Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystemer indusere celle-formet formasjon

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi utviklet en heterogen bryst kreft modell består av udødeliggjort svulst og fibroblast celler i en bioprintable alginate/gelatin bioink. Modellen viser i vivo svulst microenvironment og forenkler dannelsen av flercellet svulst spheroids, gir innsikt i mekanismer kjøring tumorigenesis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den cellulære biokjemiske og Biofysiske heterogeniteten opprinnelige svulsten microenvironment er ikke recapitulated av voksende udødeliggjort kreftcelle linjer med konvensjonelle todimensjonal (2D) cellekultur. Disse utfordringene kan overvinnes ved å bruke bioprinting teknikker for å bygge heterogene tredimensjonale (3D) svulst modeller der ulike typer celler er innebygd. Alginate og gelatin er to av de vanligste biologisk materiale i bioprinting deres biocompatibility, biomimicry og mekaniske egenskaper. Ved å kombinere de to polymerer, oppnådd vi en bioprintable sammensatte hydrogel med likheter til en innfødt svulst stroma mikroskopiske arkitektur. Vi studerte om utskrift er mulig til sammensatte hydrogel via Reologi og fått vinduet for optimal utskrift. Brystkreft celler og fibroblaster var innebygd i hydrogels og utskrift for å danne en 3D-modell mimicking i vivo microenvironment. Bioprinted heterogene modellen oppnår en høy levedyktighet for langsiktig cellekultur (> 30 dager) og fremmer den selv-montering av brystkreft celler i flercellet svulst spheroids (MCTS). Vi observerte migrasjon og samspillet av kreft-assosiert fibroblast cellene (CAFs) med MCTS i denne modellen. Ved å bruke bioprinted celle kultur plattformer som co kultur systemer, tilbyr et unikt verktøy for å studere avhengigheten av tumorigenesis stroma sammensetningen. Denne teknikken har en høy gjennomstrømning og lav pris og høy reproduserbarhet, og det kan også gi en alternativ modell til konvensjonelle monolayer cellekulturer og dyr svulst modeller å studere kreft biologi.

Introduction

Selv om 2D cellekultur brukes mye i kreftforskning, finnes begrensninger som cellene er dyrket i et monolayer format med en ensartet konsentrasjon av næringsstoffer og oksygen. Disse kulturene mangler viktige celle-celle, og cellen matrise interaksjoner stede i den opprinnelige svulsten microenvironment (TME). Derfor recapitulate disse modellene dårlig fysiologiske forhold, noe som resulterer i avvikende celle atferd, inkludert unaturlig morphologies, uregelmessig reseptor organisasjon, membran polarisering og unormale genuttrykk, blant annet forhold1,2,3,4. På den annen side, tilbyr 3D cellekultur, der celler er utvidet i løpet volumetriske aggregat, spheroids eller organoids, en alternativ teknikk for å skape mer nøyaktig i vitro miljøer for å studere grunnleggende cellebiologi og fysiologi. 3D celle kultur modeller kan også oppfordre celle-ECM interaksjoner som er kritiske fysiologiske egenskaper av innfødte TME i vitro1,4,5. Den nye 3D bioprinting-teknologien gir muligheter til å bygge modeller som etterligner den heterogene TME.

3D bioprinting er avledet fra rapid prototyping og gjør fabrikasjon av 3D microstructures som er i stand til å etterlikne noen av kompleksiteten av levende vev prøver6,7. Gjeldende bioprinting metoder omfatter inkjet, ekstrudering og laser-assistert utskrift8. Blant dem kan metoden ekstrudering heterogenitet skal kontrolleres i de utskrevne matriser av nøyaktig posisjonering forskjellige typer materialer på ulike første steder. Det er derfor den beste måten å dikte heterogene i vitro modeller som involverer flere typer celler eller matriser. Ekstrudering bioprinting har blitt brukt til å bygge auricular formet stillaser9, vaskulære strukturer10,11,12, og huden vev13, som resulterer i høy utskrift gjengivelse og celle levedyktighet. Teknologien har også allsidig materielle valg, muligheten til å sette inn materialer med celler innebygd med kjente tetthet og høy reproduserbarhet14,15,16,17 . Naturlige og syntetiske hydrogels brukes ofte som bioinks for 3D bioprinting deres biocompatibility, bioactivity og hydrofile nettverket som kan bli konstruert å strukturelt ligner ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels er også en fordel siden de kan inneholde lim nettsteder for celler, strukturelle elementer, permeabilitet for næringsstoffer og gasser, og de aktuelle mekaniske egenskapene å oppmuntre celle utvikling24. For eksempel tilbyr kollagen hydrogels integrin anchorage nettsteder celler kan bruke til å legge til matrisen. Gelatin, denaturert kollagen, beholder samme celle vedheft nettsteder. I kontrast, alginate er bioinert, men gir mekanisk integritet ved å danne krysskoblinger med divalent ioner25,26,27,28.

I dette arbeidet utviklet vi et sammensatt hydrogel som en bioink, alginate og gelatin, med likhetstrekk til en innfødt svulst stroma mikroskopiske arkitektur. Brystkreft celler og fibroblaster var innebygd i hydrogels og utskrift via en ekstrudering-baserte bioprinter for å opprette en 3D-modell som etterligner i vivo -microenvironment. Utviklet 3D-miljøet kan kreftceller til flercellet svulst spheroids (MCTS) med en høy levedyktighet i lange perioder med cellekulturer (> 30 dager). Denne protokollen demonstrerer metodikkene of syntetisere sammensatt hydrogels karakteriserer materialers mikrostruktur og om utskrift er mulig, bioprinting mobilnettet heterogene modeller, og observere dannelsen av MCTS. Disse metodene kan brukes på andre bioinks i extrusion bioprinting også på ulike utførelser av heterogen vev modeller med potensielle programmer i narkotikarelaterte screening, celle migrasjon analyser og studier som fokuserer på grunnleggende celle fysiologiske funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av materialer, Hydrogel og celle kultur materialer

  1. Materiale og løsning forberedelse
    1. Vask og tørk 250 mL og 100 mL glass kanner, magnetiske stirrers, spatler, 10 mL patroner, 25 G sylindriske dyser (en lengde på 0,5 i) og en diameter på 250 µm. Sterilisere materialer av autoklavering dem på 121 ° C/15 min/1 atm. holde materialet under sterile forhold til bruk.
      Merk: Se Tabell for materiale for leverandørinformasjon.
    2. Veie 3 g av alginate (3% w/v) og 7 g av (7% w/v) (betegnet som A3G7 heretter).
    3. Sterilisere følgende elementer under UV-lys for minst 4 h: alginate og gelatin pulver, parafin film, aluminiumsfolie stykker av 5 cm2, og 1 mL og 5 mL sprøyter. Sterilisere endestykker, tips caps og stempler ved å fordype seg i 70% etanol minst 4 h og vaske dem 2 x med sterilisert ultra rent vann.
      Merk: Se Tabell for materiale for leverandørinformasjon.
    4. Oppløse 4 g agarose med svært rent vann og steriliseres med autoklavering.
      Merk: Agarose er fullstendig oppløst etter autoklavering prosessen.
    5. Forberede en 100 mM løsning av vannfri veisalt (CaCl2) i steriliserte ultra rent vann og et sterilt filter (med en porestørrelse på 0.22 µm) før bruk.
    6. For agarose-belagt 6-og plater, smelte den sterile agarose i mikrobølgeovn til å få en flytende løsning; så, under en Biosafety kabinett (BSC) og bruker 1 mL brønnene, Legg 2 mL per brønn og bland forsiktig for å opprette et jevnt lag i bunnen av brønnen. La det avkjøles og forsegle brønnen med parafin film. Holde det ved romtemperatur (RT) før bruk.
  2. Utarbeidelse av A3G7 hydrogel forløperen
    1. Bland 3 g av alginate og 7 g gelatin pulver i en 250 mL kanne innenfor en BSC. Legge til en magnetisk rørestang og 100 mL DPBS. Forsegle begeret med sterilt parafin film og aluminium folie (5 cm2) å unngå forurensning.
    2. Oppløse pulver under en konstant agitasjon i en magnetisk/varm plate med 600 rpm på 60 ° C i 1 time og RT for en ekstra 2 h.
    3. Varme materialet 37 ° C til gel gjennomgår en fase overgang til flytende staten (for 100 mL lager gel løsning, dette tar ca 45 min). Overføre løsningen til sterilt 50 mL konisk sentrifuge rør, forsegle dem og sentrifuge rør 834 x g i 5 min å eliminere gass bobler fra materialet.
    4. Sug opp hydrogel forløperen til 10 mL sprøyter. Seal sprøyter med caps og parafin. Lagre dem på 4 ° C før bruk.
  3. Cellekultur
    Merk: Trinnene i denne delen må utføres under sterile forhold.
    1. Forberede basale DMEM mediet som følger (1 L): i en BSC, bland 100 mL fosterets bovin serum (FBS) pluss 10 mL av en antibiotika/antimycotic løsning (en 100 x stabilisert løsning) i en fersk sterile containeren. Legge til DMEM medium for å justere blandingen opptil 1000 mL. Sel beholderen og holde det ved 4 ° C.
    2. I et tidligere varmet vannbad (37 ° C), tine 1 hetteglass med MDA-MB-231-GFP (menneskelig bryst kreft cellen linje GFP-merket, kjernefysisk lokalisering) og 1 hetteglass med IMR-90-mCherry (kreft-assosiert fibroblast cellelinjer mCherry-merket, med cytoplasmatiske lokalisering ) celler fra flytende nitrogen oppbevaring ved å flytte dem forsiktig i vannet. Både linjer og plasmider for GFP og mCherry merking, er kommersielt tilgjengelig.
    3. Overføre 160 µL/godt av cell løsningen (3 x 106 celle/mL) i en 6-vel plate og legge 5 mL av varmet (37 ° C) basale DMEM medium. Inkuber platen på 37 °C/5% CO2 24-48 h til cellene kommer 80% samløpet.
    4. Når cellene når samløpet, forkaste mediet og skyll cellene to ganger med DPBS; Inkuber cellene med 500 µL av trypsin-EDTA løsning/vel (0,25%, 1 x, tidligere oppvarmet på 37 ° C) ved 37 ° C i 6 min. Deretter deaktivere trypsin ved å legge 500 µL av FBS, gjenopprette celle løsningen og overføre den til T-75 flasker. Inkuber dem igjen på 37 °C/5% CO2 til cellene kommer 80% samløpet.
      Merk: Volumet av trypsin-EDTA løsning kan variere avhengig av celle-vekst fartøyet.
    5. Gjenta det forrige trinnet arbeide med celler på passering 3-4 som er når celler har flere metabolsk aktivitet og stabilitet.
    6. Telle celler ved hjelp av en trypan blå analysen (0,4%) å bestemme første konsentrasjonen av celler som skal blandes med hydrogel.

2. målinger av reologiske egenskapene til Hydrogels

  1. Forberede alginate/gelatin hydrogel forløperen som beskrevet i trinn 1.2.
    Merk: Sterile forhold er ikke nødvendig for prøver generert for mekanisk testing og analyse. Alle reologiske tester er utført i tre eksemplarer.
  2. Ta en sprøyte av hydrogel forløperen og varme den opp i et 37 ° C vannbad 1t.
  3. Slå på rheometer og starte systemet slik følgende.
    1. Slå på luftkompressoren koblet til rheometer og la luftkompressoren kjøre for 30 min. bryteren på temperatur kontrollboksen for rheometer, slå på rheometer seg selv, og slå på datamaskinen koblet til rheometer.
    2. Åpne rheometer-programvaren, klikk initialisere på kontrollpanelet, og la initialiseringsprosessen ferdig. Angi plattform temperaturen 37 ° c på kontrollpanelet.
    3. Kategorien måle sett og gå til starte funksjon, velg Juster driveren treghet i drop-down menyen, og klikk Start justering i popup-vinduet.
    4. Montere en parallell måleverktøy i rheometer. Alle eksperimenter utført her bruker en 25 mm diameter plate med en 1 mm avstand mellom platene.
    5. Klikk Angi null-gap på kontrollpanelet og venter på prosedyren til slutt. Ta hensyn til den vanlige styrken i denne prosessen.
      Merk: Etter denne prosedyren, normal styrken skal være 0.
    6. Kategorien måle sett og gå til starte funksjon, velg Juster øvre måler system treghetog klikk Start justering i popup-vinduet. Når ferdig, klikk på trekanten på kontrollpanelet for å tillate måling å flytte.
  4. Gjennomføre en amplituden feie.
    1. Klikk Start, og klikk Sett inn i den øverste menyen, velg vente fra det miste-ned menyen. Trekke opp setup vinduet og angir ventetiden til 2T.
      Merk: Dette vil legge litt venter før testene.
    2. Klikk Start, klikk Sett inn -knappen igjen, og rullegardinmenyen, velg enheten. Trekke opp setup vinduet Velg temperaturog velge den som 25 ° C. Uncheck boksen vente til verdien er nådd.
    3. Klikk på trinn målingderetter variabelen svinging belastningen, trekke opp setup vinduet, angi profilen skal rampen logaritmenog klikker endre verdien til 0,001% og 100% som første belastning og endelige belastninger, henholdsvis. Angi frekvensen på 0,01 Hz.
    4. Klikk Legg til for å legge til variabelen temperatur . Klikk variabel temperatur og velge den som 25 ° C. I vinduet pull-up utvide kalkulator, setter punkt tetthet til 10 poeng/tiår.
    5. Ta sprøyten ut av vannbad og extrude ca 0,5 mL av forløperen på rheometer plattformen.
    6. Klikk den nedover trekant knappen på kontrollpanelet. Vent til verktøyet måle flytte til trimming posisjon.
    7. Bruk en slikkepott til å trimme noen overflødig prekursorer som unnslapp ved måle og forkaste det overflødige materialet.
    8. Pipetter mineralolje på kanten av måle og vent til olje fullt sel grensen.
    9. Klikk Fortsett på kontrollpanelet. Klikk Start -knappen (grønn trekant), etterfulgt av å klikke Fortsett på nederste skjermen .
    10. Når testingen er ferdig, slipper måle, og klikk deretter den oppover trekant knappen på kontrollpanelet. Fjern måle og rengjør det med 70% etanol. Rengjør plattformen med 70% etanol.
    11. Det gjeldende prosjektet, klikk på trinn måling og trekk opp setup vinduet. Nå sett frekvensen til 100 Hz. holde alle andre parametere uendret.
    12. Gjenta trinn 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Klikk Diagram. Observere kurven av G', G " versus svinging belastningen. Finn nedbøyning poeng g ' for begge frekvenser (0,01 Hz og 100 Hz). Finne de tilsvarende oscillation stammene for både nedbøyning poeng.
    14. Velg mindre svinging belastningen og bruk 1/10 av denne belastningen for alle oscillation tester utført etterpå.
      Merk: Utbruddet av G' nedbøyning anses endelig lineære elastiske belastningen (regler) som ikke bør overskrides i oppfølging tester. Forholdet 1/10 brukes vanligvis i engineering av sikkerhetsgrunner. Dette beregnede belastning er merket som gC.
    15. Når testen er ferdig, klikker du tabell, kopiere alle data og lime den inn i en tekstfil.
  5. Gjennomføre en temperatur feie.
    1. Klikk mine apps og Velg malen temperatur rampen, oscillasjon skjær: Gelation.
    2. Navnet prosjektet.
    3. Klikk på trinn måling i arbeidsflyten. Velg variabelen temperatur, trekke opp setup vinduet og sette innledende og avsluttende temperaturen å være 37 ° C og 25 ° C, henholdsvis.
    4. I vinduet pull-up satt svinging belastningen til 0,1%, oscillation frekvens 1Hz. Angi antall datapunkt skal 61. Angi data samling frekvensen til 1 poeng/min. Klikk kalkulator og angi peker tetthet 0,2 ° c/punkt.
      Merk: Dette gjør at temperaturen å endre frekvensen av 0,2 ° C/min.
    5. Belaste prøven på rheometer plattform og utføre testen ved å følge trinn 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klikk diagrammet, observere G', G " versus temperaturen. Finne crossover punkt G' og G ". Finne temperaturen crossover poenget.
      Merk: Dette er sol/gel overgang temperaturen på hydrogel forløperen.
    7. Gjenta trinn 2.4.15.
  6. Utføre en isotermiske gangen feie.
    1. Klikk mine apps og Finn og klikk malen isotermiske tid temperatur test. Klikk på trinn måling arbeidsflyten og deretter variabelen svinging belastningen, trekke opp oppsettvinduet satt svinging belastningen til 0,1%, og angi oscillation frekvensen til 1 Hz. I vinduet pull-up angi antall datapunkt til 120. Angi data samling frekvensen til 1 poeng/min.
      Merk: Verdien av denne belastningen er basert på resultatene fra den amplitude feie.
    2. Klikk Legg til for å legge til variabelen temperatur . Klikk variabel temperatur i vinduet midt og sett den til 25 ° C.
      1. Høyreklikk trinnet enheten flytte til målepunkt i arbeidsflyten, klikker du Slett. Klikk trinn enheten setteravkrysningen vente til verdien er nåddog sette verdien til 25 ° C. Klikk bilde, tittleog knapper på nederste skjermen, uncheck boksen Fortsett. Klikk trinn starter, navnet prosjektet og lagre den.
    3. Belaste prøven på rheometer plattformen og start testen ved å følge trinn 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Observere G', G " mot tiden. Finne crossover punkt G' og G ". Finne tid på krysset point. Når testen er ferdig, klikker du tabell, kopiere alle data og lime den inn i en tekstfil.
      Merk: Dette er sol/gel overgangstid hydrogel forløperen på 25 ° C.
  7. Måle avkastningen styrken til ulike gelling tider.
    1. Klikk mine apps og Finn og klikk malen avkastning og flyt stress, Gel-lignende. Navnet prosjektet. Klikk på trinn starter arbeidsflyten. Klikk Sett inn i menyen øverst og velg i rullegardinmenyen, vente. Trekke opp setup vinduet og angi ventetiden være 20 min.
      Merk: Dette vil legge litt venter før testene.
    2. Klikk Start, deretter klikker Sett inn igjen og, i rullegardinmenyen, velg enheten. Trekke opp setup vinduet, valgte temperatur, og sett den til 25 ° C. Fjern merket i boksen vente til verdien er nådd.
    3. Klikk på trinn måling i arbeidsflyten, velger du variabelen skjæring stress, trekke opp setup vinduet og satt det innledende og avsluttende skjæring stresset til 0 og 10 000 Pa, henholdsvis.  Klikk på Kalkulator, setter punkt tetthet til 0,2 poeng/Pa. I kategorien datapunkt til venstre angir du 1 poeng per sekund.
      Merk: Dette vil resultere i en stress gradvis rate på 5 Pa/s.
    4. Klikk kategorien hendelse control nederst i vinduet pull-up og angi stopp vilkåret: Stopp målingen hvis skjær rate > 100 s-1.
      Merk: Dette vil automatisk stoppe målingen hvis materialet er gitt.
    5. Belaste prøven på rheometer plattformen og start testen ved å følge trinn 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klikk Diagram. Observere belastning-stress kurven. Finne nedbøyning poenget med belastningen og tilsvarende stress. Gjenta 2.7.2 - 2.7.6, men endre ventetiden til 30, 40 og 50 min for hver replikere; Dette vil resultere i yield styrken til forskjellige gelling tider.
      Merk: Dette stress regnes som tilsynelatende gir styrke.
      Merk: programvare klikk kan variere rheometer modeller og programvareversjoner. Vi anbefaler lesere til å ta referanse av testing parametrene som vi gir, stund se håndboken til bestemte rheometer/programvare i praksis.
       

3. stillas Design, celle-laden Hydrogel og 3D-utskrift modeller

  1. Stillaset design
    1. Tegne en propell som modell på papir.
      Merk: Propell som modellen er designet basert på følgende betraktninger: (a) it simulerer i vivo scenariet der celler er omgitt av CAFs; (b) reduserer konsentrasjonen av stress via bruk av sirkulære geometrier; (c) det er fleksible slik at flere sektorer kan legges inn i modellen i fremtiden uten å endre eksisterende geometrier; (d) det er i den loddrette skalaen til rette næringsstoffer diffusjon.
    2. La midten av propellen være opprinnelsen og bruke symboler R0og R1 R2 representerer maksimal radius av indre sirkel, midterste sektorer og ytre sektorer, henholdsvis. Bruk symboler m og n representerer antall interne buer og eiker sektor området, henholdsvis.
    3. Beregn koordinatene for hver node på propell som modell og skrive dem i symbolsk uttrykk R0, R1, R2, mog n.
    4. Starte et program skript, angi R0, R1, R2, mog n som variabler og input symbolsk uttrykk for hver noden.
      Merk: Se Tabell for materiale for programvareinformasjon.
    5. Ordne en bane som kobler sammen nodene og tilordne en patron for den indre sirkelen, den midterste sektorer og ytre sektorene. Angi lagtykkelse 150 µm og antall lag skal 4.
    6. La programmet utgang en tekstfil i G-koden format som gjenkjennes av bioprinter.
    7. Angi R0 = 3,85, R1 = 6,85, R2 = 8.65, m = 2 og n = 5. Kjør skriptet og hente filen genererte G-koden. Kopier og lim inn filen i bioprinter egen mappe for G-koden.
    8. Slå på bioprinter og dens programvare. Initialisere skriveren. Åpne G-koden skriptet bare opprettet og satt alle presset til null. Tilbake til Kontrollprogramvaren, klikker du kategorien Scaffolder generator, og deretter på Kjør -knappen på høyre hjørne. Observer bevegelige banen til skriveren.
      Merk: Dette tester presisjonen for den genererte G-koden. Se Tabellen for materiale for informasjon knyttet til bioprinter.
    9. Dette trinnet er valgfritt. Bygge en demonstrativt 3D modell basert på parameterne ovenfor via dataassistert konstruksjon (CAD) programvare.
      Merk: Se Tabell for materiale for programvare leverandørinformasjonen.
  2. Gjøre en celle-laden A3G7 hydrogel forløper
    Merk: Trinnene i denne delen må utføres under sterile forhold. Hold bioprinter inne en BSC.
    1. Sterilisere bioprinter av sprøyting 70% etanol grundig og utsette det til UV lys over natten.
    2. Ta ut sprøyter hydrogel forløperen (på 4 ° C) og varme den i et vannbad ved 37 ° C i 1 time.
    3. Ta T-flasken celler (se trinn 1.3) fra CO2 inkubator og plassere den i en BSC. Forkaste kultur medium og skyll cellene med DPBS to ganger. Legge til en varmet trypsin-EDTA løsning (3.0 mL) og ruge cellene på 37 ° C i 6 min. Inactivate trypsin med samme volum av FBS. Telle celler med trypan blå analysen.
    4. Ta sprøyten av hydrogel forløperen i vannbad rengjøres og steriliseres med 70% etanol. Legg sprøyten i BSC.
    5. Extrude ca 3 mL hydrogel forløperen til 10 mL utskrift patron. Bland forløperen med MDA-MB-231-GFP celler på 1 x 106 celler/mL ved sakte pipettering, unngå produksjon av bobler. Dekk til tonerkassetten med sterilt slutten og beste landskamper og forsegle den med parafin film. Sentrifuge det 834 x g for 1 min å eliminere gass bobler produsert.
    6. Gjenta trinn 3.2.3 - 3.2.5 IMR-90-mCherry celle-laden forløperen og celle-fri forløperen.
    7. Sterilisere alle 3 patroner med 70% etanol, og deretter laste dem inn i kamrene i bioprinter. I skriverens programvare, sett kassetten temperaturen til 25 ° C. Vent 35 min å tillate forløperen til nå utskrivbar forhold.
      Merk: Denne gangen påvirker ikke levedyktigheten til cellene i hydrogel.
  3. 3D utskrift-modeller
    1. I skriverens programvare, utvide kategorien verktøy hodet i skriverens programvare, klikk på 1 kassett med det grafiske grensesnittet til venstre og deretter måle kort for å måle plasseringen av dysen spissen. Gjenta dette for de andre 2 patronene.
    2. Plasser en klar polystyren microplate, åpne filen G-koden, og endre presset til 200 kPa for alle patroner. Tilbake til Kontrollprogramvaren, klikker du kategorien Scaffolder generator, velge et punkt å begynne utskriften og deretter på Kjør -knappen på høyre hjørne. Gjenta dette trinnet for å få 3 mer gjentak.
    3. Når du skriver ut alle replikater propell modellene, legge en 100 mM CaCl2 løsning link modellene for 1 min og skyll den 2 x med DPBS å fjerne overflødig Ca++ ioner.
    4. Nøye overføre modellene på en agarose-belagt 6-vel plate ved hjelp av en slikkepott. Legge til 5 mL av DMEM media i hver brønn. Inkuber plater i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
      Merk: Kontroller at modellene er flytende i brønnene.
    5. Erstatte celle kultur medium med fersk medium hver tredje dag, kultur det 30 dager totalt.

4. levedyktighet og formet formasjon eksperimenter på Hydrogel diskene.

  1. Hydrogel disk forberedelse
    1. Gjenta trinn 3.2.1 - 3.2.6.
      Merk: Det er mulig å erstatte patronen med en liten sterile containeren.
    2. Bruk en steril uteksaminert 1 mL sprøyte og kuttet munnstykket for å opprette et stort hull i sprøyten (hullet har samme diameter som resten av sprøyte rør). Rengjøre den med 70% etanol og la den til den er tørr.
      Merk: Dette gjør i et sterilt BSC.
    3. Bruk vel-plate lokk, tilsett 100 mM CaCl2 til overflaten er dekket; så, ta på celle-laden hydrogel fylle sprøyten; extrude 100 µL bruker hengende slipp-metoden. La hydrogel for 1 min og skylle den med overdreven DPBS. Overføre hydrogel diskene på en agarose-belagt 6-vel plate, legge til 5 mL av basale DMEM og ruge dem på 37 ° C og 5% CO2 i opptil 30 dager. Oppdater medium hver tredje dag.
  2. Celle- og formet levedyktighet
    1. Bruk MTS analysen for å bestemme levedyktigheten cellen. Vask hver disk med DPBS og skjær den i 4 deler med fine sterilt blad. Samle deler av hele disken og overføre dem til en 96-brønns plate. Deretter legge 100 μL DMEM pluss 20 μL MTS reagens til hver brønn og ruge blandingen ved 37 ° C i 2 timer.
    2. Etter reaksjon MTS gjenopprette nedbryting og overføre den til en ren 96-brønns plate. Måle absorbansen prøvene på 490 nm.
  3. Formet formasjon
    1. Ta ut inkubert propeller eller disk modellen settefiskanlegg dager 0, 7, 15, 21 og 30 av kultur og overføre dem til en ren 6-vel plate.
    2. Bruk en AC confocal spinning disk invertert mikroskop for å visualisere spheroids og bildene bruke flere posisjoner og z-stabler. Bilde hvert propell, eller disk-modellen, langs vannrette diameter fra venstre til høyre med en 500 µm gap og skaffe en z-stabel fra bunnen til toppen fokalplanet på hver vannrette posisjon.
      Merk: Se Tabell for materiale for leverandørinformasjonen.
    3. Rekonstruere bildet med en maksimal stabel aritmetiske verktøyet, i programmet ImageJ, opprette 2D bildene som brukes for en spheroid analyse.

5. skanning elektronmikroskop (SEM)

  1. Forberede alginate/gelatin hydrogel som beskrevet i trinn 1.2.
    Merk: Sterile forhold er ikke nødvendig.
    FORSIKTIG: Flytende nitrogen og paraformaldehyde er farlig og må håndteres med forsiktighet.
  2. Sett 1 mL av hydrogel i en morter, legge til flytende nitrogen og male det med en støter. Fortsett å legge til flytende nitrogen å unngå hydrogel fra avriming. Overføre pulver til en 1,5 mL sentrifuge tube, forsegle den og lagre den på-80 ° C for 2 h. Freeze-dry utvalget for 24 timer.
  3. For spheroid bildebehandling, vask hydrogel forsiktig med DPBS 2 x, fastsette cellene av nedsenking i 4% paraformaldehyde i 30 min ved 37 ° C, og deretter skyll med DPBS og fryse dem med flytende nitrogen. Endelig freeze-dry utvalget for 24 timer.
  4. Analysere hydrogel/formet struktur og morfologi med en scanning elektron mikroskop (SEM) på 25.0 kV, under 70 Pa (kammer trykk) med en forstørrelse på 40 X opptil 5 000 X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den temperatur feie viser en tydelig forskjell av A3G7 forløperen ved 25 ° C og 37 ° C. Forløperen er flytende ved 37 ° C og har en kompleks viskositet 1938.1 ± 84.0 MPA x s, som er godkjent av en større G "over G'. Når temperaturen synker, gjennomgår forløperen fysiske gelation på grunn av den spontane fysiske sammenfiltring av gelatin molekyler i en tri-helix formasjon29,30. Begge G' og G "øke og samles i 30.6 ° C, som indikerer en sol-gel overgang. Moduli fortsetter å øke, med redusert temperatur, nå 468.5 ± 34,2 Pa av G' og 140.7 ± 9.3 Pa av G "ved 25 ° C (figur 1a). Basert på resultatene av den temperatur feie, valgte vi 25 ° C som utskrift temperaturen. Gelation kinetics eksperimentet simulerer temperatur endring som oppstår under eksempel forberedelse og håndtering (dvs., fjerne prøven fra 37 ° C vann bad og plassere den i 25 ° C bioprinter kammeret). G', G ", og | η * | øke med tiden ved lavere temperatur, og sol-gel overgangen skjer på ~ 17 min ved 25 ° C, når G' ≈ G "≈ 64.3 Pa og tap faktoren tilsvarer 1 (figur 1b og 1 c). Forløperen fortsetter å stive og når en utskrift vindu etter 50-90 min av gelation. Innenfor dette utskrift vinduet kan forløperen jevnt ekstrudert en G25 sylindriske munnstykke med et trykk på 200 kPa. Eksistensen av avkastning stress innebærer en solid-lignende oppførsel av materialet og hever den strukturelle integriteten etter byggesystemer tåle sin egen vekt31. Stress rampen gjenkjenner avkastning stress på ulike tider av gelation. Resultatene viser at avkastning stress øker med økende gelation tid. 50 min av gelation, avkastning stress når 325.9 Pa, sikre at modellen er stabil etter byggesystemer.

Utskrevne propell modellen er vist i figur 2a. AC confocal mikroskopi bekrefter første ekstrudering plasseringene til både MDA-MB-231-GFP og Havforskningen-90-mCherry cellene (figur 2b). MDA-MB-231-GFP cellene begynner å utvikle spheroids 15 dager i kultur perioden, etterfulgt av økt størrelse og antall spheroids inntil dag 30 (figur 2 c - 2f). Noen av Havforskningen-90-mCherry cellene også danne byområdene (figur 2 g - 2j). Merkbart, etter 30 dager av kultur, er IMR-90-mCherry celler observert i regionen først okkupert av MDA-MB-231-GFP cellene (figur 2f), antyde eventuell migrering hendelser i modellen. Likeledes kan overførte MDA-MB-231-GFP celler også observeres i regionen IMR-90-mCherry dominerte på dag 30 (figur 2j).

Disk modellen er vist i figur 3a. AC confocal mikroskopi bekrefter homogen celle fordelingen i disken (figur 3b). MDA-MB-231-GFP cellene oppfører seg på samme måte i disk modellen som de gjorde da skrives ut som en propell-modell. Representant bilder vises i Figur 3 c - 3f. SEM imaging avslører en MDA-MB-231-GFP spheroid-laden hydrogel etter 21 dager av kultur (figur 4a). Generasjon, og tilstedeværelse av spheroid valideres ved å sammenligne SEM bildene med celle-gratis hydrogels (figur 4b).

Cellen levedyktigheten til begge celletyper er vist i Figur 4 c. MDA-MB-231-GFP celler uttrykke en høyere celle levedyktighet sammenlignet IMR-90-mCherry celler. Interessant, forevise MDA-MB-231-GFP cellene en økt trend av levedyktighet før dag 15, med en tredobling av antall levedyktige cellers sammenlignet med dagen 0. Dette etterfølges av en nedgang på dag 21, før utvinne igjen på dag 30. Havforskningsinstituttet-90-mCherry cellene har derimot minimal svingninger i levedyktighet under hele kultur perioden. Synkende verdiene levedyktigheten til MDA-MB-231-GFP cellene på dag 21 tilsvarer en stor MTCSs formasjon, som har utviklet nekrotisk kjerner.

Figure 1
Figur 1: reologiske karakteristikk av hydrogel forløperen. (en) A temperatur feie viser sol-gel overgangen på 30.6 ° C. (ABC) The gelation kinetics av A3G7 forløperen viser en økning av G', G ", og | η*| på tidspunktet for gelation og sol-gel skjer overgangen omtrent 17 minutter på 25 ° C. (d) dette panelet viser avkastning stress forløper versus av gelation. En økning av avkastning stress er observert med lenger gelling tid. Resultatene vises i gjennomsnittlig ± SD, n≥ 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: MCTS formasjon i en 3D bioprinted i vitro modell IMR-90-mCherry myofibroblast og MDA-MB-231-GFP brystkreft celler. (en) disse bildene viser bioprinted i vitro prøven (venstre) og DAK-modellen (høyre). (b) representant AC confocal time-lapse bildet viser det MDA-MB-231-GFP (grønn) og Havforskningsinstituttet-90-mCherry (rød) celler bioprinted innenfor modellen. (c - f) Disse zoom-ins viser MDA-MB-231-GFP celle regioner (hvite stiplede bokser). (g - j) disse zoom-ins viser IMR-90-mCherry celle regioner (gul stiplede bokser). Skala barer er 2 mm i panelet 2aog 1 mm i panelet 2b500 µm i paneler 2 c - 2j for valgte områder, forstørrelsen er 10 X. Hovedstaden "D" i bildene betyr "dager kultur". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: MCTS formasjon i en 3D MDA-MB-231-GFP-laden hydrogel disk. (en) dette fotografiet viser en hydrogel disk. (b) dette representant AC confocal bildet viser MDA-MB-231-GFP celler i sammensatt. (c-f) Disse zoom-moduler Vis MDA-MB-231-GFP celle regionen (hvite stiplede boksen i panelet 3b) på (c) 0, (d) 7, (e) 15, og (f) 21 dager kultur. Skala barer er 2 mm i panelet 3a, 1 mm i panelet 3bog 500 µm i paneler 3 c - 3f for merkede områder, forstørrelsen er 10 X. Hovedstaden "D" i bildene betyr "dager kultur". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: morfologi og celle levedyktigheten til MTCSs. (en) denne SEM bildet viser en MDA-MB-231-GFP MCTS i gel etter 21 dager av kultur, viser liten MCTS (pil-spiss). (b) denne SEM bildet viser en alginate/gelatin hydrogel uten celler. Forstørrelsen er 350 X. (c) dette panelet viser cellen levedyktigheten til MDA-MB-231-GFP og Havforskningen-90-mCherry i 30 dager etter kultur innen hydrogel. Resultatene ble analysert som gjennomsnittlig ± SD og analysert statistisk ved hjelp av en toveis VARIANSANALYSE og en Bonferroni post-test. p (*) < 0,05, n ≥ 3. Dataene ble normalisert til celle tetthet brukes til å opprette prøvene dag 0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Celle-laden strukturer kan kompromitteres hvis forurensning (biologiske eller kjemiske) oppstår når som helst i prosessen. Vanligvis biologiske forurensning er sett etter to eller tre dager av kultur som en farge endring i kultur media eller bioprinted struktur. Derfor er sterilisering (fysisk og kjemisk desinfeksjon) et viktig skritt for alle celle-relaterte prosesser. Merke, autoklavering gelatin endrer gelling egenskaper, som gjorde det gel tregere i forsøkene vi gjennomførte. Derfor sterilisert vi alginate og gelatin strøm via UV eksponering. På grunn av den svært begrenset gjennomtrenging evnen UV lys, skal et meget tynt lag (< 0,5 mm) brukes. Konsentrasjonen av alginate og gelatin kan endres vilkårlig finjustere de mekaniske og biologiske egenskaper32. I den nåværende arbeidet valgte vi A3G7, fordi gir ønskelig om utskrift er mulig under utskrift vinduet og krysskoblet hydrogel gir en høy stabilitet gjennom 30-dagers eksperimentet. Oppvarming til 60 ° C mens oppløsende pulver til DPBS bidrar til å forbedre liquefication av, som letter omrøring. Også du kan bruke en lavere temperatur; men vil en lenger gripende tid deretter bli pålagt.

Den reologiske temperatur feie gir en sol-gel punkt på 30.6 ° C, som er kompatibel med andre publikasjoner33. Teoretisk sett, noen temperaturen høyere enn 30.6 ° C kan flytende forløperen. Vi valgte 37 ° C å forenkle arbeidet, celle kultur medium er forvarmes i et 37 ° C vannbad. Basert på gelation kinetics (før forløper geléer), er det ca 17 min for cellen blanding; etter denne tid er blanding cellene og hydrogel forløperen vanskelig på grunn av økt viskositet og moduli, forårsaker en ikke-homogene celle-laden bioink. Derfor foreslår vi håndterer celle-miksing arbeidet innen de første 10 min av gelling. Avkastning stress anses ikke å være et materiale attributt som påvirker om utskrift er mulig inntil nylig34; Uansett, har det vært mye anerkjent av polymer forskere som en markør av deigaktig/detaljert væske31,35,36,37. Eksistensen av avkastning stress bidrar til å bygge opp en strukturell integritet å tåle sin egen vekt. En høy avkastning stress kan også kreve en økt oppstart trykket i ekstrudering; Derfor kan dette resultere i skade til cellene på grunn av overdreven skjæring stress32. Modell gjengivelsen kan kompromitteres hvis ekstruderingsprosessen oppstår utenfor vinduet for optimal utskrift. Felles indikatorer problemet vises i siste bioprinted strukturen: det vil enten være for grovt eller for flytende på kantene. A3G7 forløperen utstillinger en optimal utskrift vindu under 50-90 min av gelling som tilfredsstiller både strukturell stabilitet og celle overlevelse, og kan brukes som medium å bygge heterogene svulst modeller14.

Den totale høyden til propell modellen er 600 µm slik det ble generert fra fire lag 150 µm filamenter. Denne utformingen gir næringsstoffer og gass utveksle celler er minst 300 µm fra overflaten å kontakte media under incubation. Høyere modeller er oppnåelig i fabrikasjon, men er bottlenecked på begrenset diffusjon avstanden av næringsstoffer i hydrogel38, som kan resultere i en lav celle overlevelse i regionen kjernen.

Forskjellige strategier har blitt utviklet til skjemaet MCTS i vitro, som hengende slipp, microfluidic chip, montering og bioprinting39. Noen av disse metodene kan imidlertid endre cellen fysiologi og biokjemi, generere ulike celle problemer som oppstår i vanlige tumor vev. For eksempel, hengende slipp-metoden styrker single celler opphold som cellen aggregater gjennom fysisk confinement40. Også kan kjemiske induksjon skjemaet MCTS av et peptid tillegg endre biokjemi spheroids41. Det hydrogel sammensatt beskrevet her kan en MCTS formasjon ved å opprette et biomimetic miljø uten eksterne stressfaktorer. (Mer enn 6 celler per spheroid), starter som godt spredt enkeltceller, etter 7 dager av kulturer, celler omorganisere som små MCTS og øker deres størrelse og antall i løpet av 30 dager av kultur.

I resultatene av denne forskningen fant vi at MDA-MB-231-GFP spheroids redusere celle levedyktighet på dag 21, samkjøre dette fenomenet med dannelsen av store spheroids. En solid svulst består av tre forskjellige lag, der den ytre lag presenterer en høy spredning hastighet i forhold til midten laget og interne nekrotisk eller senescent kjernen av spheroid18. Dette kan forklare levedyktighet nedgangen i resultatene.

Denne begrensninger av denne protokollen er (1) bioink dynamikk og (2) cellen type kompatibilitet. Bioink dynamics refererer til de varierende materialegenskaper under gelation prosessen, noe som resulterer i en optimal utskrift vinduet utover som trykte strukturen er defekt. Celle type kompatibilitet refererer til den manglende evne til visse celletyper (celle linje eller primære kultur) oppfører seg en innfødt i vivo .

A3G7-hydrogel oppnår en høy stabilitet og celle levedyktighet. 3D bioprinting kan brukes til å bygge 3D heterogene sykdom modeller med høy gjennomstrømming, lav pris og høy reproduserbarhet som et mer realistisk alternativ til tradisjonelle cellekultur og små dyr svulst modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Tao Jiang Takk Kina stipend råd (201403170354) og McGill Engineering doktorgrad Award (90025) for sine stipend midler. Jose G. Munguia-Lopez Takk CONACYT (250279, 290936 og 291168) og FRQNT (258421) om sine stipend midler. Salvador Flores-Torres Takk CONACYT for sine stipend midler (751540). Joseph M. Kinsella Takk National Science og Engineering Research Council, det kanadiske stiftelsen for innovasjon, Townshend-Lamarre Family Foundation og McGill University for deres finansiering. Vi vil gjerne takke Allen Ehrlicher for tillater oss å bruke sin rheometer, Dan Nicolau for å la oss bruke hans AC confocal mikroskop og Morag Park for å gi oss tilgang til fluorescently merket linjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433, (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7, (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15, (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244, (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116, (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25, (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34, (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20, (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7, (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33, (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4, (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34, (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6, (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1, (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32, (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32, (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35, (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13, (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49, (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49, (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. Wiley-Interscience. Hoboken, NJ. (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8, (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32, (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8, (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42, (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. Fluidity and plasticity. McGraw-Hill. New York, NY. (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53, (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33, (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18, (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506, (1-2), 148-157 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics