Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Immunology and Infection

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Summary

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

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Haynes, B. A., Huyck, R. W., James, A. J., Carter, M. E., Gaafar, O. U., Day, M., Pinto, A., Dobrian, A. D. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e57804, doi:10.3791/57804 (2018).

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Abstract

A obesidade é acompanhada por uma extensa remodelação do tecido adiposo, principalmente através de hipertrofia dos adipócitos. Crescimento extremo dos adipócitos resulta em uma má resposta à insulina, hipóxia local e inflamação. Estimulando a diferenciação dos adipócitos brancos funcionais de progenitores, hipertrofia radical da população adipócito pode ser prevenida e, consequentemente, melhorar a saúde metabólica do tecido adiposo juntamente com uma redução de inflamação. Também, estimulando uma diferenciação dos adipócitos bege/marrom, o gasto de energia total do corpo pode ser aumentado, resultando em perda de peso. Esta abordagem poderia impedir o desenvolvimento de co-morbidades como diabetes tipo 2 e doença cardiovascular obesidade.

Este artigo descreve o isolamento, expansão e diferenciação dos adipócitos brancos e bege de um subconjunto de células endoteliais de tecido adiposo humano que expressam co os marcadores CD31 e CD34. O método é relativamente barato e não é trabalhoso. Ele requer acesso ao tecido adiposo humano e é adequado para amostragem o depósito subcutâneo. Para este protocolo, amostras de tecido adiposo fresco de indivíduos obesos mórbidos [índice de massa corporal (IMC) > 35] são recolhidos durante os procedimentos de cirurgia bariátrica. Usando um immunoseparation sequencial da fracção vascular do estroma, células suficientes são produzidas a partir de tão pouco como 2 – 3 g de gordura. Estas células podem ser expandidas em cultura durante 10 a 14 dias, podem ser criopreservadas e mantém suas propriedades de adipogenic com passagem até passagem 5 – 6. As células são tratadas por 14 dias com um coquetel, usando uma combinação de insulina humana e o agonista do PPARγ-rosiglitazone de adipogenic.

Esta metodologia pode ser usada para a obtenção de prova dos experimentos de conceito sobre os mecanismos moleculares que conduzem a respostas adipogenic nas células endoteliais adiposas, ou para a seleção de novos medicamentos que podem melhorar o adipogenic resposta dirigido também para o branco ou diferenciação dos adipócitos bege/marrom. Usando pequenas biópsias subcutâneas, esta metodologia pode ser usada para filtrar os assuntos não-Respondente para ensaios clínicos vistos estimular adipócitos bege/marrom e brancos para o tratamento da obesidade e co-morbidades.

Introduction

Evidência recente mostra que, tanto nos ratos e nos seres humanos, um subconjunto de células que residem na vasculatura do tecido adiposo pode ser diferenciado em adipócitos branco ou bege/marrom1,2,3. O fenótipo de tais células é um assunto controverso, com evidências que sustentam as células endoteliais, musculares lisas/Pericito ou um espectro de fenótipos intermediários4,5,6,7. O escopo de desenvolver esta metodologia foi testar o potencial de adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais isoladas de diferentes depósitos de gordura dos humanos obesos. Outros estudos na literatura estão focando o adipogenic potencial de fração total do estroma vascular ou do adipócito conhecido progenitores2,8,9. Desde tecnologias actualmente existentes podem alvejar especificamente tecido adiposo células endoteliais por drogas entrega10, compreendendo o potencial de tais células adipogenic submeter-se a indução no sentido de adipócitos brancos ou bege é importante para terapias alvo futuras.

Diferentes grupos relataram a combinação de marcadores CD31 e CD34 como substitutos para isolar as células endoteliais de tecido adiposo humano11,12,13. Normalmente, o isolamento é realizado usando duas etapas sequenciais e uma seleção positiva usando esferas magnéticas. Neste relatório, foi utilizada a immunoseparation usando CD34 + grânulos magnéticos combinados com grânulos plásticos CD31. Encontramos essa técnica superior para o sequencial immunoseparation magnético com relação a preservação da morfologia endotelial típico de paralelepípedos. Além disso, fomos capazes de gerar células suficientes, necessárias para a expansão e adipogenic indução a partir de tão pouco quanto 1-2 g de gordura. A biópsia de pequena amostra de gordura subcutânea é suficiente para produzir a quantidade necessária de células para aplicações a jusante. Este aspecto é potencialmente importante, particularmente se esse método será utilizado para a seleção para uma capacidade de resposta à indução de adipogenic em cobaias humanas.

Ao contrário de outros sistemas relatados na literatura, este método utiliza apenas dois ingredientes para a indução de adipogenic do CD34 + CD31 + células: um agonista do PPARγ — rosiglitazone — e da insulina humana. Importante, a quantidade de insulina usada cai dentro do intervalo normal/alta de circulação post-absorptive insulina em seres humanos14. O grau de sensibilidade à insulina de células em vitro, medido por fosforilação da Akt, não se correlaciona com a capacidade de responder para a indução de cocktail. Curiosamente, usando este condições de cocktail e experimental de indução, uma mistura de brancas e bege/marrom células foram obtidos conforme determinado pelo tamanho e número de gotículas lipídicas intracelulares e a expressão de marcadores moleculares. Este protocolo de indução simples e econômica, juntamente com a avaliação quantitativa do fenótipo das células Respondente (branco vs bege) permite um rastreio dos agentes que potencialmente podem alterar o equilíbrio de bege diferenciada : branco adipócitos.

Este método também fornece uma abordagem translacional para compreender os mecanismos subjacentes da adipogenesis de progenitoras endoteliais vasculares no tecido adiposo humano. Usando esta técnica de isolamento específico/diferenciação, investigadores podem interrogar várias vias responsáveis para adipogenesis em um subconjunto de pilhas endothelial vasculares de vários depósitos de gordura em humanos obesos e magros.

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Protocol

O Comitê de placa de revisão institucional na Eastern Virginia Medical School aprovado a pesquisa e a coleta de amostras de tecido adiposo humano utilizados no estudo. Termo de consentimento informado foram coletado dos pacientes.

1. preparação de Buffers, meios e instrumentos

  1. Preparar uma solução de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 milímetros de cloreto de sódio, 5 mM de cloreto de potássio, sulfato de magnésio 1 mM, 0,4 milímetros de fosfato de potássio dibásico, glicose de 5,5 mM, adenosina de 1mm, mistura de antibiótico/antimicótico 0,01% (50 µ g/mL de penicilina, 50 µ g/mL de estreptomicina, 30 µ g/mL de gentamicina, 15 ng/mL de anfotericina) e 10 mM HEPES (pH = 7,4). Esta solução é preparada fresca cada vez para a coleção de tecido e digestão.
  2. Preparar uma solução de colagenase fresco: 1 mg/mL de colagenase, tipo 1, em KRBSS; fazer 3 mL/g de gordura. Pré-aquecer a solução de colagenase a 37 ° C em banho de água antes da digestão do tecido.
  3. Preparar um Buffer de isolamento de células CD34: 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de EDTA em salina tampão fosfato (PBS).
  4. Preparar a mídia Adipogenesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina, 1,25 µ l/mL de insulina humana (5 µ g/mL ou 144 mU/mL) e 0,36 µ l/mL de 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).
  5. Prepare uma solução stock de óleo vermelho O (ORO) de 0,3% (peso/volume), dissolver 0,3 g de ORO em 100 mL de isopropanol.

2. tecido adiposo do estroma Vascular fração isolamento

Nota: O estudo incluiu uma coorte transversal de morbidamente obesos tipo 2 diabéticos (T2D) e indivíduos não-diabéticos, com idade entre 18-65 anos, submetidos à cirurgia bariátrica no Sentara metabólica e centro de cirurgia de perda de peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Critérios de exclusão foram uma doença auto-imune, incluindo diabetes mellitus tipo 1, as condições que requerem terapia imunossupressora crônica, medicamentos anti-inflamatórios, thiazolinendiones, uso ativo do tabaco, infecções crônicas ou agudas ou uma história de malignidade tratados nos últimos 12 meses. T2D foi definida como um jejum de glicose do plasma de 126 mg/dL ou maior, um de 200 mg/dL ou maior após uma tolerância à glicose 2h teste de glicose ou o uso de medicamentos anti-diabéticos.

  1. Recolha humano omental (OM) e tecido adiposo de subcutânea (SC) (AT) de seres humanos submetidos à cirurgia bariátrica.
  2. Mantenha a OM e SC AT em frascos separados, contendo solução salina em buffer do Hank com 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina em temperatura ambiente imediatamente após a retirada de tecido.
  3. Limpe cuidadosamente e remover seções de tecido fibróticas e cauterizadas usando uma pinça e tesoura de colheu etanol 70% quando a amostra chega ao laboratório após a extração do tecido.
  4. Pesar o tecido adiposo e alíquotas que em 5 g (ou menos) para a digestão de colagenase de partição.
  5. Picar finamente a 5 g do AT em 5 mL de uma solução de colagenase em um frasco de cintilação em temperatura ambiente, usando dois pares de tesouras.
  6. Adicione um adicional 10 mL da solução de colagenase no tecido picada para total 15 mL.
  7. Digeri as amostras por 1h, a 37 ° C, em banho-maria com agitação contínua.
  8. Corte a ponta fora uma seringa de 20 mL, tornar um fim brusco.
  9. Corte um quadrado de 9 x 9 cm de uma malha de 250 µm e empurre-a meio caminho em um tubo cônico de 50 mL, utilizando a seringa de fim brusco.
  10. Despeje as amostras a seringa de 20 mL fim brusco e filtro através da malha de nylon 250 µm no tubo cónico de 50 mL separar adipócitos e células do estroma vasculares do tecido não digerido.
    Nota: Não use mais de 5g de AT por tubo cónico de 50 mL, como a malha vai entupir devido ao excesso de material não digerido fibrótico.
  11. Lavar o frasco de cintilação com 10 mL de KRBBS e derramá-lo através do filtro para coletar células residuais.
  12. Incube as amostras filtradas por 5 min à temperatura ambiente.
    Nota: Este passo é importante para permitir os adipócitos para flutuar na parte superior do tubo e algumas das células do estroma vasculares repousar no fundo do tubo.
  13. Utilize uma seringa de 20 mL e um 20 x 6 na pipetagem agulha para remover a camada de fração vascular do estroma e transferir para um tubo cônico de 50ml limpo.
  14. Adicionar 10 mL de KRBBS e permitir que as amostras se sentar no banco durante 5 min, à temperatura ambiente.
  15. Repita as etapas de 2.12 – 2.14 duas vezes.
    Nota: Estes passos irão garantir que não há nenhuma contaminação das células do estroma vasculares com os adipócitos flutuantes.
  16. Manter as frações do estroma vasculares de ambos os depósitos no gelo para processamento adicional, conforme descrito nas etapas abaixo.
    Nota: Não deixe as células no gelo por mais de 1h, pois isto pode ter um impacto sobre a viabilidade celular. Os adipócitos podem ser congelado em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo ou usadas frescos para experimentos.

3. isolamento de células endoteliais de tecido adiposo

  1. Girar as frações vasculares do estroma (SVF) a 500 x g por 5 min, a 4 ° C.
  2. Retire as amostras da centrífuga e com cuidado decantar o sobrenadante; manter a pelota que contém as células SVF.
  3. Resuspenda suavemente as pelotas de célula em 5 mL de PBS.
    Nota: Se mais de 5 g de um depósito de AT foi processada em várias alíquotas (ver passo 2.4), juntar as pelotas de célula.
  4. Girar as amostras em 500 x g durante 5 min, a 4 ° C.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS contar as células.
    Nota: Aqui, um contador automático de células foi usado para a contagem de células. A viabilidade celular foi obtida através da mistura de 12 µ l de suspensão de células com 12 µ l de uma solução de iodeto de laranja/propidium (AO/PI) acridina (ver Tabela de materiais). O número médio de células por grama de AT para cada depósito é: (a) OM Depot: 1,69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC Depot: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. A viabilidade das células de ambos os depósitos era > 90%.
  6. Pelotas as amostras em 500 x g durante 5 min, a 4 ° C.
    Nota: Um protocolo de seleção CD34 Fima (ver Tabela de materiais) foi adaptado para etapas 3.7 – 3.15.
  7. Resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de isolamento de CD34.
    Nota: A contagem de células totais exige os seguintes volumes de re-suspensão: (a) < 2 x 107 células: resuspenda o pellet em 100 µ l; (b) 2 x 108– 5 x 108 células: resuspenda o pellet em 1 mL. Em passos 3.9 – 3.16, os volumes dos reagentes usados foram reduzidos para < 2 x 107 células.
  8. Adicionar 10 µ l de coquetel CD34 e incubar a amostra durante 15 minutos, à temperatura ambiente.
  9. Adicionar 5 µ l de grânulos magnéticos e incubar a amostra durante 10 minutos, à temperatura ambiente.
  10. Adicionar 2,5 mL de tampão de isolamento de CD34 para cada amostra e coloque as amostras para o ímã, por 5 min, à temperatura ambiente.
  11. Inverter o ímã para 5 s para decantar o tampão de isolamento.
  12. Remover as amostras do ímã e repita os passos x 4 3.10 e 3.11.
  13. Retire o tubo do ímã e adicionar 2 mL de tampão de isolamento de CD34.
  14. Pelotas as células a 500 x g por 5 min, a 4 ° C.
  15. Resuspenda as pelotas de células em 1 mL de tampão de isolamento de CD34 e contar as células.
    Nota: Aqui, o número médio de células por grama de AT é: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3.36 x 104; (b) SC Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Um protocolo de plástico immunobead CD31 foi adaptado para etapas 3.16 – 3.34 (ver Tabela de materiais).
  16. Células a 500 x g por 5 min de pelotas e resuspenda o pellet em 250 µ l de tampão B e 250 µ l de tampão de lavagem.
  17. Resuspenda completamente os grânulos CD31 vortexing o tubo.
  18. Adicione 20 µ l de grânulos CD31.
    Nota: Devido a célula total conta > 1 x 106, o volume foi reduzido de acordo com a entrada do fabricante.
  19. Incube a amostra com balanço por 30 min, à temperatura ambiente.
  20. Anexe um coador para um tubo cônico estéril 50 mL.
    Nota: A maior abertura do filtro deve estar no topo.
  21. Antes da separação da célula, adicione 1 mL de tampão de lavagem para equilibrar o coador. Aplique a mistura gerada em etapa 3,16 para o filtro.
  22. Lave o filtro com 5 mL de tampão de lavagem em um movimento circular para um volume total de 20ml. Encaixe o conector para um tubo cônico estéril 50 mL e fechar o conector luer-lock.
  23. Ligue o filtro ao conector. Adicione 1 mL de tampão de lavagem ao longo da parede do filtro. Adicione 1 mL de tampão registrado D ao longo da parede do filtro. Agitar suavemente o frasco da amostra e incube-lo por 10 minutos, à temperatura ambiente.
  24. Adicione 1 mL de tampão de lavagem. Separe as células os grânulos pipetando acima e para baixo 10 x.
    Nota: Evite a geração de bolhas de ar.
  25. Abra o conector luer-lock e permitir que as células destacadas a fluir no tubo cónico de 50 mL. Lavar o filtro 10 x com 1 mL de tampão de lavagem cada vez.
  26. Descartar o conector e o filtro e centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 minutos, a 4 ° C. Resuspenda o pellet celular em 2 mL de mídia de EGM-2 completa para cultura.
    Nota: O número médio de células por grama de AT neste momento é: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC Depot: 4,12 x 103 ± 2,1 x 103. A viabilidade de células de ambos os depósitos foi superior a 90%.

