Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

Immunology and Infection

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Summary

Hier beschreiben wir eine Protokoll, die ist ein anpassungsfähiges, ganze Host, High-Content-Screening-Tool, das genutzt werden kann, um Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung verwendet werden.

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Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

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Abstract

Die Zahl der neuen Medikamente identifiziert durch traditionelle, in-vitro- Bildschirme hat nachgelassen, den Erfolg dieses Ansatzes bei der Suche nach neuen Waffen gegen mehrere Resistenzen reduzieren. Dies führte zu dem Schluss, dass Forscher nicht nur Notwendigkeit, neue Medikamente zu finden, sondern auch neue Wege zu finden, sie zu entwickeln müssen. Methoden gehören des vielversprechendsten Kandidat ganzen Organismus, in Vivo Tests dieser Verwendung Hochdurchsatz-, phänotypische auslesen und beherbergt, die von Caenorhabditis Elegans , Danio Rerioreichen. Diese Hosts haben mehrere leistungsstarke Vorteile, einschließlich dramatische Kürzungen in falsche positive Treffer, wie Verbindungen, die giftig für die Host- und/oder Biounavailable sind in der Regel bis in das Einstiegsbild vor kostspieligen folgen gelöscht werden.

Hier zeigen wir, wie unser Test verwendet wurde, um Host-Variation in den gut dokumentierten C. Eleganszu verhören –Pseudomonas Aeruginosa flüssige Tötung Pathosystem. Wir zeigen auch mehrere Erweiterungen dieser gut ausgearbeitete Technik. Wir sind beispielsweise Hochdurchsatz-genetische Bildschirme mit RNAi in 24 oder 96-Well Plattenformate Abfrage Host Faktoren in diesem Wirt-Pathogen Interaktionen durchführen zu können. Mit Hilfe dieser Assay, können gesamte Genom-Bildschirme in nur wenigen Monaten abgeschlossen werden die drastisch vereinfachen kann die Aufgabe Drogeziele potentiell ohne mühsame biochemische Reinigung Ansätze zu ermitteln.

Außerdem berichten wir hier eine Variation unserer Methode, die der gram-positiven Bakterium Enterococcus Faecalis für gramnegative Erreger p. Aeruginosaersetzt. Ähnlich wie bei p. Aeruginosader Fall ist, ist die Tötung von E. Faecalis zeitabhängig. Im Gegensatz zu früheren C. ElegansE. Faecalis -Assays, unsere Assay für E. Faecalis ohne Preinfection auskommt, Verbesserung seiner Sicherheitsprofil und reduzieren die Wahrscheinlichkeit von kontaminierenden Flüssigkeiten Handhabungsgeräte. Der Test ist sehr robust, ~ 95 % Sterbeziffern 96 h Post Infektion zeigen.

Introduction

Die Identifikation und Entwicklung von wirksamen, Breitspektrum-Antibiotika, nun vor fast einem Jahrhundert führte zu einem Wendepunkt im Gesundheitswesen gab es eine weit verbreitete Überzeugung, dass infektiöse Krankheit wäre eine Geißel der Vergangenheit. Innerhalb von wenigen Jahrzehnten begann dieser Optimismus zu schwinden als Erreger nach Erreger Resistenzmechanismen entwickelt, die diese einmal wunderbaren Behandlungen begrenzt. Eine Zeitlang schien das Wettrüsten zwischen Drug Discovery Bemühungen und die Erreger ausgeglichen. Der Missbrauch von Antibiotika hat jedoch vor kurzem bei der Entstehung von Pan-resistente Stämme von Klebsiella Pneumoniae, Acinetobacter Baumanii, Serratia Marcescensund p. Aeruginosa1gipfelte, 2,3,4.

P. Aeruginosa ist ein opportunistisch, Gram negative, Multi-Host Erreger, eine schwere Bedrohung für Patienten mit schweren Verbrennungen, diejenigen, die sind immungeschwächte oder Mukoviszidose. Es wird auch zunehmend als ein Erreger in schweren Nosokomialinfektionen, vor allem durch die laufende Übernahme von Antibiotikaresistenzen identifiziert. Um zu beginnen, um dieser Bedrohung zu begegnen, haben wir den gut dokumentierten C. Elegans-p. Aeruginosa Infektion System5verwendet. Unser Labor hat genutzt, dieses System zu entwickeln eine Liquid-basierter, Hochdurchsatz-, High-Content Screening-Plattform um neue Verbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit des Erregers, die Host-6töten zu begrenzen. Faszinierend, scheinen diese Verbindungen mindestens drei allgemeine Kategorien, einschließlich Antibiotika7 und Virulenz Inhibitoren8anzugehören. Andere High-Content-Droge-Entdeckung-Assays in C. Elegans für Mycobacterium Tuberculosum, Chlamydia Trachomatis, Yersinia Pestis, Listeria Monocytogenes, Francisella Tularensis, Staphylococcus Aureus, Candida Albicans, gemeldet wurden und Enterococcus Faecalis, unter anderem9,10,11,12,13,14,15,16. Diese Arten von Tests haben mehrere allgemein anerkannten Vorteile, wie die Begrenzung falsche positive Treffer, die möglicherweise giftig für beide der Host und der Erreger, erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bioverfügbarkeit im Vergleich zu einem chemischen Bildschirm und Hits jenseits zu identifizieren einfach die Begrenzung mikrobiellen Wachstums, wie Anti-Virulents, immun stimulierende Moleküle oder Verbindungen, die sonst das Gleichgewicht der Wirt-Pathogen Interaktionen zu Gunsten der ehemaligen kippen. Darüber hinaus sind die Verbindungen entdeckt in diesen Bildschirmen oft wirksam bei Säugetieren Gastgeber.

Es ist erwähnenswert, dass mindestens zwei anderen Assays17,18 sind zur Durchführung von Hochdurchsatz-Bildschirme in C. Elegans in Flüssigkeit. Jeder dieser Tests ist jedoch eine Änderung, die die prototypische intestinale Kolonisation Assay, bekannt als langsam-Tötung, in Flüssigkeit, durchgeführt werden kann Erhöhung des Durchsatzes und ermöglicht Verbindungen leichter untersucht werden. Achten Sie darauf, dass Charakterisierung schlüssig nachgewiesen, dass die Mechanismen der bakteriellen Virulenz dieser Assays und unsere Liquid-basierter Bildschirm7unterschiedlich sind. Da beide Arten von Virulenz bei Säugetieren Systemen beobachtet werden, ist es wichtig zu überlegen, welche Virulenz Determinante für den Experimentator Interessen vor Assay Auswahl am relevantesten ist.

Hier zeigen wir eine optimierte Version der Liquid-basierter C. Elegans-P. Aeruginosa Assay. Wir berichten auch die Anpassung der unsere Liquid-basierter Assay-Methode, um den grampositiven bakteriellen Erreger beherbergen Enterococcus Faecalis. Wie p. Aeruginosaist E. Faecalis zunehmend als schwere nosokomiale Bedrohung mit einer wachsenden Bewaffnung der Antibiotikaresistenz Wege1erkannt. Obwohl eine frühere Methode für Hochdurchsatz-Screening von E. Faecalis 14vorhanden ist, erfordert es Preinfection mit dem Erreger, die das Verfahren kompliziert und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kontaminierung Ausrüstung wie die COPAS-FlowSort. Unser Protokoll überflüssig vor Infektion, das Sicherheitsprofil zu verbessern. Zu guter Letzt berichten wir über ein Mittel, mit denen entweder diese Assays kombiniert werden können, mit der Fütterung RNAi, so dass der Benutzer suchen für Host-Faktoren, die eine bei der Schaffung Rolle oder Widerstandskraft gegen Infektionen.

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Protocol

Achtung: P. Aeruginosa und E. Faecalis sind Biosafety Level 2 Krankheitserreger und angemessene Sicherheitsvorkehrungen getroffen, um versehentliche Infektion zu verhindern und Verschmutzung von Oberflächen zu minimieren. Alle Medien und Materialien, die in Kontakt mit Krankheitserregern kommen müssen sterilisiert bzw. verworfen werden. Weitere Richtlinien sind bei der CDC Publikation Biosicherheit in Mikrobiologie und biomedizinischen Labors (BMBL), 5. Auflage erhältlich.

1. Vorbereitung und Wartung von p. aeruginosa

  1. Streak p. Aeruginosa aus einem gefrorenen bestand auf einer nährbodenplatte LB (Lysogeny Brühe). Inkubieren Sie 16 bis 24 h bei 37 ° C
    Hinweis: Führen Sie p. Aeruginosa Experimente innerhalb eines BSL-2 biologischen Sicherheitsschrank zu Sterilität zu gewährleisten. Verwenden Sie entsprechende Sicherheitsvorkehrungen um pathogenen Infektion oder Verunreinigung zu vermeiden.
  2. Übertragen Sie diese Platte auf 4 ° C. Diese Platte werden bei 4 ° C aufbewahrt und Kulturen bis zu einer Woche impfen verwendet. Nach einer Woche zu dekontaminieren Sie und verwerfen Sie die Platte und machen Sie eine neue LB-Streifen-Platte zu.
    Hinweis: P. Aeruginosa Virulenz verringert sich nach längerer Lagerung.
  3. Impfen Sie zwei Tage vor der Einrichtung Assay Platten, 3-5 mL sterile LB-Brühe mit einer einzigen Kolonie von p. Aeruginosa von der Platte in 1.1 gemacht. Inkubation bei 37 ° C für 12 bis 16 Uhr.
    Hinweis: Nicht länger als 16 h inkubieren. In reiche flüssige Kulturen beginnt p. Aeruginosa PA14 zu lösen.
  4. Sterile 10 cm Platten mit langsamen töten Medien vorbereiten (3 g NaCl, 3,5 g Pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL Phosphatpuffer (Menge pro Liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) und 868 mL KH2PO4 (1 M)) und 18 g Agar/L).
    Hinweis: Bereiten Sie Platten vor der Zeit. Sie können bis zu 3 Wochen in einem luftdichten Behälter bei 4 ° c aufbewahrt werden
  5. Säen Sie jede 10 cm langsam töten Platte (SK-Platte) mit 350 μL von p. Aeruginosa von frischen Nacht LB-Kultur. Mit einem sterilen bakterielle Spreader Bakterien gleichmäßig über die Oberfläche der Medien und in einer biologischen Sicherheitsschrank BSL-2 trocknen lassen.
  6. Inkubieren Sie Platten bei 37 ° C für 24 h.

2. Vorbereitung der RNAi-Bakterien

  1. Streifen, oder Pin-Transfer gewünschte Bakterienstämme RNAi-haltigen auf LB-Agar-Platten mit geeigneten Antibiotika (Carbenicillin bei 100 µg/mL) und Tetracyclin bei 15 µg/mL für Ahringer und Vidal-Bibliotheken aus einem gefrorenen bestand.
    Hinweis: Beim Arbeiten mit apathogen Bakterien verwenden entweder eine BSL-2 A / B biologische Sicherheitswerkbank oder Laminar-Flow ein BSL-1 Haube, Sterilität der Kulturen zu gewährleisten und die Möglichkeit einer Kreuzkontamination der Bibliothek zu minimieren.
  2. Inkubieren Sie Platten für 24 h bei 37 ° c
  3. Speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.
    1. Nach zwei Wochen die Platten zu verwerfen und mit frisch zubereiteten Platten zu ersetzen.
  4. Testen Sie mehrere RNAi Stämme parallel durch einzeln impfen eine einzige Kolonie von jeder Klon in 4 mL LB Carbenicillin ergänzt, in einem einzigen gut von einer 24-Well Deep-Well-Platte oder in ein steriles Röhrchen.
    Hinweis: Tetracyclin wurde berichtet, um die Effizienz der RNAi zu reduzieren. Verwenden Sie es nicht in diesem Medium.
  5. 24-Brunnen Tiefbrunnen Platten in einem schütteln Inkubator für multiwell-Platten optimiert und Inkubation bei 37 ° C 16 h unter Schütteln bei 950 u/min.
    Hinweis: Es ist schwer, einheitliche Bakterienwachstum in multiwell-Platten mit einer konventionellen schütteln Inkubator zu erhalten. Der schüttelnde Inkubator muss schütteln bei mindestens 750 u/min in Reihenfolge für die Kulturen richtig wachsen zu können. In Abwesenheit von einem spezialisierten Shaker ist es möglich, jede Kultur in eine einzelne Röhre zu wachsen. Kulturen können in der 24-Well-Platte für Zentrifugation danach übertragen werden, falls gewünscht.
  6. Sammeln Sie Bakterien, indem Sie für 5 Minuten bei 2.000 x g zentrifugieren.
  7. Dekantieren Sie Überstand durch Umdrehen der Plattenrandes und kräftig schütteln. Aufschwemmen Sie RNAi Bakterien in 100 µL der basalen S (5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 in 1 Liter Reinstwasser aufgelöst und durch Autoklaven sterilisiert).
  8. Pipette resuspendierte Bakterien in eine entsprechende Anzahl von Brunnen einer multiwell NGM-Platte (Nematode Wachstumsmedien, 3 g NaCl, 2,5 g Pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL Phosphatpuffer (Menge pro Liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) und 868 mL KH2PO4 (1 M)), und 18 g Agar pro Liter Wasser) mit IPTG (1 mM Endkonzentration) und Carbenicillin (100 μg/mL Endkonzentration) ergänzt.
    1. Verwenden Sie 3,5 mL NGM Medien pro Bohrloch 6-Well-Platte, 1 mL pro Bohrloch einer 24-Well-Platte oder 150 µL pro Bohrloch des 96-Well-Platte.
    2. Verwenden Sie 100 μl/Well von Bakterien, für 6-Well-Platte; 50 μL/gut für 24-Well; oder 20 μL/gut für 96-Well-Platte. Trocknen lassen.
      Hinweis: Trocknung wird normalerweise in einer sterilen Fluss Kapuze, schnelle und gleichmäßige Trocknung zu fördern durchgeführt. Gleichmäßige Trocknung ist sehr wichtig. Vermeiden Sie zu trocknen, Risse im Agar fördert Würmer wühlen. Dies führt zu Verlusten und mögliche Verstopfung der Liquid-Handling-Systeme Wurm.
  9. Die vorbereiteten Platten sofort verwenden oder sie bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen für die spätere Verwendung speichern.
    Hinweis: Um Platten Austrocknen verhindert wird, sie können mit Kunststoff Paraffin Film versiegelt oder in einem dicht verschlossenen Behälter mit feuchten Papiertüchern.

3. Wartung und Vorbereitung von C. elegans

Hinweis: Vor dem Beginn der Experimente, erstellen Sie eine synchronisierte Bevölkerung von trächtigen, Erwachsene hermaphroditischen Würmer wie folgt.

  1. Waschen trächtigen Erwachsene (d. h. mit mehrere Embryonen in die Gonade sichtbar) von 4-6 10 cm NGM Platten in ein 15 mL konische Röhrchen durch Zugabe von 4 mL S basale Platte vorsichtig schwenken und dann in ein 15 mL konische Röhrchen Gießen.
  2. Pellet-Würmer durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 30 Sekunden.
  3. Aspirat überstand, kümmert sich nicht um den Wurm Pellet zu stören.
  4. Fügen Sie 3,5 mL Wurm Bleichmittel-Lösung (Endkonzentration 0,5 M NaOH, 1 % Natriumhypochlorit in sterilem Wasser), der Wurm Pellet und Mix durch Umkehrung für 1 Minute.
  5. Kurz Wirbel und Zentrifuge bei 1.000 x g für 30 Sekunden.
  6. Aspirieren oder dekantieren des Überstands, kümmert sich nicht um den Wurm Pellet zu stören.
  7. Das Wurm-Pellet 3,5 mL frische Wurm Bleichmittel-Lösung hinzufügen.
  8. Mischen Sie kräftig Würmer in Bleichmittel-Lösung. In regelmäßigen Abständen (ca. alle 10 Sekunden) Sichtprüfung Würmer unter dem sezierenden Mikroskop. Achten Sie auf Wurm Nagelhaut zu brechen, Freigabe Eier. Einmal wurden die meisten der erwachsenen Würmer gelösten (~ 95 %), verdünnen Sie Bleichmittel zu 15 mL mit basalen S, Verdauung zu stoppen.
    Hinweis: Eierschalen sind widerstandsfähiger als adulten Geweben zu bleichen, aber sie können bei längerer Einwirkung aufgelöst werden. Zur Vermeidung von Ei Auflösung setzen Sie Eier um Bleichmittel-Lösung für länger als 7 Minuten Wurm nicht aus. Eierschalen sind übermäßig beschädigt, werden die Embryonen sterben.
  9. Pellet-Embryonen bei 1.000 x g für 30 Sekunden und Aspirieren oder dekantieren des Überstands ohne Entfernen der Pellets von Embryonen.
  10. Aufschwemmen Sie Würmer in S zu einem Endvolumen von 15 mL basale verbleibenden Bleichmittel-Lösung verdünnen.
  11. Wiederholen Sie den waschen (3,9-3.10) drei weitere Male für eine Gesamtmenge von 4 aufeinander folgenden Waschungen.
  12. Aspirieren Sie nach der vierten Wäsche überstand und summieren Sie sich zu 5 oder 6 mL steril S Basal in der 15 mL konische Röhrchen. Ziel ist es, Embryonen zu einer Konzentration von ~ 50 Würmer pro Mikroliter aufzuwirbeln.
    Hinweis: Die Höhe der basalen S richtet sich nach der Größe des Pellet-Ei; Je größer das Pellet ist mehr S basale notwendig.
  13. Inkubieren Sie das konische Rohr über Nacht auf einer Tischplatte Rotator bei Raumtemperatur oder 48 h bei 15 ° c Larven schlüpfen, aber Larvalentwicklung wird in der Phase L1 (L1 Diapause) durch Nährstoff Entbehrung verhaften.
  14. Untersuchen Sie die Embryonen unter dem sezierenden Mikroskop um sicherzustellen, dass die meisten von ihnen haben geschlüpft und im L1 Stadium der Entwicklung verhaftet.
  15. Bestimmen Sie die Anzahl der Wurm 20 µL Wurm Prep und verdünnt es mit 80 µL der basalen S. Pipette 10 µL verdünnter Wurm Lösung direkt auf einen leeren Teller der NGM. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
    1. Zählen Sie die Larven an jeder Stelle und bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl. Teilen Sie diesem Durchschnitt durch 2, um eine ungefähre Anzahl von Würmern pro Mikroliter in die Wurm-Prep zu erhalten. Wurm Preps können dann für Vermehrung Platten oder für Experimente verwendet werden.
      Hinweis: Nach 4-5 Tagen werden ausgehungerte Larven beginnen zu sterben; entsorgen Sie die Vorbereitung zu diesem Zeitpunkt.
  16. Für die Vermehrung der Sorte, eine angemessene Anzahl von L1 Würmer (5.000-6.000) auf 3-4 10 cm NGM Teller getupft mit, Pipette konzentrierte OP50 E. Coli – "Supernahrungsmittel" (E. Coli OP50 spotted bei 25 X-Konzentration (d.h. 1 L des über Nacht OP50 Kultur in LB gewachsen liefert 40 mL 25 X OP50 Supernahrungsmittel); 2 mL dieser konzentrierten Bakteriensuspension sind auf jede 10 cm NGM Platte gesichtet).
  17. Um Platten für Experimente vorzubereiten, führen Sie einen der folgenden (für "Basic" Verwendung 3.17.1 Protokolleinstellungen für die "RNAi-Bildschirm einrichten" Verwendung Schritte 3.17.2 - 3.17.4 je nach Bedarf):
    1. Pipette ~ 5.000 Würmer/10 cm Platte mit RNAi oder OP50 Supernahrungsmittel ausgesät.
    2. Pipette ~ 500 Würmer/Brunnen in einem 6-Well-Platte mit RNAi ausgesät.
    3. Pipette ~ 300 Würmer/Brunnen in einer 24-Well-Platte mit RNAi ausgesät.
    4. Pipette ~ 100 Würmer/Brunnen in einer 96-Well-Platte mit RNAi ausgesät.
      Hinweis: Anweisungen wie RNAi ausgesät wurde finden Sie Schritte 2,7-2,9 in Vorbereitung der RNAi-Bakterien.
  18. Wenn eine fruchtbare Sorte Würmer verwendet wird, brüten Sie Würmer bei 25 ° C ~ 44-48 h. Gebrauch diese Würmer so schnell wie möglich nach die Bevölkerung das entsprechende Alter erreicht hat. Dies minimiert die Auswirkungen von Ei schlüpfen innerhalb der Würmer während des Tests.
  19. Wenn die Belastung verwendet wird ist Temperatur-steril (z. B. fer-15(b26); FEM-1(HC17) oder glp-4(bn2)), brüten Würmer bei 15 ° C ~ 16 h und übertragen Sie dann auf 25 ° C für 44 h Entwicklung abzuschließen und verhindern Embryogenese.

4. Flüssigkeit töten Assay Setup (grundlegende Protokoll)

Hinweis: Dies ist ein Protokoll für ein Bakterienstamm und eine Quelle von Würmern.

  1. Mit einem Zelle Schaber, p. Aeruginosa aus ein SK-Platte entfernen und erneut ~ 5 mL S Basal. Scale-up bei Bedarf. Messung der optischen Dichte der Bakteriensuspension mit einem Spektralphotometer (OD600)
  2. 24 mL verdünnten bestand von p. Aeruginosa in basalen S bei OD600 ≈ 0,09 (3 X Endkonzentration) vorzubereiten. 4.6.2 für den endgültigen Inhalt pro Bohrloch zu sehen, und Volumen der bakteriellen Verdünnung entsprechend zu skalieren.
  3. Fügen Sie 21 mL flüssiger Medien langsam zu töten (3 g NaCl, 3,5 g Pepton/l ergänzt mit CaCl2 und MgSO4 , um eine Endkonzentration von 1 mM). Mit einer Mehrkanal-Pipette übertragen Sie 45 µL von Bakterien und Medien in jede Vertiefung ein 384-Well-Platte.
  4. Waschen Sie Würmer von ihrer Quelle (d.h.Schritt 3.17.1) in ein 50 mL konische Röhrchen und ermöglichen Sie Würmer sich unter Schwerkraft zu. Aspirieren Sie Überstand bis 5 mL. Aufschwemmen Sie in insgesamt 50 mL S basal.
  5. Wiederholen Sie 4.4 Schritt zweimal.
  6. Verwenden einen Wurm-Sorter, Sortieren Sie, ca. 22 Würmer in jede Vertiefung von 384-Well-Platte.
    Hinweis: Das Setup fällt jeder Wurm in ~1.1 µL Flüssigkeit. 22 Würmer belaufen sich auf 25 µL 70 µL/Well total Assay Volumen bringen.
    1. Die endgültige Zusammensetzung der einzelnen Brunnen besteht aus 70 µL. 45 µL dieses Bandes wird als bakterielle Medium hinzugefügt (0,03 OD600 Bakterien in 24 µL S basale und 21 µL SK ergänzt mit CaCl2 und MgSO4). Die anderen 25 µL ist mit den 22 Würmern hinzugefügt.
    2. Wenn der Sortierer verwendet hier nicht verfügbar ist (siehe Tabelle der Materialien), Würmer können verdünnt werden, um eine Endkonzentration von 1 Wurm/µL in S basale und pipettiert 25 µL/Well mit einer Mehrkanal-Pipette. Ergebnisse weisen jedoch erhöhte Variabilität. Alternativ ist es möglich, einen peristaltischen liquiden Dispenser zu verwenden, wie durch Leung und Kollegen19beschrieben.
  7. Nachdem die 384-Well-Platte Würmer einsortiert wurden, Dichtplatte mit einem gasdurchlässigen Film und inkubieren Sie Platten bei 25 ° C für 24-48 h.
  8. Zum gewünschten Zeitpunkt verwenden Sie einer Mikrotestplatte Unterlegscheibe, um die 384-Well-Platte mit basalen S waschen insgesamt 5 Mal.
    1. Nach der zweiten Wäsche Aspirieren Sie die meisten Medien, verlassen ~ 20 µL. kräftig schütteln Platten mit einer Mikrotestplatte Vortexer für mindestens 30 Sekunden um jeglichen Schmutz von der Unterseite der Brunnen zu lösen).
  9. Nachdem die letzte Wäsche, aspirat Überstand bis zu 20 µL. hinzufügen 50 µL 0.98 µM Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien) / gut von 384-Well-Platte für eine Endkonzentration von 0,7 µM.
  10. Inkubation bei Raumtemperatur für 12-16 Uhr. Dieser Farbstoff färbt nur Tote Würmer. Nach der gewünschten Inkubationszeit Fleck waschen Platten mit Mikrotestplatte Unterlegscheibe um überschüssiges Öl zu entfernen (mindestens 3 Wäschen).
  11. Verwenden Sie für die Datenerfassung ein Spektralphotometer oder ein automatisiertes Mikroskop Durchlicht und Fluoreszenz (531 nm Anregung und 593 Emission) Bild.
    1. Verwenden Sie ein schwacher Vergrößerung Ziel damit ein Bild des ganzen gut erfasst werden.
    2. Alternativ können Sie Fluss Vermimetry. Diese Technik nutzt ein großes Objekt Durchflusszytometer als ein Wurm Fluorimeter, messen die Größe und die Fluoreszenz des Gesamtorganismus (d. h. C. Elegans) in einer Weise, die Durchflusszytometrie stark ähnelt.
  12. Verwenden Sie automatisierte Bildanalyse-Software (z. B. CellProfiler, ein Kostenloses Bild-Analyse-Studio basierend auf MatLab http://cellprofiler.org/), fluoreszierenden und totale Wurm Bereiche pro Bohrloch auf unvoreingenommene Weise zu berechnen.
    Hinweis: Die Quotient aus diesen Zahlen ist der Bruchteil Tod für jedes gut. Hätte man gut gebeizt 7 Würmer heraus von 20 gesamt, dann der Bruchteil Tod 0,35 oder 35 % umfasst.
    1. Vor dem ersten Gebrauch muss die automatische Bildverarbeitung-Pipeline durch manuelle scoring validiert werden. Dies geschieht durch den Vergleich der Ergebnisse aus der automatisierten Pipeline wird durch das visuell inspizieren Bilder Bruchteile von toten Würmer für jeden von ihnen die Note. Die Validierung stellt sicher, dass die Parameter für die automatisierte bildgebenden Verarbeitung korrekt sind und die Daten korrekt darstellen.

5. Anpassung für Screening mehrere C. Elegans Stämme oder Niederschlägen (RNAi Bildschirmmasken)

Hinweis: Dies ist ein RNAi-Bildschirm für einen 24-Well-Platte-Setup beschrieben.

  1. Fügen Sie 1 mL der basalen S pro Bohrloch einer 24-Well-Platte (siehe Schritt 3.17.3). Sanft schütteln Sie Würmer durch Schütteln der Plattenrandes, dann übertragen Sie Würmer auf eine leer, sterile 24 Deep-Well-Platte. Können Sie Würmer sich gravitativ (~ 5 Minuten).
  2. Aspirieren Sie überstand, so dass ca. 1 mL. 7 mL S Basal in jede Vertiefung hinzugeben.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.2 ein Minimum von 2 weitere Male. Nach dem letzten Waschen Aspirieren Sie überstand, verlassen ca. 400 µL.
  4. Mithilfe der Resampler-Funktion von dem Wurm Sorter sortiert 22 Würmer aus der 24-Well-Platte-Wurm-Suspension in jede Vertiefung ein 384-Well-Platte (jedes gut von einer 24-Well-Platte Erträge 8-12 Brunnen von 384-Well-Platte).
    1. Zur Vermeidung von Hunger pipette Bakterien vor der Sortierung in 384-Well-Platten (eine Sorte, die ausschließlich als Nahrung, wie OP50, dient oder einem pathogenen Stamm).
      Hinweis: Erreger können hinzugefügt werden, indem folgende Schritte 2,3-2,5 oder 6,4-6,5 und Nahrungsquelle Bakterien verdünnt und durch nach dem gleichen Schema wie bei p. Aeruginosahinzugefügt werden können.
  5. Nachdem die 384-Well-Platte Würmer einsortiert wurden, fügen Sie kleine Moleküle oder andere Experiment-spezifische Materialien hinzu.

6. Anpassung für E. faecalis

Hinweis: Es werden nur die Unterschiede von p. Aeruginosa Assay beschrieben.

  1. Bereiten Sie eine frische Quelle von E. Faecalis durch Schlieren Bakterien aus einem gefrorenen bestand auf einer Agarplatte BHI (Brain Heart Infusion) und Inkubation für 16 bis 24 h bei 37 ° C.
    Hinweis: Führen Sie E. Faecalis Experimente innerhalb eines BSL-2 biologischen Sicherheitsschrank zu Sterilität zu gewährleisten. Verwenden Sie entsprechende Sicherheitsvorkehrungen um pathogenen Infektion oder Verunreinigung zu vermeiden.
  2. Platten können bis zu eine Woche lang bei 4 ° C gelagert werden. Nach Ablauf dieser Frist zu ersetzen mit einem frischen Teller.
  3. Die Nacht vor dem Sortieren Würmer, impfen 3-5 mL sterile BHI mit einer einzigen Kolonie von E. Faecalis. Inkubieren Sie 12-16 h bei 37 ° C unter Rühren.
  4. Fügen Sie Bakterien in die Vertiefungen wie bei p. Aeruginosa (3 X Bakterien im basalen S OD600≈0.09).
    Hinweis: Für E. Faecalis, die endgültige Zusammensetzung gut ist: E. Faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10 % V/V, mit dem restlichen Volumen bestehend aus S basal. Beachten Sie, dass 25 µL der basalen S wird mit Würmern geliefert werden.
    Hinweis: E. Faecalis produziert dicken Biofilme, die die fluoreszierenden Fleck aufsaugen was zu unscharfe Bildern. Umfangreiche waschen kann ausreichen, um diesen Biofilm zu entfernen. In diesem Fall können Würmer auf einen leeren Teller mit einer Mehrkanal-Pipette übertragen werden. Zur Erleichterung der Übertragung können Tween 20 S Basal, eine Endkonzentration von 0,1 % (V/V) Tween 20 in basalen S hinzugefügt werden. Dies hilft bei der Beseitigung der Würmer aus der Biofilm.

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Representative Results

Wichtige Parameter für die Testleistung

Ein richtiges Verständnis der zugrunde liegenden dieser Assay Biologie ist notwendig für die Problembehandlung und Optimierung der Assay. Zu diesem Zweck verweisen wir zunächst auf einige wichtige Papiere, die Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese von p. Aeruginosa-vermittelte Tötung in liquid7,20. Unter der Voraussetzung, dass die oben genannten Schritte befolgt werden (siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Assay-Protokoll) wird eine zeitabhängige Tötung von C. Elegans nur in Anwesenheit der Erreger (Abbildung 2A) eingehalten werden. Im Gegensatz dazu wird in das Fehlen von wichtigen Nahrungsergänzungen (z. B. wenn die Pepton aus den Medien bleibt, und nur der basalen S hinzugefügt wird), wenig bis keine Tötung (Abbildung 2 b) beobachtet werden. Interessant ist, dass die zweistufigen Inkubation von p. Aeruginosa (für 24 h bei 37 ° C, dann 24 h bei 25 ° C), ist von entscheidender Bedeutung für konventionelle langsam-Tötung-Assays und war ursprünglich, in flüssigen töten21, umgesetzt in diesem Assay ( entbehrlich Abbildung 2). Es ist zwar möglich, fügen Sie p. Aeruginosa direkt aus über Nacht LB Kultur damit deutlich ändert Letalität Kinetik und wird nicht empfohlen.

Assay-Biologie zu verstehen ermöglicht auch Vereinfachung des Assays, wenn angemessen und wünschenswert. Zum Beispiel der wichtigste Treiber der Host in diesem Assay zu töten ist Siderophore Pyoverdine, und Host Toxizität verursacht durch Pyoverdine ist abhängig von seiner Fähigkeit, Eisen7zu binden. Als solche kann der Test vereinfacht werden, mit der Substitution von Pyoverdine-reiche Filtrat, gereinigten Pyoverdine oder sogar einige synthetische Eisen chelatisierenden Chemikalien (z. B. 1,10-Phenanthroline) für lebende Bakterien als transcriptional Antwort der C. elegans für diese Behandlungen ist sehr ähnlich (Abbildung 3)22.

Verschiedene Linien des Beweises zu sprechen, die Robustheit des experimentellen Aufbaus. Erstens verträgt das Setup eine Vielzahl von anfänglichen Bakterienkonzentration. Konzentrationen von OD600 = 0.0025 (ca. 10-divisibel niedriger als empfohlen) noch Ausstellung zeitabhängig und Konzentration Tötung, obwohl das Timing (Abb. 4A) verlagern. Zweitens ist die Reproduzierbarkeit des Tests so, dass möglichst wenige als 4 Brunnen ist häufig ausreichend, um statistisch signifikante Daten (Abbildung 4 b) zu erhalten.

Es gibt einige Änderungen, die wir nicht empfehlen. Verwenden beispielsweise erste Bakterien Impfkulturen mit Konzentrationen viel höher als die im Protokoll aufgeführt; Dies führt in dicken, Biofilm Material, das schwierig oder unmöglich effektiv abzuwaschen ist die scoring Letalität erschwert. Darüber hinaus können hoher Konzentration bakterielle Impfkulturen auch konkurrieren für Sauerstoff und unspezifische Host töten7auslösen.

Ein weiterer wichtiger Hinweis ist den Zeitraum zwischen Stopp der Assay und imaging die toten Würmer zu begrenzen. Beachten Sie, dass dieser Zeitrahmen enthalten muss, Färbung, so ist es wichtig, effizient zu sein. Nach dem Tod beginnt das biologische Material in Worms zu Extrudieren und/oder von Bakterien konsumiert werden. Innerhalb von 24-32 h bleibt nur die Nagelhaut. Die Kutikula Flecken sehr schlecht und ist sehr leicht, macht es einfach, während Wäschen verlieren. Es ist wichtig zu beachten, dass Dehnungen oder Belastung/RNAi-Bedingungen mit sehr unterschiedlichen Kinetik des Tötens können durch dieses Phänomen (d. h. , die einige Würmer noch am Leben sein können, während andere bereits, deren Inhalt verloren haben und sind unmöglich zu Bild) erschwert werden. Abbildung 4A zeigt dieses Phänomen als Würmer auf der linken Seite der Platte, lebst mit sehr geringen anfänglichen Bakterienkonzentration geimpft, noch weitgehend während der Würmer auf der rechten Seite der Platte, die viel höheren Konzentrationen von ausgesetzt wurden Bakterien, wurden weg gewaschen.

Eine sehr wichtige Determinante der Assay-Erfolg ist die Methode, die Daten sammeln und analysieren. In unserem Labor haben wir mindestens drei Methoden zum Sammeln von Daten von dieser Assays verwendet: Spektrophotometrie, automatisierte Mikroskopie und Fluss Vermimetry (d. h. die Anpassung des Flow Cytometry Techniken zu C. Elegans; wörtlich: die Messung Würmer in einer flüssigen Lösung). Die erste dieser Methoden verwendet eine Spectophotometer um die Fluoreszenz der Farbstoff oder Reporter der Würmer in Frage zu lesen. Diese Methode hat den Vorteil, mit einem ziemlich allgegenwärtig Stück Ausrüstung (ein standard Spektralfotometer mit einer Mikrotestplatte Leser) und ist die schnellste Methode, um Daten zu erwerben. Allerdings mangelt es den Informationsgehalt von automatisierten Mikroskopie und die statistische Aussagekraft der Fluss Vermimetry.

Automatisierte Mikroskopie ist eine weitere nützliche Option. Eine Reihe von Mikrotestplatte bildgebende Systeme sind derzeit auf dem Markt, bis hin zu Preisen, die erschwinglich sind für einen einzelnen Forscher (z. B. ein Bio-Tek Cytation5) zu größeren, teureren und hochwertigere Maschinen, die häufiger im Kern gefunden werden Einrichtungen (z. B. eine molekulare Geräte ImageXpress Mikroskop). In der Praxis sind die meisten dieser Lösungen für erzielte die meisten Bildschirme und Assays. Automatisierte Bildverarbeitung-Plattformen können auch nachgeschaltete Software zur Bildbearbeitung (z. B. MetaMorph, ImageJ, Gene5 oder Zelle Profiler) um die Ausbeute an Informationen weiter gekoppelt werden. Beispiele für den Nutzen der Verarbeitung sind in Abbildung 5 und Abbildung 6. Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis (wie in Abbildung 5) hoch ist, Analyse ist einfach und Unterscheidung zwischen positiven und negativen Bedingungen ist trivial. In diesen Fällen können auch schwache Treffer leicht identifiziert werden. Viele Tests haben jedoch eine schwächere Signal-Rausch-Verhältnis. Behandlung von PINK-1::GFP22 Würmer (mit konstitutiven mCherry Ausdruck in ihren Pharynges) mit 1,10-Phenathroline erhöht beispielsweise die PINK-1::GFP. Für die Datenanalyse ist die induzierbare GFP-Reporter auf der konstitutiven mCherry Signal (Abbildung 6) normalisiert. In diesem Fall die Reporter hat schwächere Ausdruck und/oder in der Mehrheit der Würmer nicht aktiviert ist. Daher kann es vorteilhaft sein, Umsetzung zusätzliche Bildbearbeitungs-Tools, wie Zelle Profiler, die Hintergrund reduzieren und Signal verstärken.

Schließlich, wenn ein COPAS FlowPilot verfügbar ist, kann es zur Gewinnung von Daten über Fluss Vermimetry verwendet werden. Viel kann wie die bekannteren Konzept der Durchflusszytometrie, dieses Instrument zur Messung der Fluoreszenz von C. Elegans in mindestens zwei oder drei Kanäle gleichzeitig verwendet werden. Diese Methode ist sehr zugänglich für den Erwerb von Daten mit hoher statistischer Signifikanz, aber der Durchsatz ist sehr viel im Vergleich zu automatisierten Mikroskopie vermindert. Der wichtigste Vorteil der Fluss Vermimetry liegt in der Fähigkeit, ganze Wurm Populationen als eine einzelne Gruppe replizieren, anstatt sie in mehrere Vertiefungen aufteilen und Analyse des Durchschnitts der Brunnen zu analysieren. Große Gruppen auf diese Weise dramatisch analysieren die statistische Aussagekraft verbessert und ermöglicht die Erkennung von auch kleine Effekte.

Änderungen des flüssigen Tötung Assays

Aktuelle Entwicklungen des Assays haben seine Nützlichkeit erweitert durch Aktivierung der fluoreszierenden Reporter (Abbildung 6), Medium-High Throughput RNAi Techniken (Abbildung 3), und auch die Ersetzung der ursprünglichen Untersuchung einschließlich Erreger.

Der offensichtlichste Grund RNAi einrichten verwenden soll für Host Verteidigung Bahnen gegen p. Aeruginosa (oder andere Krankheitserreger) zu testen. Beispiele für RNAi Knockdown von Genen, die relevant für das Überleben in der Probe sind in Abbildung 3dargestellt. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen20,23,24,25, verbesserte daf-2(RNAi) C. Elegans überleben während der Exposition gegenüber p. Aeruginosa, während Daf-16) RNAi), zip-2(RNAi) und cebp-1(RNAi) gekürzt. Wie bereits erwähnt, gehört RNAi am einfachsten in der Probe, die wachsende Worms am multiwell-Platten wo jeder auch einen unterschiedlichen RNAi-Klon enthält. Aufgrund der hohen Viskosität der Agar und Kleinmengen beteiligt ist es schwierig, einheitliche, blasenfreie Füllung der 96-Well-Platten ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen. Trocknen die Bakterienstämme, die Durchführung der RNAi kann darüber hinaus auch ein Problem sein, da die äußeren Brunnen Trocknen schneller als inneren Brunnen führt zu Uneinheitlichkeit und bedeutende Potenzial auf Agar Risse. Wie bereits erwähnt, fördert diese Würmer zu buddeln, Verringerung der Zahl der Tiere für Screening und Risiken Verstopfung Liquid-Handling-Maschinen zur Verfügung. Für beide der folgenden Gründe sind 24-Well Platten einfacher zu handhaben als 96-Well-Platten. Obwohl das Assay Durchsatz reduziert, es verbessert die Zuverlässigkeit und empfiehlt sich besonders für Einstiegsbilder.

Schließlich wurde der Test Assay p. Aeruginosa mit E. Faecalisersetzen geändert. (Im Prinzip Substitution mit anderen Bakterienarten nicht unnötige Schwierigkeiten, soll unter der Voraussetzung, dass geeignete Kultivierung und Expositionsbedingungen identifiziert werden.) Der wichtigste Faktor zu berücksichtigen ist die Medienanforderungen des Erregers, für Wachstum und Entwicklung und für die Induktion der Virulenz. Beispielsweise erfordert der Gram positive, opportunistische Erreger E. Faecalis nährstoffreiche Medien (wie BHI) und Inkubation bei höheren Temperaturen im Vergleich zu p. Aeruginosa14,26. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren, Anpassung der Assay, E. Faecalis zu verwenden war einfach. Wie bereits erwähnt für p. Aeruginosa, sahen wir zeitabhängige Tötung (Abbildung 7). Interessanterweise war der Zeitpunkt des Todes ähnlich wie zuvor veröffentlichten Assays, die Pre-Infektion auf Agar-Platten26, trotz des Fehlens von diesem Schritt, was darauf hindeuten könnte verwendet, dass die Mechanismen in der Pathogenese variieren.

Figure 1
Abbildung 1: Schema für Liquid-basierter C. Elegans p. Aeruginosa Infektion Assay. Schritten, Nematoden Ausbreitung und Vorbereitung sind Links, bakterielle Vorbereitung sind auf der rechten Seite. Schritten, beide sind zentriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Tötung von C. Elegans durch p. Aeruginosa ist spezifisch und erfordert die richtige bakterielle Ernährung. (A) C. Elegans Tod im Beisein von E. Coli und p. Aeruginosa. (B) C. Elegans Tod im Beisein von p. Aeruginosa mit (rechts) und ohne (links) langsam töten Medien Mischen hinzugefügt (d. h. S nur basal). Basalen S ist eine minimale Medien und enthält keine für das bakterielle Wachstum benötigten Nährstoffe und verhindert die Produktion von Pyoverdine. (C) C. Elegans Tod im Beisein von anders vorbereitet p. Aeruginosa. p < 0,01, basierend auf der Student t-test. Fehlerbalken darzustellen S.E.M 10 Brunnen pro biologische replizieren pro Zustand verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: C. Elegans Widerstand gegen p. Aeruginosa hängt Host immun Wege. Eine Gruppe von ausgewählten RNAi Niederschlägen wurde mit p. Aeruginosa (A) oder 1,10-Phenanthroline (eine chemische Chelator, die Exposition gegenüber p. Aeruginosa in Flüssigkeit imitiert) behandelt (B). p < 0,01, #p < 0,05, basierend auf der Student t-test. Fehlerbalken darzustellen S.E.M 10 Brunnen pro biologische replizieren pro Zustand verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: C. Elegans Tötung durch p. Aeruginosa ist robust und bakterielle Konzentration abhängig. (A-B) repräsentative Bilder (A) und (B) Quantifizierung von C. Elegans Tod nach Exposition mit unterschiedlichen Konzentrationen von p. Aeruginosa für 72 h p-Werte wurden berechnet anhand des Schülers t -test. Maßstabsleiste in (A) ist 1 mm. 16 Brunnen pro biologische replizieren pro Zustand verwendet wurden. BF: Helles Feld, FL: Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Erwerb und Bild Datenverarbeitung ein Test mit einem starken Signal. (A) repräsentative Bilder live (Negativkontrolle) und Toten (Positivkontrolle) C. Elegans. (B) statistische Analyse der negativen und positiven Steuerelemente basierend auf Daten Erwerbsmethode Verarbeitungsmodus und Anzahl der Bohrungen analysiert. (C) Fluoreszenz wurde für Würmer aus vier einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte (zwei Positive und 2 negative Kontrolle Brunnen) analysiert. Jeder enthielt auch ~ 100 Würmer. Jeder Punkt im Diagramm stellt einen einzigen Wurm, Time-of-Flight (die korreliert mit, sondern durch das Aufwickeln der lebende Würmer unvollkommen entspricht Größe) und die gemessene Fluoreszenz für Würmer, die gefärbt sind mit Sytox Orange zeigen. Positivkontrolle Würmer wurden vorab durch Hitzeeinwirkung getötet. Aufgrund von Änderungen in Form von toten Würmer und Spannung (wie in (A) gesehen werden kann, erscheinen mehr stabförmige toten Würmer und haben einige Körper Kurven) im Vergleich zu lebenden, toten Würmer haben eine längere TOF. p-Werte wurden anhand der Student t-test. Maßstabsleiste in (A) beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Erwerb und Bild Datenverarbeitung ein Test mit einem moderaten Signal. (A) repräsentative Bilder von C. Elegans tragen ein induzierbares PINK-1::GFP-Reporter und ein mCherry konstitutiv Marker (um die Expression von Genen aus dem Extrachromosomale Array zu normalisieren). C. Elegans DMSO (Negativkontrolle) oder 1,10-Phenanthroline (Positivkontrolle) ausgesetzt. (B) statistische Analyse der negativen und positiven Steuerelemente basierend auf Daten Erwerbsmethode Verarbeitungsmodus und Anzahl der Bohrungen analysiert. (C) vier individuelle Vertiefungen einer 96-Well-Platte (zwei Positive und 2 negative Kontrolle Brunnen) wurden mit Flow Vermimetry analysiert. p-Werte wurden anhand der Student t-test. Maßstabsleiste in (A) beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: C. Elegans Tötung durch E. Faecalis ist robust und Zeit abhängig. (A-B) repräsentative Bilder (A) und (B) Quantifizierung von C. Elegans Tod nach Exposition gegenüber E. Faecalis. p < 0,01, basierend auf der Student t-test. 10 Bohrungen wurden pro biologische replizieren pro Zustand verwendet. Fehlerbalken darzustellen S.E.M Maßstabsbalken in (A) ist 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieser Assay (oder ähnliche Tests wo andere Krankheitserreger für p. Aeruginosa oder E. Faecalisersetzt werden) eignet sich für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der Arzneimittelforschung. Es ist auch nützlich für grundlegende biologische Fragestellungen, z. B. Virulenzfaktoren, die Aufklärung der Host Verteidigung Bahnen, Identifizierung und Bestimmung der regulatorischen Maschinen der Wirt-Erreger-Interaktion beteiligt.

Obwohl p. Aeruginosa flüssige Tötung-Assay robust ist, gibt es einige Punkte, wo sorgfältige Augenmerk gelegt werden sollte, um das Risiko des Scheiterns zu minimieren. Zunächst, wie bereits erwähnt, muss die bakterielle Quelle Platte für p. Aeruginosa Impfungen bleiben frisch, damit die Bakterien Virulenz, trotz über Nacht LB verlieren. Zweitens ist es Schlüssel um sicherzustellen, dass Calcium und Magnesium p. Aeruginosa töten Assays hinzugefügt werden. Ohne sie wird Virulenz erheblich gefährdet. Schließlich ist es erwähnenswert, dass Würmer aufgezogen auf HT115 (für RNAi-basierten Assays) deutlich später sterben werden als Würmer auf OP50 aufgezogen (N. Kirijenko, persönliche Kommunikation). Aus diesem Grund, wenn RNAi-basierten Studien zu wechseln ist es wichtig, empirisch zu bestimmen, den beste Zeitpunkt für den Assay.

Für das Töten von Assays mit p. Aeruginosa oder E. Faecalis, ist es wichtig, sicherzustellen, dass gibt es ausreichend Nahrung für die Entwicklung der Würmer aus der L1-Stufe, bis sie bereit sind, in der Probe verwendet werden. Hunger, auch kurzfristig, ist bekannt für eine Anzahl von Host Verteidigung Wege, wie der DAF-2/DAF-16 Insulin/IGF Signalisierung Netzwerk27aktivieren. Unsere Daten deuten darauf hin, dass DAF-16/FOXO ist bereits leicht durch flüssige20kultiviert wird aktiviert, und weitere Aktivierung stark unerwünscht, ist da DAF-16/FOXO Breitspektrum Erreger Widerstand23fördert.

Schließlich ist es entscheidend, völlig steril Würmer in jedem Test zu verwenden, die stützt sich auf Sterblichkeit als eine Anzeige. Wenn Würmer fruchtbar sind, wird in Flüssigkeit verursacht Schwierigkeiten bei der Eiablage. Infolgedessen schlüpfen einige der Embryonen innerhalb des übergeordneten Elements, was schließlich zu seinem Tod. Aus diesem Grund verwenden wir in der Regel eine genetische Läsion, wie glp-4(bn2)28, , das einen komplett durchdringungsmittel sterilen Phänotyp für diese Assays demonstriert. Die Verwendung von Chemikalien, die embryonale Entwicklung zu verhindern, aber immer noch erlauben, Eiablage, z. B. 5-Fluorodeoxyuridine (FUdR), sollte vermieden werden, da sie auch bakterielles Wachstum und Entwicklung beeinträchtigen.

Im allgemeinen fanden wir es sehr hilfreich, mehrere Zeitpunkte für die Analyse zu planen. Obwohl der Test robust ist und das Timing im Allgemeinen ist, können stochastische und unmerkliche Veränderungen den Zeitpunkt des Todes in der Probe innerhalb von 2-4 Stunden verschieben. Wenn Problembehandlung erforderlich ist, ist es oft hilfreich, zuerst die einfachsten Antworten überlegen; d. h. bereiten frische Medien, verwerfen die jüngsten Bakterienkulturen und erneut Streifen Bakterienstämme aus gefrorenen Vorräte, etc. , nur sehr selten diese Maßnahmen nicht den Assay Funktionalität wiederherzustellen.

Aufgrund der relativen Einfachheit der Methode kann eine Vielzahl von Modifikationen leicht durchgeführt werden. Ändern die Würmer aus einem einheitlichen glp-4(bn2) Hintergrund für Hochdurchsatz-RNAi-Screens, wie z. B. diejenigen beschreiben wir hier ist nützlich für die Identifizierung von Host Reaktion Wege für eine breite Palette von XENOBIOTIKA und giftige Chemikalien. Beispielsweise können durch das Hinzufügen der gleichen chemischen oder Toxin in jede Vertiefung der RNAi-Platten (z. B. Cry5B Toxin, Phenanthroline usw.), Wege, die die Sensibilität für diese Toxine zu ändern leicht identifiziert werden. Diese Arten von Bildschirmen können auch zur Verteidigung Netzwerke gegen das Spektrum der Erreger zu identifizieren, die C. Eleganszu infizieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der Krebsprävention und Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930, und von den nationalen Instituten der Gesundheit K22 AI110552 verliehen an NVK unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

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