  6. Recuperar o tubo com ligadura em pool de centrífuga e seque cuidadosamente a pelota do RNA.
    1. Remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta de 1 mL, mas deixar algum líquido no fundo. Inclinar o tubo e usar uma pipeta de 20 mL para remover o sobrenadante restante sem tocar a pelota. Sucção do vácuo do tubo usando uma pipeta Pasteur com uma ponta de 10 µ l em sua extremidade, sem tocar a pelota.
    2. Resuspenda o pellet de RNA em 20 µ l de água livre de RNase por agredir o tubo. Adicionar 20 µ l de gel PAA carregar solução para Ressuspender o RNA, agite para misturar, centrífuga para 2 RT, sentou-se e definir o tubo a 90 ° c por 1 min e coloque imediatamente no gelo.
  7. Substituir o 0.5 x TBE do aparato gel com fresco 0,5 x TBE e carga da escada, marcadores de tamanho e miRNAs ligados no centro do gel, deixando vazio 2 poços em ambos os lados (Figura 2).
  8. Funcione o gel a 450 V (35 mA) para 60 min, pausa a correr durante 10 minutos esfriar e executar novamente a 520 V (25 mA) para outro 60 min. Uncast os 15% página por retirar uma das placas de vidro.
  9. Borrife levemente o gel sentado na placa de vidro com solução corante fluorescente (10 µ l), em 25 mL de 0.5 x TBE e deixe ele sentar apartamento para 5 min no escuro.
  10. Coloque o copo com o gel em um transiluminador de luz azul e alinhar ambos 19 nt e 24 marcadores de tamanho nt com uma régua para direcionar a excisão do RNAs pequeno ligado (Figura 2). Excisar o gel.
  11. Coloque o gel extirpado em um tubo de 0,5 mL, projetado para gel de fatias, firmemente posicionadas em um tubo de 1,5 mL siliconizado microcentrifuga do fragmento. Centrifugar a 16.000 x g durante 3 minutos em RT. Ressuspender o gel fragmentado com 300 µ l de solução de NaCl de 400mm, fechar o tubo e selá-lo com o filme de parafina.
  12. Conjunto do tubo na agitação em um thermomixer a 1.100 rpm em um quarto frio de 4 ° C para uma incubação overnight (16-17 h).

4. ligadura do adaptador 5'

  1. Transferir a solução e gel fragmentado para um filtro de 5 µm tubo sentado em um tubo de 1,5 mL siliconizado, selar com película de parafina e centrifugar durante 5 min à 2.300 x g e RT
  2. Adicione 950 µ l de etanol 100% a solução filtrada, fechar o tubo, inverter para misturar, centrifugue durante 2 s, feche o tubo com a película de parafina e definido no gelo por 1h.
  3. Preparar um 12% do gel da página conforme descrito na etapa 3.3, mas combinar 12,6 mL de diluente, 14,4 mL de concentrado, 3 mL de tampão, 240 µ l APS e 12 µ l de TEMED em um tubo de 50 mL. Pre-executar a 12% gel PAGE por 30 min a 450 V (~ 35 mA) em 0,5 x TBE.
  4. Centrifugue a solução de RNA pequena purificada a 16.000 x g, durante 60 min a 4 ° C.
  5. Cuidadosamente, pipete fora o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL para remover a maior parte da solução e utilizar uma pipeta de 200 mL para remover o restante da solução, sem tocar a pelota.
  6. Com uma pipeta Pasteur com ponta em sua extremidade, conectada a um balão de vácuo 10 mL, cuidadosamente seca a pelota sem tocá-lo.
  7. Resuspenda o pellet em 9 µ l de água livre de RNase sem pipetagem para cima e para baixo, mas por sacudindo levemente o tubo, centrifugue durante 2 s e o conjunto do tubo no gelo.
  8. Preparar o 10x fresco de RNA Ligase Buffer (com ATP), combinando a 500 µ l de 1 M Tris pH 7,5, 100 µ l de 1 M MgCl2, 50 µ l de 20 mg/mL acetilado BSA, 200 µ l de 10mm ATP, 7 µ l de 2-Mercaptoetanol 14m e 143 µ l de água livre de RNase.
  9. Misture o 10x RNA Ligase Buffer (com ATP) por agredir o tubo e centrifugar durante 2 s para recolher a solução na parte inferior do tubo.
  10. Configurar a ligadura de adaptador 5' pela adição µ l 2 de 10 x RNA Ligase Buffer (com ATP), 1 µ l de 100 µM 5' adaptador e 6 µ l 50% DMSO aquoso para o µ l 9, 3' código de barras pequeno RNA solução.
  11. Agite o tubo levemente para misturar, centrifugue durante 2 s para recolher a solução, coloque o tubo num bloco de calor a 90 ° C por 1 min e volta no gelo pelo menos 2 min.
  12. Adicionar 2 µ l de T4 RNA Ligase 1 na solução (não pipete acima e para baixo), agite o tubo, centrífuga para 2 s e sente-se o tubo em flutuante rack em banho-maria 37 ° C por 60 min.
  13. Simultaneamente, configurar dois ligadura entre os 19 nt-3' e o adaptador de 5' e dois ligadura entre o nt-24 3' adaptador e o adaptador de 5'.
    1. Combinar 2 µ l do 19nt-3' adaptador (250 ng / µ l) ou nt-24 3' adaptador (250 ng / µ l) com: 2 µ l do 5' adaptador (100 µM), 2 µ l de RNA Ligase Buffer (com ATP), de 10X 6 µ l de 50% DMSO aquosa, 6 µ l de água livre de RNase e 2 µ l de T4 RNA Ligase 1 em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado.
    2. Agite os tubos para misturar, centrifugue durante 2 s e o conjunto dos tubos a 37º C por 60 min.
  14. Adicionar 20 µ l de tampão de desnaturação PAA a ligadura todos (purificado RNAs pequeno, 2 ligadura com 19nt-3' adaptador e 2 ligadura com 24nt-3' adaptador).
    1. Mix por agredir os tubos, centrífuga para 2 s e incubar os tubos num bloco a 90 ° C, durante 1 min. transferência de calor de todos os tubos para o gelo e preparar uma escada (3 mL de escada com 20 µ l de PAA).
  15. Esvazie o reservatório superior do aparato gel com o pre-run 12% PAGE gel e adicionar a solução fresca de 0,5 x TBE abaixo do nível dos poços (poços são esvaziados com uma pipeta de ponta longa e fina).
    1. Carrega as amostras com uma ponta de pipeta fina, conforme descrito na Figura 3.
    2. X TBE uso 0.5 fresco para encher poços individuais para o topo do gel.
    3. Adicionar 0,5 fresco x TBE ao reservatório acima dos poços e iniciar a electroforese da 12% página para 60 min a 450 V (~ 35 mA).
    4. Pause a execução desligando o gerador para 10 min arrefecer o gel. Reinicie o gerador e execute o gel por 60 min em 520 V (~ 25 mA).
  16. Parar o gerador, esvaziar os reservatórios invertendo-se o aparelho acima uma pia e uncast a 12% página por retirar uma das placas de vidro.
  17. Sente-se o vidro com o gel liso, spray gel com 10 µ l do corante fluorescente em 25 mL 0,5 x TBE, incubar no escuro por 5 min. colocar o vidro com o gel em um transiluminador de luz azul e alinhar ambos os 19 nt e ambos os 24 nt tamanho marcadores com uma régua para direcionar a excisão do RNAs pequeno ligado (Figura 3).
    1. Excisar o gel e transferir o pedaço de gel de extirpado num tubo 0,5 mL gel de disjuntor. Feche a tampa do tubo de gel separador, conjunto em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado e seguro com a película de parafina. Remova o tubo de gel de disjuntor, adicionar 300 µ l de 300 mM de NaCl e 1 µ l de 100 µM 3' do PCR da primeira demão para os pedaços de gel esmagado em um tubo de 1,5 mL.
    2. Feche o tubo com película de parafina na agitação em um thermomixer a 1.100 rpm a 4 ° C, durante a noite (17 – 18 h) em uma sala fria.

