الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول هو المضيف قابلة للتكيف، وكله، أداة فحص عالية المحتوى التي يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض ويمكن استخدامها لاكتشاف المخدرات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

عدد الأدوية الجديدة التي حددت بالتقليدية، في المختبر شاشات تضاءل، الحد من نجاح هذا النهج في البحث عن أسلحة جديدة لمكافحة مقاومة الأدوية المتعددة. وادي هذا إلى الاستنتاج بأن الباحثين لا تحتاج فقط إلى العثور على أدوية جديدة، ولكن أيضا بحاجة إلى تطوير طرق جديدة للعثور عليهم. بين المرشح الأكثر تبشيرا بالنجاح أساليب مسببة للجامعة، في فيفو فحوصات هذا الاستخدام الفائق، والمظهرية قراءات ويستضيف أن تتراوح بين ايليجانس كاينورهابديتيس دانيو rerio. هذه الأجهزة المضيفة لها العديد من المزايا القوية، بما في ذلك تخفيضات هائلة في عدد الزيارات إيجابية كاذبة، كما يتم عادة إسقاط مركبات سامة للمضيف و/أو بيونافيلابل في الشاشة الأولى، قبل متابعة مكلفة حتى.

هنا نعرض كيف استخدمت لدينا المقايسة لاستجواب تباين المضيف في الموثقة توثيقاً جيدا C. ايليجانسالزائفة الزّنجاريّة قتل السائل باثوسيستيم. كما نبدي ملحقات عدة لهذا الأسلوب جيدا عملت بها. على سبيل المثال، نحن قادرون على الاضطلاع بشاشات الجينية الفائق باستخدام [رني] في بئر 24 أو 96 لوحة الأشكال لعوامل المضيف الاستعلام في هذا التفاعل المضيف الممرض. باستخدام هذا التحليل، يمكن أن تكتمل شاشات الجينوم كله في بضعة أشهر فقط، التي يمكن تبسيط مهمة تحديد أهداف المخدرات، يحتمل أن تكون دون الحاجة إلى اتباع نهج التنقية البيوكيميائية شاقة بشكل كبير.

نحن أيضا تقرير هنا تلاف أسلوب لدينا بدائل بكتيريا إيجابية faecalis البرازية الممرض الغرام P. الزّنجاريّة. كثير كما الحال بالنسبة P. الزّنجاريّة، قتل faecalis هاء- تعتمد على الوقت. على عكس السابق C. ايليجانس– فحوصاتفايكاليس هاء ، ولدينا المقايسة faecalis هاء- لا يتطلب برينفيكتيون، تحسين صورتها السلامة وتقليل فرص تلوث معدات مناولة السائل. المقايسة قوية جداً، عرض ~ 95% معدلات الوفاة 96 ساعة بعد الإصابة.

Introduction

تحديد وتطوير المضادات الحيوية واسعة الطيف، وفعالة، الآن تقريبا قبل قرن من الزمان، أدت إلى لحظة فاصلة في مجال الصحة العامة حيث كان هناك اعتقاد على نطاق واسع أن المعدية المرض سيكون آفة من الماضي. في بضعة عقود قصيرة، بدأ هذا التفاؤل إلى الزوال، الممرض بعد الممرض وضعت آليات المقاومة التي تحد من هذه العلاجات المعجزة مرة واحدة. لبعض الوقت، ويبدو أن سباق التسلح بين الجهود الرامية إلى اكتشاف المخدرات ومسببات الأمراض متوازنا. ومع ذلك، قد توجت إساءة استخدام مضادات الميكروبات مؤخرا في ظهور سلالات مقاومة للعقاقير عموم الكلبسيله الرئويةو راكدة بوماني، السراتية marcescensو, P. الزّنجاريّة1 2،،من34.

من P. الزّنجاريّة انتهازية، غرام السلبية، متعدد المضيف ممرض أن تهديدا شديدا للمرضى الذين يعانون من حروق شديدة، أولئك الذين هم المناعة أو التليف الكيسي. فإنه يتم تعريف أيضا بصورة متزايدة كعامل المسبّب للمرض في العداوي المستشفوية شديدة، لا سيما بسبب حيازته الجارية لمقاومة مضادات الميكروبات. للبدء في التصدي لهذا التهديد، وقد استخدمنا موثقة توثيقاً جيدا C. ايليجانس-P. الزّنجاريّة عدوى النظام5. وقد الاستدانة لدينا مختبر هذا النظام لتطوير منصة فرز المستندة إلى السائل، والفائق، وعالية المحتوى لتحديد المركبات الرواية التي تحد من قدرة مسببات المرض قتل المضيف6. الفضول، تبدو هذه المركبات تنتمي إلى مالا يقل عن ثلاث فئات عامة، بما في ذلك مضادات الميكروبات7 وضراوة مثبطات8. وردت أخرى فحوصات اكتشاف المخدرات عالية المحتوى في C. ايليجانس لبكتريا توبيركولوسوم، والمتدثرة الحثريه، واليرسينيا بيستيس، الليستريه المستوحدة، فرانسيسيلا تولارنسيس، المكوّرات العنقودية الذهبية، المبيضات البيض، و فايكاليس البرازية، بين أمور أخرى9،10،11،،من1213،14،،من1516. هذه الأنواع من فحوصات لها العديد من المزايا المعترف بها جيدا، مثل الحد من يضرب الإيجابية الكاذبة التي قد تكون سامة للبلد المضيف والممرض، احتمال زيادة التوافر الحيوي بالمقارنة مع شاشة كيميائية، والقدرة على تحديد عدد الزيارات خارج مجرد الحد من نمو الميكروبات، مثل مكافحة فيرولينتس أو جزيئات محفزة محصنة ضد المركبات إلا إمالة توازن التفاعل المضيف الممرض صالح السابقة. بالإضافة إلى ذلك، أن المركبات التي اكتشفت في هذه الشاشات غالباً ما تكون فعالة في الثدييات المضيفين.

تجدر الإشارة إلى أن مالا يقل عن اثنين آخرين فحوصات17،18 متاحة للاضطلاع بشاشات الفائق في C. ايليجانس في السائل. ومع ذلك، كل من هذه الاختبارات هو تعديل يسمح الإنزيم المعوية الاستعمار تنميط، المعروف بالقتل البطيء، يمكن أداؤها في السائل، زيادة الإنتاجية، والسماح لمركبات فحص أكثر سهولة. وقد أظهرت توصيف دقيق قاطع أن آليات الفوعة الجرثومية المختلفة بين هذه الاختبارات ولدينا الشاشة المستندة إلى السائل7. إذ لوحظت كلا النوعين من ضراوة في نظم الثدييات، من المهم النظر المحدد ضراوة الذي هو الأكثر ملاءمة لمصالح المجرب قبل اختيار المقايسة.

هنا نظهر إصدار محسن من السائل على أساس مقايسة C. ايليجانس P. الزّنجاريّة . ونحن أيضا تقرير تكييف أسلوب التحليل القائم على سائل لدينا لاستيعاب الممرضات البكتيرية إيجابية البرازية faecalis. مثل P. الزّنجاريّة، يتم تعريف faecalis هاء- يتزايد كتهديد خطير المستشفيات مع تسلح متزايد لمقاومة مضادات الميكروبات مسارات1. على الرغم من وجود أسلوب سابقة للفرز الفائق من faecalis هاء- 14، فإنه يتطلب بريينفيكشن مع مسببات المرض، مما يزيد من تعقيد الإجراءات ويزيد من احتمال تلويث المعدات مثل فلووسورت COPAS. لدينا بروتوكول يلغي الحاجة لقبل الإصابة، تحسين السلامة الشخصية. أخيرا، نحن التقرير وسيلة بها أي من هذه الاختبارات يمكن دمجها مع تغذية [رني]، مما يتيح للمستخدم البحث عن المضيف من العوامل التي تلعب دوراً في إنشاء، أو مقاومة للعدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: P. الزّنجاريّة و faecalis هاء- 2 مستوى السلامة البيولوجية المسببة للأمراض، ويجب اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة لمنع الإصابة بعرضي والتقليل من تلوث الأسطح. يجب تعقيم جميع وسائل الإعلام والمواد التي تتلامس مع مسببات الأمراض أو التخلص منها. وتتوفر المزيد من المبادئ التوجيهية من المنشور منها السلامة الأحيائية في الأحياء المجهرية والمختبرات الطبية الحيوية (بمبل)، الطبعة الخامسة.

1-إعداد وصيانة P. الزّنجاريّة

  1. الانتصارات P. الزّنجاريّة من أسهم مجمدة على صفيحة أجار رطل (مرق ليسوجيني). احتضان ح 16 إلى 24 في 37 درجة مئوية
    ملاحظة: إجراء تجارب P. الزّنجاريّة داخل سلامة بيولوجية BSL-2 مجلس الوزراء لضمان العقم. استخدام احتياطات السلامة المناسبة لتقليل فرصة الإصابة المسببة للأمراض أو التلوث.
  2. نقل هذه اللوحة إلى 4 درجات مئوية. يجوز الإبقاء على 4 درجة مئوية هذه اللوحة ويستخدم لتطعيم الثقافات لمدة تصل إلى أسبوع واحد. بعد أسبوع واحد، إزالة التلوث وتجاهل اللوحة وجعل لوحة الانتصارات رطل جديدة.
    ملاحظة: إنقاص الفوعة P. الزّنجاريّة بعد تخزين طويلة.
  3. يومين قبل إعداد لوحات المقايسة، وتطعيم 3-5 مل مرق LB العقيمة مع مستعمرة واحدة من P. الزّنجاريّة من اللوحة في 1.1. احتضان في 37 درجة مئوية ح 12 إلى 16.
    ملاحظة: لا احتضان أطول من ح 16. في الثقافات السائلة الغنية، يبدأ PA14 P. الزّنجاريّة ليسي.
  4. إعداد لوحات العقيمة 10 سم مع وسائل الإعلام "قتل بطيء" (الجيل الثالث 3g كلوريد الصوديوم، ببتون 3.5 g, 1 مم كاكل2, 1 مم MgSO4، 25 مل من المخزن المؤقت للفوسفات (المبلغ للتر الواحد: 132 مل ك2هبو4 (م 1) ومل 868 من خ2ص4 (1 م)) واجار 18 جرام/لتر).
    ملاحظة: إعداد لوحات قبل الموعد المحدد. يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3 أسابيع في وعاء محكم في 4 درجات مئوية.
  5. البذور كل 10 سم "قتل بطيء" لوحة (لوحة كورونا) مع ميكروليتر 350 من P. الزّنجاريّة من جديد بين عشية وضحاها الثقافة رطل. استخدام الناشرة جرثومي عقيمة، تنتشر البكتيريا بالتساوي عبر السطح من وسائل الإعلام والسماح لتجف في سلامة بيولوجية BSL-2 مجلس الوزراء.
  6. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية ح 24.

2-إعداد البكتيريا [رني]

  1. خط خارجاً أو دبوس-نقل المطلوب سلالات من البكتيريا التي تحتوي على [رني] على لوحات أجار رطل المحتوية على المضادات الحيوية المناسبة (كاربينيسيلين في 100 ميكروغرام/مل) والتتراسيكلين في 15 ميكروغرام/مل للمكتبات أهرينجير وفيدال من الأوراق المالية مجمدة.
    ملاحظة: عند العمل مع nonpathogenic البكتيريا، استخدم أما BSL-2 أ/ب السلامة البيولوجية مجلس الوزراء أو تدفق الصفحي BSL-1 هود لضمان عقم الثقافات وتقليل فرصة التلوث عبر مكتبة.
  2. احتضان لوحات ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    1. وبعد أسبوعين، تجاهل اللوحات واستبدالها بلوحات تقدم طازجة.
  4. اختبار متعددة [رني] سلالات بالتوازي بتطعيم مستعمرة واحدة من كل استنساخ منفردة في 4 مل من استكمال كاربينيسيلين رطل في واحدة جيدا في صحن عميق 24-بئر أو في أنبوب اختبار عقيمة.
    ملاحظة: التتراسيكلين قد أبلغ إلى تقليل الكفاءة [رني]. لا تستخدم في هذه الوسائط.
  5. وضع لوحات جيدا 24-بئر عميقة في حاضنة تهز الأمثل للوحات مولتيويل واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16 بينما تهز 950 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: من الصعب الحصول على النمو البكتيري موحدة في لوحات مولتيويل حاضنة تهز تقليدية باستخدام. حاضنة تهز يحتاج ليتمكن من هزة في الحد أدنى من 750 دورة في الدقيقة في ترتيب للثقافات أن تنمو بشكل صحيح. نظراً لغياب شاكر المتخصصة، من الممكن أن ينمو كل ثقافة في أنبوب فردية. يمكن نقل الثقافات في لوحة 24-جيدا للطرد المركزي بعد ذلك، إذا رغبت في ذلك.
  6. جمع البكتيريا التي سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 2,000 س ز.
  7. صب المادة طافية بعكس اللوحة وتهتز بقوة. ريسوسبيند البكتيريا [رني] في 100 ميليلتر من القاعدية S (ز 5.85 كلوريد الصوديوم، ز 1 ك2مكتب البراءات الهنغاري4، ز 6 خ2بو4 حله في 1 لتر الماء عالي النقاوة وتعقيمها قبل اﻷوتوكﻻف).
  8. "الماصة؛" حراكه البكتيريا إلى عدد مناسب من الآبار لصفيحة NGM مولتيويل (ديدان أسطوانية وسائط النمو، الجيل الثالث 3g كلوريد الصوديوم، ببتون 2.5 g, 1 مم كاكل2, 1 مم MgSO4، 25 مل من المخزن المؤقت للفوسفات (المبلغ للتر الواحد: 132 مل ك2هبو4 (1 م) ومل 868 من خ2ص4 (1 م))، واجار ز 18 لتر من الماء) تستكمل مع إيبتج (تركيز النهائي 1 مم) وكاربينيسيلين (100 ميكروغرام/مل تركيز النهائي).
    1. استخدام 3.5 مل NGM وسائل الإعلام كل من لوحة 6، حسنا، 1 مل كل من صفيحة 24-جيدا جيدا، أو 150 ميليلتر كل من لوحة 96-جيدا جيدا جيدا.
    2. استخدام 100 ميكروليتر/جيدا للبكتيريا للوحة 6-جيدا؛ 50 ميكروليتر/جيدا ل 24-جيدا؛ أو 20 ميكروليتر/جيدا للوحة 96-جيدا. السماح لتجف.
      ملاحظة: التجفيف يتم عادة في غطاء تدفق عقيمة لتعزيز تجفيف سريع وموحد. تجفيف موحد مهم جداً. تجنب الإفراط في التجفيف، الشقوق في أجار الترويج تختبئ من الديدان. وهذا يؤدي إلى دودة الخسائر وانسداد المحتملة لنظم معالجة السائل.
  9. استخدام لوحات مستعدة فورا أو تخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين لاستخدامها في وقت لاحق.
    ملاحظة: لمنع الجفاف، لوحات يمكن مختومة مع الفيلم البلاستيك البارافين أو وضعها في حاويات مختومة محكم مع مناشف ورقية رطبة.

