ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन टैगिंग और 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole धुंधला Caenorhabditis एलिगेंस में द्वारा प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने

Biology

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Summary

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि कैसे एक हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) एक मार्कर और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला के रूप में फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग करके गर्मी तनाव के तहत एक प्रोटीन परमाणु translocation ट्रैक करने के लिए । DAPI दाग प्रोटोकॉल तेजी से है और GFP और प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण संकेतों को बरकरार रखता है ।

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Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल में, एक हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) फ्यूजन प्रोटीन और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) दाग प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण परिवर्तन ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है; विशेष रूप से, एक परमाणु गर्मी तनाव हालत के तहत translocation । प्रोटीन बाह्य और आंतरिक संकेतों के अनुरूप प्रतिक्रिया करते हैं । एक आम तंत्र को अपने उपसेलुलर स्थानीयकरण बदल रहा है । यह आलेख एक एंटीबॉडी, रेडियोधर्मी लेबलिंग, या एक फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता नहीं है कि प्रोटीन स्थानीयकरण को ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है । इस लेख में, GFP को CLICs स्तनधारी सहित क्लोराइड intracellular चैनल प्रोटीन (CLIC4) परिवार के एक सदस्य सी. एलिगेंसमें लक्ष्य प्रोटीन EXL-1 टैग करने के लिए उपयोग किया जाता है । एक एकीकृत शोधों exl-1:: gfp ट्रांसजेनिक लाइन (एक प्रमोटर और एक पूर्ण जीन अनुक्रम के साथ) परिवर्तन और γ-विकिरण द्वारा बनाया गया था, और छुरा जीन और gfpव्यक्त करता है । हाल के शोध से पता चला है कि गर्मी तनाव पर, ऑक्सीडेटिव तनाव नहीं, EXL-1:: GFP नाभिक में जमा । दोनों नाभिक संरचना और DAPI संकेतों के साथ GFP संकेत अतिव्यापी तनाव के तहत EXL-1 उपसेलुलर स्थानीयकरण परिवर्तन की पुष्टि करता है । इस प्रोटोकॉल DAPI धुंधला के लिए दो अलग निर्धारण तरीकों: इथेनॉल निर्धारण और एसीटोन निर्धारण प्रस्तुत करता है । इस लेख में प्रस्तुत DAPI दाग प्रोटोकॉल तेजी से और कुशल है और दोनों GFP संकेत और प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण परिवर्तन को बरकरार रखता है । इस विधि केवल Nomarski, एक FITC फिल्टर, और एक DAPI फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है । यह एक छोटी सी प्रयोगशाला की स्थापना के लिए उपयुक्त है, स्नातक छात्र अनुसंधान, उच्च विद्यालय के छात्र अनुसंधान, और जैव प्रौद्योगिकी कक्षाओं ।

Introduction

प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण के परिवर्तन के जवाब में एक आम तंत्र है जैसे गर्मी तनाव, भुखमरी, ऑक्सीडेटिव तनाव, apoptosis, प्रोटीन फास्फारिलीकरण, और दूसरों के रूप में आंतरिक या बाहरी संकेतों । उदाहरण के लिए, गर्मी तनाव एक FOXO सदस्य डीएएफ-16 परमाणु translocation1,2, और प्रो अपोप्तोटिक BCL-2 प्रोटीन बोली translocates के लिए3,4संकेतन मौत प्राप्त करने पर mitochondria के लिए प्रेरित । इन परिवर्तनों का पता लगाने के लिए विभिंन तकनीकों उपलब्ध हैं । पश्चिमी सोख्ता का एक संयोजन और जैव रासायनिक अलग उपसेलुलर संरचनाओं (जैसे, mitochondria या नाभिक) अच्छी तरह से3लक्ष्य को प्राप्त कर सकता है । हालांकि, यह ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता है । इस प्रकार, एक अच्छी तरह से स्थापित एंटीबॉडी सफलता की कुंजी बन जाता है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए विभिंन मार्करों जैसे हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP), लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन (आरएफपी), पीला प्रतिदीप्ति प्रोटीन (YFP), और mCherry, और इस बीच के रूप में लेबल के साथ अलग उपसेलुलर संरचनाओं या organelles लेबल है के प्रोटीन अंय मार्करों के साथ ब्याज । फिर, उंहें एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण के लिए लक्ष्य स्थानीयकरण5,6। रेडियोधर्मी आइसोटोप लक्ष्य प्रोटीन लेबलिंग और फिर उनके सेलुलर स्थानीयकरण7का पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक विकल्प हैं. हालांकि, इस विधि उचित प्रशिक्षण और रेडियोधर्मी अपशिष्ट की हैंडलिंग की आवश्यकता है । ऐसी एक विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी के रूप में परिस्थितियों के तहत, एक उचित मार्कर के अभाव, या उपकरणों की एक फोकल माइक्रोस्कोप के रूप में दुर्लभता, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण की जरूरत पर विचार किया जाएगा । एक प्रोटीन परमाणु translocation की पहचान करने के लिए, यह केवल एक मार्कर के साथ लक्ष्य प्रोटीन लेबल और रासायनिक रिएजेंट 4 ' के साथ नाभिक दाग के लिए आकर्षक है, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के बाद से यह केवल एक नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है ।

एंटीबॉडी के साथ Immunolabeling सी एलिगेंस या तो eggshell या कोलेजन छल्ली पशु आसपास के कम पारगम्यता के कारण चुनौतीपूर्ण है । इस बीच, के बाद से सी एलिगेंस प्रोटीन काफी अपने हड्डीवाला orthologs से अलग हैं, कुछ वाणिज्यिक कंपनियों के विशिष्ट उत्पादों के साथ सी. एलिगेंस प्रदान करते हैं । एक छोटी सी प्रयोगशाला के लिए अपने लिए सी. एलिगेंस एंटीबॉडी पैदा करना मुश्किल है. समुदाय में शोधकर्ताओं अक्सर मार्कर के रूप में चिह्नित प्रोटीन का उपयोग करने के लिए एक प्रोटीन स्थानीयकरण या जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है । इस आलेख का उपयोग करता है EXL-1:: एक उदाहरण के रूप में GFP हीट तनाव8के तहत एक प्रोटीन परमाणु translocation ट्रैक करने के लिए । एक एकीकृत शोधों exl-1:: पशु जीनोम में gfp को छुरा gfp फ्यूजन के साथ जीन व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अनुसंधान से पता चला है कि exl-1 आंत में व्यक्त की है, शरीर की दीवार की मांसपेशी, और अंय उपसेलुलर संरचनाओं8। इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि कैसे चौथे लार्वा (L4) चरण के लिए कीड़े को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, एक गर्मी तनाव प्रयोग करते हैं, और आचरण DAPI धुंधला, इथेनॉल निर्धारण, एसीटोन निर्धारण, और इमेजिंग एक नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के अंतर्गत ।

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Protocol

1. समाधान

  1. NGM प्लेट्स
    1. एक 2 L Erlenmeyer कुप्पी में, NaCl के 3 माम, आगर के 17 ग्राम, Peptone के २.५ ग्राम, और डीएच2ओ के ९७५ मिलीलीटर जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी के साथ कुप्पी के मुंह को कवर । आटोक्लेव के लिए कुप्पी ५० मिनट के लिए यह 20-30 मिनट के लिए अच्छा है ।
    2. तो फिर निष्फल समाधान जोड़ें: 1 एम CaCl2, 1 मिलीलीटर 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल इथेनॉल, 1 एम MgSO4के 1 मिलीलीटर, और 1 मीटर केपीओ4 (पीएच ६.०) बफर के 25 मिलीलीटर । समाधान भंवर उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
    3. एक तरल मशीन का प्रयोग, ६० mm पेट्री प्लेटों के लिए NGM समाधान बांटना । प्लेटें भरें आगर से भरा 2/3 । उंहें भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक हवा तंग कंटेनर में स्टोर ।
  2. 1 मीटर केपीओ4 बफर (पीएच ६.०)
    1. भंग १०.८३ KH के2पो4 और ३.५६ ग्राम के K2HPO4 में डीएच2हे, तो कुल मात्रा १०० मिलीलीटर को समायोजित करें । 15 मिनट के लिए समाधान आटोक्लेव ।
  3. M9
    1. भंग 3 जी के KH2पो4, 6 जी के एनए2HPO4, और 5 जी के NaCl के डीएच2हे, 1 M MgSO4की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और कुल मात्रा 1 L को समायोजित करें ।
  4. 10 µ g/मिलि DAPI
    1. 1 µ l को 10 मिलीग्राम/mL DAPI में ९९९ µ l के डीएच2हे.
  5. ९५% अल्कोहल (v/
    1. उपाय ९५ १००% शराब की मिलीलीटर और आसुत जल जोड़ने के लिए मात्रा को समायोजित करने के लिए १०० मिलीलीटर ।
  6. 30% एसीटोन (v/
    1. डीएच2ओ करने के लिए एसीटोन के 30 मिलीलीटर जोड़ें और १०० मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा समायोजित करें ।

2. गर्मी तनाव

  1. एक अनुवाद के साथ एक extrachromosomal सरणी लाइन उत्पंन लक्ष्य जीन9,10का निर्माण । वैकल्पिक रूप से, Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC), जो सी. एलिगेंस अनुसंधान के लिए एक सार्वजनिक संसाधन है, या एक पहले से प्रकाशित अनुसंधान प्रयोगशाला से ऐसी लाइनें प्राप्त करें ।
  2. ३,८०० रेड γ-विकिरण9के लिए कीड़े को उजागर करके जीनोम में extrachromosomal लाइनों को एकीकृत । तो, एक पशु एक GFP या रोलर के रूप में एक मार्कर प्रोटीन व्यक्त इतना है कि छुरा व्यक्त लाइनों का चयन करें ।
  3. विकिरण के दौरान उत्पंन उत्परिवर्तनों को दूर करने के लिए, लाइनों को पार कम 2x । तनाव के तहत प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस ट्रांसजेनिक लाइन का प्रयोग करें ।
  4. चरण १.१ में वर्णित के रूप में NGM वर्म प्लेट तैयार करें । लकीर एक OP50 क्लोन और संस्कृति तरल पौंड शोरबा में बैक्टीरिया रातोंरात । बीज तरल OP50 संस्कृति के साथ NGM प्लेटें और एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में प्लेटें रात भर के कीड़े के लिए एक खाद्य स्रोत के रूप में एक जीवाणु लॉन बढ़ने के लिए । उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर प्लेटें कम से कम 30 मिनट के लिए ठंडा करें ।
  5. 20 डिग्री सेल्सियस से कम 2 पीढ़ियों के लिए गर्मी तनाव परख करने से पहले के लिए भुखमरी के बिना ट्रांसजेनिक लाइन हो जाना ।
  6. 8 उठाओ-10 युवा gravid वयस्कों (गर्भाशय अंडे से भरा) एक नया कीड़ा थाली के लिए, तो उंहें के बारे में 3 के लिए अंडे देना-5 ज और प्लेटों से सभी वयस्कों को हटा दें ।
  7. कीड़े को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, अंडे हैच और लगभग ४८ एच के लिए चौथे लार्वा (L4) चरण के लिए लार्वा विकसित करते हैं । उनकी योनी संरचना (एक आधा चंद्रमा संरचना) की जांच करने के लिए L4 चरण (चित्रा 1, तीर)11की पहचान ।
  8. गर्मी तनाव को प्राप्त करने के लिए 2-5 एच के लिए एक ३५ डिग्री सेल्सियस मशीन में L4 लार्वा के साथ कीड़ा प्लेट रखें । सही तापमान मापने के लिए मशीन में एक थर्मामीटर प्लेस ।

3. DAPI धुंधला

  1. इथेनॉल निर्धारण
    1. एक गिलास स्लाइड के केंद्र में M9 बफर के 10 µ एल जोड़ें ।
    2. २.८ कदम से गर्मी सदमे कीड़े उठाओ और कांच स्लाइड पर M9 बफर में डाल दिया ।
      1. वैकल्पिक रूप से, M9 के साथ थाली धोने, यह १,००० एक्स जी पर कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें । ग्लास स्लाइड में कीड़े जोड़ें ।
    3. किसी भी अतिरिक्त तरल नाली के लिए एक नरम ऊतक का उपयोग करें । एक विदारक खुर्दबीन के नीचे इस कदम को देखो ।
    4. कीड़े पर ९५% शराब के 10 µ एल जोड़ें और उंहें शुष्क हवा । एक विदारक खुर्दबीन के नीचे की प्रक्रिया को देखें, और जानवरों को भी सूखा नहीं होने दें । इथेनॉल जानवरों से वाष्पित हो गया है के तुरंत बाद, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: इथेनॉल बहुत जल्दी काफूर हो जाती है ।
    5. दोहराएं कदम 3.1.4 दो बार इतना है कि कीड़े तय कर रहे हैं ।
      नोट: यह जानवरों के लिए सामांय है और गहरा देखने के विकृत ।
    6. कीड़े को DAPI (10 µ ग्राम/एमएल) के 10 µ एल जोड़ें । तुरंत उंहें एक coverslip के साथ कवर और पारदर्शी नेल पॉलिश जेल के साथ स्लाइड सील ।
    7. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर लगभग 10 मिनट के बाद जानवरों को देखें ।
  2. एसीटोन निर्धारण (एक वैकल्पिक दृष्टिकोण)
    1. M9 के साथ २.८ कदम से गर्मी सदमे थाली से धो लें, यह कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें । डीएच2ओ के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो, गोली इकट्ठा, और supernatant त्यागें ।
    2. जोड़ें ४०० µ एल 30% एसीटोन के लिए 15 min. केंद्रापसारक के लिए १,००० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए और supernatant त्यागें । का प्रयोग करें ५०० µ एल के डीएच2हे जानवरों को 2x धोने के लिए । supernatant को त्यागें ।
    3. जोड़ें २०० µ एल के DAPI (10 µ जी/एमएल), या 4x कुल ' कीड़े की मात्रा की मात्रा, ट्यूब में 15 मिनट के लिए ।
    4. 1 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । धो गोली 2x के साथ ५०० µ एल के डीएच2ओ । ग्लास स्लाइड पर कीड़े प्लेस, उन्हें coverslips के साथ कवर, पारदर्शी नेल पॉलिश जेल के साथ स्लाइड सील, और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत जानवरों का पालन.

4. माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग

  1. यूवी प्रकाश स्रोत और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर बारी । माइक्रोस्कोप से कनेक्टेड कंप्यूटर चालू करें ।
  2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर स्लाइड लोड । कीड़े का पता लगाने के लिए एक कम शक्ति उद्देश्य लेंस (10x) का प्रयोग करें, 400X के लिए आवर्धन शक्ति में वृद्धि, और नमूना पर ध्यान केंद्रित ।
  3. माइक्रोस्कोप के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर खोलें । मेनू में "अधिग्रहण" पर क्लिक करें; "कैमरा" पर क्लिक करें और माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे का चयन; यह चयनित कैमरा सॉफ्टवेयर के साथ संवाद करने की अनुमति देता है ।
    नोट: विभिन्न सूक्ष्मदर्शी आपरेशन में भिन्न हो सकते हैं ।
  4. इसी "अधिग्रहण" के तहत "बहुआयामी अर्जन" पर क्लिक करें । यह एक नया "बहुआयामी अधिग्रहण" नेविगेशन विंडो खोलता है । "मल्टीचैनल" बटन पर क्लिक करें, और सभी उपलब्ध चैनल दिखाई देंगे ।
  5. चुनें नीले, हरे, और (विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट) के लिए नमूना निरीक्षण । "बहुआयामी अधिग्रहण" नेविगेशन विंडो में, "ब्लू-DAPI", "ग्रीन-GFP", और "ग्रे-उद्योग", "Nomarski" चैनलों पर छोड़; अन्य चैनलों पर राइट-क्लिक करें, जैसे कि "लाल-rhodamine" और "व्हाइट-ब्राइट फील्ड", उन्हें बंद करने के लिए.
  6. सबसे पहले, प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम समय को मापने:
    1. बाएँ क्लिक करें "ब्लू-DAPI" चैनल यह चयन करने के लिए और फिर स्वचालित जोखिम समय के साथ DAPI चैनल के तहत एक जीवित छवि लेने के क्रम में "उपाय" पर क्लिक करें. एक लाइव छवि के साथ एक नई विंडो दिखाई देगा ।
    2. लाइव छवि विंडो के बाईं ओर, मैन्युअल रूप से वांछित के रूप में छवि बनाने के लिए अगर जरूरत जोखिम समय समायोजित करें ।
    3. अंत में, "ठीक है" पर लाइव छवि विंडो में क्लिक करें । यह DAPI चैनल के तहत एक्सपोज़र समय सेट करता है ।
  7. अन्य चैनलों के लिए ४.६ कदम दोहराएँ, "ग्रीन-GFP" और "ग्रे-डिक", "Nomarski", उन चैनलों के लिए जोखिम समय सेट करने के लिए.
  8. "बहुआयामी अधिग्रहण" नेविगेशन विंडो में, "प्रारंभ" पर क्लिक करें स्वचालित रूप से 3 विभिंन चैनलों के तहत आदेश में 3 छवियों को इकट्ठा करने के लिए सेट के रूप में विशिष्ट जोखिम समय के साथ (ऊपर देखें) ।
  9. फ़ाइल को बचाने के लिए, मुख्य मेनू पर जाने के लिए, पर क्लिक करें "फ़ाइल" तो पर "के रूप में सहेजें" । इनपुट फ़ाइल नाम और फ़ोल्डर का नाम । भावी संदर्भ के लिए विस्तृत इमेजिंग जानकारी रक्षित करने के लिए फ़ाइल को डिफ़ॉल्ट फ़ाइल स्वरूप के रूप में सहेजें ।
  10. फ़ाइल को अंय स्वरूपों में निर्यात करने के लिए:
    1. "फ़ाइल" पर जाएं और "निर्यात" पर क्लिक करें । यह एक निर्यात सेटिंग विंडो खुल जाएगा ।
    2. फ़ाइल का नाम और फ़ोल्डर सेट करें । बेहतर डेटा व्यवस्थित करने के लिए "एक प्रोजेक्ट फ़ोल्डर बनाएं" की जांच करें । सॉफ्टवेयर भी 4 अन्य विकल्प निर्दिष्ट करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है: "विलय छवियों उत्पन्न", "चैनल छवियों के लिए रंग का उपयोग करें", "चैनल नाम का उपयोग करें", और "केवल विलय छवि".
    3. ड्रॉप-डाउन मेनू से कोई इच्छित फ़ाइल प्रकार चुनें, जैसे "TIF", "BMP", "PSD", या "JPG" और अंय प्रकार । तो निर्यात करने के लिए "प्रारंभ" पर क्लिक करें ।

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Representative Results

क्लोराइड intracellular चैनल प्रोटीन (CLIC) अत्यधिक12प्रजातियों के पार संरक्षित कर रहे हैं कि बहुआयामी प्रोटीन हैं. बहुत अनुसंधान से पता चलता है कि CLICs सेलुलर तनाव, autophagy, apoptosis, कैंसरजनन, angiogenesis, और मैक्रोफेज प्रणाली13,14,15,16 में स्तनधारी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित ,17. सी. एलिगेंसमें दो CLIC homologs हैं: exl-1 और exc-4। हमारे हाल के अध्ययन से पता चला है कि exl-1 पशु तनाव प्रबंधन8नियंत्रित करता है । हम एक अनुवाद exl-1 एकीकृत:: gfp एक जानवर जीनोम में निर्माण और ट्रांसजेनिक लाइनों, जो छुरा एक मार्कर (चित्रा 2a और 2 बी) के रूप में एक gfp के साथ जीन exl-1 एक्सप्रेस बनाया । गर्मी तनाव के तहत, EXL-1:: GFP मजबूत GFP संकेत नाभिक संरचना (चित्रा 2c) के साथ ओवरलैप के बाद से आंतों क्षेत्र में नाभिक में जमा । उपसेलुलर स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए, DAPI धुंधला नाभिक दाग के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । DAPI धुंधला के लिए इथेनॉल निर्धारण का उपयोग पशु शरीर (चित्र बी) में स्पष्ट नाभिक से पता चलता है । एसीटोन निर्धारण भी इसी तरह के परिणाम (फिगर 3E) को प्राप्त होता है. अतिव्यापी GFP और DAPI संकेत पुष्टि करते है कि EXL-1:: GFP वास्तव में आंतों क्षेत्र में नाभिक में संचित (3सी, एफ) ।

Figure 1
चित्र 1: विभिन्न आवर्धन शक्तियों के अंतर्गत चौथी लार्वा (L4) चरण C. एलिगेंस की छवियां । (क) 63X, (ख) 115X, और (ग) 400X आवर्धन शक्ति । तीर एक L4 कीड़ा की योनी को इंगित; नोट आधा चंद्रमा संरचना । स्केल बार = १०० सभी छवियों में µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: गर्मी तनाव के तहत, EXL-1:: GFP आंत के नाभिक में जम जाता है । (एक) गर्मी सदमे से पहले एक आंत्र क्षेत्र के Normaski छवि । (ख) गर्मी सदमे से पहले instestinal क्षेत्र में एक मजबूत GFP संकेत देखा गया था । (ग) गर्मी सदमे के बाद आंत्र क्षेत्र की Normaski छवि (तीर आंत्र क्षेत्र के नाभिक को इंगित) । (घ) एक मजबूत GFP संकेत गर्मी सदमे के बाद जमा । (ङ) GFP और Normaski की अतिव्यापी छवि । सभी चित्र 400X आवर्धन शक्ति के साथ लिया जाता है । स्केल बार = ५० सभी छवियों में µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: EXL-1:: GFP नाभिकीय translocation DAPI दाग की पुष्टि की है । (A-C) DAPI धुंधला के लिए इथेनॉल निर्धारण का उपयोग करना. (डी एफ) DAPI धुंधला के लिए एसीटोन निर्धारण का उपयोग करना । एक और डीमें, हरे रंग आंत्र क्षेत्र में GFP संकेत दिखाता है । बी और में, नीले रंग DAPI धुंधला द्वारा नाभिक से पता चलता है । सी और एफ GFP, DAPI, और Normaski के अतिव्यापी छवियों को दिखाते हैं । स्केल बार = ५० सभी छवियों में µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा: एसीटोन निर्धारण नमूना बरकरार रखता है और एसीटोन निर्धारण के बाद ६० दिन, GFP और DAPI संकेत अभी भी चौकस हैं । (क) हरी GFP के लिए है. (ख) DAPI संकेत के लिए नीला है । (ग) GFP, DAPI, और उद्योग के अतिव्यापी छवि । सभी छवियों 400X आवर्धन शक्ति के तहत लिया जाता है । स्केल बार = ५० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

इस लेख कोशिका द्रव्य से नाभिक के लिए प्रोटीन उपसेलुलर परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए एक तेज और कुशल विधि प्रस्तुत किया । प्रोटीन अभिव्यक्ति एक GFP फ्यूजन द्वारा दिखाया गया था, जबकि नाभिक संरचना DAPI धुंधला (चित्रा 3) द्वारा सत्यापित किया गया था । चूंकि immunostaining c. एलिगेंस प्रोटीन चुनौतीपूर्ण है, अधिकांश c. एलिगेंस प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण उन GFP, Laz, mCherry, और दूसरों के रूप में मार्कर प्रोटीन के साथ टैगिंग द्वारा विशेषता है18,19 , 20 , 21. इस अनुच्छेद में, gfp के लिए लक्ष्य जीन exl-1 टैग के लिए अपने प्रोटीन सेलुलर स्थानीयकरण का प्रदर्शन किया गया । परमाणु स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए, DAPI धुंधला इस्तेमाल किया गया था । दो वैकल्पिक तरीकों DAPI धुंधला के लिए प्रस्तुत किया गया । दोनों कुशलता से एक सभ्य काम समय सीमा के भीतर कीड़े में मजबूत नाभिक दिखाया (कम से 1 ज) । इथेनॉल निर्धारण एक गुणवत्ता अवलोकन के रूप में एक छोटा सा नमूना संग्रह के लिए उपयुक्त है (कम से ५० कीड़े इकट्ठा) । कीड़े को पूरी तरह से सूखने से रोकना कुंजी है । एक बार ९५% शराब कीड़े से वाष्पित हो, अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना । एसीटोन निर्धारण ऐसे एक मात्रात्मक विश्लेषण के रूप में एक बड़े पैमाने पर नमूना संग्रह के लिए अनुकूल है (५० से अधिक पशुओं का संग्रह) । हालांकि, नमूना धोने के कई कदम के कारण, कुछ नमूना खो जाएगा । इस प्रकार, यह अत्यधिक सावधानी से supernatant को हटाने और संभव के रूप में कई कीड़े के रूप में बनाए रखने की सिफारिश की है । एक बार जब वे सील कर रहे हैं, एसीटोन निर्धारण से उत्पंन स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के हित के अंय प्रोटीन के लिए समायोजित किया जा सकता है उपसेलुलर स्थानीयकरण परिवर्तन ट्रैक । गर्मी यहां प्रस्तुत तनाव के अलावा, अंय तनाव परख ऐसे ऑक्सीडेटिव तनाव के रूप में, मूल्यांकन किया जा सकता है, भारी धातु तनाव, आहार प्रतिबंध, और अंय । प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण परिवर्तन भी ब्याज के प्रोटीन की आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बदलकर जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक लाइन एक अलग उत्परिवर्ती की पृष्ठभूमि में पार किया जा सकता है, ताकि उपंयास आनुवंशिक बातचीत की पहचान की जा सकती है । आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) भी विशिष्ट जीन नीचे दस्तक और परिणामस्वरूप प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण परिवर्तन की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है । इन आवेदनों उच्च ब्याज के लिए उपंयास विनियामक घटकों की पहचान कर रहे हैं । एक अज्ञात प्रोटीन के लिए, विभिंन प्रायोगिक स्थितियों परीक्षण किया जाना चाहिए, जैसे परीक्षण एजेंट सांद्रता, तनाव समय की अवधि, और कीड़े के विशिष्ट विकास के चरणों के रूप में । हमारे अध्ययन में, हम विभिंन अवधियों की कोशिश की, 30 मिनट से 5 ज, और अलग गर्मी तनाव तापमान । 3 एच के लिए ३५ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी सदमे स्पष्ट रूप से एक प्रोटीन परमाणु translocation दर्शाता है ।

DAPI धुंधला के अतिरिक्त आवेदन कीड़े में अर्धसूत्रीविभाजन और बँटवारा प्रक्रिया की परीक्षा में शामिल हैं, विशेष रूप से germline कोशिकाओं में22,23,24,25, और एक में नाभिक की संख्या की गिनती आनुवंशिक है उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि20,26,27

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Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgements

इस अध्ययन में प्रयुक्त होने वाले सी. एलिगेंस उपभेदों को Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर से प्राप्त किया गया है, जो कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान-कार्यालय अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) द्वारा समर्थित है. यह काम NIH द्वारा समर्थित था: 1R03AG048578-01 to jun लिआंग, CUNY-CCRG १५०१ से जून लिआंग, और पीएससी-CUNY 66184-00 44 और 67248-00 45 से जून लिआंग । हम धंयवाद कैथी बर्बर-डन के लिए कृपया उसे प्रयोगशाला अंतरिक्ष साझा । क्वींस कॉलेज कोर सुविधा में सभी प्रतिदीप्ति छवियों को एकत्र किया गया । हम पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणी के लिए विलियम जे चावल का शुक्र है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

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References

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