4. indução de Adipogenesis em células endoteliais isoladas

  1. Crescem as células em placas de cultura de tecidos tratados 6-poços com completa EGM-2 de mídia em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Substitua a mídia cada 3-4 dias até as células atinjam a confluência de 80-90%.
    Nota: A duplicação da população é entre 2 a 3 dias.
  2. Expandir as células por chapeamento-los em pratos de Petri de 100mm e dividir as células uma vez 1:3. Nesta fase, as células são na passagem 2.
  3. Contagem de células usando uma célula automática contador (ver Tabela de materiais).
  4. Células de sementes aproximadamente 100 – 200.000 em 6-poços chapas garantindo poços duplicados para cada depósito e cultura-los em completa mídia EGM-2 para 2 dias.
  5. Aspire fora qualquer mídia de crescimento e substituí-lo com 2 mL de DMEM/F12 com 5% FBS e 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina para o controle de células e substituí-lo com 2 mL de mídia Adipogenesis (consulte a etapa 1.4) para as células de tratamento.
  6. Incube as celulas a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 incubadora há 13 dias, substituindo os respectivos meios de comunicação a cada 3 a 4 dias.
    Observação: Células começará a acumular lipídios após 4 dias de tratamento.
  7. Conduta de ORO e Nilo vermelho coloração de acordo com métodos publicados1517.
  8. Para isolar as células para uma extração de RNA, remova a mídia as placas de indução 6-poços e lave-a com 1 mL de PBS estéril.
  9. Adicione 350 µ l de uma solução de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidium (consulte a Tabela de materiais) para cada um bem e incube-lo em temperatura ambiente por 5-10 min.
  10. Raspar as células no prato com uma espátula de célula e transferir as células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    Nota: As amostras podem ser armazenadas no freezer-80 ° C para a extração do RNA e posterior processamento em data posterior.
  11. Extrair o mRNA das amostras usando uma extração de RNA adaptada de protocolo (consulte Tabela de materiais).
  12. Executar uma reação em cadeia do polymerase em tempo real (RT-PCR) para avaliar a expressão gênica usando as seguintes pontas de prova: adiponectina, UCP-1 e CIDEA (ver Tabela de materiais).
    Nota: Aqui, os procedimentos de RT-PCR foram realizados utilizando o seguinte protocolo padrão: desnaturação (95 ° C; 15 s), recozimento e extensão (60 ° C; 1 min) para 40 ciclos. As amostras que expressa genes com valores de CT > 35 foram considerados indetectável.

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Representative Results

Nosso protocolo visa proporcionar uma abordagem in vitro para determinar o potencial de adipogenic de CD34 + CD31 + vascular em células de diferentes depósitos de tecido adiposo humano. Um diagrama de fluxograma simplificado é mostrado na figura 1A. O primeiro passo usando uma seleção positiva de CD34 expressando células resulta em > 95% células CD34 + na população das células recém isoladas (figura 1A). Importante, este marcador é perdido após as células são cultivadas por um par de passagens. Desde CD34 é um marcador comum para diversas progenitores hematopoiéticos e não-hematopoiéticas, a seguinte etapa necessária para a separação dos progenitores endoteliais é a selecção positiva das células CD31 + fora a população de células CD34 + (figura 1A). Embora CD31 é um marcador para células endoteliais, ele também pode ser encontrado nos subconjuntos de células hematopoiéticas. Analisamos várias preparações de ambos a gordura subcutânea e omental por citometria de fluxo e encontradas consistentemente que CD34 + CD31 + células não expressam o marcador CD45 (figura 1B, painéis superiores). Normalmente, < 1% das células mostrou positividade CD45, a população total da célula. Este resultado nos levou a concluir que provavelmente obtivemos uma preparação praticamente livre de progenitores hematopoiéticos. Para determinar se as células expressam o marcador de células-tronco dos adipócitos CD24, analisamos as células de depósitos omental e subcutâneos e encontrado que praticamente não há células expressaram o marcador CD24 no depósito omental (figura 1B, painéis de fundo) e menos de 5% do as células expressaram o marcador no depósito subcutâneo (não mostrado). Para concluir, usando esta metodologia de separação, obtivemos CD34 + CD31 + CD45-CD24-células de depósitos omental e subcutâneos de indivíduos obesos.

Usar os grânulos plásticos conjugado com um anticorpo CD31, obtivemos células exibida a morfologia endotelial paralelepípedos durante passagens precoce, ao contrário de células separadas usando os grânulos magnéticos conjugados com um anticorpo CD31 exibido um fusiformes fenótipo mesenquimal imediatamente após a separação (Figura 2A). Para fundamentar ainda mais a identidade endotelial das células CD34 + CD31 +, realizamos dois ensaios funcionais: uma absorção de DiI-Ac-LDL e uma matriz de membrana basal (referido como matriz aqui) do tubo de formação em vitro. CD34 + CD31 + células foram incubadas com DiI-Ac-LDL e a grande maioria das células foram positiva para a absorção (Figura 1). Como um controle positivo, usamos uma linha microvascular endothelial da pilha primária de tecido adiposo humano (HAMVEC) que está comercialmente disponível (ver Tabela de materiais e Figura 1). Nós também testamos se o CD34 + CD31 + células retêm sua função endotelial após cultivo, determinando a capacidade de tais células para formar estruturas de embarcação-como espontânea em vitro, em uma matriz 3D. Após 3 passagens, CD31 + CD34 + estruturas tubulares de embarcação-como formulários em uma matriz comparável a uma linha de primário de células endoteliais humanas HAMVEC (Figura 1).

Após a expansão das células por 2 – 3 passagens, trocamos as células de mídia completa EGM-2 que contém fatores de crescimento angiogênico-pro na mídia DMEM/F12 suplementada com 5% FBS, rosiglitazona (1 µm) e insulina (144 mU/mL). Manter que as células na EGM-2 completa mídia drasticamente reduzido sua diferenciação de adipogenic. Também, um acréscimo de dexametasona e 3-isobuthyl-1-methylxanthine aos meios de comunicação não alterou a taxa e a extensão da acumulação de lipídios e adição de indometacina reduziram significativamente o acúmulo de lipídios (dados não mostrados). Baseando-se nestes experimentos preliminares, decidimos usar apenas rosiglitazone e insulina para a indução de adipogenic. Após 14 dias da cultura na mídia adipogenic, as células foram fixadas e manchadas com óleo vermelho O ou Nilo vermelho e os núcleos foram counterstained com DAPI (Figura 2B). Nas figuras, imagens representativas são mostradas de células isoladas de emparelhados subcutânea (SC) (Figura 2B, painéis superiores) e tecido de adiposo omental (OM) (Figura 2B, painéis de fundo) de três seres humanos com um IMC entre 37 – 45 kg/m2. Por favor, note que a resposta para a indução varia amplamente entre os indivíduos e entre depósitos do mesmo assunto. Como pode ser visto na imagem fluorescente na Figura 2B, uma população mista de unilocular (setas vermelhas) e multilocular (setas brancas) lipídios contendo células, bem como as células que não se acumulam lipídios (setas amarelas) estão normalmente presentes. A proporção entre os números dessas células é também altamente variável com o assunto e o depósito de origem. Uma quantificação do percentual de lipídios, contendo células (com base na positividade de óleo vermelho O) fora das células totais (baseadas em núcleos de DAPI-manchado) mostraram diferença significativa entre os depósitos de SC e OM do mesmo individuais, com as células do depósito SC sendo mais ágil para a indução de adipogenic (Figura 2). A explicação para a heterogeneidade na resposta entre os indivíduos e os depósitos do mesmo assunto não está clara. No entanto, podemos especular que provavelmente está relacionado com a natureza intrínseca da população celular que carrega a impressão digital na vivo fenótipo/meio ambiente e não devido à variabilidade no protocolo de isolamento.

Para confirmar que as células submeteu-se a diferenciação para amadurecer adipócitos, medimos a expressão de gene da Adiponectina de marcador do pan-adipócito e os marcadores de marrom/bege UCP-1 e CIDEA nas células após 13 dias de indução de adipogenic em comparação com células de controle não-induzido. A expressão da Adiponectina foi aumentada até 10,000-fold nas células diferenciadas em comparação aos controles (Figura 2D). A expressão do gene do CIDEA e UCP1 foi apenas detectável nas células após a estimulação de adipogenic (Figura 2D). Em particular, a expressão de UCP-1 foi altamente variável, refletindo as diferentes proporções do branco: marrom / bege células no seio da população celular. A expressão do gene da limpeza RPL27 foi notavelmente consistente entre as amostras com valores de CT variando entre 18 a 20 ciclos e sem diferenças significativas foram encontradas entre as células que submeteu-se a diferenciação de adipogenic e o controles não tratados. Também detectamos uma expressão da proteína UCP-1 nas células que exibido o fenótipo multi locular, em um padrão punctated que sugere uma localização mitocondrial (Figura 2E). A proteína UCP-1 não era detectável em células que não acumular lipídios ou em células com múltiplas, muito pequenas gotas que provavelmente não são totalmente diferenciadas adipócitos (Figura 2E).

Nossa observação que o potencial de adipogenic de células CD34 + CD31 + é depósito específico e altamente variável entre diferentes assuntos nos levou a procurar potenciais correlações com IMC, idade e HbA1c. Entre as 28 amostras analisadas, não encontramos qualquer correlações significativas entre o potencial de adipogenic e idade ou IMC; no entanto, encontramos uma correlação negativa significativa entre HbA1c e o acúmulo de lipídios nas células do depósito OM (Figura 3A). Esta constatação indica uma potencial relação com o ambiente hiperglicêmico crônico e merece investigação futura. Isto também sugere que o CD34 + CD31 + prováveis células carregam a assinatura na vivo da sua capacidade para responder a uma indução de adipogenic. Também mostramos que essas células exibem níveis variáveis de fosforilação Akt, seguindo um estímulo de insulina em vitro (Figura 3B, topo). No entanto, essa variabilidade na resposta não se correlaciona bem com a sua capacidade de se submeter a uma diferenciação de adipogenic como mostrado pela coloração óleo vermelho O nas fotos das amostras correspondentes (Figura 3B, inferior).

Figure 1
Figura 1: separação e caracterização de células do tecido adiposo humano + CD34 + CD31. (A), este diagrama de fluxograma mostra as principais etapas de isolamento e diferenciação. Após a selecção positiva usando grânulos magnéticos CD34, > 95% das células recém isoladas, antes da segunda etapa de seleção, são CD34 +. (B) Este citometria de fluxo representativa mostra um avanço dispersado enredo fechado para a população de células vivas; um exemplo imaculado no canal FITC (BluFl2); e CD45 coloração de uma amostra representativa omental no topo. A parte inferior mostra a mesma sequência como mostrado no topo, mas para as células de CD24 (Alexafluor 647-rotulado) da amostra omental. (C) estas representante micrografias mostram uma absorção de DiI-Ac-LDL (vermelho) por CD34 + CD31 + células após 4 h de incubação de em vitro (painel superior). Uma absorção semelhante foi encontrada em uma linha de célula primária de células endoteliais microvascular do tecido adiposo humano (HAMVEC) (painel inferior). Os núcleos são mostrados azuis por DAPI. (D) estas micrografias representativas mostram uma formação de tubo em vitro de células semeadas em uma matriz 3D + CD34 + CD31. CD34 + CD31 + células (trecho 3) foram semeadas em placas de 24 poços seguindo uma coloração com FITC-calceína e incubadas durante 4 h em mídia de célula endotelial completa. As células foram fotografadas usando um microscópio fluorescente invertido. HAMVEC, semeada na mesma densidade, foi usado para comparação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Adipogenic indução e marcadores de células CD34 + CD31 +. (A) estes representante show de micrografias as diferenças morfológicas entre CD34 + CD31 + células isolaram usando uma seleção positiva com CD31 + magnética vs CD31 + plásticos grânulos. As células foram fotografadas na passagem 1 após o isolamento. A ampliação usada é 100 X. (B) estes painéis são micrografias representativas do óleo vermelho O manchado CD34 + CD31 + células de emparelhados subcutânea (SC) e amostras de (OM) viscerais omental 3 assuntos diferentes. As células foram cultivadas por 2 – 3 passagens em mídia completa EGM-2 e, em seguida, ligado a mídia DMEM/F12 com 5% FBS e tratados com insulina (144 mU/mL) e rosiglitazona (1 µM) durante 14 dias, com mídia trocada a cada 3 dias. A ampliação usada é 100 X. A imagem representativa fluorescente mostra gotículas de lipídios vermelho adipo (verdes) e DAPI nuclear de coloração (azul). Por favor, note que uma mistura de células que contêm lipídios unilocular (seta vermelha), gotículas lipídicas multilocular (seta branca) ou células que mostram sem acúmulo de lipídios (seta amarela). A ampliação usada é 200 X, barra de escala = 50 µm. (C) este painel mostra uma quantificação de adipogenic potenciais expressa como óleo vermelho O ORO () células positivas normalizadas para totais núcleos DAPI-manchado. CD34 + CD31 + células de depósitos OM e SC do mesmo assunto mostram uma diferença significativa na adipogenic potenciais por um par de t-Student (n = 7). (D) a expressão do gene do adipócito maduro marcadores (adiponectina, UCP-1 e CIDEA) foi medido por RT-PCR em células após 14 dias de indução de adipogenic e nas células de controle. Os dados são expressos como uma dobra-mudança para a expressão de gene Adiponectina. A expressão de CIDEA e UCP-1 não era detectável em amostras de controle. Os valores representam ΔCt normalizada para RPL27 como um gene de limpeza. Os valores de C,T para RLP27 estavam entre os 18 a 20 ciclos para todas as amostras incluídas na análise (n = 3 – 5 temas). Os dados são expressos como média ± SD Um par de t-Student foi utilizado para uma análise estatística dos dados. p < 0.05 rejeita a hipótese nula. (E) este painel mostra a expressão da proteína UCP-1 no CD34 + CD31 + células após 13 dias de indução com insulina e rosiglitazona. Imunocitoquímica, usando um anticorpo policlonal de UCP-1 humano mostrou uma expressão seletiva de UCP-1 em adipócitos multi locular. A detecção foi obtida usando um rodamina-anticorpo secundario conjugado (vermelho) e DAPI mancha para núcleos (azul). A grande ampliação na inserção mostra o sinal vermelho punctated correspondente a UCP-1 (seta vermelha), bem como as várias gotículas lipídicas (LD) de tamanhos diferentes em torno do núcleo da célula (N). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Correlação entre adipogenic diferenciação, HbA1c e em vitro insulina sinalização. (A) Spearman (não-paramétrica) e coeficientes de correlação Pearson (paramétricos) para as células de OM e SC, respectivamente, foram usados para determinar a correlação entre HbA1c e o acúmulo de lipídios (n = 20). A hipótese nula foi rejeitada para p < 0,05. (B) na parte superior, uma mancha ocidental mostra a Akt fosforilada (verde) e a total expressão de Akt (vermelho) em células + CD34 + CD31 estimulada em vitro com 5 insulina nM por 30 min antes da indução de adipogenic (n = 8). Na parte inferior, é mostrada uma mancha de óleo vermelho O das mesmas células após a indução de adipogenic durante 14 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O foco deste artigo é fornecer uma metodologia para o isolamento, a expansão e a indução de adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de depósitos viscerais e subcutâneas de tecido adiposo humano.

Metodologias foram relatadas para o isolamento de células endoteliais de vários leitos vasculares de roedores ou humanos que envolvem principalmente técnicas usando anticorpos CD31 fluorescente etiquetado ou acoplado a grânulos magnético18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. um grande desafio para o uso universal destas técnicas de isolamento é a heterogeneidade da população em diferentes camas vasculares endothelial da pilha e o alto risco de contaminação com fibroblastos e células murais vasculares. Entretanto, os refinamentos das técnicas de isolamento para evitar tais contaminações foram relatados24. Usando estas técnicas, principalmente de células endoteliais maduras são isoladas dos tecidos. Tecido adiposo é um grande reservatório de células tronco/progenitoras, incluindo progenitoras endoteliais25,26. Alguns jornais relataram a purificação de células endoteliais de tecido adiposo humano, usando uma combinação de CD34 + e CD31 + anticorpos2711,. Células que expressam os dois marcadores são uma população mista de células endoteliais maduras e progenitoras endoteliais11,28,29. Vários trabalhos seminais recentes relatam que um pequeno subconjunto de endotelial (CD31 +) ou células (PDGFRβ +) murais na vasculatura adiposa é uma fonte rica de adipócito progenitores5,30. Estas células vasculares com potencial adipogenic podem produzir adipócitos brancos ou marrom/bege e estão associadas com o ativo angiogênese na vasculatura adiposa5. Estes resultados podem fornecer novas oportunidades terapêuticas para melhorar a performance metabólica da obesidade e/ou para induzir perda de peso gerando adipócitos brancos e/ou termogênicos de progenitores vasculares. É, portanto, de interesse para identificar uma metodologia para o isolamento fácil e econômico, expansão e avaliação do potencial adipogenic de pilhas endothelial vasculares do tecido adiposo humano.

O CD34 + CD31 + células de depósitos subcutâneos e omental visceral adiposo tecido humano anteriormente foram caracterizadas com base em seu potencial angiogênico, a produção de mediadores inflamatórios, os marcadores de senescência e outras funções11 , 31. no entanto, não há nenhuma evidência publicada para o potencial de adipogenic de tais células. Publicações anteriores que separava CD34 + CD31 + células usando grânulos magnéticos relatam sobre dados de células em um pool de um grande número de indivíduos (10 ou mais)11. Este trabalho relata pela primeira vez um protocolo para o isolamento de sucesso e expansão do CD34 + CD31 + células de doadores humanos único de ambos os depósitos subcutâneos e omental. Estamos isolados e expandido as células do tão pouco quanto 2 – 3 g de tecido adiposo. O CD34 + CD31 + células representadas 3 – 5% das células SVF totais e exibido > 90% viabilidade após o isolamento. Estas células foram altamente proliferativas e mostraram uma grande variedade de respostas para a diferenciação de adipogenic seguindo uma estimulação em vitro com Rosiglitazona e insulina. Estudos anteriores só usado células-tronco adiposas ou fracção vascular do estroma total de tecido adiposo humano para testar adipogenic respostas4,32,33,34. Um estudo recente usado suspensões única célula da microvasculatura do tecido adiposo humano, mas não está claro se os adipócitos diferenciados eram mural ou endoteliais na natureza3.

Immunophenotyping adicional do CD34 + CD31 + células usando citometria de fluxo mostrou sua falta de marcadores CD45 e CD24 independentemente do seu depósito de origem. Importante, mostramos que após 3 passagens em cultura, o CD31 + CD34 + células retêm sua funcionalidade endotelial demonstrada pelo acúmulo de LDL acetilado e uma formação de tubo em vitro em 3D-matriz. Além disso, os adipócitos diferenciados representado uma população mista de células brancas e bege/marrom, com base na sua morfologia e marcadores moleculares, incluindo uma expressão de proteína UCP-1. Estudos anteriores em ratos mostraram que a vascularização do tecido adiposo pode ser uma fonte de ambos brancos e adipócitos marrons5,30 e os dados mais recentes mostraram um resultado semelhante com relação a diferenciação de branco e funcionalmente termogênicos bege células da vasculatura tecido adiposo humano3.

Ao contrário da maioria das publicações que usado adipogenic coquetéis contendo vários ingredientes para a diferenciação dos adipócitos de uma gama de progenitores em vitro, encontramos que a Rosiglitazona e insulina são necessárias e suficientes para o adipogenic indução de células + CD34 + CD31. Enquanto estamos conscientes que rosiglitazone sozinha pode induzir um acúmulo de lipídios em células não-adiposo35, a assinatura molecular para pan-adipócito e marcadores dos adipócitos marrom/bege, incluindo uma proteína UCP-1 expressão em selecionadas células, confirma o maduro fenótipo dos adipócitos de algumas das células diferenciadas. Nosso dois-ingrediente adipogenic cocktail simplifica o protocolo processual e torna-lo mais rentável.

Uma observação importante que era a resposta de adipogenic do CD34 + CD31 + células altamente variável com o assunto de doador e depósito de tecido adiposo. Enquanto diferenças específicas do depósito no adipogenic respostas de células-tronco adiposas ou do estroma vasculares progenitores foram relataram anteriormente32,34, a variabilidade de tal resposta é uma observação de romance. Humano 20 amostras analisadas, 3 SC e 7 células OM não respondeu para a indução de adipogenic. As respostas mais robustas mostraram > 90% das células responsivos para a indução de 4 amostras de SC e para 2 amostras de OM. Curiosamente, descobrimos que a capacidade de resposta está negativamente correlacionada com HbA1c e não se correlaciona com a resposta a um em Vitro estimulação da insulina em células indiferenciadas. Argumentamos que a diferença de resposta não é devido a pobre reprodutibilidade da técnica mas prefiro reflete a impressão individual de células que imitam respostas na vivo . A preservação desta resposta diferencial requer mais validação e pode representar um método de triagem relativamente fácil para a capacidade de resposta às terapias visava estimular adipogenesis em vivo. Para se perceber a fonte de variabilidade individual em potencial a adipogenic, immunophenotyping adicional é necessário identificar subpopulações de células dentro do CD34 + CD31 + população que ostentam uma função de progenitor específicas dos adipócitos.

Algumas das limitações do presente protocolo incluem uma caracterização incompleta das populações celulares; relativamente longa expansão e diferenciação vezes (2 semanas + 2 semanas); possíveis limitações de acesso às amostras humanas e a necessidade do processamento imediato dos tecidos recém coletados; e a atual falta de dados funcionais das células diferenciadas. Existem várias vantagens desta metodologia que incluem um protocolo reprodutível e não intensivo; células que provavelmente retêm a impressão digital do seu fenótipo na vivo ; a expansão de células de pequenas quantidades de tecidos com custos relativamente baixos; a possibilidade de cryopreserve as células e reter sua assinatura adipogenic após re-cultura; e a opção de gerar repositórios dessas células, de modo que eles podem ser usados para a triagem de futura ou outros fins.

Este protocolo e o CD34 + CD31 + células obtidas como resultado podem ser usadas como uma plataforma de translação para estudos mecanicistas e para fins de triagem.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores desejam reconhecer Becky Marquez, o coordenador clínico no centro de bariátrica Sentara, pela sua assistência com o processo do paciente, triagem e concordando. Esta pesquisa foi apoiada pelo R15HL114062 para Anca D. Dobrian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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