5. reversa transcrição do 5' ligado e 3' Barcoded purificado RNAs pequeno

  1. Recuperar o tubo do filtro thermomixer e purificar a solução com um tubo de filtro de 5 µM.
    1. Utilização de uma pipeta de 1 mL para transferir a solução para um tubo de filtro 5 µM inserido um 1,5 mL siliconizado RNase-livre do tubo de coleta. Centrifugar o tubo por 3 min em 2.300 x g e RT
    2. Descartar o tubo do filtro e adicionar 950 µ l de etanol 100% para o tubo de colheita de microcentrifuga de 1,5 mL contendo solução filtrada. Inverta o tubo à mistura, centrífuga para 2 s e lugar no gelo por 60 min. precipitado o RNA de pelotas por centrifugação do tubo em 16.000 x g e 4 ° C, durante 1 h.
  2. Seque a pelota do RNA.
    1. Abra a tampa e remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL, deixando um pouco de líquido no fundo.
    2. Use uma pipeta de 20 µ l para remover todo o sobrenadante restante sem tocar a pelota. Incline o tubo para permitir que qualquer solução para sentar-se no lado oposto da pelota.
    3. Use uma pipeta Pasteur com uma ponta de pipeta não filtrada de 10 mL para aspirar o sobrenadante e secar o sedimento usando um vácuo.
  3. Resuspenda o pellet de RNA em 5,6 µ l de água livre de RNase.
    1. Descongele os reagentes de transcrição reversa no gelo por 15 min. conjunto para uma reação de transcrição reversa adicionando 3 µ l de 5 x 1,5 µ l de ditiotreitol (DTT), 4,2 µ l de 10 x deoxynucleotide trifosfato (dNTPs) (a cada 2 mM) e Buffer para os 5,6 µ l de RNase-livre ressuspenso.
    2. Agite suavemente o tubo para misturar a reação e centrifugar durante 2 s para recolher a solução. Configurar a reação em um bloco de calor a 90 ° C para exatamente 30 s e então transferência diretamente sobre um thermomixer a 50 ° C.
    3. Deixe o tubo sobre o thermomixer por 2 min para que equaliza a temperatura. Adicione 0,75 µ l da enzima transcrição reversa diretamente para a solução, filme delicadamente para misturar e conjunto o tubo de volta a thermomixer a 50 ° C por 30 min imediatamente.
  4. Depois de 30 min, transferi o tubo para um bloco de calor a 95 ° C por 1 min parar a transcrição reversa. Adicionar 95 µ l de água livre de RNase diretamente para a transcrição reversa, agite o tubo para misturar e configurá-lo diretamente no gelo por 2 min.
  5. Rótulo do tubo com a identificação do cDNA estoque biblioteca e biblioteca.

6. piloto do PCR e amplificação por PCR em grande escala

  1. Prepare-se fresco 10 de x PCR buffer por adicionando µ l 304 de água livre de RNase, 125 µ l de 2 M de KCl, 50 µ l de 1 M Tris pH 8.0, 10 µ l de 1m MgCl2, 5 µ l de 1% Triton X-100 e 6 µ l de 1 M 2-Mercaptoetanol num tubo siliconizado microcentrifuga e mantém na RT
  2. Montar a reação de PCR piloto combinando 67 µ l de água livre de RNase, 10 µ l de tampão de PCR, 10 µ l de 10 x dNTPs, 0,5 µ l de 100 µM 5' PCR da primeira demão, 0,5 µ l de 100 µM 3' do PCR da primeira demão, 10 µ l de estoque biblioteca de cDNA de 10x e 2 µ l de 50 x Taq polimerase.
    1. Configurar dois PCR ciclos em um thermocycler como segue: arquivo 1: 94 ° C por 45 s, 50 ° C para 85 s e 72 ° C por 60 s para 10 ciclos, segure a 4 ° C; Arquivo 2: 94 ° C por 45 s, 50 ° C para 85 s e 72 ° C por 60 s para 2 ciclos, segure a 4 ° C. Configurar a reação de PCR de piloto no thermocycler e iniciar o arquivo 1.
    2. No final do arquivo 1, abrir o tubo PCR, e usando uma pipeta de 20 µ l, transferência, 12 µ l da reação de PCR de piloto em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 3 µ l de 5 x gel carregando o corante, misture pipetando para cima e para baixo, fechar o tubo e rotulá-la "10 ciclos".
    3. Fechar o tubo do PCR de piloto e começar 2 arquivo um thermocycler. No final do arquivo 2, abra o tubo do PCR usar uma pipeta de 20 mL para transferir 12 µ l da solução no tubo de 1,5 mL microcentrifuga com 3 µ l de 5 x tintura do carregamento de gel e rotulá-la "12 ciclos".
    4. Repita as etapas descritas em etapas 6.2.2 e 6.2.3 para coletar 12 produtos PCR µ l da reação de PCR de piloto em ciclos PCR, 14, 16, 18 e 20. Adicionar 3 µ l de 5 x tintura gel de carregamento para cada uma das alíquotas PCR 12 µ l e para a escada de nt 20 contendo 3 µ l de escada e 9 µ l de água livre de RNase.
  3. Preparar um gel de agarose de 2,5% com 0,5 x TBE.
    1. Pesar 2,5 g de agarose em um copo limpo e adicionar 100 mL de 0.5 x TBE. Aquece a solução no microondas até ferver. Remover a solução do microondas, agite o frasco para misturar o agarose, adicionar 4 μL de brometo de etídio (10 mg/mL) e transferir a solução para uma bandeja de eletroforese2 7 x 10 cm, fechada em ambas as extremidades com fita adesiva.
    2. Defina um pente 8 poços e deixe o gel de agarose solidificar no RT. transferência o agarose solidificado do gel em um aparelho de eletroforese repleto de 0.5 x TBE.
  4. Carregar a escada e amostras PCR em gel de agarose e executá-lo por 30 min em 120 V.
  5. Avalie o gel em uma caixa de UV para identificar o ciclo ideal de PCR (Figura 4A).
    Nota: O tamanho das bandas PCR antecipados é mostrado na Figura 4B.
    1. Observar as duas bandas PCR em cada um dos diferentes poços (banda superior: biblioteca de DNA, a banda inferior: dímero da primeira demão).
    2. Identificar o ciclo adequado de PCR para a amplificação do cDNA, selecionando o ciclo onde a biblioteca de cDNA é visível, mas o dímero da primeira demão é mal observável.
      Nota: Geralmente, o ciclo adequado de PCR é selecionado entre 12 – 16 ciclos. Na Figura 4A, o ciclo PCR adequado para esta biblioteca é 14.
  6. Configurar as reações de PCR em grande escala (6 x 100 µ l) para a purificação de biblioteca de gel de agarose.
    1. Prepare um tubo fresco de 10x Buffer PCR, seguindo passo 6.1.
    2. Prepare a grande escala do PCR Master Mix em um tubo de 1,5 mL, combinando 435,5 µ l de água livre de RNase, 65 µ l de tampão de x PCR 10, 65 µ l de 10 x dNTPs, 3.25 µ l de 5' primer PCR, 3.25 µ l de 3' PCR primer e pipetagem para cima e para baixo para misturar.
    3. Transferi 88 µ l do PCR Master Mix em seis tubos PCR de 0,5 mL. Transferência de 10 µ l de cDNA Library de estoque (armazenado no gelo), adicionar 2 µ l de 50 x Taq polimerase em cada um dos 6 tubos PCR e pipetar para misturar.
    4. Prepare um tubo de reação de PCR negativo, combinando 77 µ l de RNase-livre água, 10 µ l de tampão de x PCR 10, 10 µ l de 10 x dNTPs, 0,5 µ l de 5' primer PCR, 0,5 µ l de 3' primer PCR e 2 µ l de 50 x Taq polimerase e pipeta para misturar.
    5. Coloque os tubos PCR no thermocycler utilizando o ciclo PCR descrito na etapa 6.2.1 e definir o número ideal de ciclos de amplificação. Preparar um gel de agarose 2,5% usando 0.5 x TBE, conforme descrito na etapa 6.3.
  7. Após amplificação por PCR, transferi 9 µ l de cada tubo PCR em seis tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo 3 µ l de 5 x tintura do carregamento de gel.
    1. Prepare 20 escada nt combinando 3 mL de escada em 9 µ l de água livre de RNase e gel de 3 µ l adicionando corante de carregamento em um tubo de 1,5 mL.
    2. Carregar a escada, controlo PCR negativo e 6 produtos PCR para o gel de agarose e funcione o gel por 30 min em 120 V.
    3. Verificar a uniformidade das amplificações do PCR entre pistas em uma caixa de UV (dê uma imagem).
    4. Combine 3 reações de PCR em duas 1,5 mL siliconizado microcentrifuga tubo (3 x 91 µ l), adicionar µ l 27 de 5 M NaCl e 950 µ l de etanol 100%. Inverta os tubos para misturar e coloque a-20 ° C durante a noite para precipitar os produtos PCR.

7. purificação de biblioteca de cDNA e avaliação

  1. Centrifugar os dois tubos com as reações de PCR a 16.000 x g, durante 60 min a 4 ° C.
  2. Remover o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL, em seguida, incline o tubo com o sedimento no lado superior e o líquido na parte inferior e usar uma pipeta Pasteur, conectada a um balão de vácuo com uma banheira e aspire o líquido com uma ponta de 10 mL no final da pipeta Pasteur.
  3. Configure o digest PmeI.
    1. Um dos rolos PCR com 17,5 µ l de água livre de nuclease Resuspenda e transferir ressuspenso ao segundo pellet de PCR. Adicionar 2 µ l de tampão de 10x e 0,5 µ l da enzima PmeI e definir o resumo em um banho de água durante 2 h a 37 ° C.
    2. Preparar um gel de agarose 2,5% usando 0.5 x TBE (etapa 6.3). Adicione 6 µ l de 5 x tintura gel de carregamento para o resumo. Transferir 13 µ l de cada Resumo em dois poços adjacentes do gel do agarose, carregar a escada de tamanho 20 nt nos poços final e funcione o gel durante 90 minutos a 150 V (Figura 4).
    3. Excisar as bandas PCR superiores do gel na caixa UV, transfira os pedaços de gel num tubo microcentrifuga recentemente pesava 1,5 mL e pesar os pedaços de gel em escala.
  4. Purifica a biblioteca de cDNA amplificado extirpada do PCR usando um kit de extração de gel seguindo as instruções do fabricante. Quantificar a biblioteca de cDNA usando um ensaio de quantificação de DNA e o instrumento, seguindo as instruções do fabricante.
  5. Avalie o tamanho e a pureza da biblioteca de cDNA com um chip de DNA de alta sensibilidade em um Bioanalyzer (Figura 5). Sequência da biblioteca de cDNA usando um sistema de alta produtividade. Transferi o arquivo de dados FASTQ para o pipeline de RNAworld para o aparamento de adaptador e alinhamento para o genoma humano para identificar as sequências de miRNA.

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Representative Results

Conforme descrito no método aqui, um total de 18 amostras de RNA FFPE individuais (100 ng cada) são criadas em tubos separados submeter-se a 3' adenylated código de barras do oligonucleotide T4 ligadura durante a noite. No dia seguinte, as reações enzimáticas são calor-desativado, combinadas e precipitadas em um único tubo. A pelota do RNA é resuspended e as moléculas de RNA ligadas são separadas em um 15% desnaturação gel de poliacrilamida (PAGE), onde marcadores de tamanho do oligonucleotide do RNA que migraram em poços adjacentes do gel página, são usados para selecionar o tamanho apropriado 3' código de barras RNAs pequeno (Figura 2). O pedaço de gel de excisado é incubado em uma solução de NaCl durante a noite para eluir as moléculas de RNA ligadas. No dia seguinte, o RNA eluted é precipitado e uma ligadura de adaptador 5' é executada. Então, as 5' adaptador ligado pequenas moléculas de RNA são migradas e separadas em um gel do acrilamido 12%, onde novamente migrados RNA tamanho marcador oligonucleotides permitirem excisão de tamanho do RNAs pequeno contendo os oligonucleotides de código de barras 3' e 5' adaptador ( Figura 3). O gel excisado é incubado durante a noite em uma solução de NaCl para permitir que a eluição do RNA. No dia seguinte, as pequenas moléculas de RNA ligadas são precipitadas, e a pelota é resuspended em água livre de RNase, seguida por reverso-transcrição; uma alíquota das moléculas de cDNA sofre uma reação de PCR piloto (Figura 4A). Reações de PCR em grande escala usando a mesma entrada de bibliotecas de cDNA são criadas e avaliadas em um gel de agarose de 2,5% para verificar que todas as reações foram adequadamente PCR amplificado (Figura 4B), precipitação do álcool etílico antes da conjugação e durante a noite. No dia seguinte, a biblioteca de cDNA amplificado que contém todos os 18 bibliotecas individuais para os 18 espécimes únicos FFPE RNA, é migrado em um gel de agarose de 2,5% e a top PCR banda, rodando a 100 nt é excisada e purificado (Figura 4). A purificação de biblioteca de cDNA é então avaliada em um chip de DNA de alta sensibilidade (Figura 5) para determinar que o produto do PCR purificado não contiver um excesso de dímeros de primeira demão ou outros subprodutos da reação de PCR. O produto do PCR é então analisado em um sistema de sequenciamento de alto rendimento. O aparamento do adaptador e a geração de 18 arquivos individuais para cada um dos 18 espécimes são executadas usando o pipeline de RNAworld (acesso foi fornecido para nós pelo Dr. Thomas Tuschl). Análises biostatistical então são realizadas para avaliar o conteúdo de miRNA dos espécimes FFPE RNA.

Para validar este otimizado procedimento, correspondido frescos congelados e amostras de tumor de mama FFPE foram usadas para as análises (Figura 6). Semelhante de dois tumores de mama invasivo ductal carcinoma (IDC) foram selecionados para avaliar a sensibilidade do procedimento e determinar se diferenças na expressão miRNA identificadas entre os dois tecidos congelados frescos também podem ser detectadas no correspondente arquivada FFPE Amostras de RNA. Para este experimento, a qualidade do total RNA obtido a 2 fresco congelado e as duas amostras de RNA FFPE combinadas foi avaliada (figura 6A). Como previsto, o tamanho do RNA e a qualidade dos espécimes FFPE severamente diminuiu quando comparado com os RNAs congelados frescos combinados (compare as travessas 1 e 3 e faixas 2 e 4). Um do RNA FFPE tinha sido arquivado na RT por 4 anos (mama invasivo câncer 1, (IBC1)) e o outro tinha sido arquivado na RT por 8 anos (IBC2), enquanto os homólogos frescos congelados tinham sido armazenados a-80 ° C. Os quatro espécimes de RNA foram analisados em uma única biblioteca, usando os códigos de barras individuais 4 e a miRNA ler distribuição parcelas são exibidas na Figura 6B. Os dois painéis top exibem miRNA correlação de expressão entre dois frescos congelado tumor RNAs e suas contrapartes de espécime FFPE RNA específicos. As parcelas entre correspondem frescos congelados e miRNAs FFPE indicam que a preparação de biblioteca de cDNA fornece uma boa reprodutibilidade como uma alta correlação pode ser observada entre os miRNAs detectados em amostras processadas de forma diferente (Frozen vs FFPE). Os dois painéis inferiores exibem a correlação entre dados de expressão miRNA dos dois tumores congelados diferentes e entre os dois tumores FFPE diferentes. Como indicado na Figura 6, as diferenças de expressão de miRNA identificadas entre os dois tumores congelados frescos foram correlacionadas com as diferenças detectadas entre as duas amostras emparelhadas de tumor FFPE. Diferenças na expressão miRNA significado foram detectáveis tanto em fresco congelado e tumores FFPE.

Para avaliar ainda mais a sensibilidade desta abordagem, foram utilizados dados de expressão miRNA de 12 amostras FFPE arquivadas e 4 amostras congeladas frescas de RNA (Figura 6). As 16 amostras diferentes de RNA foram individualmente 3' código de barras e todos usados para a preparação de uma biblioteca de cDNA único. As amostras de RNA usadas nesta linhas de células de mama dois biblioteca incluída, o MCF10A (normal-como a linha celular) e o MCF7 (linha de células de câncer de mama) com RNA de células frescas e da sua arquivados FFPE homólogos23, correspondido frescos congelados e amostras do RNA FFPE de câncer de duas mama amostras analisaram de forma independente (IBC1 e IBC2 na figura 6A e 6B) e correspondem frescos congelados e amostras de RNA FFPE de amostras cervicais normais (Cx). Além disso, analisaram-se amostras de FFPE arquivadas da normal (Br1 normal, normal Br2 e Br3 normal) e cancro da mama nos tecidos (IBC 5, IBC 6 e 7 do IBC), sem seus homólogos frescos congelados. Como observado no heatmap, independentemente de fresco congelado ou RNA FFPE origem, miRNA perfis de expressão das mesmas células (MCF10 ou MCF7), ou mesmos tecidos (IBC1, IBC2 ou Cx) agrupados. Além disso, como observado no cluster sem supervisão, da esquerda para a direita, mamário normal células e tecidos agrupados enquanto tumores de mama e células tumorais agrupado à direita. O tecido do colo do útero, que exibido um perfil de expressão de miRNA diferentes, agrupados no lado direito do heatmap.

Considerando que a maioria dos espécimes FFPE clinicamente arquivados não têm correspondentes congelados frescos mas que eles podem ser recuperados após a duração de armazenamento diferentes, ele foi procurado para determinar se o protocolo de preparação de biblioteca de cDNA otimizado era aplicável e pode ser reproduzido com espécimes FFPE cada vez mais velhos. Conforme exibido na Figura 7, miRNA perfis de expressão de tecidos FFPE arquivados para 18, 20, 22, 27, 30 e 35 anos foram obtidos. O RNA foi extraído usando o otimizado simultânea do RNA/DNA procedimento21, e alíquotas de RNA quádruplo de cada amostra individual de FFPE foram elaboradas no mesmo dia e armazenadas a-80 ° C antes de preparações de biblioteca. Um total de 9 diferentes FFPE amostras foram analisadas em duplicado, onde cada indivíduo alíquota de RNA foi ligada com código de barras diferentes oligonucleotides (18 códigos de barras totais), dentro da mesma biblioteca. Este experimento foi repetido durante duas semanas consecutivas (semana 1 e 2). Isto permitiu a avaliação da reprodutibilidade de preparação de biblioteca de cDNA com as mesmas amostras de RNA usando dois códigos de barras diferentes dentro de uma única biblioteca e entre duas diferentes bibliotecas com um intervalo de uma semana. Como observado na Figura 7, o coeficiente de correlação permaneceu acima 0,96 independentemente da idade da amostra ou a semana de preparação da biblioteca; Portanto, o protocolo de preparação de biblioteca de cDNA otimizado fornece uma ferramenta robusta para análise reprodutível de espécimes FFPE independentemente do seu tempo de arquivamento, por exemplo, o RNA FFPE arquivados de 35 anos de idade (ver mama #9) exibido altas medidas reprodutíveis equivalentes às que observou com as amostras de RNA FFPE 20 anos de idade (ver mama #3).

Figure 1
Figura 1: Oligonucleotides. Todas as sequências do oligonucleotide, seus correspondentes modificações químicas e concentrações utilizadas no presente protocolo são descritas. Os tipos de modificações químicas são descritos na caixa de modificação e as modificações abreviadas exibidas nas sequências do oligonucleotide. O calibrador cocktail exibe a lista dos 10 individuais do RNA do oligonucleotide calibradores, que foram resuspended em uma solução contendo do oligonucleotide transportadora (0,5 µM). Os dezoito adaptadores 3' código de barras do oligonucleotide são detalhados com sombreamento cinzento em sequência do código de barras. A sequência de RNA do adaptador de 5' e as sequências de DNA dos 3' PCR e 5' PCR primers são detalhados. As sequências de RNA dos oligonucleotides marcador de dois tamanho, ou seja referenciados no protocolo como 19 nt-3' adaptador e nt-24 3' marcadores de tamanho do adaptador, são fornecidos. Todos os oligonucleotídeos de DNA e RNA foram adquiridos comercialmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: purificação de página das amostras de código de barras do RNA de 3'. Depois de pool e precipitando as 18 amostras de código de barras do RNA, ressuspenso RNA é migrado e separados por eletroforese em do acrilamido 15% gel (Veja bem-8). O quadrado vermelho destaca a área que contém a 3' microRNAs de código de barras, que foi extirpado com uma lâmina de bisturi e transferido para um tubo isento de nuclease microcentrifuga siliconizado. Um total de quatro poços, com dois contendo o nt-19 3' adaptador e dois contendo o nt-24 3' adaptador foi definido um bem longe, em cada lado da biblioteca (ver poços 5, 6 e 10, 11, respectivamente). Como um teste para o ligase do RNA T4 1 e para a purificação do tamanho ligado marcadores para ser concluída no dia seguinte, reações de ligadura contendo o nt-19 3' marcador de tamanho de adaptador com o adaptador de 5' e o nt-24 3' marcador de tamanho de adaptador com o adaptador de 5' foram executados em poços 2 um D3, respectivamente. Os quadrados amarelos exibem as bandas extirpadas representando os oligonucleotides de RNA do marcador de tamanho ligados com o adaptador de 5'. Essas bandas são purificadas, precipitadas e executar durante sobre os 12% purificação de página (ver Figura 3 abaixo). Poços 1 e 13 contêm a escada de tamanho 20 nt, que ajudou a confirmar os tamanhos antecipados dos produtos ligados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: purificação de página da biblioteca purificada após ligadura do adaptador de 5'. A biblioteca de RNA purificada foi ligada com o adaptador de 5' e o tamanho do produto esperado foi extirpado do 12% página utilizando os marcadores de tamanho ligados (ver a Praça vermelha). Os produtos da ligadura de RNA de T4 entre os 19 nt-3' adaptador e o adaptador 5' (poços 4 e 9) e entre o nt-24 3' adaptador e o adaptador 5' (poços 5 e 10) foram executados em paralelo, de cada lado do bem que contém a biblioteca de RNA. As bandas mais altas (ver asteriscos brancos) são os produtos da 5' adaptador da ligadura e usado como guia para a excisão de banda de gel contendo 5' adaptador ligado a biblioteca de RNA. Os produtos da ligadura ligadura de marcador de tamanho purificados na página anterior são executados em 3 bem. Como observado em poços 1 e 12, a escada de tamanho 20 nt também foi executado para validar o tamanho esperado da biblioteca de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: piloto do PCR e em grande escala amplificação da biblioteca de cDNA. O tamanho e a relação entre os produtos PCR foram avaliados em um gel de agarose de 2,5% na presença de brometo de etídio. (A) após a transcrição reversa da biblioteca de código de barras do RNA, uma alíquota da biblioteca de cDNA foi amplificada utilizando os primers PCR 5' e 3' em uma única reação de PCR piloto. Alíquotas das piloto reações de PCR foram obtidas em ciclos de 10, 12, 14, 16, 18 e 20 e migradas em um gel de agarose de 2,5%. Como observado entre 1 e 7 poços, a presença de dímeros de biblioteca e adaptador do cDNA foi exponencialmente observável (ver retângulos verdes). Para esta biblioteca, o ciclo PCR selecionado para a amplificação da biblioteca de cDNA tinha 15 anos. (B), este esquema mostra a posição e o comprimento dos oligonucleotides diferentes e os produtos resultantes de RNA e DNA, que são identificáveis sobre as página e agarose géis. (C) alíquotas das 6 reações de PCR em grande escala (identificadas em A) foram analisadas separadamente em um agarose de 2,5% do gel (ver poços 3 a 8). Os dois tipos de produtos PCR, nomeadamente a biblioteca (banda superior) e os dímeros de primers (banda baixa) são visíveis sobre este gel (ver verde retângulos). A reação de PCR em branco sem cDNA exibe sem amplificação por PCR (Veja bem 2). A escada de tamanho 20 nt permite verificação dos tamanhos do produto (ver 1 bem). (D) Gel imagem sobre um transiluminador de luz azul de agarose a 2,5% gel contendo as reações de PCR em pool correu em dois poços adjacentes. Como observado, a banda mais alta em ambos os poços está dentro do tamanho esperado biblioteca e a banda de dímero de adaptador situa-se abaixo. As bandas superiores de PCR foram extirpadas e purificadas com um kit de extração do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: avaliação da PCR purificada amplificado biblioteca DNA. Uma pequena alíquota (1 µ l) da biblioteca de cDNA amplificado PCR é analisada usando um chip de DNA de alta sensibilidade em uma plataforma baseada em microfluídica. (A), este painel exibe a migração dos marcadores de tamanho para a calibração do instrumento. (B), este painel exibe a migração da biblioteca de cDNA amplificado PCR purificada. O pico mais alto é medido em um tamanho de 100 bp (veja asterisco) e representa a biblioteca de cDNA. O pico pequeno, avaliado em 72 bp pelo instrumento representa os dímeros de adaptador da primeira demão. O pico de bp 100 detectado por microfluídica baseada plataforma revela o tamanho estimado para a biblioteca de cDNA amplificado, que contém 18 amostras de RNA de código de barras individual para NGS subsequentes em um sistema de sequenciamento de alto rendimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: preparação de biblioteca de cDNA e sequenciamento de última geração usando correspondem espécimes frescos congelados e fixada em formol parafina incorporada. (A) de RNA Total extraído de correspondência fresco congelado e tumores de carcinoma ductal invasivo (IDC) FFPE foi analisada em um chip de RNA total em uma plataforma de microfluídica baseada. (B) RNA Total de correspondência fresco congelado e espécimes FFPE (IBC 1 e IBC2) submeteu-se o protocolo de preparação de biblioteca de cDNA e os dados de sequenciamento de miRNA foram plotados. (C) DifferentialmiRNA expressão entre espécimes de IBC1/IBC2 e correlação entre congelado e FFPE emparelhado amostras. miRNA expressão é exibida no log de contagem por milhão (CPM), de alto a baixas leituras (vermelho a cor azul). O significado da diferença entre os pares de dois tecidos, por miRNA, expressão é exibido por círculos cinzento, com alta e baixa expressão miRNAs identificados no fresco e FFPE amostras. (D) RNA Total extraído correspondente fresca e espécimes de RNA FFPE de célula linhas (MCF10A e MCF7), humano mama invasivo câncer (IBC 1 e IBC2), cervical tecido mamário (Cx), arquivados tecidos mamário normal (normal Br1, Br2 normal e normal 3 Br), e câncer de mama invasivo arquivados (IBC 5, 6 do IBC e IBC7) submeteu-se a preparação de biblioteca de cDNA dentro da mesma. Os dados NGS dos miRNAs detectados nas bibliotecas são exibidos em uma configuração de mapa de calor. Esta figura foi modificada de Loudig et al . 20 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: cDNA biblioteca preparação e miRNA expressão correlação entre repetições usando mais antigos arquivados espécimes FFPE. O RNA total de 18, 20, 22, 27, 30 e 35 anos arquivados FFPE mama amostras passou por nosso protocolo de preparação de biblioteca de cDNA otimizado. Amostras do RNA de 9 amostras diferentes de FFPE foram ligadas com 3 diferentes ' barcoded oligonucleotides e analisadas dentro da mesma biblioteca na semana 1 (w1). O mesmo experimento foi repetido dentro de um intervalo de uma semana (semana 2 ou w2). Medidas de reprodutibilidade de dados de expressão miRNA duplicados entre as mesmas amostras de RNA arquivados são exibidas no heatmaps e com coeficientes de correlação avaliados entre 0,93 e 0,99. Esta figura foi modificada de Loudig et al . 20 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA altamente reprodutível e robusto para NGS de RNAs pequeno Arquivado em amostras de RNA FFPE é apresentado no presente protocolo, que é uma versão modificada e otimizada do procedimento descrito por Hafner et al . 22

Todas as etapas do presente protocolo foram otimizadas para uso com mais antigo arquivado e comprometido o RNA total recuperado de espécimes FFPE. A etapa chave do presente protocolo, para o processamento de pequenas quantidades de RNA FFPE, reside na conjugação de todas as amostras de RNA (ou seja, 18 amostras individuais 100 ng FFPE RNA) após ligadura individuais com os adaptadores de código de barras original 3' 18. Esta etapa crítica permite as 18 amostras de RNA FFPE uniformemente submeter-se a todos os bioquímicas e enzimáticas etapas subsequentes necessárias para a preparação da biblioteca de cDNA de RNA pequena. Além disso, esta etapa maximiza a quantidade de RNA passando por precipitações e purificações de gel, aumentando o efeito de transportadora das pequenas moléculas de RNA e, facilitando a observação de pelotas e seleções do gel. Outra característica fundamental do presente protocolo, o que mais destaca sua versatilidade quando se trabalha com pequenas quantidades de RNA FFPE, é que um piloto reação de PCR é usada para identificar o ciclo ideal de amplificação da biblioteca de cDNA. Esta etapa também fornece insights sobre a dinâmica da amplificação da biblioteca contra a amplificação de dímero da primeira demão, que é crítica quando preparar a reação de PCR em larga escala e purificação da pequena biblioteca de RNA na agarose gel. Os dados adicionados ao presente protocolo demonstram a reprodutibilidade dessa abordagem entre correspondência congelados e FFPE espécimes e também destacar sua aplicabilidade ao mais velho FFPE RNA amostras de espécimes arquivados por até 35 anos.

Este protocolo foi modificado da versão original, então ele é otimizado para preparação de pequenas bibliotecas de RNA de baixa qualidade e quantidade do RNA de FFPE quimicamente modificados e comprometido. Um aspecto deste procedimento que foi modificado para ligate e amplificar RNAs pequeno de espécimes FFPE com êxito se relaciona com a quantidade de Calibrador cocktail cravado durante a inicial 3' ligadura de adaptador de código de barras, para que a entrada foi reduzida a 0,026 nM para evitar concorrência com a ligadura de baixa abundância RNAs pequeno presente em amostras de RNA FFPE. Outra modificação importante para o procedimento original foi a remoção de todos os tamanho-marcadores radioactivamente rotulados usado durante a seleção do RNAs pequeno ligado em geles da página. Uso destes marcadores radiolabeled do tamanho não apenas restrito a aplicabilidade desta abordagem aos laboratórios certificados para uso de radioisótopos mas também impedido a observação dos produtos sobre os geles do RNA. Em vez disso, no presente protocolo otimizado, marcadores de tamanho são executados em poços adjacentes à biblioteca, sobre o gel da página e visualizados diretamente com uma tintura fluorescente para direcionar a excisão do RNAs pequeno ligado. Importante, a tintura fluorescente é levemente pulverizada sobre o gel para prevenir a difusão dos produtos RNA e depois visualizada em uma caixa de luz azul. Posteriormente, como medida de precaução e para melhorar a difusão do RNAs pequeno ligado contidos na página gel de fragmentos extirpados, quebra-gel de tubos são usados para esmagar uniformemente o gel antes da incubação em uma solução de NaCl durante a noite a 4 ° C, sob agitação. Todos estes passos foram cuidadosamente avaliados para trabalhar com pequenas quantidades de material.

Este protocolo foi aplicado a amostras de RNA FFPE de diferentes fontes (órgãos e instituições) que foram guardadas para diferentes quantidades de tempo. As análises revelaram a grande reprodutibilidade de sequenciamento RNAs pequeno de espécimes frescos e congelados, quando usando este otimizado o procedimento. Análises adicionais, utilizando a mais velhos espécimes FFPE arquivados, armazenados por até 35 anos, demonstraram ainda mais vasta aplicabilidade do protocolo amostras clínicas. A RNA FFPE entrada mínimas para espécimes FFPE foi mostrada para ser 100 ng. Esta baixa exigência permite a aplicabilidade do presente protocolo para uma variedade de lesões de diferentes tamanhos e disponibilidade, mas não permitiria que a análise de uma única célula FFPE RNA. É importante notar, no entanto, que esta otimizado protocolo também tem sido usado com RNA total extraído de circulação exosomes com entradas de menos de 1 ng e mostrado para fornecer altamente reprodutíveis perfis pequenos de expressão de RNA (dados não mostrados). Esta entrada baixa sugere que pequenos RNAs em amostras FFPE, embora representativa do tecido fresco original, estão presentes em muito menores proporções do que no RNA total de circulação exosomes.

Em trabalhos recentes, onde este protocolo otimizado foi aplicado aos espécimes de DCIS FFPE clinicamente classificados, verificou-se que diferenças na expressão miRNA identificadas por NGS da biblioteca de cDNA podem ser validadas por PCR quantitativo. Este trabalho demonstrou a viabilidade do uso de lesões de carcinoma ductal in situ de tecidos arquivados de diferentes instituições para estudos retrospectivos em grande escala [20]. Este estudo também destacou a robustez desta preparação de biblioteca de cDNA quando realizados em momentos diferentes (com intervalos de várias semanas), sem comprometer a reprodutibilidade e a sensibilidade do ensaio.

Considerando a grande quantidade de espécimes clinicamente classificados de FFPE arquivados, este protocolo otimizado fornece uma ferramenta robusta para a preparação de bibliotecas de cDNA em análises retrospectivas em larga escala e para a identificação de potencial de biomarcadores miRNA associado com o desenvolvimento de câncer21.

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Disclosures

Os autores desejam divulgar que uma publicação que contém alguns dos dados apresentados neste manuscrito foi publicada no jornal internacional de Ciências moleculares por Loudig et al . 21.

Acknowledgments

Agradecemos o Dr. Thomas Tuschl, chefe do laboratório de biologia molecular de RNA, bem como membros de seu laboratório por seu apoio e para compartilhar a tecnologia desenvolvida no seu laboratório e fornecendo acesso ao pipeline de RNAworld. Agradecemos também o Dr. Markus Hafner para o protocolo de compartilhamento e fornecendo descrições detalhadas sobre todos os passos bioquímicos e enzimáticos utilizados em seu procedimento inicial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

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References

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