3-صيانة وإعداد C. ايليجانس

ملاحظة: قبل الشروع في تجارب، توليد عدد سكانها متزامنة من الديدان hermaphroditic جرابيد، والكبار كما يلي.

  1. أغسل جرابيد البالغين (أي، مع أجنة متعددة مرئية داخل الغدد التناسلية) من 4-6 لوحات NGM 10 سم في أنبوب مخروطي 15 مل بإضافة 4 مل من S القاعدية للوحة ويحوم بلطف وثم صب في أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. بيليه الديدان عن طريق استخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 30 ثانية.
  3. نضح المادة طافية، رعاية لا لعرقلة بيليه دودة.
  4. إضافة 3.5 مل من محلول التبييض دودة (التركيز النهائي 0.5M هيدروكسيد الصوديوم، محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1%، في الماء المعقم) دودة بيليه، ومزيج من عكس لمدة 1 دقيقة.
  5. باختصار من دوامة وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 30 ثانية.
  6. نضح أو صب المادة طافية، مع الحرص على عدم تعكير بيليه دودة.
  7. إضافة 3.5 مل من محلول التبييض دودة جديدة إلى بيليه دودة.
  8. قوة مزيج الديدان في حل التبييض. بشكل دوري (تقريبا كل عشر ثوان) تفقد بصريا الديدان تحت مجهر تشريح. لمشاهدة البشرة دودة لكسر، الإفراج عن البيض. مرة واحدة وكانت معظم الديدان الكبار المذابة (~ 95 ٪)، يؤدي إلى تمييع التبييض إلى 15 مل مع S القاعدية لوقف عملية الهضم.
    ملاحظة: قشرة البيض أكثر مقاومة للتبييض من أنسجة البالغين، إلا أنها يمكن أن تحل خلال التعرض لفترة طويلة. ولتجنب تفكك البيض، لا تعرض البيض دودة حل التبييض لمدة أطول من 7 دقائق. في حالة تلف قشرة البيض مفرطة، سوف يموت الأجنة.
  9. بيليه الأجنة في 1,000 س ز لمدة 30 ثانية ونضح أو صب المادة طافية دون إزالة بيليه للأجنة.
  10. ريسوسبيند الديدان في S القاعدية لوحدة تخزين نهائي من 15 مل تمييع الحل التبييض المتبقية.
  11. كرر الخطوات الغسيل (3.9-3.10) ثلاث مرات أكثر لما مجموعة 4 يغسل على التوالي.
  12. وبعد الغسيل الرابعة، نضح المادة طافية وتضيف ما يصل إلى 5 أو 6 مل من S العقيمة "القاعدية" في أنبوب مخروطي 15 مل. والهدف من ذلك ريسوسبيند الأجنة إلى تركيز ديدان ~ 50 كل ميليلتر.
    ملاحظة: مقدار القاعدية S يعتمد على حجم بيليه البيض؛ أكبر بيليه، القاعدية S أكثر من الضروري.
  13. احتضان الأنبوبة المخروطية بين عشية وضحاها في دوار أعلى الجدول في درجة حرارة الغرفة أو 48 ساعة في 15 درجة مئوية. وسوف تفقس اليرقات، ولكن سيتم القبض على التنمية اليرقات في مرحلة L1 (L1 ديبوس) بسبب الحرمان المغذيات.
  14. فحص الأجنة تحت مجهر تشريح للتحقق من أن معظمهم قد دبرت واعتقل في المرحلة L1 للتنمية.
  15. تحديد عدد دودة بأخذ 20 ميليلتر من دودة الإعدادية واذابته مع 80 ميليلتر من S القاعدية. "الماصة؛" 10 ميليلتر من محلول دودة المخفف مباشرة على لوحة NGM فارغة. كرر 2 مرات أكثر.
    1. عد اليرقات في كل بقعة وتحديد متوسط عدد. قسمة هذا المتوسط 2 للحصول على تعداد تقريبي للديدان كل ميليلتر في الإعدادية دودة. ثم يمكن استخدام محضرات دودة لوحات النشر أو للتجارب.
      ملاحظة: بعد 4-5 أيام، سيبدأ اليرقات المتعطشة للموت؛ تجاهل prep عند هذه النقطة.
  16. لنشر السلالة، تتركز ماصة رصدت عددا مناسباً من الديدان L1 (5,000-6,000) على لوحات NGM 10 سم 3-4 مع OP50 كولاي – "سوبيرفود" (OP50كولاي رصدت 25 X تركيز (أي 1 لتر من OP50 بين عشية وضحاها ثقافة نمت في رطل غلة 40 مل من عشب البحر X OP50 25)؛ رصدت 2 مل من هذا التعليق البكتيرية تتركز على كل لوح NGM 10 سم).
  17. لإعداد لوحات لإجراء تجارب عليها، قم بأحد الإجراءات التالية (بالنسبة للإعداد استخدام 3.17.1 "بروتوكول الأساسية"، "[رني] شاشة إعداد" استخدام الخطوات 3.17.2-3.17.4 حسب الاقتضاء):
    1. ماصة ~ 5,000 الديدان/10 سم لوحة المصنف مع عشب البحر [رني] أو OP50.
    2. ماصة ~ المصنف 500 الديدان/بئر في لوحة 6-جيدا مع [رني].
    3. المصنف ماصة ~ 300 الديدان/بئر في صفيحة 24-جيدا مع [رني].
    4. المصنف ماصة ~ 100 الديدان/بئر في صفيحة 96-جيدا مع [رني].
      ملاحظة: للحصول على إرشادات حول كيف كان المصنف [رني] يرجى الرجوع إلى الخطوات 2.7 2.9 في إعداد البكتيريا [رني].
  18. إذا كان يتم استخدام سلالة خصبة من الديدان، احتضان الديدان عند 25 درجة مئوية ل ~ 44-48 h. استخدام هذه الديدان، في أسرع وقت ممكن بعد أن السكان قد بلغ السن المناسبة. وهذا يقلل من أثر بيض الفقس داخل الديدان خلال المقايسة.
  19. إذا كان يتم استخدام السلالة هو درجة الحرارة العقيمة (مثلاً، fer-15(b26)؛ fem-1(hc17) أو glp-4(bn2))، احتضان الديدان عند 15 درجة مئوية ح ~ 16 وثم نقل إلى 25 درجة مئوية ح 44 استكمال تطوير ومنع امبريوجينيسيس.

4-سائل قتل إعداد المقايسة (بروتوكول الأساسية)

ملاحظة: هذا بروتوكول لسلالة بكتيرية واحدة ومصدر واحد من الديدان.

  1. باستخدام مكشطة خلية، إزالة P. الزّنجاريّة من صفيحة كورونا وريسوسبيند في ~ 5 مل من S القاعدية. مقياس إذا لزم الأمر. قياس الكثافة البصرية تعليق البكتيرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي (OD600)
  2. إعداد مل 24 من الأسهم المخفف من P. الزّنجاريّة في القاعدية S في التطوير التنظيمي600 ≈ 0.09 (3 X تركيز النهائي). انظر 4.6.2 للمحتوى النهائي للبئر الواحد، والحجم لتمييع البكتيرية تبعاً لذلك.
  3. إضافة مل 21 من وسائل الإعلام السائلة "القتل البطيء" (غ 3 من كلوريد الصوديوم، غ 3.5 ببتون/لتر تستكمل مع كاكل2 و مجسو4 لتركيز نهائي من 1 مم). استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 45 ميليلتر من البكتيريا ووسائط الإعلام لكل بئر من صفيحة 384-جيدا.
  4. أغسل الديدان من مصدرها (أيخطوة 3.17.1) في أنبوب 50 مل مخروطية والسماح للديدان تسوية تحت قوة الجاذبية. نضح المادة طافية إلى 5 مل. ريسوسبيند في ما مجموعة 50 مل S القاعدية.
  5. كرر الخطوة 4، 4 مرتين.
  6. استخدام أرز دودة، فرز حوالي 22 الديدان في كل من لوحة 384-جيدا جيدا.
    ملاحظة: الإعداد يسقط كل دودة في ~1.1 ميليلتر من السائل. الديدان 22 ستصل إلى 25 ميليلتر، يصل حجم إجمالي المقايسة إلى 70 ميليلتر/جيدا.
    1. التشكيل النهائي لكل بئر ويتألف من 70 ميليلتر. 45 ميليلتر من هذا الحجم يتم إضافته كالمتوسطة البكتيرية (OD 0.03600 البكتيريا في 24 ميليلتر S ميليلتر القاعدية، و 21 كورونا تستكمل مع كاكل2 ومجسو4). يتم إضافة ميليلتر 25 أخرى مع الديدان 22.
    2. في حالة استخدام فارز غير متوفر هنا (انظر الجدول للمواد)، يمكن أن تضعف الديدان إلى تركيز نهائي للدودة 1/ميليلتر في S القاعدية وبيبيتيد 25 ميليلتر/البئر باستخدام ماصة الأقنية. ومع ذلك، قد يحمل نتائج زيادة التقلبات. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن استخدام موزع سائلة تحوي، كما وصفها ليونغ والزملاء19.
  7. بعد أن تم فرز الديدان في لوحة 384، حسنا، ختم اللوحة مع فيلم غاز نفاذية واحتضان لوحات عند 25 درجة مئوية ح 24-48.
  8. وفي الوقت المطلوب، استخدم غسالة ميكروسكوبية لغسل لوحة 384-جيدا مع القاعدية S ما مجموعة 5 مرات.
    1. بعد الغسيل الثاني، نضح معظم وسائل الإعلام، تاركاً ~ 20 ميليلتر. قوة تهز لوحات باستخدام فورتيكسير ميكروسكوبية لمدة 30 ثانية على الأقل لتخفيف أي حطام من الجزء السفلي من الآبار).
  9. بعد الغسيل النهائي، المادة طافية aspirate وصولاً إلى 20 ميليلتر. إضافة 50 ميليلتر من الحمض النووي ميكرومتر 0.98 وصمة عار (انظر الجدول للمواد)/كذلك من لوحة 384، حسنا، لتركيز نهائي من 0.7 ميكرومتر.
  10. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 12-16. فقط سوف هذه الصبغة من وصمة عار الديدان الميت. بعد فترة الحضانة المرجوة، وصمة ألواح الغسيل باستخدام الغسالة الميكروسكوبية لإزالة أي فائض (الحد أدنى ليغسل 3).
  11. للحصول على البيانات، استخدم جهاز المطياف الضوئي أو مجهر الآلي للصور الخفيفة المنقولة والأسفار (531 نانومتر الإثارة والانبعاثات 593).
    1. استخدم هدفا تضخم منخفضة للسماح لصورة البئر كله لالتقاطها.
    2. وبدلاً من ذلك، استخدم فيرميميتري التدفق. ويستخدم هذا الأسلوب من سيتوميتير تدفق كائن كبير فلوريميتير دودة، قياس حجم والأسفار للكائن الحي كله (أي، C. ايليجانس) بطريقة مشابهة بشدة للتدفق الخلوي.
  12. استخدام برنامج تحليل الصور الآلي (مثل سيلبروفيلير، استوديو تحليل صور حرة استناداً إلى مطلب http://cellprofiler.org/) لحساب مجالات دودة الفلورسنت ومجموع كل بئر بطريقة غير متحيزة.
    ملاحظة: يمثل حاصل قسمة هذه الأرقام الموت كسر لكل بئر. إذا كان كذلك 7 الملون الديدان خارجاً من 20 المجموع، ثم وفاة الكسر يتألف 0.35 أو 35%.
    1. قبل أول استخدام، يجب التحقق من صحة الأنابيب ومعالجة الصور الآلي بتسجيله يدوياً. يتم ذلك عن طريق مقارنة النتائج من خط الأنابيب الآلي للنتائج التي تم الحصول عليها بتفتيش الصور بصريا وتسجيل كسور ديدان الميت لكل منها. ويضمن عملية التحقق من صحة المعلمات من أجل تجهيز التصوير الآلي دقيقة وتمثيل البيانات بشكل صحيح.

5-التكيف لسلالات "الفرز متعددة" C. ايليجانس أو كنوكدوونس ([رني] شاشة الإعداد)

ملاحظة: هذا شاشة [رني] ووصف لإعداد لوحة 24-جيدا.

  1. أضف 1 مل من القاعدية S كل من صفيحة 24-جيدا جيدا (راجع الخطوة 3.17.3). بلطف تحرض الديدان التي تهز اللوحة، ثم نقل الديدان إلى صفيحة الآبار العميقة 24 فارغة، وعقيمة. السماح للديدان لتسوية جذبي (~ 5 دقائق).
  2. نضح المادة طافية، ترك حوالي 1 مل. إضافة 7 مل من S القاعدية لكل بئر.
  3. كرر الخطوات من 5، 1-5، 2 كحد أدنى من 2 مرات أكثر. بعد الغسيل النهائي، نضح المادة طافية، تاركاً ما يقرب من 400 ميليلتر.
  4. استخدام الدالة ريسامبلير فارز دودة، فرز الديدان 22 من تعليق دودة لوحة 24-جيدا في كل بئر من صفيحة 384-جيدا (كل بئر آبار غلة 8-12 لوحة 24-جيدا من صفيحة 384-جيدا).
    1. لتجنب المجاعة، ماصة البكتيريا في لوحات 384-جيدا (سلالة يخدم فقط كالغذاء، مثل OP50، أو سلالة ممرضة) قبل الفرز.
      ملاحظة: يمكن إضافة الكائنات الممرضة بواسطة الخطوات التالية 2.3 2.5 أو 6.4-6.5، والمصدر الغذائي يمكن أن تضعف البكتيريا وإضافتها باتباع نفس نظام أما P. الزّنجاريّة.
  5. بعد أن تم فرز الديدان في لوحة 384، حسنا، إضافة الجزيئات الصغيرة أو غيرها من المواد الخاصة بالتجربة.

6-التكيف هاء-فايكاليس

ملاحظة: يتم وصف الاختلافات فقط من P. الزّنجاريّة المقايسة.

  1. تعد مصدرا جديداً ل faecalis هاء- streaking البكتيريا من أسهم مجمدة على طبق أجار بهي (ضخ القلب الدماغ) وتفرخ ح 16 إلى 24 في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: القيام بتجارب faecalis هاء- داخل سلامة بيولوجية BSL-2 مجلس الوزراء التأكد من العقم. استخدام احتياطات السلامة المناسبة لتقليل فرصة الإصابة المسببة للأمراض أو التلوث.
  2. ويمكن تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. وبعد هذه الفترة، استبدل بلوحة جديدة.
  3. ليلة قبل الفرز الديدان، تطعيم 3-5 مل بهي العقيمة مع مستعمرة واحدة من هاء-فايكاليس. احتضان ح 12-16 في 37 درجة مئوية مع إثارة الشغب.
  4. إضافة البكتيريا إلى الآبار أما P. الزّنجاريّة (3 x البكتيريا الموجودة في S القاعدية، OD600≈0.09).
    ملاحظة: هاء-faecalis، تكوين جيدا النهائي: faecalis هاء (OD600≈0.03)، وبهي = 10% v/v، مع حجم المتبقية المؤلفة من S القاعدية. تذكر أنه سيتم تسليم 25 ميليلتر من S القاعدية مع الديدان.
    ملاحظة: تنتج faecalis هاء- سميكة الأغشية الحيوية التي تستوعب وصمة عار الفلورسنت، مما تسبب في عدم وضوح الصور. الغسيل واسعة النطاق قد لا تكون كافية لإزالة هذا بيوفيلم. في هذه الحالة، يمكن نقل الديدان إلى صفيحة فارغة استخدام ماصة متعددة القنوات. لتسهيل نقل، يمكن إضافة 20 توين إلى S القاعدية لتركيز 0.1% (v/v) 20 توين في القاعدية S نهائية. وهذا يساعد في إزالة الديدان من بيوفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المعالم الهامة لتحليل الأداء

فهم سليم للبيولوجيا الكامنة وراء هذا التحليل ضروري لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسين المقايسة. تحقيقا لهذه الغاية، ونشير أولاً إلى عدة ورقات رئيسية توضيح آليات إمراضية P. الزّنجاريّة-بوساطة قتل في السائل7،20. شريطة أن يتم اتباع الخطوات المذكورة أعلاه (انظر الشكل 1 لتخطيطي البروتوكول المقايسة) سيتبع عملية قتل تعتمد على الوقت من C. ايليجانس إلا بحضور الممرض (الشكل 2A). على النقيض من ذلك، في غياب المكملات الغذائية الرئيسية (مثلاً، إذا ترك ببتون الخروج من وسائل الإعلام، وتتم إضافة فقط S القاعدية)، قليل من قتل لا سيتبع (الشكل 2). من المثير للاهتمام، نفذت في "السائل مما أسفر عن مصرع"21، الحضانة خطوتين من P. الزّنجاريّة (عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، ثم 24 ساعة عند 25 درجة مئوية) والحاسمة لفحوصات القتل البطيء التقليدية، وكان في الأصل يمكن الاستغناء عنها في هذا التحليل ( الشكل 2). بينما من الممكن إضافة P. الزّنجاريّة مباشرة من الثقافة رطل بين عشية وضحاها، وذلك إلى حد كبير التغيرات حركية الفتك وغير مستحسن.

فهم البيولوجيا الإنزيم يسمح أيضا تبسيط المقايسة، إذا كان مناسباً ومرغوب فيه. على سبيل المثال، برنامج التشغيل الأكثر أهمية للمضيف قتل في هذا التحليل هو بيوفيرديني سيديروفوري، والمضيف السمية الناتجة عن بيوفيرديني مرهون بقدرتها على ربط الحديد7. على هذا النحو، يمكن تبسيط الفحص عن طريق استبدال filtrate الغنية بيوفيرديني، بيوفيرديني المنقي أو حتى بعض الكيماويات الاصطناعية خالب حديد (مثلاً، 1,10-فينانثروليني) للبكتيريا الحية، كرد C. ايليجانس النسخي لهذه العلاجات هي مشابهة جداً (الشكل 3)22.

يتكلم عدة خطوط مختلفة من الأدلة على متانة الإعداد التجريبية. أولاً، الإعداد تتسامح مع طائفة واسعة من تركيزات البكتيرية الأولية. تركيزات منخفضة قدر OD600 = 0.0025 (أقل من الموصى بها من الوقت تقريبا) لا يزال المعرض تعتمد على الوقت وتركيز القتل، على الرغم من أن التوقيت التحول (الشكل 4 أ). ثانيا، إمكانية تكرار نتائج للفحص مثل هذا النحو قليلة الآبار 4 كثيرا ما يكفي للحصول على بيانات يعتد به إحصائيا (الشكل 4 باء).

وهناك العديد من التغييرات التي لا ننصح. على سبيل المثال، باستخدام لقاح البكتيريا الأولية مع تركيزات أعلى بكثير من تلك المدرجة في البروتوكول؛ ويؤدي القيام حتى سميكة، مثل بيوفيلم المواد التي يصعب أو يستحيل أن فعالية يغسل بعيداً، مما يزيد من تعقيد الفتك التهديف. وعلاوة على ذلك، تركيزات عالية من لقاح البكتيريا أيضا يمكن أن تتنافس للأكسجين وتشغيل المضيف غير محددة مقتل7.

ملاحظة هامة أخرى قصر الفترة الزمنية بين وقف الفحص والتصوير الديدان الميت. لاحظ أن هذا الإطار الزمني يجب أن تشمل تلطيخ، ولذلك من الأهمية بمكان أن تكون فعالة. بعد الموت، والمواد البيولوجية ضمن الديدان يبدأ بثق و/أو يتم استهلاكها بواسطة البكتيريا. في غضون 24-32 ساعة، يبقى فقط بشرة. بشرة بقع سيئة للغاية وخفيفة جداً، مما يجعل من السهل أن تفقد خلال يغسل. من المهم ملاحظة أنه يمكن تعقدت سلالات أو ظروف سلالة/[رني] مع حركية مختلفة جداً من قتل هذه الظاهرة (أي، بعض الديدان قد يكون لا يزال على قيد الحياة في حين أن آخرين قد فقدت بالفعل المحتوى الخاص بهم، ومن المستحيل على الصورة). يظهر الشكل 4A هذه الظاهرة، كالديدان في الجانب الأيسر من اللوحة، تلقيح مع تركيزات البكتيرية الأولية منخفضة جداً، لا تزال إلى حد كبير على قيد الحياة بينما الديدان على الجانب الأيمن من اللوحة، التي تتعرض لكثير من تركيزات أعلى من وقد جرفت المياه البكتيريا،.

عامل مهم جداً في نجاح التحليل هو الطريقة المستخدمة في جمع وتحليل البيانات. استخدمنا في المختبر، ولدينا على الأقل ثلاثة أساليب لجمع البيانات من هذه الاختبارات: كانت، والفحص المجهري الآلي، وتدفق فيرميميتري (أي، تكييف تقنيات قياس التدفق إلى C. ايليجانس؛ حرفيا، بقياس الديدان في حل تتدفق). وأول هذه الأساليب يستخدم سبيكتوفوتوميتير لقراءة fluorescence صبغ أو مراسل من الديدان في السؤال. هذا الأسلوب في الاستفادة من استخدام في كل مكان إلى حد ما قطعة من المعدات (معيار جهاز المطياف الضوئي مع قارئ ميكروسكوبية)، وهي الطريقة الأسرع للحصول على البيانات. بيد أنها تفتقر إلى المحتوى المعلوماتي المتاحة من الفحص المجهري الآلي والقوة الإحصائية لتدفق فيرميميتري.

المجهر الآلي خيار آخر. عدد من أنظمة التصوير الميكروسكوبية حاليا في السوق، بدءاً بأسعار معقولة لمحقق واحد (مثلاً Cytation5 بيو-تك) إلى أكبر وأكثر تكلفة، وأعلى نوعية الآلات التي هي أكثر شيوعاً في الأساسية المرافق (مثلاً، مجهر إيماجيكسبريس الأجهزة الجزيئية). في الواقع، معظم هذه الحلول قابلة للتهديف معظم الشاشات وفحوصات. يمكن أيضا إضافة معظم منصات التصوير الآلي للبرمجيات المتلقين للمعلومات لمعالجة (مثلاً، ميتامورف، إيماجيج، Gene5، أو خلية منشئ ملفات التعريف) زيادة عائد معلومات الصور. أمثلة للأداة المساعدة لتجهيز مبينة في الشكل 5 و الشكل 6. عندما تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية (كما هو الحال في الشكل 5)، تحليل بسيط وتميز بين الظروف الإيجابية والسلبية تافهة. وفي هذه الحالات، يمكن تحديد يضرب ضعيفة حتى يسهل. ومع ذلك، قد فحوصات عديدة، نسبة الإشارة إلى الضوضاء أضعف. على سبيل المثال، علاج الديدان22 الوردي-1::GFP (مع التعبير مشري التأسيسي في تلك فارينجيس) مع 1,10-فيناثروليني يزيد من مستوى 1::GFP الوردي. لتحليل البيانات، هو تطبيع المراسل بروتينات فلورية خضراء إيندوسيبلي إلى إشارة مشري التأسيسي (الشكل 6). وفي هذه الحالة، المراسل قد أضعف التعبير و/أو لم يتم تنشيط في أغلبية الديدان. ولذلك، تنفيذ معالجة الصور أدوات إضافية، مثل "التعريف الخلية"، التي يمكن أن تقلل من الخلفية وتضخيم الإشارات قد يكون مفيداً.

أخيرا، إذا كان متوفراً فلووبيلوت COPAS، يمكن استخدامه للحصول على البيانات عن طريق تدفق فيرميميتري. كثير مثل مفهوم أكثر دراية من التدفق الخلوي، هذا الصك يمكن أن تستخدم لقياس fluorescence C. ايليجانس في قنوات على الأقل اثنين أو ثلاثة في وقت واحد. هذا الأسلوب قابلة جداً للحصول على البيانات ذات دلالة إحصائية عالية، ولكن سرعة النقل يتناقص كثيرا مقارنة بالفحص المجهري الآلي. وأهم ميزة تدفق فيرميميتري في القدرة على تحليل السكان دودة كاملة كمجموعة واحدة من تكرار، بدلاً من تقسيم هذه الآبار متعددة وتحليل متوسط الآبار. تحليل مجموعات كبيرة في هذا الشكل جذريا يحسن القوة الإحصائية ويتيح الكشف عن آثار حتى الصغيرة.

إدخال تعديلات على المقايسة قتل السائل

التطورات الأخيرة المقايسة مدت فائدته بها بما في ذلك فحص التنشيط للصحفيين الفلورسنت (الشكل 6)، باستخدام تقنيات [رني] متوسطة إلى عالية الإنتاجية (الشكل 3)، وحتى استبدال الأصلي الممرض.

والسبب الأكثر وضوحاً لاستخدام إعداد [رني] اختبار للمضيف سبل الدفاع ضد P. الزّنجاريّة (أو مسببات الأمراض الأخرى). وترد أمثلة لضربة قاضية [رني] من الجينات ذات الصلة للبقاء على قيد الحياة في المقايسة في الشكل 3. وتمشيا مع الملاحظات السابقة20،،من2324،25، daf-2(RNAi) تعزيز بقاء C. ايليجانس أثناء التعرض P. الزّنجاريّة، بينما داف-16 ( [رني])، zip-2(RNAi) ، و cebp-1(RNAi) تقصير فإنه. كما ذكر، يتم تضمين [رني] الأكثر بساطة في مقايسة تنمو الديدان في لوحات مولتيويل حيث يحتوي كل جيدا على استنساخ [رني] مختلفة. بسبب لزوجة عالية أجار والأحجام الصغيرة المعنية، من الصعب تحقيق موحدة، وخالية من فقاعة بملء لوحات 96-جيدا دون المعدات المتخصصة. وباﻹضافة إلى ذلك، تجفيف السلالات البكتيرية التي تحمل [رني] يمكن أيضا قضية، كما تجف الآبار الخارجي أسرع من الآبار الداخلية، مما يؤدي إلى احتمال عدم الاتساق وهامة لتكسير أجار. كما ذكر أعلاه، وهذا يشجع الديدان تحفر، خفض عدد الحيوانات متوفرة للفحص ومخاطر انسداد السائل-المناولة الآلية. لكل هذه الأسباب، 24-جيدا اللوحات أسهل للعمل مع لوحات 96-جيدا. على الرغم من أن هذا يقلل من إنتاجية المقايسة، يحسن الموثوقية، ويقترح، خاصة بالنسبة للشاشات الأولية.

وأخيراً، تم تعديل المقايسة المقايسة إلى استبدال P. الزّنجاريّة فايكاليس هاء. (من حيث المبدأ، استبدال مع غيرها من الأنواع البكتيرية ينبغي أن لا توفر صعوبات لا مبرر لها، شريطة أن يتم التعرف على استزراع مناسبة وظروف التعرض.) هو أهم عامل للنظر في متطلبات وسائل الإعلام من مسببات المرض، سواء للنمو والتنمية واستحثاث الفوعة. على سبيل المثال، يتطلب غرام الإيجابية والانتهازية الممرض faecalis هاء- الوسائط الغنية بالمغذيات (مثل بهي) والحضانة عند درجات حرارة أعلى بالمقارنة مع14، P. الزّنجاريّة26. بأخذ هذه العوامل في الحسبان، تكييف الفحص استخدام فايكاليس هاء- كانت واضحة. وكما لاحظت ل P. الزّنجاريّة، شاهدنا قتل تعتمد على الوقت (الشكل 7). من المثير للاهتمام، أن توقيت الإعدام كان مماثلاً لفحوصات المنشورة سابقا التي استخدمت قبل الإصابة في أجار لوحات26, على الرغم من عدم وجود هذه الخطوة، التي قد توحي بأن الآليات التي تشارك في الآلية المرضية تختلف.

Figure 1
رقم 1: مخطط المستندة إلى سائل C. ايليجانس P. الزّنجاريّة العدوى المقايسة. الخطوات التي تنطوي على نشر السلكية وإعداد في الجانب الأيسر، ويتم إعداد البكتيريا في حق. وتتمحور الخطوات التي تنطوي على حد سواء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: قتل C. ايليجانس من P. الزّنجاريّة محددة وتتطلب التغذية السليمة البكتيرية. الموت (A) C. ايليجانس حضور كولاي و P. الزّنجاريّة. (ب) الوفاة C. ايليجانس حضور P. الزّنجاريّة مع (يمين) ودون وسائط "قتل بطيء" (يسار) إضافة إلى خلط (أي S القاعدية فقط). S القاعدية هو وسائط الحد أدنى ولا تحتوي على العناصر الغذائية اللازمة للنمو البكتيري ويحول دون إنتاج بيوفيرديني. (ج) الوفاة C. ايليجانس حضور معدّة بطريقة مختلفة P. الزّنجاريّة. ف < 0.01، استناداً إلى الطالب t-اختبار. أشرطة الخطأ تمثل S.E.M. 10 آبار واستخدمت كل تكرار البيولوجية كل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مقاومة ايليجانس C. P. الزّنجاريّة يعتمد على مسارات المضيف المناعية. عومل فريق مختارة [رني] كنوكدوونس P. الزّنجاريّة (A) أو 1,10-فينانثروليني (تشيلاتور كيميائية الذي يحاكي التعرض إلى P. الزّنجاريّة في السائل) (ب). ف < 0.01، #ف < 0.05، استناداً إلى الطالب t-اختبار. أشرطة الخطأ تمثل S.E.M. 10 آبار واستخدمت كل تكرار البيولوجية كل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: قتل ايليجانس C. P. الزّنجاريّة قوية ويعتمد على تركيز البكتيريا. الصور التمثيلية (أ-ب) (أ) والكمي (ب) لوفاة C. ايليجانس بعد التعرض لتركيزات مختلفة من P. الزّنجاريّة 72 h. فحسبت القيم استناداً إلى الطالب تي --اختبار. شريط مقياس في (A) 1 مم-16 بئرا واستخدمت كل تكرار البيولوجية كل حالة. فرنك بلجيكي: مشرق الميدانية، فلوريدا: الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تجهيز البيانات اقتناء وصورة للفحص مع إشارة قوية- (أ) صور الممثل يعيش (المراقبة السلبية) والقتلى (مراقبة إيجابية) C. ايليجانس. (ب) التحليل الإحصائي لعناصر سلبية وإيجابية استناداً إلى طريقة الحصول على البيانات ومعالجة الوضع، وعدد من الآبار التي تم تحليلها. وقد تم تحليل الأسفار (ج) الديدان من أربعة آبار الفردية من صفيحة 96-جيدا (إيجابية اثنين وبئرين لمراقبة سلبية). كذلك يتضمن كل الديدان ~ 100. وتمثل كل نقطة في الرسم البياني دودة واحدة، تبين الوقت الطيران (الذي يرتبط مع، لكن بسبب تصفية الديدان الحية، ناقص يمثل حجم) والأسفار المقاسة الديدان ملطخة باللون البرتقالي سيتو. قبل قتل الديدان التحكم الإيجابي بالتعرض للحرارة. بسبب التغييرات في التوتر والشكل من الديدان الميت (كما يمكن أن يرى في (A)، الديدان الميت يبدو أكثر مثل قضيب ويكون قليل الجسم الانحناءات) مقارنة بنظرائهم الذين يعيشون، والديدان الميت قد TOF أطول. فحسبت القيم استناداً إلى الطالب t-اختبار. شريط مقياس في (A) هو 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: تجهيز البيانات اقتناء وصورة للفحص مع إشارة معتدلة. (أ) صور الممثل من C. ايليجانس تحمل مراسل وردي-1::GFP إيندوسيبلي وعلامة مشري تأسيسي (لتطبيع الجينات من مجموعة اكستراتشروموسومال). C. ايليجانس يتعرض إلى [دمس] (مراقبة سلبية) أو 1,10-فينانثروليني (التحكم بإيجابية). (ب) التحليل الإحصائي لعناصر سلبية وإيجابية استناداً إلى طريقة الحصول على البيانات ومعالجة الوضع، وعدد من الآبار التي تم تحليلها. (ج) أربعة آبار الفردية من صفيحة 96-جيدا (إيجابية اثنين وبئرين للمراقبة السلبية) حللت باستخدام تدفق فيرميميتري. فحسبت القيم استناداً إلى الطالب t-اختبار. شريط مقياس في (A) هو 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: قتل ايليجانس جيم- هاء-faecalis تعتمد على قوي والوقت. الصور التمثيلية (أ-ب) (أ) والكمي (ب) الوفاة C. ايليجانس بعد التعرض هاء-فايكاليس. ف < 0.01، استناداً إلى الطالب t-اختبار. وقد استخدمت 10 آبار كل تكرار البيولوجية كل حالة. أشرطة الخطأ تمثل شريط مقياس S.E.M. في (A) 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا الإنزيم (أو فحوصات مماثلة حيث يتم استبدال مسببات الأمراض الأخرى عن P. الزّنجاريّة أو هاء-faecalis) مفيدة لمجموعة متنوعة من الأغراض، بما في ذلك اكتشاف المخدرات. كما أنها مفيدة لمعالجة المسائل البيولوجية الأساسية، مثل تحديد عوامل الفوعة، توضيح سبل الدفاع المضيف، وتحديد الآلية التنظيمية المشتركة في التفاعل الممرض المضيف.

على الرغم من مقايسة "قتل" P. الزّنجاريّة السائل قوية، هناك عدة نقاط حيث ينبغي إيلاء اهتمام دقيق لتقليل الفرصة للفشل. أولاً، وكما ذكر، يجب أن تظل لوحة مصدر الجرثومية لتطعيم P. الزّنجاريّة الطازجة، خشية أن تفقد البكتيريا ضراوة، على الرغم من النمو بين عشية وضحاها في رطل. وثانيا، أنها المفتاح للتأكد من أن تضاف إلى P. الزّنجاريّة قتل فحوصات الكالسيوم والمغنيسيوم. وبدون ذلك، ستتأثر إلى حد كبير ضراوة. وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن يموت الديدان تربى في HT115 (لفحوصات على أساس [رني]) إلى حد كبير يتجاوز الديدان تربى على OP50 (أ. كيرينكو، اتصال شخصي). لهذا السبب، إذا كان التحول إلى الدراسات المستندة إلى [رني], من المهم تجريبيا تحديد النقطة وقت أفضل للمقايسة.

لقتل فحوصات مع P. الزّنجاريّة أو هاء-faecalis، من الأهمية بمكان ضمان عدم وجود الغذاء الكافي لتطوير الديدان من مرحلة L1 حتى أنهم على استعداد لاستخدامها في مقايسة. الموت جوعاً، حتى في الأجل القصير، المعروف بتنشيط عدد من مسارات الدفاع المضيف، مثل الأنسولين داف-2/داف-16/IGF إشارات الشبكة27. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن يتم تفعيل DAF-16/فوكسو الفعل قليلاً يجري مثقف في السائل20، ومزيد تفعيل غير مرغوب فيه بشدة، منذ DAF-16/فوكسو يعزز مقاومة واسعة الطيف الممرض23.

وأخيراً، من المهم استخدام الديدان عقيمة تماما في أي تحليل يعتمد على معدل الوفيات حسب قراءات. إذا كانت الديدان الخصبة، ويجري في السائل يسبب صعوبات في وضع البيض. نتيجة لذلك بعض الأجنة هاتش في الأصل، في نهاية المطاف مما تسبب في الموت. لهذا السبب، نحن عموما استخدام آفة وراثية، مثل glp-4(bn2)28، الذي يوضح النمط الظاهري عقيمة تماما الاختراق لهذه الاختبارات. وينبغي تجنب استخدام المواد الكيميائية التي تمنع التنمية الجنينية، لكنها لا تزال تسمح بوضع البيض، مثل 5-فلوروديوكسيوريديني (فودر)، كما أنها أيضا قد تتداخل مع النمو البكتيري والتنمية.

بشكل عام، وجدنا أنها مفيدة جداً لخطة عدة نقاط زمنية للتحليل. على الرغم من الفحص قوية والتوقيت ينسجم عموما، يمكن أن تحول التغيرات العشوائية وغير محسوس توقيت الإعدام في المقايسة خلال 2-4 ساعات. عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها أمرا ضروريا، غالباً ما يكون من المفيد النظر أولاً في أبسط الأجوبة؛ أي إعداد وسائط جديدة، وتجاهل الثقافات البكتيرية الأكثر حداثة، وإعادة خط السلالات البكتيرية من الأرصدة المجمدة، و ما إلى ذلك فقط نادراً جداً ما لا هذه التدابير استعادة المقايسة إلى وظيفة.

بسبب البساطة النسبية للأسلوب، يمكن بسهولة إجراء مجموعة واسعة من التعديلات. تغيير الديدان من خلفية موحدة glp-4(bn2) لشاشات [رني] الفائق، مثل تلك التي يصف لنا هنا، مفيدة لتحديد مسارات استجابة المضيف لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية السامة و xenobiotics. على سبيل المثال، عن طريق إضافة نفس المادة الكيميائية أو السمية في كل بئر من لوحات [رني] (السميةمثل Cry5B، فينانثروليني، إلخ)، مسارات تغيير الحساسية لهذه السموم يمكن سهولة التعرف. يمكن أيضا استخدام هذه الأنواع من الشاشات لتحديد شبكات الدفاع ضد أي من ترسانة من مسببات الأمراض التي تصيب C. ايليجانس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة بالوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من ولاية تكساس (كبريت) جائزة RR150044، ج المنح البحثية مؤسسة ولش-1930، ومن المعاهد الوطنية من AI110552 K22 على الصحة، منح NVK. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32, (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8, (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12, (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5, (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21, (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6, (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13, (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1, (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8, (1), e55167 (2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154, (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4, (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9, (2), e89189 (2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3, (2), e18 (2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5, (8), e1000540 (2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75, (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300, (5627), 1921 (2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13, (6), e1006876 (2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61, (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116, (3), 755-766 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics