Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Haynes, B. A., Huyck, R. W., James, A. J., Carter, M. E., Gaafar, O. U., Day, M., Pinto, A., Dobrian, A. D. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e57804, doi:10.3791/57804 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Obezite bir geniş yağ dokusu adipocyte hipertrofisi ile öncelikle remodeling tarafından eşlik ediyor. Aşırı adipocyte büyüme insülin, yerel hipoksi ve inflamasyon zavallı bir yanıt sonuçlanır. Tarafından ataları gelen fonksiyonel beyaz adiposit farklılaşma uyarıcı, radikal hipertrofisi adipocyte nüfusun önlenebilir ve sonuç olarak, yağ dokusu metabolik sağlık bir azalma ile birlikte geliştirilebilir iltihap. Ayrıca, bej/kahverengi adiposit bir farklılaşma uyararak, toplam vücut enerji harcaması, kilo kaybına kaynaklanan artırılabilir. Bu yaklaşım obezite komorbiditeler tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişimini engelleyebilir.

Bu kağıt yalıtım, genişleme ve beyaz ve bej adiposit CD31 ve CD34 işaretleri Co hızlı insan yağ dokusu endotel hücre alt grubunu üzerinden farklılaşma açıklanmaktadır. Yöntem nispeten ucuzdur ve emek yoğun değil. İnsan yağ dokusu erişimi gerektirir ve subkutan depo örnekleme için uygundur. Bu iletişim kuralı için taze yağ doku örnekleri morbid obez bir konu [vücut kitle indeksi (VKİ) > 35] Bariatrik cerrahi prosedürler sırasında toplanır. Stromal vasküler kesir üzerinden sıralı bir immunoseparation kullanarak, yeterince hücre gibi 2-3 g yağ küçük üretilmektedir. Bu hücreler kültür-ebilmek var olmak genişlemek 10-14 gün içinde cryopreserved ve geçiş kadar 5-6 passaging ile onların Adipojenik özellikleri korurlar. Hücreleri bir Adipojenik insan insülin bir arada ve PPARγ agonist-rosiglitazone kullanarak kokteyl ile 14 gün için kabul edilir.

Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış yağ endotel hücrelerinde Adipojenik yanıt-e doğru götürmek moleküler mekanizmaları üzerinde kavramı deneyler kanıtı elde etmek için veya Adipojenik artırabilir yeni ilaçlar eleme için yanıt ya beyaz doğru yönetmen ya da bej/kahverengi adipocyte farklılaşma. Küçük subkutan biyopsi kullanarak, Bu metodoloji Yanıtlayıcı olmayan konular için klinik çalışmalarda bej/kahverengi ve beyaz adiposit komorbiditeler ve obezite tedavisi için teşvik etmek amaçlı dışarıda için kullanılabilir.

Introduction

Son kanıtlar hem fareler ve insanlar, yağ dokusu damarlara ikamet eden hücre alt grubunu beyaz veya bej/kahverengi adiposit1,2,3Ayrıştırılan gösterir. Bu tür hücrelerin fenotip tartışmalara, endotel hücreleri, düz kas/pericyte veya ara fenotipleri4,5,6,7bir spektrum destekleyen kanıt ile bir konudur. Bu metodoloji geliştirme kapsam CD34 + CD31 + endotel hücreleri obez insanlar farklı yağ depoları dan izole Adipojenik potansiyelini test etmek için yapıldı. Diğer çalışmalar literatürde potansiyel toplam stromal vasküler fraksiyonunun veya bilinen adipocyte ataları2,8,9Adipojenik üzerinde duruluyor. Şu anda mevcut teknolojilerin özellikle yağ dokusu endotel hücreleri ilaç teslim10için hedef olabilir olduğundan, potansiyel böyle hücrelerinin Adipojenik geçmesi anlama indüksiyon beyaz veya bej adiposit doğru için önemlidir gelecekte hedefli tedaviler.

Farklı gruplar CD31 ve CD34 işaretleri arada insan yağ dokusu11,12,13endotel hücreleri izole etmek için vekilleri olarak bildirdi. Genellikle, yalıtım iki sıralı adımları ve manyetik boncuklar kullanarak pozitif seçimi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu raporda, CD31 plastik boncuk ile kombine CD34 + manyetik bir boncuk kullanarak immunoseparation kullanılmıştır. Bu teknik sıralı manyetik immunoseparation tipik Arnavut kaldırımlı endotel morfoloji korunması ile ilgili olarak daha üstün bulduk. Ayrıca, 1-2 g yağ gibi küçük başlangıç genişleme ve Adipojenik indüksiyon için gerekli yeterince hücre oluşturmak başardık. Küçük örnek biyopsi subkutan yağ hücreleri aşağı akım uygulamaları için gerekli miktarı üretmek için yeterli olacaktır. Bu açıdan özellikle bu yöntem insan denekler Adipojenik indüksiyon bir kavramaları için tarama için kullanılacaktır, potansiyel olarak önem kazanır.

Literatürde bildirilen diğer sistemlerin aksine, bu yöntem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik indüksiyon için sadece iki malzemeler kullanır: bir PPARγ agonist — rosiglitazone — ve insan insülin. Önemlisi, insanlar14post-absorptive insülin dolaşan normal/yüksek Aralık içinde kullanılan insülin miktarı düşer. Akt fosforilasyon tarafından ölçülen hücreleri vitro, insülin duyarlılık derecesini indüksiyon kokteyl tepki yeteneğini kendi ile ilişkili değil. İlginçtir, bu indüksiyon kokteyl ve deneysel koşullar kullanarak, beyaz ve bej/kahverengi hücreleri bir karışımı elde edilen boyutu ve sayıda hücre içi lipid damlacıkları ve moleküler işaretleyicilerin görünümünü ifade tarafından belirlendiği gibi. Bu basit ve maliyet-etkin indüksiyon Protokolü (bej beyaz vs. ) Yanıtlayıcı hücrelerinin fenotip kantitatif değerlendirilmesi ile birlikte potansiyel olarak farklılaştırılmış bej dengesini değiştirebilir ajanlar bir tarama için izin verir : beyaz adiposit.

Bu yöntem aynı zamanda insan yağ dokusu içinde vasküler endotel ataları adipogenesis temel mekanizmaları anlamak için translasyonel bir yaklaşım sağlar. Bu özel yalıtım/farklılaşma tekniği kullanarak, müfettişler çeşitli yolları yalın ve obez insanlarda çeşitli yağ depoları dan adipogenesis vasküler endotel hücre alt grubunu içinde sorumlu sorguya çekebiliriz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kurumsal teftiş kurulu Derneği Doğu Virginia Tıp Fakültesi, araştırma ve çalışmada kullanılan insan yağ doku örnekleri toplanması onayladı. Bilinçli yazılı izni hastalardan toplanmıştır.

1. hazırlanması arabellekleri, medya ve aletleri

  1. Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered çözüm (KRBBS) hazırlamak: 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibasic, 5.5 mM glikoz, 1 mM Adenozin, % 0,01 antibiyotik/antimycotic mix (50 µg/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin, gentamisin 30 µg/mL, amfoterisin 15 ng/mL) ve 10 mM HEPES (pH 7.4 =). Bu çözüm doku toplama ve sindirim için her zaman taze hazırlanır.
  2. Taze collagenase çözüm hazırlamak: 1 mg/mL collagenase, tip 1, KRBSS; 3 mL/g yağ olun. Doku sindirim önce su banyosunda 37 ° C'de collagenase çözüm önceden ısıtmak.
  3. CD34 hücre izolasyon arabellek hazırlamak: % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM EDTA steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
  4. Adipogenesis ortam hazırlamak: DMEM/F12, % 5 FBS, 50 µg/mL penisilin/streptomisin, 1,25 µL/mL (5 µg/mL veya 144 mU/mL) insan insülin ve 0,36 µL/mL 2.8 mM rosiglitazone (1 µM).
  5. %0,3 yağ kırmızı O (ORO) hisse senedi çözüm (ağırlık/hacim) ORO 0.3 g isopropanol 100 mL içine çözülerek hazırlayın.

2. yağ Stromal vasküler kesir yalıtım

Not: Morbid obez tip 2 diyabetik (T2D) ve Sentara metabolik ve kilo kaybı cerrahi Merkezi'nde (Sentara Medikal Grubu, Norfolk, VA) obezite cerrahisi uygulanan diyabetik olmayan konular, 18-65 yaş arası kesitsel bir kohort çalışma dahil. Dışlama kriterleri bir otoimmün hastalığı tip 1 diyabet, kronik immünsüpresif tedavi, Anti-inflamatuar ilaçlar, thiazolinendiones, etkin tütün kullanımı, kronik veya akut enfeksiyonlar veya bir geçmiş gerektiren koşullar da dahil olmak üzere dahil Son 12 ay içinde tedavi malignite. T2D 126 mg/dL veya daha büyük bir açlık plazma glukoz, 200 mg/dL veya daha büyük 2 h glikoz tolerans testi sonra bir glukoz veya antidiyabetik ilaçların kullanımı tanımlanmıştır.

  1. İnsan omental (OM) ve subkutan (SC) Yağ dokusundan (AT) insan denekler obezite cerrahisi uygulanan toplamak.
  2. OM ve SC AT hemen doku çıkarma sonra Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 50 µg/mL penisilin/streptomisin, oda sıcaklığında içeren ayrı şişeleri tutun.
  3. Dikkatli bir şekilde temiz ve fibrotik ve dağlanmış bölümleri doku örneği laboratuarda doku çıkarma sonra geldiğinde % 70 etanol makas örnek aldım ve cımbız kullanarak kaldırın.
  4. Yağ dokusu tartmak ve BT 5 g (veya daha az) aliquots collagenase sindirim için bölüm.
  5. İnce iki çift makas kullanarak at 5 ml collagenase çözüm oda sıcaklığında bir mercek şişe içinde 5 g kıyma.
  6. 15 mL toplam için kıyılmış doku için ek bir 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin.
  7. Sürekli titriyor ile bir su banyosu içinde 37 ° C'de 1 h için örnekleri sindirmek.
  8. Künt bir son yapmak için bir 20 mL şırınga ihbar kesti.
  9. 250 µm kafes üzerinden 9 cm x 9 cm kare şeklinde bir kesik ve künt son şırınga kullanarak 50 mL konik tüp yarıya kadar itin.
  10. Örnekleri 20 mL künt son şırınga ve 250 µm naylon mesh adiposit ve stromal damar hücreleri sindirilmemiş dokusundan ayırmak için 50 mL konik tüp içine filtreden içine dökün.
    Not: mesh aşırı fibrotik sindirilmemiş malzeme nedeniyle tıkanmış olsun AT 5 g 50 mL konik Tüp, başına birden fazla kullanmayın.
  11. KRBBS 10 mL ile mercek şişe dışarı yıkama ve kalan hücreleri toplamak için filtreden dök.
  12. Filtre uygulanmış örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    Not: Adipositler float tüp üstünde ve bazı stromal damar hücreleri tüpün dibinde yerleşmek için izin vermek bu adım önemlidir.
  13. 20 mL şırınga ve bir 20 G x 6'pipetting iğne stromal vasküler kesir katmanı kaldırın ve temiz 50 mL konik tüp aktarmak için kullanmak.
  14. KRBBS 10 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için bankta oturmak örnekleri sağlar.
  15. 2.12-2,14 adımları iki kez tekrarlayın.
    Not: Aşağıdaki adımları hiçbir kirlenme ile kayan adiposit stromal vasküler hücre olduğundan emin olun.
  16. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi her iki depoları için daha fazla alay, buzda stromal vasküler kesirler tutmak.
    Not: Bu hücre canlılığı üzerinde bir etkiye sahip gibi hücreleri daha 1 h, buz üzerinde terk etmeyin. Adiposit deneyler için taze kullanılan ya da flash donmuş sıvı azot uzun süreli depolama için olabilir.

3. yağ dokusu endotel hücre izolasyon

  1. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de stromal vasküler kesirler (SVF) spin
  2. Örnekler santrifüj kaldır ve dikkatle süpernatant dökün; SVF hücreleri içeren pelet tutun.
  3. Yavaşça hücre topakları PBS 5 mL resuspend.
    Not: bir AT depo daha--dan 5 g (bkz. Adım 2.4) birden çok aliquots işlendiyse, hücre topakları birlikte havuz.
  4. Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de spin
  5. Süpernatant kaldırmak, PBS 1 mL hücrelerde resuspend ve hücreleri saymak.
    Not: Burada, bir otomatik hücre sayaç hücre sayımı için kullanıldı. Hücre canlılığı 12 µL hücre süspansiyon, akridin turuncu/propidium iyodür (AO/PI) çözümünü 12 µL ile karıştırılarak elde edildi ( Tablo malzemelerigörmek). Hücreleri her depo için at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 1,69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC depo: 1,24 x 105 ± 6.45 x 104. Her iki depoları hücrelerden canlılığı yapıldı > % 90.
  6. Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips
    Not: CD34 immunomagnetic seçim Protokolü ( Tablo malzemelerigörmek) adımlar için 3.7-3.15 uyarlanmıştır.
  7. Pelet CD34 yalıtım arabellek 100 µL içinde resuspend.
    Not: Toplam hücre sayısı aşağıdaki re-süspansiyon birimleri gerektirir: (a) < 2 x 107 hücreleri: Pelet 100 µL; resuspend (b) 2 x 108–5 x 108 hücreleri: pelet 1 mL resuspend. 3.9-3,16, adımda kullanılan reaktifler hacimleri için küçülttüm < 2 x 107 hücreleri.
  8. CD34 kokteyl 10 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında örnek kuluçkaya.
  9. Manyetik boncuklar 5 µL ekleyin ve örnek oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  10. CD34 yalıtım arabellek 2.5 mL her örnek için ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için mıknatıs örnekleri yerleştirin.
  11. Mıknatıs 5 için ters çevir'i s yalıtım tampon dökün.
  12. Örnekler mıknatıs kaldırmak ve 3.10 ve 3,11 4 x arasındaki adımları yineleyin.
  13. Tüp mıknatıs kaldır ve CD34 yalıtım arabellek 2 mL ekleyin.
  14. Hücreleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips
  15. Hücre topakları 1 mL CD34 yalıtım arabellek resuspend ve hücreleri saymak.
    Not: İşte, at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC depo: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Bir CD31 plastik immunobead iletişim kuralı için adımları 3,16-3,34 ( Tablo malzemelerigörmek) uyarlanmıştır.
  16. Hücreleri 500 x g 5 min için de cips ve Pelet arabellek b 250 µL ve yıkama arabelleği 250 µL'resuspend.
  17. İyice CD31 boncuk vortexing tüp tarafından resuspend.
  18. 20 µL CD31 boncuk ekleyin.
    Not: Toplam hücresini nedeniyle sayar > 1 x 106, birimin üreticinin giriş göre küçültülmüş.
  19. Oda sıcaklığında 30 dakika sallanan ile örnek kuluçkaya.
  20. Bir süzgeç steril 50 mL konik tüp takın.
    Not: Süzgeç büyük açılış üstte olması gerekir.
  21. Önce hücre ayırma, yıkama arabelleği süzgeç equilibrate 1 mL ekleyin. Süzgeç 3,16 adıma altında oluşturulan karışımı uygulamak.
  22. Dairesel bir hareketle toplam hacmi 20 mL için süzgeç yıkama arabelleği 5 mL ile yıkayın. Bağlayıcı bir steril 50 mL konik tüp takmak ve radarı kilit kapatın.
  23. Süzgeç konektöre takın. Yıkama arabellek süzgeç duvar boyunca 1 mL ekleyin. Süzgeç duvar boyunca aktif arabellek D 1 mL ekleyin. Örnek hafifçe girdap ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  24. Yıkama arabellek 1 mL ekleyin. Yukarı ve aşağı 10 x pipetting tarafından boncuk ayrı hücreler.
    Not: hava kabarcıkları oluşturulmasını engellemek.
  25. Radarı-kilidi açmak ve 50 mL konik tüp içine akmaya müstakil hücreleri izin vermek. Süzgeç 10 yıkama yıkama arabelleği her zaman 1 mL x.
  26. Bağlayıcı ve süzgeç atmak ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi Hücre Pelet komple EGM-2 Medya kültürü için 2 ml resuspend.
    Not: Hücreler bu noktada at gram başına ortalama sayısıdır: (a) OM depo: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC depo: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. Her iki depoları hücrelerden canlılığı üzerinde % 90 oldu.

