Bioprintable Alginate/ג'לטין הידרוג 3D במבחנה דגם מערכות זירוז היווצרות ספרואיד תא

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פיתחנו מודל סרטן השד הטרוגנית המורכבת מונצחים הגידול פיברובלסט ותאי נעוץ bioink alginate/ג'לטין bioprintable. המודל recapitulates microenvironment הגידול ויוו ואסטמה ומקילה על היווצרות הגידול multicellular spheroids, מניבים תובנות מנגנוני נהיגה tumorigenesis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הטרוגניות הסלולר הביוכימי, ביופיזיקלי של microenvironment הגידול הטבעית לא recapitulated על ידי גדל שורות תאים של סרטן מונצחים, באמצעות תרבית תאים (2D) דו מימדי קונבנציונלי. האתגרים הללו ניתן להתגבר על ידי שימוש בטכניקות bioprinting לבנות מודלים הטרוגנית הגידול תלת מימדי (3D) לפיה מוטבעים סוגים שונים של תאים. קילוף פלסטיצידיות ואת הג'לטין הם שני biomaterials הנפוץ ביותר המועסקים bioprinting שלהם הביו, ביומימטיקה וכתוצאה תכונות מכניות. על ידי שילוב של שני פולימרים, השגנו הידרוג ללא הפרדות צבע של bioprintable עם דמיון לאדריכלות מיקרוסקופיים של משתית הגידול הטבעית. למד את שמשטחו של הידרוג ללא הפרדות צבע באמצעות rheology ואנו שהושג חלון ההדפסה האופטימלי. תאים סרטניים בשד ו fibroblasts היו שמוטבע על hydrogels, מודפס כדי ליצור דגם תלת-ממד מחקה את microenvironment ויוו . המודל הטרוגניות bioprinted משיגה את הכדאיות גבוהה לתרבות תא לטווח ארוך (> 30 ימים) ומקדם הרכבה עצמית של תאים סרטניים בשד לתוך הגידול multicellular spheroids (MCTS). הבחנו את ההעברה ואת האינטראקציה של תאי פיברובלסט הקשורים לסרטן (CAFs) עם MCTS במודל זה. על ידי שימוש bioprinted תא תרבות פלטפורמות כמערכות תרבות משותפת, הוא מציע כלי ייחודי כדי ללמוד את התלות של tumorigenesis הרכב משתית. טכניקה זו כולל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה, וגבוה הפארמצבטית, זה יכול גם לספק מודל אלטרנטיבי לתרבויות טפט תא קונבנציונאלי ומודלים גידול בעלי חיים כדי ללמוד ביולוגיה סרטן.

Introduction

למרות תרבית תאים 2D נעשה שימוש נרחב לחקר הסרטן, מגבלות קיימות כמו התאים גדלים בתבנית חד שכבתי עם ריכוז אחיד של חומרים מזינים וחמצן. תרבויות אלה חוסר תא חשוב-תא, התא-מטריקס אינטראקציות להציג הגידול מקורי microenvironment (טיים). כתוצאה מכך, מודלים אלה לקוי מסכם את הדברים בתנאים פיזיולוגיים, וכתוצאה מכך התנהגויות תא סוטה, לרבות מורפולוגיות לא טבעי, הארגון קולטן לא סדיר, ממברנה קיטוב ביטוי גנים לא נורמלי, בין היתר תנאים1,2,3,4. מצד שני, תרבית תאים תלת-ממד, שבו תאים מורחבים בחלל הנפחי אגרגטים, spheroids או organoids, מציעה טכניקה חלופית ליצירת מדויקת יותר במבחנה סביבות ללמוד יסוד התא ופיזיולוגיה. מודלים תרבות תלת התא יכול גם לעודד אינטראקציות סלולרי-ECM כי הם קריטיים הפיזיולוגיות של יליד טיים במבחנה1,4,5. הטכנולוגיה 3D bioprinting המתעוררים מספק אפשרויות לבנות מודלים המחקים את טיים הטרוגנית.

Bioprinting תלת-ממד נגזרת שטנץ מהירה ומאפשרת הזיוף של תלת-ממד מזערים המסוגלים לחקות חלק המורכבות של החיים דגימות רקמה6,7. השיטות bioprinting הנוכחי כוללים דיו, שחול הדפסת לייזר בסיוע8. ביניהם, מאפשרת השיטה ההבלטה של הטרוגניות להיות בשליטת בתוך מטריצות מודפס דווקא מיקום סוגים שונים של חומרים במקומות שונים ראשונית. לכן הגישה הטובה ביותר ליצור הטרוגניות במבחנה מודלים המערבים מספר סוגים של תאים או מטריצות. שחול bioprinting שימש בהצלחה כדי לבנות פיגומים בצורת אוריקולארית9,11,10,מבנים כלי דם12, ועור רקמות13, וכתוצאה מכך באיכות הדפסה גבוהה תא הכדאיות. הטכנולוגיה כולל גם בחירות חומרים מגוונים, היכולת להפקיד חומרים עם תאים מוטבע עם צפיפות ידוע וחדר הפארמצבטית גבוהה14,15,16,17 . Hydrogels טבעיים וסינתטיים משמשים לעתים קרובות כמו bioinks 3D bioprinting עקב הביו שלהם, אתריים ורשתות הידרופילית שלהם זה ניתן לתכנן להידמות מבנית ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels גם הם יתרון כיוון שהם יכולים לכלול אתרים דבק עבור תאים, אלמנטים מבניים, חדירות של חומרים מזינים וגזים, התכונות המכאניות המתאים כדי לעודד תא פיתוח24. למשל, קולגן hydrogels מציעים אינטגרין אתרי anchorage תאים יכולים להשתמש בו כדי לצרף המטריקס. ג'לטין, שפגע בסימני קולגן, שומר על אתרים דומים של הידבקות תאים. לעומת זאת, alginate bioinert אך מספק תקינות מכנית על ידי יצירת crosslinks עם יונים כלט25,26,27,28.

בעבודה זאת, פיתחנו של הידרוג ללא הפרדות צבע כמו bioink, המורכב alginate, ג'לטין, עם קווי דמיון לאדריכלות מיקרוסקופיים של משתית הגידול הטבעית. תאים סרטניים בשד fibroblasts הוטבעו ב hydrogels, מודפס באמצעות bioprinter מבוססות ההבלטה ליצירת דגם תלת-ממד המחקה את microenvironment ויוו . בסביבת 3D מהונדסים מאפשר לתאים סרטניים בצורת הגידול multicellular spheroids (MCTS) עם הכדאיות גבוהה לתקופות ארוכות תרבית תאים (> 30 ימים). פרוטוקול זה מדגים את מתודולוגיות של סינתזה hydrogels ללא הפרדות צבע, אפיון של החומרים מיקרו ו שמשטחו, bioprinting דגמי הסלולר הטרוגנית, התבוננות היווצרות MCTS. מתודולוגיות אלה ניתן להחיל על אחרים bioinks ב שחול bioprinting כמו גם באשר עיצובים שונים של רקמות הטרוגנית מודלים עם יישומים פוטנציאליים והתרופות הקרנה תא העברת מבחני, מחקרים התמקד תא בסיסי פונקציות פיזיולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת החומרים, הידרוג וחומרים תא תרבות

  1. הכנת חומר והפתרון
    1. שטוף ויבש 250 מ ל ו 100 מ ל זכוכית בקבוקונים, מטלטלות, שפכטלים, מחסניות 10 מ ל, 25 גרם חרירי גלילי (באורך של 0.5 ב), של הקוטר הפנימי של 250 מיקרומטר. לחטא את החומרים על-ידי autoclaving אותם-121 מעלות צלזיוס/15 דקות/1 הטיולים המאורגנים לשמור את החומרים בתנאים סטריליים עד השימוש.
      הערה: עיין טבלה של חומרים למידע הספק.
    2. שוקלים דור 3 של קילוף פלסטיצידיות (3% w/v) ו- 7 גר' ג'לטין (7% w/v) (מסומן בתור A3G7 להלן).
    3. לעקר את הפריטים הבאים תחת אולטרא סגול לפחות 4 ח': קילוף פלסטיצידיות ואת הג'לטין אבקות, הסרט פרפין, אלומיניום לסכל חתיכות של 5 ס מ2ו 1 מ"ל וכן מזרקים מ. לחטא את הקצה אותיות גדולות, כמוסות עצה ו בוכנות במועט אותם 70% אתנול במשך לפחות 4 שעות ולשטוף אותם 2 x עם מים אולטרא טהורים מעוקר.
      הערה: עיין טבלה של חומרים למידע הספק.
    4. להמיס 4 g של agarose עם מים אולטרא טהורים ולחטא אותו על-ידי autoclaving.
      הערה: agarose התפרקה לחלוטין לאחר תהליך autoclaving.
    5. להכין פתרון 100 מ מ של נטול מים סידן כלורי (2CaCl) סטיריליים מים אולטרא טהורים, מסנן סטרילי (עם גודל הנקבוביות של 0.22 מיקרומטר) לפני השימוש.
    6. עבור agarose מצופה לוחות 6-ובכן, להמיס את agarose סטרילי במיקרוגל כדי להשיג פתרון נוזלי; לאחר מכן, תחת micropipette של 1 מ"ל הקבינט אבטחה (BSC) ושימוש, להוסיף 2 מ"ל לכל טוב, לערבב בעדינות כדי ליצור שכבה אחידה בתחתית הבאר. . תניחו לזה להתקרר. ואטמו את הבאר עם סרט פרפין. שיהיה בטמפרטורת החדר (RT) עד השימוש.
  2. הכנת למבשר הידרוג A3G7
    1. מערבבים דור 3 של קילוף פלסטיצידיות, 7 גר' ג'לטין אבקות לתוך גביע 250 מ ל במסגרת תואר ראשון. להוסיף פגים ו 100 מ של DPBS. חותם את הספל בנייר פרפין סטרילי הסרט ואלומיניום (5 ס מ2) כדי למנוע זיהום.
    2. להמיס את אבקות תחת עצבנות מתמדת לתוך צלחת מגנטית חמים עם 600 סל ד ב- 60 ° C עבור 1 h וב -RT, בתוספת 2 h.
    3. מחממים את החומר ב 37 ° C עד הג'ל עובר שלב מעבר למצב נוזלי (עבור 100 מ ל ג'ל מניות פתרון, זה לוקח כ- 45 דקות). להעביר את הפתרון לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט סטרילי 50 מ ל, לסמנם ולאחר centrifuge הצינורות-834 g x עבור 5 דקות כדי לחסל את כל בועות הגז מן החומר.
    4. האחות למבשר הידרוג לתוך מזרקים 10 מ"ל. החותם המזרקים עם כמוסות וקולנוע פרפין. לאחסן אותם ב 4 ° C עד השימוש.
  3. תרבית תאים
    הערה: השלבים בסעיף זה חייב להתבצע בתנאים סטריליים.
    1. להתכונן המדיום הבזליים DMEM כדלקמן (1 ליטר): ב- BSC, לערבב 100 מ של סרום שור עוברית (FBS) פלוס 10 מ"ל של פתרון אנטיביוטיקה/antimycotic (100 x פתרון מיוצב) לתוך מיכל סטרילי טריים. להוסיף DMEM בינוני כדי להתאים את התערובת עד 1,000 מ ל. לאטום את המיכל ולשמור אותו ב 4 º C.
    2. בתוך אמבט מים בעבר ומחוממת (37 מעלות צלזיוס), להפשיר מבחנה 1 של מד א-MB-231-GFP (השד אנושי סרטן תאים בטור לוקליזציה GFP שכותרתו, גרעיני) ו 1 בקבוקון IMR-90-mCherry (סרטן הקשורים פיברובלסט שורות תאים mCherry עם התווית, עם לוקליזציה cytoplasmic ) תאים מהמחסן חנקן נוזלי על-ידי הזזת אותם בעדינות לתוך המים. שורות תאים וגם על פלסמידים GFP, mCherry תיוג, זמינים מסחרית.
    3. להעביר µL 160/טוב של התא פתרון (3 x 106 תאים/mL) לתוך צלחת 6-ובכן, הוסף 5 מ של בינוני DMEM הבזליים ומחוממת (37 מעלות צלזיוס). דגירה לצלחת-37 °C/5% CO2 במשך 24-48 שעות עד התאים מגיעים למפגש 80%.
    4. לאחר התאים להגיע למפגש, למחוק את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם DPBS; דגירה התאים עם 500 µL טריפסין-EDTA פתרון/הבאר (0.25%, 1 x, בעבר חימם ב 37 מעלות צלזיוס) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. לאחר מכן, בטל את טריפסין על-ידי הוספת µL 500 של FBS, לשחזר את הפתרון תא, להעביר אותו T-75 המבחנות. דגירה אותם שוב-37 °C/5% CO2 עד התאים מגיעים למפגש 80%.
      הערה: הנפח של פתרון טריפסין-EDTA יכול להשתנות בהתאם כלי הקיבול של צמיחת תאים.
    5. חזור על השלב הקודם כדי לעבוד עם תאים על מעבר 3-4 כפי שהוא כאשר התאים יש יותר פעילות חילוף החומרים ויציבות.
    6. לספור את התאים באמצעות וזמינותו trypan blue (0.4%) כדי לקבוע את הריכוז ההתחלתי של תאים כדי להיות מעורב עם הידרוג.

2. מדידות של מאפייני Rheological של Hydrogels

  1. להכין מבשר הידרוג alginate/ג'לטין כפי שמתואר בשלב 1.2.
    הערה: בתנאים סטריליים אינם נדרשים עבור דגימות שנוצרו עבור בדיקות מכניות וניתוח. כל הבדיקות rheological מבוצעות דולר.
  2. לקחת מזרק של הידרוג מבשר, לחמם את זה בתוך אמבט מים 37 מעלות לשעה.
  3. הפעל את rheometer ולאחר לאתחל את המערכת על-פי השלבים הבאים.
    1. הפעל את מדחס אוויר מחובר את rheometer ולתת מדחס אוויר לרוץ במשך 30 דקות לעבור על תיבת בקרת טמפרטורה עבור rheometer, הפעילי את rheometer עצמה, ולעבור על המחשב מחובר rheometer.
    2. פתח את תוכנת rheometer, לחץ על אתחל בלוח הבקרה, והנח את תהליך אתחול לסיים. הגדר את הטמפרטורה פלטפורמה 37 ° C בלוח הבקרה.
    3. לחץ על הכרטיסיה מערכת מדידה , לנווט הפעלת שירות פונקציה, בחר התאם הנהג אינרציה בתפריט הנפתח ולאחר לחץ התחל התאמת בחלון המוקפץ.
    4. הר מקביל מדידת כלי ב- rheometer. כל הניסויים שבוצעו כאן להשתמש צלחת בקוטר 25 מ מ עם פער 1 מ מ בין הלוחות.
    5. לחץ על הגדר אפס-gap בלוח הבקרה ולחכות שהפרוצדורה לסיים. שים לב כוח נורמלי במהלך תהליך זה.
      הערה: לאחר הליך זה, הכוח נורמלי צריך להיות 0.
    6. לחץ על הכרטיסיה מערכת מדידה , לנווט הפעלת שירות פונקציה, בחר התאם אינרציה העליון מערכת מדידהולאחר לחץ התחל התאמת בחלון המוקפץ. פעם עשיתי, לחץ על לחצן המשולש בחלונית ' בקרה ' כדי לאפשר לכלי המדידה להתקדם.
  4. התנהגות של משרעת לטאטא.
    1. לחץ על התחלולאחר מכן לחץ על הוסף בתפריט הראשי, בחר להמתין מתוך התפריט הנפתח. משוך למעלה חלון ההתקנה ולהגדיר זמן ההמתנה 2 h.
      הערה: פעולה זו תוסיף שלב ההמתנה לפני הבדיקות.
    2. לחץ על התחל, לחץ שוב על הלחצן הוסף , ואז בתפריט הנפתח, בחר בהתקן. משוך למעלה חלון הגדרת, בחרו טמפרטורה, וקבעו שזה יהיה 25 º C. בטל את סימון התיבה של לחכות עד הגיע לערך.
    3. לחץ על הצעד מדידהואז לחץ על המשתנה תנודה זן, משוך למעלה חלון הגדרת, להגדיר פרופיל להיות סרגל הלוגריתם, שנה את הערך ל 0.001% ל-100% כמו הלחץ הראשוני ואת המתח הסופי, בהתאמה. להגדיר את התדירות ב 0.01 הרץ.
    4. לחץ על לחצן ' הוסף ' כדי להוסיף את הטמפרטורה המשתנה. לחץ משתנה טמפרטורת ולהגדיר אותו להיות 25 º C. בחלון מתח, הרחב את ' מחשבון ', לקבוע נקודת צפיפות 10 נקודות/בעשור.
    5. . קח את המזרק מהאמבטיה המים, כ- 0.5 מ ל מבשר על הפלטפורמה rheometer ' הבלטת ממד '.
    6. לחץ כלפי מטה משולש כפתור בלוח הבקרה. המתן בכלי מדידה להעביר המיקום זמירה.
    7. השתמש במרית כדי לקצץ כל סימנים מקדימים עודף. ברח בקצה הכלי מדידה ולמחוק את החומר מיותר.
    8. פיפטה שמן מינרלי אל קצה הכלי מדידה והמתן עד השמן מלא חותמות על הגבול.
    9. לחץ על המשך בלוח הבקרה. ואז לחץ על הלחצן התחל (משולש ירוק), ולאחריה לחיצה על לחצן ' המשך ' על המסך התחתון.
    10. כאשר הבדיקה נעשית, לשחרר את הכלי מדידה, ולאחר מכן לחץ כלפי מעלה כפתור המשולש בחלונית ' בקרה '. להסיר את הכלי מדידה ולנקות את זה עם 70% אתנול. לנקות את הפלטפורמה עם 70% אתנול.
    11. בפרויקט הנוכחי, לחץ על הצעד מדידה ומשוך למעלה חלון הגדרת. עכשיו, קבע התדר ל 100 הרץ. לשמור על כל שאר הפרמטרים ללא שינוי.
    12. חזור על שלבים 2.4.5 - 2.4.10.
    13. לחץ על דיאגרמה. להתבונן העקומה של G', G " לעומת המתח תנודה. למצוא את הנקודות הסטה של G' עבור שני תדרים (0.01 הרץ ו- 100 הרץ). למצוא זנים תנודה המתאים בשתי נקודות סטיה.
    14. לבחור את המתח תנודה קטנה יותר ומשתמשים 1/10 של זן זה כל תנודה בדיקות שנערכו לאחר מכן.
      הערה: תחילתה של G' הסטה נחשב האולטימטיבי ליניארי אלסטי המתח (ULES) זה לא צריך להיות חריגה בבדיקות מעקב. היחס 1/10 משמש בדרך כלל בהנדסה מטעמי בטיחות. זן זה מסומן בתור gCמחושב.
    15. לאחר הבדיקה מתבצעת, לחץ על טבלה, להעתיק כל הנתונים ולאחר הדבק אותו לתוך קובץ טקסט.
  5. לבצע סריקה טמפרטורה.
    1. לחץ על יישומים שלי , בחר את התבנית טמפרטורה הרמפה, הטיה מתנדנדות: Gelation.
    2. שם הפרויקט.
    3. לחץ על הצעד מדידה בזרימת העבודה. ואז לחץ על המשתנה טמפרטורה, משוך למעלה חלון הגדרת והגדר את הטמפרטורה התחלתי וסופי להיות 37 ° C ו- 25 ° C, בהתאמה.
    4. בחלון מתח, הגדר תנודה זן 0.1%, תדירות תנודה 1 הרץ. לאחר מכן הגדר את מספר נקודות הנתונים להיות 61. התדר אוסף נתונים מוגדר 1 נקודה לדקה לחץ מחשבון , הגדרת הצבע צפיפות 0.2 ° C/הצבע.
      הערה: זה יאפשר את הטמפרטורה לשינוי בשיעור של 0.2 ° C/min.
    5. לטעון את הדגימה על פלטפורמה rheometer ולבצע את הבדיקה על-ידי ביצוע שלבים 2.4.5 - 2.4.10.
    6. לחץ על דיאגרמה, להתבונן הג ', G " לעומת הטמפרטורה. למצוא נקודת G של כבל מוצלב ' ו- G ". למצוא את הטמפרטורה בנקודה מוצלב.
      הערה: זהו טמפרטורת המעבר sol/ג'ל של הידרוג מבשר.
    7. חזור על שלב 2.4.15.
  6. התנהגות של טאטא זמן איזותרמי.
    1. לחץ על שלי apps , למצוא ולחץ על התבנית איזותרמי טמפרטורה-זמן הבדיקה. לחץ על הצעד מדידה בזרימת העבודה, ואז לחץ על המשתנה תנודה זן, משוך למעלה חלון ההתקנה, הגדר את המתח תנודה 0.1%, והגדר את תדירות תנודה 1 הרץ. בחלון מתח, להגדיר את מספר נקודות הנתונים ל-120. הגדר את התדר אוסף נתונים 1 נקודה/min.
      הערה: הערך של זן זה מבוסס על התוצאות של משרעת בסריקה.
    2. לחץ על לחצן הוסף כדי להוסיף את הטמפרטורה המשתנה. לחץ משתנה טמפרטורת בחלון האמצעי ולהגדיר אותו 25 º C.
      1. קליק ימני השלב ההתקן לעבור מדידת נקודת בזרימת העבודה, לחץ על מחק. ואז לחץ על הצעד שהתקן קבע ערךבטל את סימון התיבה לחכות עד הגיע לערך, הגדר ערך ל- 25 ° C. לחץ על התמונות, בשידור, לחצנים על המסך התחתון, בטל את סימון התיבה המשך. ואז לחץ על הצעד תתחיל, שם הפרויקט ולשמור אותו.
    3. לטעון את הדגימה על הפלטפורמה rheometer ולהתחיל את הבדיקה על-ידי ביצוע שלבים 2.4.5 - 2.4.10.
    4. להתבונן הג ', G " נגד הזמן. למצוא נקודת G של כבל מוצלב ' ו- G ". למצוא את הזמן בנקודת מוצלב. לאחר הבדיקה מתבצעת, לחץ על טבלה, להעתיק כל הנתונים ולאחר הדבק אותו לתוך קובץ טקסט.
      הערה: זו הפעם המעבר sol/ג'ל של הידרוג למבשר ב 25 º C.
  7. מודדים את הכוח התשואה בזמנים שונים ג'לי.
    1. לחץ על שלי apps , למצוא ולחץ על התבנית מתח התשואה וזרימה, דמוי ג'ל. שם הפרויקט. לחץ על הצעד להתחיל בזרימת העבודה. לחץ על הוסף בתפריט הראשי של, בתפריט הנפתח, בחר להמתין. משוך למעלה חלון ההתקנה ולהגדיר זמן ההמתנה להיות 20 דקות.
      הערה: פעולה זו תוסיף שלב ההמתנה לפני הבדיקות.
    2. לחץ על התחל, ואז לחץ על הוסף שוב, בתפריט הנפתח, בחר בהתקן. משוך למעלה חלון ההתקנה, בחר טמפרטורה, ולהגדיר אותו 25 º C. בטל את הסימון בתיבה המתן עד הגיע לערך.
    3. לחץ על הצעד מדידת זרימת העבודה, בחר במשתנה גזירה, משוך למעלה חלון הגדרת והגדר גזירה התחלתי וסופי את הרשות הפלסטינית 0 ו- 10,000, בהתאמה.  לחץ על מחשבון, לקבוע את נקודת צפיפות 0.2 נקודת/אבא בכרטיסייה ' נקודות נתונים ' מצד השמאל, להגדיר נקודה אחת בשנייה.
      הערה: זה יגרום שיעור ramping מתח של הרשות הפלסטינית 5/s.
    4. לחץ על הכרטיסיה אירוע שליטה בחלק התחתון של החלון משיכה למעלה ולהגדיר את קריטריון עצירה: לעצור את המידה אם ההטיה קצב > 100 s-1.
      הערה: זה יעצור אוטומטית את המידה, אם החומר הוא הניב.
    5. לטעון את הדגימה על הפלטפורמה rheometer ולהתחיל את הבדיקה על-ידי ביצוע שלבים 2.4.5 - 2.4.10.
    6. לחץ על דיאגרמה. לבחון את עקומת מאמץ-מתח. למצוא נקודת הסטה של המתח והלחץ המתאים שלה. חזור על שלבים 2.7.2 - 2.7.6, אך לשנות את זמן ההמתנה 30, 40 ו- 50 דקות עבור כל שכפול; זה יביא הכוח התשואה בזמנים שונים, ג'לי.
      הערה: הלחץ הזה נחשב את הכוח התשואה נראית לעין.
      הערה: התוכנה לחיצות יכולים להיות שונים על ידי מודלים rheometer וגירסאות תוכנה. אנו ממליצים לקוראים את ההפניה של הפרמטרים הבדיקה שאנו מספקים, זמן לעיין במדריך של rheometer/תוכנה ספציפית בשימוש מעשי.
       

3. לגרדום עיצוב הידרוג עמוסי תא, הדפסת תלת-ממד מודלים

  1. עיצוב לגרדום
    1. צייר מודל כמו מדחף על נייר.
      הערה: המודל כמו מדחף מעוצב בהתבסס על השיקולים הבאים: (א) זה מדמה את ויוו תרחיש שבו תאים סרטניים מוקפים CAFs; (ב) מצמצם את הריכוז של מתח באמצעות השימוש גיאומטריות מעגלית; (ג) הוא גמיש כך ניתן להוסיף מגזרים יותר הדגם בעתיד מבלי לשנות את גיאומטריות קיים; (ד) וזה שטוח את קנה המידה האנכי שלו כדי להקל על הפצת חומר מזין.
    2. תן למרכז של המדחף להיות המקור, להשתמש בסמלים R0 R1, R2 כדי לייצג מקסימלי הרדיוס של המעגל הפנימי, מגזרים האמצעי, המגזרים החיצוני, בהתאמה. השתמש בסמלים m ו- n כדי לייצג מספר קשתות פנימי, חישורים בתוך השטח המגזר, בהתאמה.
    3. לחשב את הקואורדינטות של כל צומת על המודל כמו מדחף ולכתוב אותם בביטויים סמליים של R0, R1, R2, mו- n.
    4. הפעלת קובץ script של תוכנית הגדר R0, R1, R2, mו- n משתנים, קלט את הביטוי הסימבולי של כל צומת מפתח.
      הערה: עיין טבלה של חומרים עבור כל מידע תוכנה.
    5. לארגן את נתיב המחבר את הצמתים והקצה מחסנית את המעגל הפנימי, המגזרים האמצעי של המגזרים החיצוני. להגדיר את עובי השכבה להיות מיקרומטר 150 ואת מספר שכבות 4.
    6. בואו התוכנית פלט קובץ טקסט בתבנית-G-code לזיהוי על-ידי bioprinter.
    7. להגדיר R0 = 3.85, R1 = 6.85, R2 = 8.65, m = 2 ו- n = 5. להריץ את הסקריפט, לאחזר את הקובץ שנוצר G-code. העתק והדבק את הקובץ לתיקייה-G-code ייעודי של bioprinter.
    8. הפעל את bioprinter ואת תוכנת השליטה שלה. אתחל את המדפסת. פתח את ה-script-G-code רק יצרת והגדרת כל הלחצים לאפס. להחזיר תוכנת הבקרה, לחץ על הכרטיסיה מחולל Scaffolderולאחר מכן לחץ על לחצן הפעל בפינה התחתונה ימינה. להתבונן הנתיב נע של המדפסת.
      הערה: זו תבדוק את מידת הדיוק של G-הקוד שנוצר. עיין בטבלה של חומרים עבור מידע הקשור את bioprinter.
    9. שלב זה הוא אופציונלי. לבנות דגם תלת-ממד כינוי רמז על סמך הפרמטרים לעיל באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD).
      הערה: עיין טבלה של חומרים עבור ספק תוכנת המידע.
  2. להפוך את הקדמה הידרוג A3G7 עמוסי תא
    הערה: השלבים בסעיף זה חייב להתבצע בתנאים סטריליים. שמור את bioprinter בתוך BSC.
    1. לחטא את bioprinter ע י ריסוס 70% אתנול ביסודיות, לחשוף אותה לאור UV למשך הלילה.
    2. להוציא מזרק של הידרוג מבשר (ב 4 ° C), לחמם אותה באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עבור 1 h.
    3. לקחת את הבקבוק-T עם תאים (ראה שלב 1.3) מן הדו חמצני2 מגשים ומניחים אותו בתוך BSC. ביטול המדיום תרבות ולשטוף את התאים עם DPBS פעמיים. להוסיף פתרון טריפסין ומחוממת-EDTA (3.0 מ"ל), דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות Inactivate טריפסין עם נפח זהה של FBS. לספור את התאים באמצעות trypan blue וזמינותו.
    4. את המזרק של הידרוג למבשר מהאמבטיה מים, לנקות אותו, לעקר אותה עם 70% אתנול. מכניסים את המזרק BSC.
    5. הבלטת כ 3 מ"ל של הידרוג קודמן לתוך מחסנית ההדפסה 10 מ"ל. לערבב למבשר עם מד א-MB-231-GFP תאי-עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל על ידי לאט pipetting, הימנעות הייצור של בועות. מכסה את המחסנית עם סיום סטרילי, כמוסות העליון, לאטום אותו עם סרט פרפין. Centrifuge זה-834 g x עבור 1 דקות לחסל בועות גז המופק.
    6. חזור על שלבים 3.2.3 - 3.2.5 למבשר עמוסי תא IMR-90-mCherry, מבשר נטול תאים.
    7. לעקר כל 3 מחסניות עם אתנול 70% ולאחר מכן טעינה אותם לתוך חדרי bioprinter. בתוכנה הבקרה של המדפסת, הגדר את הטמפרטורה מחסנית 25 º C. המתן 35 דקות כדי לאפשר למבשר להגיע תנאים הניתנים להדפסה.
      הערה: הפעם לא משפיעה את הכדאיות של התאים נעוץ את הידרוג.
  3. דגמי הדפסת תלת-ממד
    1. בתוכנה הבקרה של המדפסת, הרחב את הכרטיסיה כלי ראשי בתוכנה הבקרה של המדפסת, לחץ על דיו 1-הממשק הגרפי בצד שמאל ולאחר מכן לחץ על לחצן אמצעי קצר כדי למדוד את המיקום של קצה הזרבובית. חזור על הפעולה עבור 2 מכלי אחרים.
    2. מקום של microplate ברור פוליסטירן, פתח את הקובץ-G-code ולשנות את הלחץ כדי 200 kPa עבור כל מחסניות. להחזיר תוכנת הבקרה, לחץ על הכרטיסיה Scaffolder גנרטור, בחר נקודה כדי להתחיל להדפיס ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעל בפינה התחתונה ימינה. חזור על שלב זה כדי לקבל 3 משכפל נוסף.
    3. לאחר הדפסה ושכפול כל המודלים מדחף, להוסיף 100 מ מ פתרון2 CaCl קשר צולב המודלים עבור 1 דקות ולשטוף אותו 2 x עם DPBS כדי להסיר את עודף של יוני Ca++ .
    4. להעביר בזהירות את הדגמים על גבי צלחת 6-ובכן מצופים agarose בעזרת מרית. הוסף 5 מ של מדיה DMEM כל טוב. דגירה הלוחות באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.
      הערה: ודא שהדגמים צפים בתוך הבארות.
    5. להחליף את המדיום תרבות תא בינוני טריים כל 3 ימים, תרבות זה 30 ימים בסך הכל.

4. הכדאיות וניסויים ספרואיד מערך האחסון בדיסקים הידרוג.

  1. הכנת דיסק הידרוג
    1. חזור על שלבים 3.2.1 - 3.2.6.
      הערה: זה אפשרי להחליף את המחסנית עם מיכל סטרילי קטן.
    2. השתמש מזרק סטרילי בוגר 1 מ"ל, לחתוך את הצינור כדי ליצור חור גדול במזרק (החור יש להיות באותו קוטר כמו שאר הצינור מזרק). לנקות את זה עם 70% אתנול ולהשאיר אותה עד שהיא יבשה.
      הערה: לעשות זאת, BSC סטרילי.
    3. השתמש מכסה טוב-צלחת, להוסיף 100 מ מ CaCl2 עד פני השטח מכוסה; . אז, קח את הידרוג עמוסי תא כדי למלא את המזרק; הבלטת 100 µL באמצעות התליה בשיטת. להשאיר את הידרוג עבור 1 דקות, לשטוף אותו עם DPBS מוגזמת. להעביר את הדיסקים הידרוג אל agarose-מצופה 6-ובכן צלחת, הוסף 5 מ של DMEM הבסיס ולאחר תקופת דגירה אותן ב- CO 37 ° C ו- 5%2 של עד 30 ימים. רענן המדיום כל 3 ימים.
  2. הכדאיות התא ואת ספרואיד
    1. השתמש וזמינותו של MTS כדי לקבוע את הכדאיות התא. לשטוף כל דיסק עם DPBS, לחתוך את זה לארבעה חלקים עם להב סטרילי מעולה. לאסוף את החלקים של הדיסק כולו ומעבירים אותם אל צלחת 96-ובכן. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של DMEM בתוספת 20 μL של MTS ריאגנט מכל קידוח, דגירה התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
    2. לאחר התגובה MTS, לשחזר את תגובת שיקוע, להעביר אותו צלחת נקי 96-ובכן. למדוד את ספיגת של הדגימות 490 nm.
  3. היווצרות ספרואיד
    1. לקחת את המודל incubated של מדחף או דיסק של החממה ימים 0, 7, 15, 21, 30 של התרבות ולהעביר אותם ל צלחת נקייה 6-ובכן.
    2. השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי ספינינג דיסק הפוכה כדי להמחיש את spheroids ולרכוש את התמונות באמצעות מספר תפקידים ו- z-במחסן. תמונה כל מדחף, או מודל דיסק, לאורך קוטרו האופקי משמאל נכון עם פער מיקרומטר 500 ולרכוש z-ערימה מלמטה למישור מוקד העליון בכל מיקום אופקי.
      הערה: עיין טבלה של חומרים עבור ספק המידע.
    3. לשחזר את התמונה באמצעות כלי אריתמטית הערימה המרבי, שמספקת התוכנית ImageJ, ליצירת 2D התמונות המשמשות עבור ניתוח ספרואיד.

5. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

  1. הכינו את הידרוג alginate/ג'לטין כפי שמתואר בשלב 1.2.
    הערה: בתנאים סטריליים אינם נדרשים.
    התראה: חנקן נוזלי paraformaldehyde מסוכנים, יש לטפל בזהירות.
  2. להכניס 1 מ"ל של הידרוג מרגמה, להוסיף חנקן נוזלי, לטחון אותו באמצעות כבעלי. המשך להוסיף חנקן נוזלי כדי למנוע את הידרוג מ מפשירה. להעביר את האבקה לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL, לאטום אותו, ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס במשך ה 2 שזה יבש והקפיא את הדגימה במשך 24 שעות ביממה.
  3. עבור ספרואיד הדמיה, לשטוף את הידרוג בעדינות עם DPBS 2 x, לתקן את התאים על ידי טבילה paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, ואז לשטוף אותם עם DPBS, להקפיא אותם עם חנקן נוזלי. לבסוף, שזה יבש והקפיא את הדגימה במשך 24 שעות ביממה.
  4. לנתח את המבנה הידרוג/ספרואיד ואת מורפולוגיה עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM)-25.0 kV, מתחת לגיל 70 הרשות הפלסטינית (קאמרית הלחץ) עם הגדלה של 40 X עד 5, 000 X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחוג טמפרטורה מראה הבדל מובהק של מבשר A3G7 ב- 25 ° C ו- 37 מעלות צלזיוס. מבשר נוזלי ב 37 מעלות צלזיוס, יש צמיגות מורכבים של 1938.1 ± 84.0 mPa x s, אשר תאומת על-ידי משחק גדול "על G'. ככל שהטמפרטורה יורדת, מבשר עובר gelation פיזית בשל שזירה הפיזי ספונטנית של מולקולות הג'לטין לתוך tri-סליל היווצרות29,30. שניהם הג ' ו- G של "להגדיל, מתכנסת ב 30.6 מעלות צלזיוס, המעידים sol-ג'ל מעבר. מודולים ממשיכים להגדיל, עם ירידה בטמפרטורה, להגיע 468.5 ± 34.2 הרשות הפלסטינית של G' ו 140.7 ± 9.3 הרשות הפלסטינית של G "25 ° c (איור 1 א'). בהתבסס על התוצאות של מחוג טמפרטורה, בחרנו 25 ° C כמו הטמפרטורה ההדפסה. הניסוי קינטיקה gelation מדמה את השינוי בטמפרטורה המתרחשת במהלך הכנת הדוגמא, טיפול (קרי, הסרת הדגימה 37 ° C מים אמבט והצבתו אל החדר bioprinter 25 ° C). G', G ", ו- | η * | הגדל עם הזמן בטמפרטורה הוריד ולאחר המעבר סול-ג'ל מתרחש ב ~ 17 דקות 25 ° c, כאשר G' ≈ G "≈ ל – 64.3 הרשות הפלסטינית, הגורם לאובדן שווה ל- 1 (איור 1b וג 1). מבשר ממשיך להתקשות ומגיעה אל חלון ההדפסה לאחר 50-90 דקות של gelation. בתוך חלון הדפסה זה, מבשר יכולה להיות חלקה extruded באמצעות זרבובית גלילי G25 בלחץ של 200 kPa. קיומו של התשואה מתח מרמז על התנהגות מוצק דמוי של החומר, מעלה את השלמות. המבנית לאחר ההבלטה לעמוד משלו במשקל31. הרמפה מתח מזהה את הלחץ התשואה בתקופות שונות של gelation. התוצאות מראות כי הלחץ התשואה עולה עם הזמן gelation הולך וגדל. ב- 50 דק ' של gelation, הלחץ התשואה מגיע 325.9 הרשות הפלסטינית, להבטיח כי המודל יציב לאחר ההבלטה.

המודל מדחף המודפס מוצג באיור 2a. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאשרת את המיקומים ההבלטה הראשונית של התאים IMR-90-mCherry (איור 2b) והן את מד א-MB-231-GFP. התאים מד א-MB-231-GFP להתחיל לפתח spheroids 15 ימים לתוך תקופת תרבות, ואחריו גודל גדל ומספרים של spheroids עד יום 30 (איור 2 c - 2f). חלק מהתאים IMR-90-mCherry גם טופס agglomerations (איור 2 g - 2j). במידה ניכרת, לאחר 30 ימים של תרבות, תאים IMR-90-mCherry הם נצפו באזור כבשו בתחילה על ידי מד א-MB-231-GFP תאים (איור 2f), רומז אירועים העברה אפשרית במודל. באופן דומה, תאים שהועברו מד א-MB-231-GFP יכול גם להיות שנצפו באזור IMR-90-mCherry נשלט ביום 30 (איור 2j).

המודל דיסק מוצג באיור 3 א. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאשרת את התפלגות התא הומוגנית בתוך הדיסק (איור 3b). מד א-MB-231-GFP התאים מתנהגים באופן דומה במודל דיסק כפי שעשו בעת הדפסת כמודל מדחף. להחליפן בתמונות מוצגות באיור 3 c - 3f. הדמיה SEM מגלה הידרוג עמוסי ספרואיד של מד א-MB-231-GFP לאחר 21 יום של תרבות (איור 4a). דור, נוכחות, ספרואיד מאומתת על-ידי השוואת תמונות SEM עם נטול תאים hydrogels (איור 4b).

תא הכדאיות של שני סוגי תאים הוא הפגין איור 4ג'. מד א-MB-231-GFP התאים מבטאים את יכולת הקיום של תא גבוה יותר בהשוואה לתאים IMR-90-mCherry. מעניין, התאים מד א-MB-231-GFP התערוכה של מגמה מוגברת של הכדאיות לפני יום 15, עם עולה כמעט פי שלושה מספר התאים קיימא לעומת יום 0. זה מלווה ירידה ביום 21, לפני שחזור שוב ב-30. לעומת זאת, התאים IMR-90-mCherry יש תנודות מינימלי הכדאיות במהלך מכלול של תקופת תרבות. הערכים יורדת יכולת הקיום של התאים מד א-MB-231-GFP ביום 21 תואמות צורה MTCSs גדולים, אשר פיתחה ליבות עם נמק.

Figure 1
איור 1: אפיון Rheological למבשר הידרוג- לטאטא טמפרטורה () א מציג את המעבר סול-ג'ל ב- 30.6 מעלות צלזיוס. (בג) קינטיקה gelation של A3G7 למבשר מציגה גידול של G', G ", ו- | η*| -זמן של gelation, סול-הג'ל המעבר מתרחש כ- 17 דקות ב 25 º C. (d) לוח זה מראה את הלחץ תשואה של קודמן לעומת הזמן של gelation. עלייה של התשואה מתח הוא ציין עם זמן עוד ג'לי. התוצאות יוצגו בזאת אומרת ± SD, n≥ 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: היווצרות MCTS בדגם חוץ גופית בתוך 3D bioprinted של IMR-90-mCherry myofibroblast, תאים סרטניים בשד מד א-MB-231-GFP. () התצלומים האלה מראים את bioprinted במבחנה הדגימה (משמאל) דגם CAD (מימין). (b) תמונה זמן לשגות קונאפוקלית ייצוגית זו מציגה את מד א-MB-231-GFP (ירוק), IMR-90-mCherry (אדום) תאים bioprinted בתוך המודל. (c - f) הזום-in אלה מציגים את האזורים תא מד א-MB-231-GFP (תיבות מנוקד לבן). (g - j) הזום-in אלה להראות את האזורים תא IMR-90-mCherry (תיבות צהוב מנוקד). פסי בקנה מידה 2 מ מ ב לוח 2a, 1 מ מ ב לוח 2bו 500 מיקרומטר לוחות 2 c - 2j עבור איזורים נבחרים, ההגדלה הוא 10 X. הבירה "D" של תמונות פירושו "ימים של תרבות". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: היווצרות MCTS בתוך דיסק הידרוג מד א MB-231-GFP-לאדן 3D. () התמונה הזאת מראה דיסק הידרוג. (b) תמונה קונאפוקלית ייצוגית זו מציגה מד א-MB-231-GFP תאים בתוך החומר המרוכב. (c-f) הזום-in אלה להראות האזור תא מד א-MB-231-GFP (לבנה מנוקדת ב לוח 3b) ב (ג) 0, (ד) 7, (e) 15, ו (f) 21 ימים של תרבות. פסי בקנה מידה 2 מ מ ב לוח 3 א, 1 מ מ ב לוח 3bו 500 מיקרומטר לוחות 3 ג - 3f עבור איזורים נבחרים, ההגדלה הוא 10 X. הבירה "D" של תמונות פירושו "ימים של תרבות". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: מורפולוגיה ותא הכדאיות של MTCSs. () במיקרוסקופ אלקטרוני סורק זה מראה של מד א-MB-231-GFP MCTS בתוך הג'ל לאחר 21 ימים של תרבות, מציג MCTS קטן (כיוון החץ). (b) SEM זו תמונת מראה של הידרוג alginate/ג'לטין ללא תאים. ההגדלה היא 350 X. (ג) לוח זה מראה את הכדאיות תא של מד א-MB-231-GFP, IMR-90-mCherry במהלך 30 ימים של תרבות בתוך הידרוג. התוצאות נותחו גם זאת אומרת ± SD, מבחינה סטטיסטית נותחה באמצעות ANOVA דו-כיווני ובדיקה של Bonferroni פוסט. p (*) < 0.05, n ≥ 3. הנתונים היה מנורמל לצפיפות התא המשמש ליצירת הדגימות ביום 0. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יכול להיות בסכנה עמוסי תא מבנים אם זיהום (כימי או ביולוגי) מתרחשת בשלב כלשהו בתהליך. בדרך כלל, המתפללים נתפס לאחר שניים או שלושה ימים של תרבות כצבע שינוי תרבות המדיה או המבנה bioprinted. לכן, העיקור (חיטוי הפיסיקליות והכימיות) היא צעד מפתח עבור כל התהליכים הקשורים לתא. ראוי לציין, ג'לטין autoclaving משנה את תכונותיו ג'לי, שהפכו אותו ג'ל לאט יותר במבחנים אשר ערכנו. לכן, אנחנו מעוקר כוח קילוף פלסטיצידיות ואת הג'לטין באמצעות UV החשיפה. בשל יכולת חדירה מוגבל מאוד של אור UV, להשתמש בשכבה דקה מאוד (< 0.5 מ"מ). הריכוז של קילוף פלסטיצידיות, ג'לטין ניתן לשנות באופן שרירותי לכוון את מאפייני מכאנית וביולוגית32. בשנת העבודה הנוכחית, בחרנו A3G7, כי זה מספק שמשטחו רצויה במהלך חלון ההדפסה, ומספק הידרוג תפור יציבות גבוהה דרך הניסוי 30 יום. חימום עד 60 ° צלזיוס ואילו המסת אבקה לתוך DPBS מסייע לשפר את liquefication של ג'לטין, אשר מקל על ערבוב. ניתן להשתמש גם בטמפרטורה נמוכה; עם זאת, זמן מלהיב יותר ואז יידרש.

מחוג טמפרטורה rheological נותן נקודת סול-ג'ל ב 30.6 מעלות צלזיוס, אשר תואמת פרסומים אחרים33. תיאורטית, כל טמפרטורה גבוהה יותר 30.6 מעלות צלזיוס יכול להפוך לנזיל מבשר. בחרנו 37 ° C כדי לפשט את העבודה, כמו תא תרבות בינוני הוא מראש ומחוממת באמבט מים 37 º C. על סמך את קינטיקה gelation (לפני ג'לים קודמן), יש כ- 17 דקות לערבוב תא; לאחר תקופה זו, ערבוב התאים למבשר הידרוג קשה עקב צמיגות מוגברת מודולים, גורם של אי-הומוגניות עמוסי תא bioink. לכן, אנו מציעים טיפול העבודה ללישת תא במרחק 10 דקות הראשונות של ג'לי. הלחץ התשואה לא נחשבת תכונה גשמי המשפיעה שמשטחו עד לאחרונה34; בכל מקרה, זה בהרחבה הוכר על ידי מדענים פולימר כסמן של נוזלים פשטידה/פרטנית31,35,36,37. קיומו של התשואה מתח מסייעת לבנות את שלמות מבנית לשאת משקל משלה. הלחץ תשואה גבוהה יכול גם לדרוש של הפעלה מוגברת בלחץ ההבלטה; לכן, זה עלול לגרום נזק לתאים עקב עודף מאמץ גזירה32. נאמנות דגם יכול להתפשר על אם תהליך ההבלטה מתרחשת מחוץ לחלון הדפסה מיטבית הסימנים הנפוצים לבעיה זו מוצגות במבנה bioprinted האחרון: זה גם יהיה קשה מדי או יותר מדי נוזלי בקצוות. מבשר A3G7 תערוכות חלון ההדפסה של האופטימלית במהלך 50-90 דקות של ג'לי מספק יציבות מבנית והן את הישרדות התא והוא יכול לשמש המדיום לבנות הגידול הטרוגנית מודלים14.

הגובה הכולל של המודל המדחף הוא 600 מיקרומטר כמו זה נוצר מתוך ארבע שכבות 150 חוטים מיקרומטר. עיצוב זה מאפשר מזין וגז להחליף תאים הם לכל היותר מיקרומטר 300 מהמשטח פנייה התקשורת בתקופת הדגירה. מודלים גבוה יותר בהגעה פבריקציה נוספת, אבל הם צוואר בקבוק חמור על-ידי המרחק מוגבל דיפוזיה של חומרים מזינים הידרוג38, אשר עלולה לגרום הישרדות cell נמוכה באזור הליבה.

אסטרטגיות שונות פותחו כדי טופס MCTS במבחנה, כגון ירידה לתלייה, צ'יפ, הרכבה, ו- bioprinting microfluidic39. עם זאת, חלק מתודולוגיות אלה יכול לשנות את התא פיזיולוגיה וביוכימיה, יצירת תאים שונים מההתנהגויות שמתרחשות ברקמת הגידול נורמלי. למשל, התליה ירידה שיטת כוחות חד תאים תישאר תא אגרגטים דרך כליאה הפיזי40. כמו כן, אינדוקציה כימי לצורה MCTS על ידי תוספת פפטיד יכול לשנות את הביוכימיה של spheroids41. החומר המרוכב הידרוג המתוארים כאן מאפשר מערך MCTS יוצרים סביבה ביונים ללא לחצים חיצוניים. מתחיל כמו תאים בודדים מפוזר היטב, לאחר 7 ימים של תרבויות, ארגן מחדש את התאים כמו MCTS קטן (יותר מ 6 תאים לכל ספרואיד), הגדלת הגודל והכמות שלהם במהלך 30 ימים של תרבות.

בתוצאות מחקר זה, מצאנו כי מד א-MB-231-GFP spheroids להקטין את הכדאיות תא ביום 21, מתאם תופעה זו עם היווצרות של spheroids גדול. גידול מוצק מורכבת משלוש שכבות שונות, לפיה השכבה החיצונית מציג את קצב התפשטות גבוה בהשוואה השכבה האמצעית, נמק או senescent פנימי את ליבת ספרואיד18. זה עשוי להסביר את הירידה הכדאיות בתוצאות.

את המגבלות של פרוטוקול זה הן דינמיקה (1) bioink (2) תא סוג תאימות. Bioink dynamics מתייחס תכונות החומר בדרגות שונות במהלך תהליך gelation, וכתוצאה מכך חלון ההדפסה האופטימלי שמעבר המבנה מודפס פגום. תאימות סוג התא מתייחס חוסר היכולת של סוגי תאים מסוימים (תאים בטור או תרבות ראשי) שהפגינו התנהגות הילידים ויוו .

הידרוג A3G7 משיגה יכולת הקיום של יציבות ותא גבוהה. 3D bioprinting ניתן לבנות מודלים 3D מחלות הטרוגנית עם תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה וגבוה הפארמצבטית כחלופה מציאותית יותר תרבית תאים מסורתיות ומודלים גידול בעלי חיים קטנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ג'יאנג טאו תודה את סין מלגת מועצה (201403170354) ואת פרס דוקטורט להנדסה מקגיל (90025) למימון מלגות שלהם. יוסי ג'י Munguia-לופז תודה CONACYT (250279, 290936 ו- 291168), FRQNT (258421) למימון מלגות שלהם. סלבדור פלורס-טורס תודה CONACYT על המלגה שלהם מימון (751540). יוסף מ' קינסלה תודה המדע הלאומי, מועצת המחקר ההנדסי, קרן קנדי על חדשנות, קרן משפחת טאונסנד-Lamarre ו אוניברסיטת מקגיל למימון שלהם. ברצוננו להודות אלן Ehrlicher ומאפשר לנו להשתמש rheometer שלו, דן Nicolau עבור ומאפשר לנו להשתמש מיקרוסקופ קונפוקלי שלו, ואת פארק מורג להענקת לנו גישה אל שורות תאים עם תוויות fluorescently.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433, (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7, (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15, (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244, (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116, (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25, (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34, (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20, (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7, (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33, (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4, (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34, (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6, (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1, (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32, (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32, (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35, (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13, (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49, (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49, (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. Wiley-Interscience. Hoboken, NJ. (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8, (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32, (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8, (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42, (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. Fluidity and plasticity. McGraw-Hill. New York, NY. (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53, (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33, (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18, (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506, (1-2), 148-157 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics