Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

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Bioengineering

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Summary

Hemos desarrollado un modelo de cáncer de mama heterogéneos consistiendo en las células fibroblastos y tumor inmortalizadas encajadas un bioink de alginato/gelatina de bioprintable. El modelo recoge el microambiente tumoral de en vivo y facilita la formación de esferoides multicelulares tumor, dando la penetración en los mecanismos de conducción tumorigenesis.

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Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

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Abstract

La heterogeneidad celular, bioquímica y Biofísica del microambiente tumoral nativo no es recapitulada por creciente líneas celulares de cáncer inmortalizadas mediante cultivo celular (2D) bidimensional convencional. Estos retos pueden superarse mediante técnicas de bioprinting para construir modelos de tumor heterogéneo de (3D) tridimensional por el que se encajan los diferentes tipos de células. Alginato y la gelatina son dos de los biomateriales más comunes empleados en bioprinting debido a su biocompatibilidad, biomimética y propiedades mecánicas. Mediante la combinación de dos polímeros, logramos un hidrogel compuesto de bioprintable con similitudes a la arquitectura microscópica de un tejido conectador tumoral nativo. Estudiamos la imprimibilidad de hidrogel compuesto por reología y obtiene la ventana de impresión óptima. Fibroblastos y las células de cáncer de mama fueron incrustados en los hidrogeles e impreso para formar un modelo 3D que mímico el microambiente en vivo . El modelo heterogéneo de bioprinted alcanza una alta viabilidad de cultivos celulares a largo plazo (> 30 días) y promueve el automontaje de las células de cáncer de mama en esferoides multicelulares tumor (MCTS). Se observan la migración y la interacción de las células de fibroblastos asociada al cáncer (CAF) con el MCTS en este modelo. Mediante el uso de plataformas de la cultura de célula bioprinted como sistemas de co-cultivo, ofrece una herramienta única para estudiar la dependencia de tumorigénesis de la composición del estroma. Esta técnica cuenta con un alto rendimiento, bajo costo y alta reproducibilidad, y también puede proporcionar un modelo alternativo a los cultivos de monocapa de celulares convencionales y modelos animales de tumor para el estudio de la biología del cáncer.

Introduction

Aunque cultivo celular 2D es ampliamente utilizado en la investigación del cáncer, existen limitaciones como se cultivan las células en forma de monocapa con una concentración uniforme de nutrientes y oxígeno. Estas culturas carecen de importante célula-célula y las interacciones célula-matriz presentan en el microambiente del tumor nativo (TME). En consecuencia, estos modelos mal recapitulan las condiciones fisiológicas, lo que resulta en comportamientos aberrantes de la célula, incluyendo morfologías antinaturales, organización irregular del receptor, polarización de la membrana y expresión de genes anormales, entre otros condiciones1,2,3,4. Por otra parte, cultivo celular 3D, donde las células se expanden en un espacio volumétrico como agregados, esferoides, organoides, ofrece una técnica alternativa para crear ambientes en vitro más precisas para estudiar la fisiología y biología de la célula fundamental. Modelos de cultura celular 3D también pueden fomentar las interacciones célula-ECM que son la fundamentales características fisiológicas de los TME nativo en vitrode4,1,5. La tecnología emergente de bioprinting 3D ofrece posibilidades para construir modelos que imitan el TME heterogéneo.

Bioprinting 3D se deriva de prototipado rápido y permite la fabricación de microestructuras 3D que son capaces de imitar algunas de las complejidades de la vida tejido muestras6,7. Los métodos actuales de bioprinting incluyen chorro de tinta, extrusión y asistida por láser impresión8. Entre ellos, el método de extrusión permite la heterogeneidad a ser controlada dentro de las matrices impresas colocando precisamente distintos tipos de materiales en diferentes lugares iniciales. Por lo tanto, es el mejor enfoque para fabricar heterogéneos en vitro modelos que involucran a múltiples tipos de células o matrices. Bioprinting de extrusión se ha utilizado con éxito para construir andamios forma auricular9,11,de10,12de estructuras vasculares y tejidos13, resultando en la célula y alta fidelidad de impresión de la piel viabilidad. La tecnología también ofrece selecciones de material versátiles, la capacidad de depósito de materiales con células con una densidad conocida y alta reproducibilidad14,15,16,17 . Hidrogeles naturales y sintéticos se utilizan con frecuencia como bioinks para 3D bioprinting debido a su biocompatibilidad, bioactividad y sus redes hidrofílicos que pueden ser diseñados para parecerse estructuralmente a la ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Los hidrogeles también son ventajosos ya que pueden incluir sitios de adhesivo para las células, elementos estructurales, permeabilidad de gases y nutrientes, y las adecuadas propiedades mecánicas a la célula de desarrollo24. Por ejemplo, hidrogeles de colágeno ofrecen integrina sitios de anclaje que las células pueden utilizar para atar a la matriz. Gelatina, colágeno desnaturalizado, conserva sitios de adherencia de células similares. En contraste, el alginato es bioinert pero proporciona integridad mecánica mediante la formación de reticulaciones con iones divalentes25,26,27,28.

En este trabajo, hemos desarrollado un hidrogel compuesto como un bioink, compuesto de alginato y gelatina, con similitudes a la arquitectura microscópica de un tejido conectador tumoral nativo. Fibroblastos y las células de cáncer de mama fueron encajados en los hidrogeles e impresión por medio de una bioprinter basada en la extrusión para crear un modelo 3D que imita el microambiente en vivo . El entorno 3D ingeniería permite las células cancerosas para formar esferoides multicelulares tumor (MCTS) con una alta viabilidad por largos períodos de cultivo celular (> 30 días). Este protocolo muestra las metodologías de síntesis de hidrogeles compuestos, caracterización de la microestructura e impresión, bioprinting celular modelos heterogéneos, los materiales y observar la formación de MCTS. Estas metodologías se pueden aplicar a otros bioinks en bioprinting de extrusión así como diversos diseños de modelos de tejido heterogéneo con potenciales aplicaciones en detección de drogas, ensayos de migración de la célula y estudios que se centran en la célula fundamental funciones fisiológicas.

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Protocol

1. preparación de los materiales, hidrogel y materiales de la cultura de célula

  1. Preparación de material y la solución
    1. Lavar y secar 250 mL y vasos de precipitado de 100 mL vidrio, agitadores magnéticos, espátulas, cartuchos de 10 mL, boquillas cilíndricas 25 G (0.5 en) y un diámetro interno de 250 μm. Esterilice en autoclave los los materiales ellos a 121 ° C/15 min/1 ATM no los materiales bajo condiciones estériles hasta su uso.
      Nota: Consulte la Tabla de materiales para la información del vendedor.
    2. Pesar 3 g de alginato (3% w/v) y 7 g de gelatina (7% w/v) (denotado como A3G7 en adelante).
    3. Esterilizar los siguientes elementos bajo UV luz para por lo menos 4 h: alginato y gelatina polvos, película de parafina, pedazos de papel de aluminio de 5 cm2y 1 mL y jeringas de 5 mL. Esterilizar las tapas, tapas de las puntas y pistones por inmersión en etanol al 70% durante al menos 4 h y lavarlas 2 x con agua ultra puro estéril.
      Nota: Consulte la Tabla de materiales para la información del vendedor.
    4. Disolver 4 g de agarosa ultra pura agua y esterilizar en autoclave.
      Nota: La agarosa se disuelve completamente después del proceso de esterilización en autoclave.
    5. Preparar una solución de 100 mM de cloruro de calcio anhidro (CaCl2) en agua ultrapura estéril y un filtro estéril (con un tamaño de poro de 0,22 μm) antes de su uso.
    6. Para placas de 6 pozo revestido de agarosa, fundir la agarosa estéril en el microondas para obtener una solución líquida; entonces, debajo de un gabinete de seguridad biológica (BSC) y utilizando una micropipeta de 1 mL, añadir 2 mL por pozo y se mezcla suavemente para crear una capa uniforme en el fondo del pozo. Dejar enfriar y sellar el pozo con la película de parafina. Mantener a temperatura ambiente (RT) hasta su uso.
  2. Preparación del precursor del hidrogel de A3G7
    1. Mezclar 3 g de alginato y 7 g de polvos de gelatina en un vaso de precipitados de 250 mL dentro de un BSC. Añadir un agitador magnético y 100 mL de DPBS. Sellar el recipiente con parafina estéril película de papel y de aluminio (5 cm2) para evitar la contaminación.
    2. Disolver los polvos en una agitación constante en un plato magnético caliente con 600 rpm a 60 ° C por 1 h y RT para un extra de 2 h.
    3. Calentar el material a 37 ° C hasta que el gel somete a una transición de fase al estado líquido (para 100 mL de solución stock de gel, esto toma aproximadamente 45 minutos). Transferir la solución a tubos de centrífuga cónico de 50 mL estéril, sellarlas y centrifugar los tubos a 834 x g durante 5 min eliminar las burbujas de gas del material.
    4. Aspire el precursor de hidrogel en jeringas de 10 mL. Sello de las jeringas con los casquillos y la película de parafina. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
  3. Cultivo de células
    Nota: Los pasos de esta sección deben realizarse en condiciones estériles.
    1. Preparar el medio DMEM basal como sigue (1 L): en un BSC, mezclar 100 mL de suero bovino fetal (FBS) más 10 mL de una solución de antibiótico/antimicótico (100 x solución estabilizada) en un recipiente estéril fresco. Añadir medio DMEM para ajustar la mezcla hasta 1.000 mL. Sellar el recipiente y mantenerla a 4 ° C.
    2. En un baño de agua previamente precalentado (37 ° C), 1 frasco de MDA-MB-231-GFP (línea de células de cáncer de mama humano localización marcada con GFP, nuclear) y 1 frasco de IMR-90-mCherry (asociada con el cáncer del fibroblasto líneas celulares etiquetado mCherry, con localización citoplásmica de descongelación ) las células desde el almacenamiento de nitrógeno líquido moviendo suavemente en el agua. Líneas celulares y la plásmidos para la GFP y etiquetado mCherry, están disponible en el mercado.
    3. Transferencia de 160 μL/pocillo de solución celular (3 x 106 células/mL) en una placa de 6 pozos y añadir 5 mL de medio DMEM basal precalentado (37 ° C). Incubar la placa a 37 °C/5% CO2 durante 24-48 h hasta que las células alcanzan el 80% de confluencia.
    4. Después de que las células alcanzan confluencia, deseche el medio y enjuague las células dos veces con DPBS; Incubar las células con 500 μl de solución de tripsina-EDTA/pozo (0.25%, 1 x, calentado previamente a 37 ° C) a 37 ° C durante 6 minutos. Luego, desactivar la tripsina por agregar 500 μl de FBS, recuperar la solución celular y transferir a matraces T-75. Incúbelos otra vez a 37 °C/5% CO2 de las células hasta el 80% de confluencia.
      Nota: El volumen de solución de tripsina-EDTA puede variar dependiendo de la nave de crecimiento de la célula.
    5. Repita el paso anterior para trabajar con células en el paso 3-4 es cuando las células tienen más actividad metabólica y la estabilidad.
    6. Contar las células usando un análisis de azul de tripán (0.4%) para determinar la concentración inicial de células que se mezcla con el hidrogel.

2. medición de propiedades reológicas de los hidrogeles

  1. Preparar el precursor del hidrogel de alginato/gelatina como se describe en el paso 1.2.
    Nota: Las condiciones de esterilidad no son necesarias para muestras generadas para ensayos mecánicos y análisis. Todas las pruebas reológicas se realizan por triplicado.
  2. Tome una jeringa del precursor del hidrogel y calentar en baño de agua de 37 ° C durante 1 hora.
  3. Encienda el Reómetro e inicializar el sistema de acuerdo a los siguientes pasos.
    1. Encender el compresor de aire conectado con el Reómetro y deje que el compresor de aire para 30 minutos encendido y la caja de control de temperatura para el Reómetro, encienda el Reómetro de sí mismo y encender el ordenador conectado con el Reómetro.
    2. Abra el software del reómetro para, haga clic en iniciar en el panel de control y dejar que el proceso de inicialización final. Ajuste la temperatura de la plataforma a 37 ° C en el panel de control.
    3. Haga clic en la pestaña de sistema de medición y desplácese hasta la función de servicio, seleccionar la inercia del conductor de ajuste en el menú desplegable y haga clic en Inicio de ajuste en la ventana emergente.
    4. Monte un paralelo herramienta en el Reómetro de medición. Todos los experimentos realizados aquí utilizan una placa de 25 mm de diámetro con una separación de 1 mm entre las placas.
    5. Haga clic en Set zero-gap en el panel de control y esperar a que el procedimiento termine. Preste atención a la fuerza normal durante este proceso.
      Nota: Después de este procedimiento, la fuerza normal debe ser 0.
    6. Haga clic en la pestaña de sistema de medición y desplácese hasta la función de servicio, seleccione inercia de sistema de medición superior de ajustey haga clic en Inicio de ajuste en la ventana emergente. Una vez hecho esto, haga clic en el botón de triángulo en el panel de control para permitir el aparato de medición subir.
  4. Realizar un barrido de amplitud.
    1. Haga clic en Inicio, luego haga clic en Insertar en el menú principal, seleccione esperar desde el menú desplegable. Tire hacia arriba de la ventana de configuración y configurar el tiempo de espera a 2 h.
      Nota: Esto agregará un paso espera antes de las pruebas.
    2. Haga clic en Inicio, haga clic en el botón Insertar otra vez y en el menú desplegable, seleccione dispositivo. Tire hacia arriba de la ventana de configuración, elegir temperaturay ponerlo a 25 ° C. Desmarque la casilla de espere hasta alcanza el valor.
    3. Haga clic en el paso de medición, haga clic en la variable tensión de oscilación, tire hacia arriba de la ventana de configuración, perfil que logaritmo de rampay cambie el valor de 0,001% y el 100% como la cepa inicial y tensión final, respectivamente. Ajuste la frecuencia de 0,01 Hz.
    4. Haga clic en el botón Agregar para añadir la variable de temperatura . Haga clic en la variable temperatura y ponerlo a 25 ° C. En la ventana de pull-up, ampliar calculadora, densidad de punto 10 puntos/década.
    5. Tome la jeringa en el baño de agua y extraer aproximadamente 0,5 mL del precursor en la plataforma de reómetro.
    6. Haga clic en el triángulo hacia abajo el botón del panel de control. Espere a que el aparato de medición mover hacia abajo a la posición de corte.
    7. Use una espátula para recortar cualquier exceso precursores que escaparon en el borde de la herramienta de medición y desechar el material sobrante.
    8. Pipeta de aceite mineral sobre el borde de la herramienta de medición y espere hasta que el aceite sella completamente el límite.
    9. En el panel de control, haga clic en continuar . Haga clic en el botón Start (triángulo verde), seguido de clic en continuar en la pantalla inferior.
    10. Cuando se realiza la prueba, libere la herramienta de medición y haga clic en el triángulo hacia arriba el botón en el panel de control. Retire la herramienta de medición y limpiar con etanol al 70%. Limpiar la plataforma con etanol al 70%.
    11. En el proyecto actual, haga clic en el paso de medición y tire hacia arriba de la ventana Configuración. Ahora, conjunto la frecuencia a 100 Hz. Mantenga todos los demás parámetros sin cambios.
    12. Repita los pasos 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Haga clic en Diagrama. Observar la curva de G', G " frente a la cepa de oscilación. Encontrar los puntos de deflexión de G' para ambas frecuencias (0,01 Hz y 100 Hz). Encuentra las cepas correspondientes de la oscilación de dos puntos de desviación.
    14. Elige la menor tensión de oscilación y 1/10 de esta variedad para todas las pruebas de oscilación realizadas después.
      Nota: El inicio de la G' desviación se considera la deformación última del lineal elástico (ULES) que no debe ser excedido en exámenes de control. La relación 1/10 se utiliza generalmente en la ingeniería por razones de seguridad. Esto calcula la tensión es denotada como gC.
    15. Después de la prueba, haga clic en tabla, copiar todos los datos y pegar en un archivo de texto.
  5. Realizar un barrido de temperatura.
    1. Haga clic en mis aplicaciones y seleccione la plantilla rampa de temperatura, cizalla oscilatoria: gelificación.
    2. Nombre del proyecto.
    3. Haga clic en el paso de medición del flujo de trabajo. Haga clic en la variable temperatura, tire hacia arriba de la ventana de configuración y seleccione la temperatura inicial y final para ser 37 ° C y 25 ° C, respectivamente.
    4. En la ventana de pull-up, ajustar tensión de oscilación a 0.1%, la frecuencia de oscilación a 1Hz. Luego establecer el número de puntos de datos a ser 61. Establece la frecuencia de recogida de datos a 1 punto/min haga clic en calculadora y punto densidad en 0,2 ° C/punto.
      Nota: Esto permitirá que la temperatura a la cambio a una tasa de 0,2 ° C/min.
    5. Cargar la muestra en la plataforma del reómetro y efectuar la prueba, siguiendo los pasos 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Haga clic en Diagrama, observar el G', G " frente a la temperatura. Encontrar el punto de cruce de G' y G ". Encontrar la temperatura en el punto de cruce.
      Nota: Esta es la temperatura de transición sol/gel del precursor del hidrogel.
    7. Repita el paso 2.4.15.
  6. Realizar un barrido de tiempo isotérmico.
    1. Mis aplicaciones , haga clic en buscar y haga clic en la plantilla de prueba isotérmica temperatura y tiempo. Haga clic en el paso de medición del flujo de trabajo y a continuación, haga clic en la variable tensión de oscilación, tire hacia arriba de la ventana de configuración, establecer que la cepa de oscilación a 0.1% y la frecuencia de oscilación a 1 Hz. En la ventana de pull-up, establezca el número de puntos de datos a 120. Establecer la frecuencia de recogida de datos a 1 punto/min.
      Nota: El valor de esta tensión se basa en los resultados del barrido de amplitud.
    2. Haga clic en el botón Agregar para añadir la variable de temperatura . Haga clic en la variable temperatura en la ventana media y situado a 25 ° C.
      1. Haga clic con el botón derecho el paso dispositivo mover al punto de medición del flujo de trabajo, haga clic en eliminar. Haga clic en el que dispositivo de ajustede paso, desmarque la casilla espere hasta alcanza el valory establecer el valor a 25 ° C. Haga clic en la imagen, título, botones en la pantalla inferior, desmarque la casilla continuar. Haga clic en el paso de Inicio, nombre del proyecto y guárdelo.
    3. Cargar la muestra en la plataforma del reómetro y comenzar la prueba siguiendo los pasos 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Observar el G', G " versus el tiempo. Encontrar el punto de cruce de G' y G ". Encontrar el tiempo en el punto de cruce. Después de la prueba, haga clic en tabla, copiar todos los datos y pegar en un archivo de texto.
      Nota: Este es el tiempo de transición sol/gel del precursor del hidrogel a 25 ° C.
  7. Medir la fuerza de la producción en varias ocasiones gelificantes.
    1. Mis aplicaciones , haga clic en buscar y haga clic en la plantilla estrés de rendimiento y caudal, Gel-like. Nombre del proyecto. Haga clic en el paso Start del flujo de trabajo. Haga clic en Insertar en el menú superior y, en el menú desplegable, seleccione esperar. Tire hacia arriba de la ventana de configuración y configurar el tiempo de espera a 20 minutos.
      Nota: Esto agregará un paso espera antes de las pruebas.
    2. Haga clic en Inicio, luego haga clic en Insertar otra vez y, en el menú desplegable, seleccione dispositivo. Tire hacia arriba de la ventana Configuración, eligió la temperatura y ajuste a 25 ° C. Desmarque la casilla espere hasta alcanza el valor.
    3. Haga clic en el paso de medición del flujo de trabajo, seleccione la variable tensión de esquileo, tire hacia arriba de la ventana de configuración y configurar el esfuerzo cortante inicial y final en Pa 0 y 10.000, respectivamente.  Haga clic en calculadora, la densidad de punto a punto 0.2/PA. En la pestaña de puntos de datos a la izquierda, puso 1 punto por segundo.
      Nota: esto resultará en una tasa de rampa de tensión de 5 Pa/s.
    4. Haga clic en la ficha de control de eventos en la parte inferior de la ventana de pull-up y establecer el criterio de parada: parada la medición Si la cizalla velocidad > 100 s-1.
      Nota: Esto detendrá automáticamente la medición Si se cede el material.
    5. Cargar la muestra en la plataforma del reómetro y comenzar la prueba siguiendo los pasos 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Haga clic en Diagrama. Observar la curva de tensión-estrés. Encontrar el punto de deflexión de la tensión y su correspondiente tensión. Repita los pasos 2.7.2 - 2.7.6, pero cambiar el tiempo de espera a 30, 40 y 50 minutos para cada repetición; Esto dará lugar a la fuerza de la producción a diferentes tiempos de gelificación.
      Nota: Esta tensión es considerada como la fuerza de la producción aparente.
      Nota: software clicks pueden diferenciarse mediante reómetro modelos y versiones de software. Recomendamos a los lectores a tomar referencia de los parámetros de prueba que ofrecemos, mientras que consulte el manual del software o reómetro en uso práctico.
       

3. diseño, cargado de celular hidrogel e impresión 3D modelos de andamios

  1. Diseño de andamios
    1. Dibujar un modelo de propulsor-como en papel.
      Nota: El modelo de propulsor-como está diseñado en base a las siguientes consideraciones: (a) it simula el escenario en vivo donde las células cancerosas están rodeadas de cafés; (b) se reduce al mínimo la concentración de estrés mediante el uso de geometrías circulares; (c) es flexible para que más sectores se pueden agregar en el modelo en el futuro sin cambiar las geometrías existentes; y (d) es plana en su escala vertical para facilitar la difusión de nutrientes.
    2. Sea el centro de la hélice el origen y utilice los símbolos R0 R1y R2 para representar el radio máximo del círculo interno, sectores medios y los sectores externos, respectivamente. Utilice los símbolos m y n para representar el número de arcos internos y rayos dentro del área del sector, respectivamente.
    3. Calcular las coordenadas de cada nodo en el modelo de propulsor-como y escribir en las expresiones simbólicas de R0 R1, R2, my n.
    4. Iniciar un programa script, establecer R0 R1, R2, my n como variables y la expresión simbólica de cada nodo clave de entrada.
      Nota: Consulte la Tabla de materiales para cualquier software.
    5. Organizar una ruta que conecta los nodos y asignar un cartucho para el círculo interno, los sectores medios y los sectores externos. Ajustar el espesor de la capa 150 μm y el número de capas que 4.
    6. Deje que el programa de salida de un archivo de texto en formato de código de G que es reconocible por la bioprinter.
    7. Conjunto R0 = 3,85, R1 = 6.85, R2 = 8.65, m = 2 y n = 5. Ejecute el script y recuperar el archivo de código G generado. Copiar y pegar el archivo a la carpeta de código de G dedicado de bioprinter.
    8. Encienda la bioprinter y su software de control. Inicializar la impresora. Abra la secuencia de comandos G-code sólo crea y establece todas las presiones a cero. Volver al software de control, haga clic en la ficha generador Scaffoldery haga clic en el botón Ejecutar en la esquina inferior derecha. Observar la trayectoria móvil de la impresora.
      Nota: Esto pondrá a prueba la precisión del código G generado. Consulte la Tabla de materiales para la información relacionados con la bioprinter.
    9. Este paso es opcional. Construir un modelo 3D demostrativos basado en los parámetros sobre vía software de diseño asistido por ordenador (CAD).
      Nota: Consulte la Tabla de materiales para la información de software de proveedor.
  2. Hacer un precursor de hidrogel de A3G7 cargados de celular
    Nota: Los pasos de esta sección deben realizarse en condiciones estériles. Mantenga el bioprinter dentro de un BSC.
    1. Esterilizar el bioprinter rociando bien etanol al 70% y exponerlo a la luz UV durante la noche.
    2. Saque una jeringa del precursor del hidrogel (a 4 ° C) y caliente en un baño de agua a 37 ° C durante 1 h.
    3. Tomar el frasco de T con las células (véase el paso 1.3) del CO2 la incubadora y coloque dentro de un BSC. Descartar el medio de cultivo y enjuague dos veces las células con DPBS. Agregar una solución de tripsina-EDTA calentado (3,0 mL) e incubar a las células a 37 ° C durante 6 minutos Inactivate la tripsina con un mismo volumen de FBS. Contar las células usando análisis de azul de tripano.
    4. Tomar la jeringa del precursor del hidrogel del baño, limpiar y esterilizar con etanol al 70%. Coloque la jeringa en el BSC.
    5. Saca aproximadamente 3 mL de hidrogel precursor en un cartucho de impresión de 10 mL. Mezcla del precursor con las células MDA-MB-231-GFP en 1 x 106 células/mL transfiriendo lentamente, evitando la producción de burbujas. Cubra el cartucho con el extremo estéril y tapas superior y selle con la película de parafina. Centrifugue a 834 x g durante 1 min eliminar las burbujas de gas producidas.
    6. Repita los pasos 3.2.3 - 3.2.5 para IMR-90-mCherry cargados de celular precursor y los precursores sin células.
    7. Esterilizar todos los 3 cartuchos con etanol al 70% y luego los carga en los compartimientos de la bioprinter. En software de control de la impresora, ajuste la temperatura del cartucho a 25 ° C. Esperar 35 minutos para permitir que el precursor alcanzar condiciones para imprimir.
      Nota: Esta vez no afecta a la viabilidad de las células en el hidrogel.
  3. Modelos de impresión 3D
    1. En software de control de la impresora, ampliar la ficha cabeza de la herramienta de software de control de la impresora, haga clic en 1 cartucho en la interfaz gráfica a la izquierda y haga clic en el botón de medida corta para medir la posición de la punta de la boquilla. Repetir este proceso para los otros 2 cartuchos.
    2. Coloque una microplaca de poliestireno claro, abra el archivo de código de G y cambiar la presión a 200 kPa para los cartuchos. Volver al software de control, haga clic en la ficha generador Scaffolder, seleccione un punto para comenzar la impresión y haga clic en el botón Ejecutar en la esquina inferior derecha. Repita este paso para que se haz 3 repeticiones más.
    3. Después de imprimir todas las réplicas de los modelos de hélice, agregar una solución de CaCl2 enlazará los modelos durante 1 min y enjuague de 100 mM x 2 con DPBS para retirar el exceso de iones Ca++ .
    4. Cuidadosamente transfiera los modelos sobre una placa de 6 pozos agarosa recubiertas con una espátula. Añadir 5 mL de medio DMEM a cada pocillo. Incubar las placas en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
      Nota: Asegúrese de que los modelos son flotantes en los pozos.
    5. Reemplazar el medio de cultivo celular con medio fresco cada 3 días, cultura por 30 días en total.

4. viabilidad y experimentos de formación esferoide en los discos de hidrogel.

  1. Preparación de disco de hidrogel
    1. Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.6.
      Nota: Es posible sustituir el cartucho con un pequeño recipiente estéril.
    2. Utilice una jeringa graduada estéril 1 mL y la boquilla para crear un gran orificio en la jeringa (el agujero tiene el mismo diámetro que el resto del tubo de la jeringa). Limpiar con etanol al 70% y dejar que se seque.
      Nota: Hacer esto en un BSC estéril.
    3. Use una tapa de placa de la pozo, añada 100 mM CaCl2 hasta cubre la superficie; Luego, tomar el hidrogel cargadas de célula para llenar la jeringa; saca 100 μL usando el colgador método de la gota. Deja el hidrogel durante 1 min y enjuague con DPBS excesiva. Transferencia de los discos de hidrogel sobre una placa de agarosa-cubierta 6-bien, añadir 5 mL de DMEM basal e incúbelos a 37 ° C y 5% CO2 para un máximo de 30 días. Actualizar el medio cada 3 días.
  2. Viabilidad celular y esferoide
    1. Utilice un ensayo MTS para determinar la viabilidad de las células. Cada disco con DPBS de lavar y cortar en 4 partes con una fina cuchilla estéril. Recoger las piezas del disco entero y transferirlas a una placa de 96 pocillos. Luego, añadir 100 μL de DMEM plus 20 μL del reactivo MTS a cada pocillo e incubar la mezcla a 37 ° C por 2 h.
    2. Después de la reacción de MTS, recuperar el sobrenadante y transferir a una placa de 96 pocillos limpia. Medir la absorbancia de las muestras a 490 nm.
  3. Formación esferoide
    1. Sacar el modelo de hélice o disco incubado de la incubadora a los días 0, 7, 15, 21 y 30 de la cultura y transferirlas a una placa limpia bien de 6.
    2. Uso un disco de giro confocal invertido microscopio para visualizar los esferoides y adquirir las imágenes con múltiples posiciones y pilas de z. Cada propulsor, o modelo de disco, a lo largo de su diámetro horizontal de izquierda a derecha con un boquete de 500 μm y adquirir una pila z desde la parte inferior a la superior plano focal en cada posición horizontal de la imagen.
      Nota: Consulte la Tabla de materiales para la información del vendedor.
    3. Reconstruir la imagen utilizando una herramienta aritmética máximo, proporcionada por el programa ImageJ, para crear las imágenes 2D utilizadas para el análisis de un esferoide.

5. microscopía electrónica (SEM)

  1. Preparar el gelatina/alginato hidrogel como se describe en el paso 1.2.
    Nota: Las condiciones de esterilidad no son necesarias.
    PRECAUCIÓN: Paraformaldehido y nitrógeno líquido son peligrosos y deben manejarse con cuidado.
  2. Poner 1 mL de hidrogel en un mortero, agregar nitrógeno líquido y moler con un mortero. Seguir añadiendo nitrógeno líquido para evitar el hidrogel de descongelación. Transferir el polvo en un tubo de centrífuga 1.5ml, sellar y almacenar a-80 ° C por 2 h. por congelación en la muestra durante 24 horas.
  3. Imagen del esferoide, lave el hidrogel con DPBS 2 x, fijar las células mediante la inmersión en paraformaldehído al 4% durante 30 min a 37 ° C y luego enjuague con DPBS y congelarlas con nitrógeno líquido. Por último, secado por congelación la muestra durante 24 horas.
  4. Analizar la estructura del hidrogel/esferoide y morfología con un microscopio electrónico de barrido (SEM) a 25.0 kV, debajo de 70 Pa (presión) con un aumento de 40 X 5, 000 X.

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Representative Results

El barrido de temperatura muestra una clara diferencia del precursor del A3G7 a 25 ° C y 37 ° C. El precursor es líquido a 37 ° C y tiene una viscosidad compleja de 1938.1 mPa ± 84,0 x s, que es validado por un G mayor "sobre G'. A medida que la temperatura disminuye, el precursor somete a congelación física debido al enredo físico espontáneo de las moléculas de gelatina en un tri-helix formación29,30. Tanto el G' y el G "aumentar y convergen a 30,6 ° C, indicando una transición sol-gel. Los módulos continúan aumentando, con menor temperatura, llegando a 468.5 ± 34.2 Pa de G' y 140.7 ± 9.3 Pa de G "a 25 ° C (Figura 1a). Basándose en los resultados del barrido de temperatura, escogimos a 25 ° C como la temperatura de impresión. El experimento de cinética de gelificación simula el cambio de temperatura que se produce durante la preparación de muestras y manipulación (es decir, remover la muestra de 37 ° C agua baño y colocarlo en la cámara de bioprinter de 25 ° C). G', G ", y | η * | aumentar con el tiempo la temperatura baja, y la transición solgel sucede en ~ 17 min a 25 ° C, cuando G' ≈ G "≈ 64.3 Pa y el factor de pérdida es igual a 1 (Figura 1b y 1C). El precursor sigue endurece y llega a una ventana de impresión después de 50-90 min de gelificación. Dentro de esta ventana de impresión, el precursor puede suavemente sacar usando una boquilla cilíndrica del G25 con una presión de 200 kPa. La existencia de tensión de producción implica un comportamiento sólido-como del material y aumenta la integridad estructural después de la extrusión para soportar su propio peso31. La rampa de tensión reconoce la tensión de producción en diferentes momentos de la gelificación. Los resultados muestran que la tensión de producción aumenta con el aumento tiempo de gelificación. En el minuto 50 de gelificación, la tensión de producción alcanza 325.9 Pa, asegurando que el modelo es estable después de la extrusión.

El modelo de hélice impreso se muestra en la Figura 2a. La microscopia confocal confirma la ubicación de extrusión inicial de MDA-MB-231-GFP y las células de IMR-90-mCherry (figura 2b). Las células MDA-MB-231-GFP se empiezan a desarrollar esferoides 15 días en el período de cultivo, seguido del aumento en el tamaño y números de esferoides hasta el día 30 (figura 2C - 2f). Algunas de las células de IMR-90-mCherry también forman aglomeraciones (figura 2 g - 2j). Notablemente, después de 30 días de la cultura, IMR-90-mCherry células se observan en la región ocupada inicialmente por las células MDA-MB-231-GFP (figura 2f), lo que implica eventos de posible migración en el modelo. Asimismo, migrados de las células MDA-MB-231-GFP también se observan en la región de IMR-90-mCherry dominado el día 30 (figura 2j).

El modelo de disco se muestra en la figura 3a. La microscopia confocal confirma la distribución homogénea de la célula dentro de la disco (figura 3b). Las células MDA-MB-231-GFP se comportan semejantemente en el modelo de disco como lo hicieron cuando se imprime como un modelo de hélice. Imágenes representativas se muestran en la figura 3 c - 3f. Proyección de imagen de SEM revela un hidrogel cargadas de esferoide MDA-MB-231-GFP después de 21 días de cultivo (figura 4a). La generación y presencia de la esferoide es validado mediante la comparación de las imágenes de SEM con hidrogeles sin células (Figura 4b).

La viabilidad de las células de ambos tipos celulares se demuestra en la figura 4C. Las células MDA-MB-231-GFP expresan una mayor viabilidad de las células en comparación con las células de IMR-90-mCherry. Curiosamente, las células MDA-MB-231-GFP exhiben una tendencia creciente de viabilidad antes del día 15, con una triplicación del número de células viables en comparación con el día 0. Esto es seguido por una disminución en el día 21, antes de recuperar otra vez el día 30. En contraste, las células de IMR-90-mCherry tienen fluctuaciones mínimas de viabilidad durante la totalidad del período de la cultura. Los valores de disminución en la viabilidad de las células MDA-MB-231-GFP en día 21 corresponden a una gran formación de MTCSs, que ha desarrollado núcleos necróticos.

Figure 1
Figura 1: caracterización reológica del precursor del hidrogel. (a) A barrido de temperatura muestra la transición de sol-gel a 30,6 ° C. (b-c) La cinética de gelificación del precursor del A3G7 muestra un aumento de G', G ", y | η*| en el tiempo de gelificación y el sol-gel transición sucede en aproximadamente 17 minutos a 25 ° C. (d) este panel muestra la tensión de producción del precursor versus el tiempo de gelificación. Se observa un aumento de la tensión de producción con un tiempo de gelificación ya. Los resultados se muestran en medias ± SD, n≥ 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Formación de MCTS dentro de un modelo in vitro de bioprinted 3D de IMR-90-mCherry miofibroblastos y las células de cáncer de mama MDA-MB-231-GFP. (a) estas fotografías muestran la bioprinted en vitro muestra (izquierda) y el modelo de CAD (derecha). (b) esta imagen representativa de Time-lapse confocal muestra el MDA-MB-231-GFP (green) y IMR-90-mCherry (rojo) las células bioprinted en el modelo. (c - f) Estos ins zoom muestran las regiones de células MDA-MB-231-GFP (cajas blancas punteadas). (g - j) estos ins zoom muestran las regiones de la célula de IMR-90-mCherry (cajas punteados amarillo). Las barras de escala son de 2 mm en panel 2a, 1 mm en el panel 2by 500 μm en paneles c 2 - 2j para áreas seleccionadas, y el aumento es 10 X. Capital "D" en las imágenes significa "días de la cultura". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: formación de MCTS dentro de un disco de hidrogel MDA-MB-231-GFP-laden 3D. (a) esta fotografía muestra un disco de hidrogel. (b) esta representativa imagen confocal muestra las células MDA-MB-231-GFP encajadas el compuesto. (c-f) Estos ins zoom muestra la región de células MDA-MB-231-GFP (caja punteada blanca en panel 3b) a (c) 0, (d) 7, (e) 15 yf21 días de cultivo. Las barras de escala son de 2 mm en panel de 3a, 1 mm en el panel 3by 500 μm en paneles 3 c - 3f para áreas seleccionadas, y el aumento es 10 X. Capital "D" en las imágenes significa "días de la cultura". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: morfología, viabilidad celular de MTCSs. (un) SEM esta imagen muestra un MCTS MDA-MB-231-GFP dentro el gel después de 21 días de la cultura, mostrando pequeñas MCTS (puntiagudo de flecha). (b) SEM esta imagen muestra un hidrogel de alginato/gelatina sin células. El aumento es de 350 X. (c) este panel muestra la viabilidad de las células MDA-MB-231-GFP y IMR-90-mCherry durante 30 días de la cultura en el hidrogel. Los resultados se analizaron como la media ± SD y analizan estadísticamente mediante un ANOVA de dos vías y post-test de Bonferroni. p (*) < 0.05, n ≥ 3. Los datos se normalizaron a la densidad de celdas utilizada para crear las muestras en el día 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Estructuras cargadas de celulares pueden ser comprometidas si contaminación (biológica o química) se produce en cualquier momento del proceso. Generalmente, contaminación biológica es vista después de dos o tres días de la cultura como un color cambia en los medios de cultivo o de la estructura de bioprinted. Por lo tanto, la esterilización (desinfección física y química) es un paso clave para todos los procesos relacionados con la célula. Notable, gelatina de autoclave cambia sus propiedades gelificantes, que hizo más lento del gel en los ensayos que realizamos. Por lo tanto, hemos esterilizado el alginato y gelatina poder via UV exposición. Debido a la capacidad de penetración muy limitada de la luz UV, puede usarse una capa muy delgada (< 0,5 mm). La concentración de alginato y la gelatina puede cambiarse arbitrariamente para sintonizar las propiedades mecánicas y biológicas32. En el presente trabajo, hemos elegido el A3G7, porque proporciona impresión deseable durante la ventana de impresión, y el hidrogel reticulado proporciona una alta estabilidad a través del experimento de 30 días. Calentar a 60 ° C mientras que disolver el polvo en DPBS ayuda a mejorar la licuefacción de la gelatina, que facilita la agitación. También se puede utilizar una temperatura más baja; sin embargo, una vez más conmovedora será necesaria.

El barrido de temperatura reológico da un punto de sol-gel a 30,6 ° C, que es compatible con otras publicaciones33. Teóricamente, cualquier temperatura superior a 30,6 ° C puede licuefacer el precursor. Elegimos a 37 ° C para simplificar el trabajo, como medio de cultivo celular es precalentada en un baño de agua de 37 ° C. Basado en la cinética de gelificación (antes de los geles de precursor), hay aproximadamente 17 minutos para la mezcla de células; después de este tiempo, las células y el precursor de hidrogel es difícil debido a la mayor viscosidad y moduli, causando un bioink cargado de celular no homogéneos. Por lo tanto, sugerimos el trabajo de mezcla de células dentro de los primeros 10 minutos de gelificación. La tensión de producción no se considera un atributo material que afecta a la capacidad de impresión hasta recientemente34; cueste lo que cueste, ha sido ampliamente reconocido por los científicos del polímero como marcador de líquido pasty/granular31,35,36,37. La existencia de tensión de producción ayuda a construir una integridad estructural para soportar su propio peso. Una tensión de alto rendimiento puede también requerir una presión inicial mayor en la protuberancia; por lo tanto, esto puede resultar en daño a las células debido a la excesiva tensión de esquileo32. La fidelidad del modelo puede verse comprometida si el proceso de extrusión se produce fuera de la ventana de impresión óptima. Indicadores comunes de este problema se muestran en la estructura de la bioprinted final: será demasiado áspera o demasiado líquido en los bordes. El precursor de A3G7 exhibe una ventana de impresión óptimo 50-90 min de gelificación que satisface la estabilidad estructural y la supervivencia de la célula y puede ser utilizado como el medio para construir tumor heterogéneo modelos14.

La altura total del modelo de hélice es 600 μm que se genera de cuatro capas de 150 μm filamentos. Este diseño permite que nutrientes y gas de intercambio como las células son a más de 300 μm de la superficie en contacto con los medios de comunicación durante la incubación. Modelos mayores son alcanzables en fabricación pero son bottlenecked por la distancia de difusión limitada de los nutrientes en el hidrogel38, que puede resultar en una supervivencia baja de la célula en la región de base.

Diferentes estrategias han sido desarrollados para forma MCTS en vitro, por ejemplo la gota colgante, microfluidos chip, montaje y bioprinting39. Sin embargo, algunas de estas metodologías pueden alterar la fisiología celular y bioquímica, generando comportamientos diferentes de la célula que ocurren en tejido tumoral normal. Por ejemplo, el colgante gota método fuerzas solo las células para permanecer como agregados de la célula a través de confinamiento físico de40. También, la inducción química para formar MCTS por adición de un péptido puede alterar la bioquímica de los esferoides41. El compuesto de hidrogel que se describe aquí permite una formación MCTS creando un ambiente de biomimetic sin factores estresantes externos. Partiendo como células bien dispersas, después de 7 días de culturas, reorganizar las células como MCTS pequeño (más de 6 células por esferoide), aumentando su tamaño y cantidad durante 30 días de cultivo.

En los resultados de esta investigación, hemos encontrado que esferoides de MDA-MB-231-GFP disminuyen la viabilidad celular en el día 21, la correlación de este fenómeno con la formación de grandes esferoides. Un tumor sólido se compone de tres capas diferentes, por el que la capa externa presenta una tasa de proliferación alta en comparación con la capa del medio y el interno núcleo necrótico o senescente del esferoide18. Esto podría explicar la disminución de la viabilidad de los resultados.

Esta limitaciones de este protocolo son dinámicas (1) bioink y (2) célula tipo compatibilidad. Bioink dinámica se refiere a las diferentes propiedades del material durante el proceso de congelación, dando por resultado en una ventana de impresión óptimo más allá del cual la estructura impresa es defectuosa. Compatibilidad de tipo de celda se refiere a la incapacidad de ciertos tipos de células (células o cultivo primario) para exhibir un comportamiento nativo en vivo .

El hidrogel de A3G7 alcanza una alta viabilidad de estabilidad y de la célula. Bioprinting 3D puede utilizarse para construir modelos 3D enfermedad heterogénea con alto rendimiento, bajo costo y alta reproducibilidad como una alternativa más realista a cultivos celulares tradicionales y modelos de tumores animales pequeños.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Tao Jiang gracias el Consejo de becas de China (201403170354) y el Premio de Doctorado Ingeniería de McGill (90025) para la financiación de su beca. Jose G. Munguia-Lopez gracias CONACYT (250279, 290936 y 291168) y FRQNT (258421) para la financiación de su beca. Salvador Flores Torres agradece a CONACYT la beca de financiación (751540). Joseph M. Kinsella gracias a la ciencia nacional y Consejo de investigación de ingeniería, la Fundación Canadiense para la innovación, la Fundación de la familia Townshend Lamarre y Universidad de McGill para su financiación. Nos gustaría agradecer a Allen Ehrlicher por permitirnos usar su reómetro, Dan Nicolau por permitirnos usar su microscopio confocal y Morag parque para nosotros otorgando acceso a líneas celulares fluorescencia marcada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

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