4. indüksiyon Adipogenesis izole endotel hücrelerinde

  1. 6-iyi doku kültürü tedavi plakaları hücrelerde bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka komple EGM-2 medya ile büyümek. Ortamı her 3-4 hücreleri % 80 – 90 izdiham ulaşana kadar gün değiştirin.
    Not: 2-3 gün arasında nüfus katlama olduğunu.
  2. 100 mm Petri yemekler üzerinde kaplama tarafından hücreleri genişletin ve 1:3 kez hücreleri bölme. Bu aşamada, geçiş 2 hücrelerdir.
  3. (Bkz. Tablo reçetesi) otomatik bir hücre kullanarak hücreleri counter Count.
  4. Tohum yaklaşık 100-200.000 hücrelere 6-şey plakaları her depo ve onları buna 2 gündür EGM-2 medya tamamlandı kültür için yinelenen wells sağlanması.
  5. Aspire herhangi bir büyüme medya ve DMEM/F12 2 mL % 5 ile onun yerine FBS ve 50 µg/mL penisilin/streptomisin denetim için hücreleri ve 2 mL (bkz. Adım 1.4) Adipogenesis medya için tedavi hücreleri ile değiştirin.
  6. Hücreleri oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya ilgili medya her 3-4 gün yerine CO2 kuluçka 13 gündür.
    Not: Hücreleri tedavi 4 gün sonra lipidler toplamaya başlayacaktır.
  7. ORO ve Nil yayınlanan yöntemleri15-17göre boyama kırmızı yürütmek.
  8. Bir RNA çıkarılması için hücreleri izole etmek için 6-iyi indüksiyon plakalar medyayı çıkarın ve 1 mL steril PBS ile yıkayın.
  9. Guanidium thiocyanate-fenol-kloroform çözüm 350 µL ekleyin (her şey ve oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya Malzemeler tablobkz:).
  10. Hücreleri kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka kapalı kazımak ve hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
    Not: Örnekleri RNA çıkarma ve daha sonraki bir tarihte işlenmesi için-80 ° C dondurucuda saklanabilir.
  11. MRNA adapte bir RNA ayıklama kullanarak örnekleri ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.
  12. Bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gen ifade aşağıdaki problar kullanarak değerlendirmek için gerçekleştirmek: adiponektin, UCP-1 ve CIDEA (bkz: Malzemeler tablo).
    Not: Burada, RT-PCR yordamlar aşağıdaki standart protokolü kullanılarak yapılmıştır: denatürasyon (95 ° C; 15 s), tavlama ve uzantısı (60 ° C; 1 dk) 40 döngüleri için. CT değerleri ile gen ifade örnekleri > 35 belirlenemeyen kabul.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bizim iletişim kuralı CD34 + CD31 + insan yağ dokusunun farklı depoları damar hücreleri Adipojenik potansiyelini belirlemek için bir vitro yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Basitleştirilmiş akış diyagramı Şekil 1Aile gösterilir. CD34 hücreleri ifade olumlu bir seçim kullanarak ilk adım > %95 CD34 + hücre nüfus taze izole hücre (Şekil 1A) sonuçlanır. Önemlisi, bu işareti hücreleri birkaç pasajlar için kültürlü sonra kaybolur. CD34 çeşitli hematopoetik ve hematopoetik sigara ataları için ortak bir işaret olduğu için endotel ataları ayrılması için gereken aşağıdaki adım CD31 + hücreleri (Şekil 1A) CD34 + hücre nüfus olumlu seçimidir. CD31 kalem endotel hücreleri için olsa da, ayrıca hematopoetik hücrelerin alt kümeleri üzerinde bulunabilir. Akış Sitometresi tarafından birkaç hazırlıklar omental ve subkutan yağ analiz ve tutarlı bir şekilde CD34 + CD31 + hücreleri CD45 marker (1B rakam, üst panelleri) ifade yok bulundu. Genellikle, < hücrelerin % 1 Toplam hücresini nüfus dışında CD45 pozitifliği gösterdi. Bu sonuç büyük olasılıkla bir hazırlık hematopoetik ataları neredeyse ücretsiz elde ipuçlarına göre yol açtı. Hücreleri adipocyte kök hücre işaretçisi CD24 hızlı Eğer belirlemek için omental ve subkutan depoları hücrelerden analiz ve hemen hemen hiçbir hücre omental depo (1B biçim, alt paneller) ve % 5'den az CD24 işaretleyicisinde ifade bulundu hücreleri (gösterilmez) Subkutanöz depo işaretleyicisinde dile getirdi. Sonuç olarak, bu ayrılık metodoloji kullanarak biz CD34 + CD31 + CD45 CD24 hücreleri obez konular omental ve subkutan depoları elde.

Plastik Boncuk kullanarak Birleşik CD31 antikor ile Arnavut kaldırımı endotel morfoloji görüntülenen bir CD31 antikor ile Birleşik manyetik boncuklar kullanılarak ayrılmış hücreleri aksine erken geçişleri sırasında gösterilen hücreleri elde edilen bir seklinde mezenkimal fenotip hemen sonra ayrılık (Şekil 2A). Daha fazla CD34 + CD31 + hücreler endotel kimliğini kanıtlamak için biz iki fonksiyonel deneyleri gerçekleştirilen: bir alımını dıı-Ac-LDL ve bir membran matris (matris bu andan anılacaktır) oluşumu içinde vitrotüp. CD34 + CD31 + hücreleri dıı-Ac-LDL ile inkübe ve hücreler büyük çoğunluğu (Şekil 1 c) alımı için olumlu idi. Pozitif kontrol, biz piyasada bulunan bir insan yağ dokusu mikrovasküler endotel birincil hücre satır (HAMVEC) kullanılır (bkz: Malzemeler tablo ve Şekil 1 c). CD34 + CD31 + hücreler endotel işlevlerine 3D Matrix'te kendiliğinden gemi benzeri yapıları vitro, oluşturmak için yetenek böyle hücre belirlenerek kültür sonra korumak olup olmadığını da test ettik. 3 geçişler sonra CD31 + CD34 + formlar gemi benzeri yapılar bir matris bir HAMVEC birincil insan endotel hücre satırı (Şekil 1 d) ile karşılaştırılabilir.

2-3 pasajlar için hücreleri genişletme sonra biz EGM-2 tam medya %5 FBS, rosiglitazone (1µM) ve insülin (144 mU/mL) ile desteklenmiş DMEM/F12 medya içine pro-anjiogenik büyüme faktörleri içeren hücrelerden açık. EGM-2 hücreleri medya önemli ölçüde tamamlandı korumak onların Adipojenik farklılaşma azaltılmış. Ayrıca, deksametazon ve 3-isobuthyl-1-methylxanthine medya için bir ek oranı değişmedi ve lipid birikimi kapsamını ve indometazin ekleme azaltılacağını lipid birikimi (veri gösterilmez). Bu ön deneyler üzerinde bağlı olarak, biz Adipojenik indüksiyon için rosiglitazone ve insülin sadece kullanmaya karar verdi. 14 gün sonra Adipojenik medya kültürünün, hücreleri sabit ve yağ kırmızı O ile lekeli veya Nil kırmızı ve çekirdekleri DAPI (Şekil 2B) ile counterstained. Rakamlar, temsili resim eşleştirilmiş subkutan (SC) (2B şekil, üst panelleri) ve 37-45 kg/m2arasında bir BMI ile üç insan deneklerin omental (OM) (2B şekil, alt paneller) Yağ dokusundan izole hücre gösterilir. Lütfen indüksiyon yanıtı konuları arasında aynı konuda depoları arasında yaygın olarak değiştiğini unutmayın. 2B şekil, üniloküler (kırmızı oklar) ve multilocular (beyaz ok) karışık bir nüfusa floresan görüntüde görülen olarak lipid içeren hücrelerin yanı sıra lipidler (sarı ok) birikir değil hücreleri genellikle mevcut. Bu hücreler sayı arasındaki oranı da çok konu ve menşe depo ile değişkendir. Bir miktar lipid içeren yüzdesi (yağ kırmızı O pozitifliği üzerinde dayalı) hücreleri (çekirdeklerin DAPI lekeli dayalı) Toplam hücrelere gösterdi aynı SC ve OM depoları arasında anlamlı bir fark bireysel, SC depo hücrelerden Adipojenik İndüksiyon (Şekil 2C) daha duyarlı olmak. Heterojenite yanıt konular ve aynı konuda depoları arasında açıklanabilecek açık değildir. Ancak, biz büyük olasılıkla yalıtım protokolünde vivo içinde fenotip/çevre ve değişkenlik nedeniyle değil parmak izi taşıyan hücre nüfus içsel doğası ilişkili, spekülasyon.

Pan-adipocyte işaretçisi adiponektin ve kahverengi/bej işaretleri UCP-1 ve CIDEA hücrelerde gen ifadesi Adipojenik indüksiyon göre 13 gün sonra şiddetindeydi hücreleri adiposit olgun farklılaşma uygulandı onaylamak için un indüklenen kontrol hücreleri. Adiponektin ifade ilâ 10,000-fold (Şekil 2B) kontrollere göre farklılaştırılmış hücrelerin artış. CIDEA ve UCP1 gen ifadesi yalnızca Adipojenik stimülasyon (2D rakam) takip hücrelerde algılanabilir. Özellikle, UCP-1 ifade son derece değişken, beyaz: kahverengi farklı oranlarda yansıtan / bej hücreleri hücre nüfus içinde. Oda temizliği gene RPL27 ifade örnekleri ile 18-20 döngüleri arasında değişen CT değerleri arasında son derece tutarlı ve hiçbir önemli farklılıklar Adipojenik farklılaşma uygulandı hücreler arasında bulundu ve tedavi edilmemiş kontrol eder. Ayrıca çok locular fenotip, mitokondrial yerelleştirme (Şekil 2E) öneriyor punctated bir desende görüntülenir hücrelerdeki UCP-1 protein ifade algıladı. UCP-1 protein algılanabilir değildi lipidler birikir değil hücre veya hücreleri birden çok, adipositler (Şekil 2E) tam olarak büyük olasılıkla yer almayan çok küçük damlacıklar Ayrıştırılan.

Bizim gözlem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik potansiyelini depo özeldir ve son derece değişken farklı konular arasında bize BMI, yaş ve HbA1c ile olası korelasyonlar için aramaya istenir. Test 28 örnekleri arasında biz did değil bulmak Adipojenik potansiyel ve yaş ve BMI arasında önemli herhangi bir korelasyon; Ancak, HbA1c ve lipid birikimi arasında önemli bir negatif ilişki OM depo (Şekil 3A) hücrelerden içinde bulduk. Bu bulgu kronik hiperglisemik çevre ile potansiyel bir bağlantı gösterir ve gelecekteki soruşturma hak ediyor. Bu da CD34 + CD31 + hücreler büyük olasılıkla bir Adipojenik indüksiyon tepki yeteneğini kendi içinde vivo imzası taşıdığını göstermektedir. Biz de bu hücreler Akt fosforilasyon vitro insülin stimülasyon takip çeşitli düzeyleri görüntülemek gösterir (Şekil 3B, üst). Ancak, yanıt bu değişkenlik de yeteneklerini petrol kırmızı O (Şekil 3B, alt) eşleşen örnekleri resimleri boyama tarafından gösterildiği gibi bir Adipojenik farklılaşma geçmesi ile ilişkili değil.

Figure 1
Şekil 1: ayrılık ve CD34 + CD31 + insan yağ dokusu hücreleri karakterizasyonu. (A) Bu akış diyagramı gösterir tecrit ve farklılaşma önemli adımlar. CD34 manyetik boncuklar, kullanarak pozitif seçimden sonra > ikinci seçim adım önce taze izole hücrelerinin % 95 olan CD34 +. (B) Bu temsilcisi akış sitometresi bir ileri gösterir dağınık Arsa geçişli canlı hücre nüfus için; bir günahı örnek FITC (BluFl2) Kanal; ve üstte temsilcisi omental örneği CD45 boyama. Alt üst, ama CD24 (Alexafluor 647-etiketli) hücrelerden, omental örnek gösterildiği gibi aynı sırada gösterilir. (C) bunlar temsilcisi filmler göstermek bir alımını dıı-Ac-LDL (kırmızı) CD34 + CD31 + 4 h, vitro kuluçka (üst panel) takip hücreleri tarafından. Benzer bir alımını bir insan yağ dokusu mikrovasküler endotel hücre birincil hücre çizgi (HAMVEC) (alt paneli) bulundu. Çekirdeklerin DAPI tarafından mavi gösterilir. (D) temsilcisi bu filmler bir vitro tüp oluşumu CD34 + CD31 + 3D matris içinde seribaşı hücreleri gösterir. CD34 + CD31 + hücreleri (Bölüm 3) 24-şey tabak boyama FITC-calcein ile takip, tohumlari ve tam endotel hücre medya 4 h için inkübe. Hücreleri ters bir floresan mikroskop kullanarak görüntüsü. Aynı yoğunluk tohumlari HAMVEC, karşılaştırma için kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Adipojenik indüksiyon ve işaretleri CD34 + CD31 + hücre. (A) Bu temsilcisi filmler Haritayı CD31 + manyetik vs CD31 + plastik boncuk ile olumlu bir seçim kullanarak CD34 + CD31 + hücreleri morfolojik farklılıkları izole. Hücreleri geçiş 1 sonra yalıtım görüntüsü. Kullanılan büyütme 100 X var. (B) bu paneller petrol kırmızı lekeli CD34 + CD31 + hücreleri eşleştirilmiş subkutan (SC) ve 3 farklı konularda omental visseral (OM) örnekleri o temsilcisi filmler vardır. Hücreleri için 2-3 pasajlar EGM-2 tam medya kültürlü olsaydı, o zaman DMEM/F12 medya % 5 ile açık FBS ve insülin (144 mU/mL) ve rosiglitazone (1 µM) ile 14 gün, 3 günde değişti medya ile tedavi. Kullanılan büyütme 100 X var. Temsilcisi floresan görüntü adipo kırmızı lipid damlacıkları (yeşil) ve DAPI nükleer (mavi) boyama gösterir. Üniloküler lipidler (kırmızı ok), multilocular lipid damlacıkları (beyaz ok) ve hiçbir lipid birikimi (sarı ok) gösteren hücreleri içeren hücre karışımı unutmayın. Kullanılan büyütme 200 X, ölçek çubuğu olduğunu 50 µm Bu panel gösterir Adipojenik bir miktar potansiyel olarak petrol kırmızı O (pozitif hücrelerinin toplam DAPI lekeli çekirdekler için normalleştirilmiş ORO) dile getirdi. (C) =. CD34 + CD31 + OM ve SC depoları aynı konuda hücrelerden göstermek Adipojenik önemli bir fark potansiyel bir öğrenci t-testi ile (n = 7). (D) olgun adipocyte gen ekspresyonu işaretleri (adiponektin, UCP-1 ve CIDEA) RT-PCR Adipojenik indüksiyon 14 gün sonra hücreleri ve kontrol hücreleri tarafından ölçülen. Verileri adiponektin gen ekspresyonu için kat-değişiklik olarak ifade edilir. CIDEA ve UCP-1 ifadesi kontrol örnekleri tespit değildi. Değerleri RPL27 olarak temizlik gen için normalleştirilmiş ΔCt temsil eder. RLP27 CT değerlerini Analize dahil tüm örneklerini devredir 18 – 20 arasında olduğunu (n = 3 – 5 konular). Verileri ± SD demek olarak ifade edilir Bir öğrenci t-test verileri bir istatistiksel analiz için kullanıldı. p < 0,05 boş varsayımı reddeder. (E) Bu panel CD34 + CD31 içinde protein ifade UCP-1 gösterir + indüksiyon insülin ve rosiglitazone ile 13 gün sonra hücreleri. Bir insan poliklonal UCP-1 antikor kullanarak Immunocytochemistry UCP-1 seçici bir ifade içinde çok locular adiposit gösterdi. Algılama bir ikincil antikor (kırmızı) rodamine Birleşik ve DAPI çekirdeği (mavi) için boyama kullanarak sağlanır. İlave büyük büyütme UCP-1'e (kırmızı ok) birden fazla lipid damlacıkları farklı boyutlarda çevreleyen hücre çekirdeği (N) yanı sıra (LD) karşılık gelen punctated kırmızı sinyal gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Adipojenik farklılaşma, HbA1c ve vitro insülin sinyal arasında korelasyon. (A)Spearman (parametrik olmayan) ve OM ve SC hücreler için Pearson (parametrik) korelasyon katsayıları sırasıyla, kullanılan HbA1c ve lipid birikimi arasındaki ilişkiyi belirlemek için (n = 20). Boş varsayımı p için reddedildi < 0,05. (B) üst kısmında bir western Blot fosforile Akt (yeşil) gösterir ve CD34 + CD31 + hücreleri toplam Akt (kırmızı) ifadesinde vitro Adipojenik indüksiyon öncesinde 30 dk için 5 nM insülin ile uyarılmış (n = 8). Alt kısmında bir yağ kırmızı O aynı hücrelerinin Adipojenik indüksiyon 14 gün boyunca takip boyama gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + visseral ve subkutan depoları insan yağ dokusunun endotel hücrelerden bir metodoloji sağlamak için bu kağıt odak noktasıdır.

Metodolojisi kemirgenler veya öncelikle teknikleri fluorescently etiketli veya manyetik boncuklar-18, birleştiğinde CD31 antikorları kullanarak dahil insanlar çeşitli vasküler yatak endotel hücrelerinin yalıtım için bildirilmiştir 19 , 20 , 21 , 22 , 23. heterojenite farklı yataklarda vasküler endotel hücre nüfusun ve fibroblast ve vasküler duvar hücreleri ile kirlenme riski yüksek bu izolasyon teknikleri evrensel kullanımı için büyük bir sorun olduğunu. Ancak, böyle contaminations önlemek için yalıtım teknikleri ayrıntılandırmaları bildirilen24olmuştur. Bu tekniklerin kullanımı, çoğunlukla olgun endotel hücreleri dokulardan izole edilmiştir. Yağ dokusu kök/progenitor hücreler endotel ataları25,26da dahil olmak üzere, büyük bir depo var. Birkaç kağıt CD34 + ve CD31 + antikor11,27' in birleşimiyle insan Yağ dokusundan endotel hücreleri arıtma bildirdi. İki işaretleri hızlı olgun endotel hücreleri ve endotel ataları11,28,29karışık bir nüfusa hücrelerdir. Birkaç son seminal kağıtları endotel (CD31 +) ya da duvar (PDGFRβ +) hücrelerinde yağ damarlara küçük bir alt kümesini adipocyte ataları5,30zengin bir kaynak olduğunu bildirin. Adipojenik potansiyel ile vasküler bu hücreler hem beyaz veya kahverengi/bej adiposit üretebilir ve etkin angiogenez adipose damarlara5ile ilişkili. Bu bulgular obezite metabolik performansını artırmak için ve/veya vasküler ataları beyaz ve/veya termojenik adiposit oluşturarak kilo kaybı teşvik için yeni tedavi edici fırsatlar sağlayabilir. Bu nedenle, kolay ve ekonomik yalıtım, genişleme ve vasküler endotel hücreleri insan Yağ dokusundan Adipojenik potansiyelinin değerlendirilmesi için bir metodoloji tanımlamak için ilgi olduğunu.

CD34 + CD31 + insan subkutan ve omental visseral yağ dokusu depoları hücrelerden daha önce anjiogenik potansiyellerini, inflamatuar aracılar üretimi, onların yaşlanma işaretleri ve diğer işlevleri11 dayalı karakterize , 31. ancak, böyle hücrelerinin Adipojenik potansiyel için yayımlanmış hiçbir kanıt yoktur. Ayrılmış CD34 + CD31 + manyetik boncuklar kullanarak hücreleri önceki yayınları çok sayıda konular (10 veya daha fazla)11havuza alınan hücrelerden veri raporu. Bu kağıt için bir protokolü başarılı yalıtım ve genişleme CD34 + CD31 + deri altı ve omental depoları tek insan bağış hücrelerden ilk kez bildirir. Biz izole ve hücreleri gibi 2-3 g yağ dokusunun küçük genişlettik. CD34 + CD31 + hücreleri 3-%5 Toplam SVF hücre temsil ve görüntülenen > % 90 canlılığı yalıtım sonra. Bu hücreler son derece proliferatif ve çok çeşitli bir vitro stimülasyon rosiglitazone ve insülin ile takip Adipojenik farklılaşma doğru yanıt gösterdi. Önceki çalışmalarda sadece yağ kök hücreleri veya toplam stromal vasküler kesir insan Yağ dokusundan Adipojenik yanıt-e doğru4,32,33,34sınamak için kullanılır. Bir son çalışmada insan yağ dokusunun microvasculature üzerinden tek hücre süspansiyonlar kullanılmış ama farklılaştırılmış adiposit duvar veya doğa3endotel olup belirsizdir.

CD34 + CD31 + hücreleri akış sitometresi kullanarak ek immunophenotyping CD45 ve CD24 işaretleri kendi depo menşei ne olursa olsun onların eksikliği gösterdi. Önemlisi, biz gösterdi ki kültür, 3 pasajlar sonra CD31 + CD34 + hücre acetylated LDL birikmesi ve 3D matris bir vitro tüp oluşumu gösterdiği onların endotel işlevselliğini korur. Ayrıca, farklılaştırılmış adiposit nüfus dayalı onların morfolojisi ve moleküler işaretleyiciler UCP-1 protein ifadesi de dahil olmak üzere, beyaz ve bej/kahverengi hücrelerinin temsil. Önceki çalışmalarda farelerde yağ dokusu damarlara hem beyaz bir kaynağı olabilir ve kahverengi adiposit5,30 ve daha yeni veriler beyaz ve işlevsel farklılaşma ile ilgili olarak benzer bir sonuç gösterdi gösterdi termojenik bej hücreleri insan yağ damarlara3.

Adipocyte farklılaşma ataları vitrobir dizi için birden fazla maddeler içeren Adipojenik kokteyller kullanılan çoğu yayınları, biz rosiglitazone ve insülin gerekli ve yeterli Adipojenik için bulundu İndüksiyon CD34 + CD31 + hücreler. Biz o rosiglitazone yalnız bir lipid birikimi olmayan yağ hücreleri35, pan-adipocyte ve kahverengi/bej adipocyte işaretleri için moleküler imza tetikleyebilir farkında olmakla birlikte, UCP-1 protein de dahil olmak üzere ifade select hücrelerdeki onaylar Olgun Adipocyte fenotip bazı farklılaştırılmış hücrelerin. Bizim iki madde Adipojenik kokteyl yordam Protokolü basitleştirir ve daha düşük maliyetli hale getirir.

Önemli bir gözlem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik yanıt verici konu ve yağ deposu ile son derece değişken idi. Yanıt yağ kök hücreleri veya stromal vasküler ataları olmuştur Adipojenik depo özgü farklılıkları daha önce32,34rapor ise böyle bir tepki konu değişkenliği roman bir gözlem. Dışarı 20 insan örnekleri analiz, 3 SC ve 7 OM hücrelerinin Adipojenik indüksiyon için cevap vermedi. En sağlam yanıt gösterdi > ilginç OM 4 örnekleri için indüksiyon için SC den ve 2 örnekleri için duyarlı hücrelerin % 90, Biz bulundu yanıt olumsuz HbA1c ile ilişkilidir ve yanıt olarak bir ile ilişkili değil in vitro farklılaşmamış hücreleri insülin uyarım. Tartışıyoruz yanıt farklılığı nedeniyle tekniği tekrarlanabilirlik zavallı değil ama oldukça bireysel parmak izi vivo yanıtları taklit hücrelerinin yansıtır. Bu fark yanıt korunması, daha fazla doğrulama gerektirir ve temsil nispeten kolay tarama yöntemi tedaviler için duyarlılık için hedef alan adipogenesis vivo içindeteşvik etmek. Daha fazla potansiyel Adipojenik bireysel değişkenlik kaynağını anlamak için ek immunophenotyping belirli adipocyte atası işlevi ayı hücre altgrupları CD34 + CD31 + nüfus içinde tanımlamak gereklidir.

Bu iletişim kuralı sınırlamaları bazıları hücre popülasyonlarının eksik bir karakterizasyonu şunlardır; nispeten uzun genişleme ve farklılaşma kez (2 hafta + 2 hafta); insan örnekleri ve taze toplanan dokuların hemen işleme için gereken erişim sınırlamaları potansiyel; ve farklılaştırılmış hücrelerin fonksiyonel verisi geçerli olmadığı. Bu metodolojinin bir tekrarlanabilir ve değil emek yoğun iletişim kuralı içeren bir çok avantajı vardır; hücreler bu büyük olasılıkla onların içinde vivo fenotip parmak izi korumak; çok az miktarda nispeten düşük maliyetlerle dokuların hücreleri genişlemesi; hücreleri cryopreserve ve yeniden kültür takip onların Adipojenik imza muhafaza imkanı; ve gelecekteki tarama veya başka amaçlar için kullanılabilir böylece depoları bu hücreler oluşturma seçeneği.

Bu iletişim kuralı ve CD34 + CD31 + bir sonuç elde edilen hücreleri translasyonel bir platform olarak Mekanik araştırmalar ve amaçlar süzmek için kullanabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Becky Marquez, klinik Koordinatörü Sentara Bariatric Merkezi, eleme ve açıklanması kabul etmiş hasta süreci ile yardımını kabul etmek istiyorum. Bu araştırma için Anca ö Dobrian R15HL114062 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, (5901), 583-586 (2008).
  2. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18, (3), 355-367 (2013).
  3. Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22, (3), 312-318 (2016).
  4. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15, (2), 230-239 (2012).
  5. Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15, (2), 222-229 (2012).
  6. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135, (2), 240-249 (2008).
  7. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20, (10), 1793-1804 (2011).
  8. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61, (7), 1691-1699 (2012).
  9. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, (4), 480-491 (2012).
  10. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (20), 5552-5557 (2016).
  11. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59, (11), 2755-2763 (2010).
  12. Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110, (3), 349-355 (2004).
  13. Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205, (1), 114-122 (2005).
  14. Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325, (13), 938-948 (1991).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, (5411), 143-147 (1999).
  16. Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87, (1), 180-196 (1980).
  17. Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8, (41), (2015).
  18. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60, (3), 673-684 (1974).
  19. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299, (3), H837-H846 (2010).
  20. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99, (8), 861-869 (2006).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29, (11), 823-830 (1993).
  22. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46, (1), 89-102 (1993).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29, (4), 325-331 (1993).
  24. Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
  25. Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1, (3), 101-109 (2015).
  26. Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10, (2), e0117644 (2015).
  27. Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53, (5), 1285-1292 (2004).
  28. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32, (6), 1380-1389 (2014).
  29. Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102, (1), 77-85 (2008).
  30. Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11, (15), 2765-2766 (2012).
  31. Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262, (4), 415-421 (2007).
  32. Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2, (2), 171-179 (2014).
  33. Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, (6), 1083-1086 (2013).
  34. Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288, (1), E267-E277 (2005).
  35. van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223, (2), 119-132 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics