Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Immunology and Infection

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Summary

Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.

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Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

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Abstract

O número de novas drogas identificado pelo tradicional, telas em vitro tem diminuído, reduzindo o sucesso desta abordagem na busca de novas armas combater a resistência a múltiplas drogas. Isto levou à conclusão de que pesquisadores não só a necessidade de encontrar novas drogas, mas também precisam desenvolver novas formas de encontrá-los. Entre o candidato mais promissor métodos são todo-organismo, in vivo , os ensaios que uso elevado-throughput, fenotípicas leituras e hospeda que variam entre Caenorhabditis elegans Danio rerio. Esses hosts têm várias vantagens poderosas, incluindo grandes reduções no falsos positivos hits, como compostos que são tóxicos para o anfitrião e/ou biounavailable são tipicamente caiu na tela inicial, antes de seguir caro acima.

Aqui nós mostramos como nosso ensaio tem sido usado para interrogar a variação do anfitrião na bem documentada c. elegans— patossistema líquido da matança dePseudomonas aeruginosa . Também demonstramos várias extensões desta técnica bem trabalhado para fora. Por exemplo, somos capazes de realizar elevado-throughput genéticas telas usando RNAi em 24 - ou 96 poços placa formatos de fatores do hospedeiro consulta nessa interação patógeno-hospedeiro. Usando este ensaio, telas de genoma inteiro podem ser concluídas em poucos meses, que drasticamente podem simplificar a tarefa de identificar alvos de drogas, potencialmente sem a necessidade de abordagens de purificação bioquímica laborioso.

Também relatamos aqui uma variação do nosso método que substitui a Gram-positive bactéria Enterococcus faecalis para o patógeno gram-negativa p. aeruginosa. Muito, como é o caso de p. aeruginosa, matar por E. faecalis é dependente do tempo. Ao contrário do anterior c. elegans— ensaios deE. faecalis , nosso ensaio de E. faecalis não precisam preinfection, melhorar seu perfil de segurança e reduzindo as chances de contaminar o equipamento de tratamento de líquido. O ensaio é altamente robusto, apresentando infecção de post ~ 95% taxas de morte 96 h.

Introduction

A identificação e o desenvolvimento de antibióticos de amplo espectro, eficazes, agora quase um século atrás, levaram a um momento decisivo na saúde pública onde havia uma crença generalizada que infecciosa doença seria um flagelo do passado. Dentro de poucas décadas, esse otimismo começou a diminuir, como patógeno após patógeno desenvolver mecanismos de resistência que limitado a esses tratamentos uma vez milagrosos. Há algum tempo, a corrida armamentista entre os esforços de descoberta de drogas e os patógenos parecia equilibrada. No entanto, o abuso de antimicrobianos recentemente culminou no surgimento de cepas de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pandrogas resistentes 2,3,4.

P. aeruginosa é um oportunista, gram negativos, vários hosts patógeno que é uma ameaça grave para os pacientes com queimaduras graves, aqueles que estão imunocomprometidos, ou tem fibrose cística. É também cada vez mais identificado como um agente causador de infecções nosocomiais graves, particularmente devido a sua aquisição em curso de resistência aos antimicrobianos. Para começar, para enfrentar esta ameaça, nós usamos o bem-documentado c. elegans-p. aeruginosa infecção sistema5. Nosso laboratório tem aproveitado este sistema para desenvolver uma plataforma baseada em líquido, alta produtividade, alto teor de rastreio para identificar novos compostos que limitam a capacidade do patógeno para matar o anfitrião6. Curiosamente, estes compostos parecem pertencer pelo menos três categorias gerais, incluindo antimicrobianos7 e virulência inibidores8. Outros ensaios de descoberta de drogas de alto teor em c. elegans foram relatados para Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, entre outros9,10,11,12,13,14,15,16. Esses tipos de ensaios têm várias vantagens bem reconhecidas, como falsos positivos sucessos que podem ser tóxicos para o host e o patógeno, aumento da probabilidade de biodisponibilidade em comparação com uma tela de química e a capacidade de identificar sucessos além de limitar simplesmente limitar o crescimento microbiano, como anti-virulents, imunes estimulatórios moléculas ou compostos que caso contrário inclinar o equilíbrio da interação patógeno-hospedeiro em favor do antigo. Além disso, os compostos descobertos nessas telas são frequentemente eficazes em hospedeiros mamíferos.

É interessante notar que pelo menos dois outros ensaios17,18 estão disponíveis para realizar em telas de alta produtividade em c. elegans em líquido. No entanto, cada um destes ensaios é uma modificação que permite o ensaio de colonização intestinal protótipo, conhecido como lento-matança, a realizar-se em líquido, aumentando o throughput e permitindo compostos mais prontamente ser projectado. Caracterização cuidadosa demonstrou conclusivamente que os mecanismos de virulência bacteriana são diferentes entre estes ensaios e nossa tela baseada em líquido7. Desde que ambos os tipos de virulência são observados nos sistemas dos mamíferos, é importante considerar quais determinantes de virulência são mais relevante para os interesses do experimentador antes da seleção do ensaio.

Aqui demonstramos uma versão otimizada do líquido-baseado ensaio c. elegans-P. aeruginosa . Também relatamos a adaptação do nosso método de ensaio de líquido-baseado para acomodar o patógeno bacteriano Gram-positiva Enterococcus faecalis. Como p. aeruginosa, E. faecalis é identificado cada vez mais como uma ameaça séria nosocomial com um armamento crescente de resistência antimicrobiana vias1. Embora um método anterior de seleção da elevado-produção de E. faecalis existe14, exige preinfection com o patógeno, o que complica o processo e aumenta a probabilidade de contaminação de equipamentos como o FlowSort COPAS. Nosso protocolo elimina a necessidade de pre-infecção, melhorando o perfil de segurança. Finalmente, nós relatamos um meio pelo qual um destes ensaios podem ser combinado com alimentação RNAi, permitindo que o usuário Pesquisar por fatores do hospedeiro que desempenham um papel no estabelecimento de, ou resistência à infecção.

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Protocol

Cuidado: P. aeruginosa e E. faecalis são patógenos de biossegurança nível 2, e devidas precauções de segurança devem ser tomadas para prevenir a infecção acidental e para minimizar a contaminação das superfícies. Todas as mídias e materiais que entram em contato com patógenos devem ser esterilizados e/ou descartadas. Orientações adicionais estão disponíveis a partir da publicação do CDC biossegurança em microbiológicas e laboratórios biomédicos (BMBL), 5ª edição.

1. preparação e manutenção de p. aeruginosa

  1. Raia de p. aeruginosa de um estoque congelado em uma placa de ágar LB (lisogenia caldo). Incubar a 16 a 24 h a 37 ° C
    Nota: Realize experimentos de p. aeruginosa dentro um BSL-2 de segurança biológica para assegurar a esterilidade. Use precauções de segurança adequadas para minimizar a chance de infecção patogénica ou contaminação.
  2. Transferir essa placa para 4 ° C. Esta placa pode ser mantida a 4 ° C e utilizada para inocular culturas por até uma semana. Depois de uma semana, descontaminar e descartar a placa e fazer um novo prato de raia LB.
    Nota: A virulência de p. aeruginosa diminui após um armazenamento prolongado.
  3. Dois dias antes da criação de placas de ensaio, inocule 3-5 mL de caldo LB esterilizado com uma única colônia de p. aeruginosa da placa feita em 1.1. Incube a 37 ° C por 12 a 16 h.
    Nota: Não incube mais de 16 h. Em culturas de líquido ricas, p. aeruginosa PA14 começa a lyse.
  4. Preparar placas estéreis de 10 cm com mídia matar lenta (3G de NaCl, peptona de 3,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL de tampão fosfato (quantidade por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) e 868 mL de KH2PO4 (1 M)) e ágar de 18 g/L).
    Nota: Prepare pratos antes do tempo. Eles podem ser armazenados por até 3 semanas em um recipiente hermético a 4 ° C.
  5. As sementes cada 10cm matar lenta placa (SK) com 350 μL de p. aeruginosa de cultura LB fresca durante a noite. Usando um difusor bacteriana estéril, equitativamente distribuídos por bactérias superfície da mídia e deixe-a secar em uma BSL-2 de segurança biológica.
  6. Incube as placas a 37 ° C por 24 h.

2. preparação de bactérias de RNAi

  1. Raia para fora ou desejada de pino-transferência cepas de bactérias contendo RNAi em placas de ágar LB contendo antibióticos apropriados (carbenicilina a 100 µ g/mL) e tetraciclina em 15 µ g/mL para Ahringer e Vidal bibliotecas de um estoque congelado.
    Nota: Quando se trabalha com bactérias não-patogênicas, use qualquer um A BSL-2 / B câmara de segurança biológica ou um fluxo laminar de BSL-1 capa para garantir a esterilidade das culturas e para minimizar a possibilidade de contaminação da biblioteca.
  2. Incubar as placas por 24 h a 37 ° C.
  3. Armazene as placas a 4 ° C por até duas semanas.
    1. Depois de duas semanas, descartar as placas e substituí-los com pratos feitos recentemente.
  4. Teste várias cepas de RNAi em paralelo, individualmente, inocular uma única colônia de cada clone em 4 mL de LB carbenicilina-completados em um único bem de uma placa de 24-bem profundo ou em um tubo de ensaio estéril.
    Nota: A tetraciclina tem sido relatada para reduzir a eficiência de RNAi. Não usá-lo nessa mídia.
  5. Coloque placas poço 24-poço profundo em uma incubadora tremendo otimizada para placas do multiwell e incubar a 37 ° C, durante 16 h agitando a 950 rpm.
    Nota: É difícil obter uniforme crescimento bacteriano em placas do multiwell usando uma incubadora tremendo convencional. A incubadora tremendo precisa ser capaz de abalar no mínimo de 750 rpm para que as culturas a crescer corretamente. Na ausência de um abanador especializado, é possível crescer cada cultura num tubo individual. Culturas podem ser transferidas para a placa de 24 para centrifugação depois, se desejado.
  6. Colete as bactérias por centrifugação por 5 minutos a 2.000 x g.
  7. Decante o sobrenadante por inverter a placa e agitação vigorosa. Resuspenda as bactérias de RNAi em 100 µ l de S Basal (5,85 g de NaCl, 1 g K2HPO4, 6g KH2PO4 dissolvido em 1 L de água ultrapura e esterilizados em autoclave).
  8. Pipetar ressuspensão de bactérias para um número adequado de poços de uma placa NGM do multiwell (nematódeo crescimento Media, 3 g de NaCl, peptona 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL de tampão fosfato (quantidade por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) e 868 mL de KH2PO4 (1 M)) e ágar de 18 g por litro de água) suplementado com IPTG (concentração final de 1 mM) e carbenicilina (concentração final de 100 μg/mL).
    1. Use 3,5 mL de mídia NGM por alvéolo de placa de 6, 1 mL por bem de uma placa de 24 ou 150 µ l por poço da placa de 96 poços.
    2. Use 100 μL/poço de bactérias para a placa de 6; 50 μL/poço para 24-bem; ou 20 μL/poço para placa de 96 poços. Deixe-a secar.
      Nota: Secagem normalmente é executada em uma capa de fluxo estéril para promover a secagem rápida e uniforme. Secagem uniforme é muito importante. Evite o ressecamento, como rachaduras em agar promovem a construção de galerias de vermes. Isto leva a worm perdas e potencial de entupimento dos sistemas de tratamento de líquido.
  9. Use as placas preparadas imediatamente ou armazená-los em 4 ° C por até duas semanas para uso posterior.
    Nota: Para impedir a secagem de placas, podem ser selados com filme plástico parafina ou colocados em um recipiente hermeticamente fechado com toalhas de papel húmido.

3. manutenção e preparação de c. elegans

Nota: Antes de iniciar os experimentos, gere uma população sincronizada de vermes hermafroditas gravid, adultos como segue.

  1. Lave adultos gravid (i.e., com múltiplos embriões visíveis dentro a gônada) de 4-6 chapas de NGM de 10 cm em um tubo cônico de 15 mL, adicionando-se 4 mL de S Basal a placa, agitando suavemente e em seguida despejando um tubo cônico de 15 mL.
  2. Granule vermes através de centrifugação a 1.000 x g durante 30 segundos.
  3. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a pelota de verme.
  4. Adicionar 3,5 mL de solução de lixívia worm (concentração final de 0.5M de NaOH, 1% de hipoclorito de sódio, em água estéril) para a pelota de worm e misture por inversão durante 1 minuto.
  5. Brevemente o vórtice e centrifugar a 1.000 x g por 30 segundos.
  6. Aspirar ou decante o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a pelota de verme.
  7. Adicione 3,5 mL de solução de lixívia fresca worm para a pelota de verme.
  8. Misture vigorosamente vermes em solução de água sanitária. Periodicamente (aproximadamente a cada dez segundos) Inspecione visualmente vermes sob um microscópio de dissecação. Cuidado com as cutículas worm quebrar, liberando ovos. Uma vez que a maioria dos vermes adultos foram dissolvidos (~ 95%), dilua água sanitária para 15 mL com S Basal para parar a digestão.
    Nota: As cascas de ovos são mais resistentes a lixívia que tecidos adultos, mas eles podem ser dissolvidos durante uma exposição prolongada. Para evitar a dissolução do ovo, não exponha os ovos para verme solução de água sanitária por mais de 7 minutos. Se as cascas de ovos são excessivamente danificadas, os embriões morrem.
  9. Pelota de embriões a 1.000 x g durante 30 segundos e aspirar ou decante o sobrenadante sem remover o sedimento de embriões.
  10. Resuspenda vermes em S basal até um volume final de 15 mL, diluir a solução de lixívia restantes.
  11. Repita as etapas de lavagem (3.9-3.10) três vezes mais para um total de 4 lavagens consecutivas.
  12. Após a quarta lavagem, aspirar o sobrenadante e adicionar até 5 ou 6 mL de estéril S Basal no tubo cônico de 15 mL. O objetivo é Resuspenda embriões para uma concentração de ~ 50 vermes por µ l.
    Nota: A quantidade de S Basal depende do tamanho da pelota ovo; Quanto maior a pelota, o mais Basal S é necessário.
  13. Incubar o tubo cônico durante a noite em um rotador mesa à temperatura ambiente ou 48 h a 15 ° C. As larvas eclodem, mas desenvolvimento larval vai prender na fase L1 (L1 diapausa) devido a privação de nutrientes.
  14. Examine os embriões sob um microscópio dissecação para verificar que a maioria deles têm eclodido e preso na fase do desenvolvimento de L1.
  15. Determine a contagem de verme tomando 20 µ l de prep worm e diluir com 80 µ l de S Basal. Pipete 10 µ l de solução diluída de worm diretamente na placa NGM vazia. Repita 2 vezes mais.
    1. Contar as larvas em cada local e determinar o número médio. Divida essa média por 2 para obter uma contagem aproximada de vermes por µ l em preparação o worm. Preparações do worm podem ser usadas para placas de propagação ou para experiências.
      Nota: Depois de 4-5 dias, larvas fome começará a morrer; Descarte o prep neste ponto.
  16. Para a propagação da estirpe, pipeta, um número adequado de vermes de L1 (5.000-6.000) nas chapas NGM 10cm 3-4 manchado com concentrado OP50 Escherichia coli – "superalimento" (e. coli OP50 manchado na concentração de X 25 (ou seja, 1 L de OP50 durante a noite cultura cultivada em LB produz 40 mL de 25 X OP50 superalimento); 2 mL da suspensão bacteriana concentrada são manchadas em cada placa NGM de 10 cm).
  17. Para preparar pratos para experimentos, faça o seguinte (para configuração de uso 3.17.1 "Protocolo básico", para as etapas de uso de "Tela de RNAi configurar" 3.17.2 - 3.17.4 conforme apropriado):
    1. Pipeta ~ 5.000 prato de vermes/10 cm semeado com RNAi ou OP50 superalimento.
    2. Pipeta ~ 500 vermes/poço em uma placa de 6 semeado com RNAi.
    3. Pipeta ~ 300 vermes/poço em uma placa de 24 semeado com RNAi.
    4. Pipetar 100 ~ vermes/poço em uma placa de 96 poços semeado com RNAi.
      Nota: Para obter instruções sobre como RNAi foi semeada por favor consulte os passos 2,7-2,9 na preparação de RNAi bactérias.
  18. Se uma cepa fértil de vermes está sendo usada, incube vermes a 25 ° C ~ 44-48 h uso esses vermes tão rapidamente quanto possível após a população ter atingido a idade apropriada. Isso minimiza o impacto dos ovos para incubação dentro os vermes durante o ensaio.
  19. Se a tensão a ser utilizado é esterilizado a temperatura (por exemplo, fer-15(b26); FEM-1(hc17) ou glp-4(bn2)), incubar vermes a 15 ° C para ~ 16 h e depois transferir a 25 ° C, para 44 h completar o desenvolvimento e prevenir a embriogênese.

4. líquido matando ensaio Setup (protocolo básico)

Nota: Este é um protocolo para uma estirpe bacteriana e uma fonte de vermes.

  1. Com uma espátula de célula, remover a p. aeruginosa de uma placa de SK e Resuspenda em ~ 5ml de S Basal. Intensificar-se, se necessário. Medir a densidade óptica da suspensão bacteriana usando um espectrofotômetro (OD600)
  2. Prepare 24 mL de caldo diluído de p. aeruginosa em S Basal no OD600 ≈ 0,09% (concentração final X 3). Ver 4.6.2 para conteúdo final por alvéolo e dimensionar o volume de diluição bacteriana em conformidade.
  3. Adicione 21 mL de meio líquido matar lenta (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L suplementado com CaCl2 e MgSO4 para uma concentração final de 1 mM). Usando uma pipeta multicanal, transferi 45 µ l de bactérias e de mídia para cada poço de uma placa de 384.
  4. Lave vermes de sua origem (ou seja, passo 3.17.1) em um tubo cónico de 50 mL e deixe vermes repousar sob a força gravitacional. Aspire o sobrenadante para 5 mL. Resuspenda em um total de 50 mL S basal.
  5. Repita a etapa 4.4 duas vezes.
  6. Usando um classificador de worm, classificar aproximadamente 22 vermes em cada poço da placa de 384 poços.
    Nota: A configuração gotas cada worm no ~1.1 µ l de líquido. 22 vermes ascenderá a 25 µ l, trazendo o volume total do ensaio a 70 µ l/poço.
    1. A composição final de cada poço é composto de 70 µ l µ l. 45 deste volume é adicionado como meio bacteriano (0,03 bactérias de600 OD em 24 µ l S Basal e 21 µ l SK suplementado com CaCl2 e MgSO4). Os outros 25 µ l é adicionado com os 22 vermes.
    2. Se o classificador usado aqui (veja a Tabela de materiais) está indisponível, vermes podem ser diluídos a uma concentração final de 1 worm / µ l em S Basal e pipetado 25 µ l/poço com uma pipeta multicanal. No entanto, os resultados podem apresentar maior variabilidade. Alternativamente, é possível usar um distribuidor de líquido peristáltico, conforme descrito por Leung e colegas19.
  7. Depois de vermes foram classificadas na placa de 384, selar a placa com uma película permeável ao gás e incubar as placas a 25 ° C por 24-48 h.
  8. No momento desejado, use uma lavadora de microplacas para lavar a placa com S Basal de 384 um total de 5 vezes.
    1. Após a segunda lavagem, aspirar a maioria dos meios de comunicação, deixando ~ 20 µ l. vigorosamente sacode placas usando uma microplaca reaccional durante pelo menos 30 segundos para soltar todos os restos do fundo dos poços).
  9. Após a lavagem final, aspirado sobrenadante até 20 µ l. Adicionar 50 µ l de 0,98 µM de ácidos nucleicos mancha (ver Tabela de materiais) / bem do prato 384-bem, para uma concentração final de 0,7 µM.
  10. Incube a temperatura ambiente por 12-16 h. Esta tintura só vai manchar vermes mortos. Após o período de incubação desejado, lavar pratos usando a lavadora de microplacas para remover qualquer excesso mancham (um mínimo de 3 lavagens).
  11. Para aquisição de dados, use um espectrofotômetro ou um microscópio automatizado para imagem tanto luz transmitida e fluorescência (531 nm de excitação e emissão 593).
    1. Use um objectivo de baixa ampliação para permitir que uma imagem de todo bem a ser capturada.
    2. Como alternativa, use o fluxo vermimetry. Esta técnica usa um citômetro de fluxo de objeto grande, como um verme fluorímetro, medir o tamanho e a fluorescência de todo organismo (i.e., c. elegans) de uma forma que é fortemente semelhante a citometria de fluxo.
  12. Use um software de análise automatizada de imagem (como CellProfiler, um estúdio de análise de imagem gratuito baseado no MatLab http://cellprofiler.org/) para calcular as áreas de worm fluorescente e total por alvéolo de forma imparcial.
    Nota: O quociente entre esses números representa a morte de fração para cada poço. Se um bem tinha 7 manchado vermes fora de 20 total, então a morte de fração compreende 0,35 ou 35%.
    1. Antes da primeira utilização, o pipeline de processamento de imagens automatizado deve ser validado, marcando manual. Isto é feito comparando resultados do pipeline automatizado para escores obtidos visualmente inspecionando imagens e gravação de fracções de vermes mortos para cada um deles. O processo de validação garante que os parâmetros para o processamento de imagens automatizado são precisos e representam os dados corretamente.

5. adaptação para estirpes múltiplas triagem c. elegans ou Knockdowns (RNAi tela Setup)

Nota: Esta é uma tela de RNAi descrita para uma configuração de placa 24.

  1. Adicionar 1 mL de S Basal por bem de uma placa de 24 (consulte a etapa 3.17.3). Suavemente agitar vermes agitando a placa e, em seguida, transferir vermes para um vazio, estéril 24 profundo-placa. Permitir que vermes resolver gravitacionalmente (~ 5 minutos).
  2. Aspire o sobrenadante, deixando cerca de 1 mL. Adicione 7 mL de S Basal a cada poço.
  3. Repita as etapas 5.1-5.2 um mínimo de 2 vezes mais. Após a lavagem final, Aspire o sobrenadante, deixando aproximadamente 400 µ l.
  4. Usando a função Resampler do classificador de worm, classificar 22 vermes da suspensão do worm 24-placa em cada poço de uma placa de 384 (cada poço de uma placa 24 rendimentos 8-12 poços de uma placa de 384).
    1. Para evitar a fome, pipetar bactérias para placas boas 384 (uma tensão que serve apenas como alimento, tais como OP50, ou uma cepa patogênica) antes da classificação.
      Nota: Patógenos podem ser adicionados pelos seguintes etapas 2.3-2.5 ou 6.4-6.5 e fonte de alimento bactérias podem ser diluídas e adicionadas, seguindo o mesmo esquema de p. aeruginosa.
  5. Depois de vermes foram classificadas na placa de 384, adicione pequenas moléculas ou outros materiais específicos do experimento.

6. adaptação de E. faecalis

Nota: Apenas as diferenças do ensaio de p. aeruginosa são descritas.

  1. Prepare uma fonte fresca de E. faecalis , listando as bactérias de um estoque congelado em uma placa de ágar BHI (infusão de cérebro coração) e incubar durante 16 a 24 h a 37 ° C.
    Nota: Realize experimentos de E. faecalis dentro um BSL-2 de segurança biológica para assegurar a esterilidade. Use precauções de segurança adequadas para minimizar a chance de infecção patogénica ou contaminação.
  2. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C por até uma semana. Após este período, substitua com um prato fresco.
  3. Na noite anterior classificação vermes, inocular 3-5 mL estéril BHI com uma única colônia de E. faecalis. Incube 12-16 h a 37 ° C, com agitação.
  4. Adicione bactérias nos poços quanto a p. aeruginosa (3 x bactérias S Basal, OD600≈0.09).
    Nota: Para o E. faecalis, a composição final do bem é: E. faecalis (OD ≈0.03 de600), BHI = 10% v/v, com o volume restante composto S basal. Lembre-se que 25 µ l de S basal será entregue com vermes.
    Nota: E. faecalis produz espessas biofilmes que absorvem o corante fluorescente, causando imagens borradas. Lavagem extensa pode ser insuficiente para remover o biofilme. Neste caso, os vermes podem ser transferidos para um prato vazio usando uma pipeta multicanal. Para facilitar a transferência, Tween 20 podem ser adicionados a S Basal para uma concentração final de 0,1% (v/v) Tween 20 em S Basal. Isso ajuda a retirar os vermes do biofilme.

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Representative Results

Parâmetros importantes para o desempenho

Uma compreensão adequada da biologia subjacente a este ensaio é necessária para a solução de problemas e otimizando o ensaio. Para o efeito, nos referimos primeiro vários papéis chaves elucidar os mecanismos de patogênese de p. aeruginosa-mediada matando em líquido7,20. Desde que as etapas descritas acima são seguidas (ver Figura 1 para um esquema do protocolo do ensaio) um assassinato de dependente do tempo de c. elegans será observado somente na presença do patógeno (Figura 2A). Em contraste, na ausência de suplementos nutricionais chaves (por exemplo, se a peptona é deixada fora da mídia, e só S Basal é adicionado), pouco ou nada de mortes será observado (Figura 2B). Curiosamente, a incubação de duas etapas de p. aeruginosa (por 24 horas a 37 ° C, 24h depois, a 25 ° C), que é crítico para ensaios convencionais de lento-matança e foi originalmente implementado em líquido matando21, é dispensável neste ensaio ( Figura 2). Embora seja possível adicionar p. aeruginosa direto da cultura LB durante a noite, fazendo assim significativamente altera a cinética de letalidade e não é recomendado.

Noções básicas sobre a biologia do ensaio também permite simplificação do ensaio, se apropriado e desejável. Por exemplo, o mais importante driver de host matando neste ensaio é o pyoverdine Sideróforo e anfitrião toxicidade causada por pyoverdine é dependente da sua capacidade para ligar o ferro7. Como tal, o ensaio pode ser simplificado substituindo pyoverdine-ricos filtrado, purificado pyoverdine ou até mesmo alguns quelantes de ferro produtos químicos sintéticos (por exemplo, 1,10-fenantrolina) para bactérias vivas, como a resposta transcricional de c. elegans para estes tratamentos é muito semelhante (Figura 3)22.

Várias linhas diferentes de evidências falam com a robustez da instalação experimental. Primeiro, a configuração tolera uma ampla gama de concentrações bacterianas iniciais. Concentrações tão baixas quanto OD600 = 0,0025 (aproximadamente 10 vezes menor do que o recomendado) ainda exposição e concentração-dependente do tempo matar, embora o calendário turno (Figura 4A). Em segundo lugar, a reprodutibilidade do ensaio é tal que, como poucos como 4 poços é frequentemente suficiente para obter dados estatisticamente significantes (Figura 4B).

Existem várias alterações que não recomendamos. Por exemplo, usando inóculos iniciais de bactérias com concentrações muito superiores aos constantes do protocolo; fazendo assim resulta em grosso, biofilme, como material que é difícil ou impossível para efetivamente lavar, que dificulta a letalidade de pontuação. Além disso, alta concentração bacterianos inóculos também podem competir pelo oxigênio e desencadear anfitrião específico matar7.

Outra nota importante é limitar o período de tempo entre a imagem os vermes mortos e parando o ensaio. Observe que neste período de tempo deve incluir a coloração, portanto, é fundamental para ser eficiente. Após a morte, o material biológico dentro de vermes começa a expulsar e/ou ser consumido por bactérias. Dentro de 24-32 h, permanece apenas a cutícula. A cutícula manchas muito mal e é muito leve, tornando mais fácil a perder durante as lavagens. É importante notar que as estirpes ou condições de tensão/RNAi com cinética muito diferente de matar podem ser complicadas por este fenômeno (ou seja, alguns vermes ainda podem estar vivas, enquanto outros já perderam seu conteúdo e são impossíveis de imagem). A figura 4A mostra este fenômeno, como vermes, no lado esquerdo da placa, inoculados com concentrações muito baixas de bacterianas iniciais, ainda são largamente vivo enquanto worms no lado direito da placa, que foram expostas a muito altas concentrações de bactérias, têm sido lavados.

Um determinante importante do sucesso do ensaio é o método usado para coletar e analisar os dados. Em nosso laboratório, usamos pelo menos três métodos para coletar dados destes ensaios: espectrofotometria, microscopia automatizada e vermimetry de fluxo (ou seja, a adaptação das técnicas de citometria de fluxo para c. elegans; literalmente, a medição de vermes em uma solução de fluxo). O primeiro desses métodos utiliza um espectrofotômetro para ler a fluorescência do corante ou repórter dos vermes em questão. Este método tem a vantagem de usar uma peça bastante onipresente de equipamento (um espectrofotômetro padrão com um leitor de microplacas) e é o método mais rápido para aquisição de dados. No entanto, falta-lhe o conteúdo informativo disponível a partir de microscopia automatizada e o poder estatístico do fluxo vermimetry.

Microscopia automatizada é outra opção viável. Um número de sistemas de imagem de microplaca está atualmente no mercado, variando dos preços que são acessíveis a um único investigador (por exemplo, um Cytation5 de Bio-Tek) a maior, mais caro e máquinas de alta qualidade que são mais comumente encontradas no núcleo instalações (por exemplo, um microscópio de ImageXpress de dispositivos moleculares). Na prática, a maioria destas soluções é favorável para marcar a maioria das telas e ensaios. Mais plataformas automatizadas de geração de imagens também podem ser acopladas a jusante software para processamento (por exemplo, metamorfo, ImageJ, Gene5 ou célula Profiler) para promover a produção de informações de imagem. Exemplos da utilidade de processamento são mostrados na Figura 5 e Figura 6. Quando a relação sinal-ruído é elevada (como na Figura 5), a análise é simples e discriminar entre as condições positivas e negativas é trivial. Nestes casos, sucessos mesmo fracos podem ser facilmente identificados. Muitos ensaios, no entanto, têm uma relação sinal-ruído mais fraca. Por exemplo, o tratamento de vermes de22 rosa-1::GFP (com expressão constitutiva mCherry em seus pharynges) com 1,10-phenathroline aumenta o nível de rosa-1::GFP. Para análise de dados, o repórter GFP inducible é normalizado para o sinal de mCherry constitutiva (Figura 6). Neste caso, o repórter tem expressão mais fraco e/ou não está ativado na maioria dos vermes. Portanto, a implementação de processamento de imagem ferramentas adicionais, como o Profiler de célula, que podem reduzir a fundo e amplificar o sinal pode ser vantajoso.

Finalmente, se um FlowPilot COPAS está disponível, ele pode ser usado para aquisição de dados através do fluxo vermimetry. Muito como o conceito mais familiar de citometria de fluxo, este instrumento pode ser usado para medir a fluorescência de c. elegans pelo menos dois ou três canais de cada vez. Este método é muito favorável para a aquisição de dados com alta significância estatística, mas a taxa de transferência é muito diminuída em comparação com microscopia automatizada. A vantagem mais significativa de fluxo vermimetry é a capacidade de analisar populações worm inteiro como um único grupo para idêntico, ao invés de separá-los em vários poços e analisando a média dos poços. Analisar os grandes grupos desta forma dramaticamente melhora o poder estatístico e permite a detecção de efeitos mesmo pequenos.

Modificações do ensaio do líquido da matança

Desenvolvimentos recentes do ensaio tem alargado a sua utilidade, incluindo análise de ativação de repórteres fluorescentes (Figura 6), utilizando técnicas de RNAi médio - a elevado-throughput (Figura 3) e até mesmo a substituição do original agente patogénico.

A razão mais óbvia para usar RNAi configurar é testar para vias de defesa do hospedeiro contra p. aeruginosa (ou outros agentes patogénicos). Exemplos de nocaute de RNAi, dos genes relevantes para a sobrevivência no ensaio são mostrados na Figura 3. Consistente com as observações anteriores20,23,24,25, daf-2(RNAi) reforçada c. elegans sobrevivência durante a exposição para p. aeruginosa, enquanto daf-16 ( RNAi), zip-2(RNAi) e cebp-1(RNAi) encurtado. Como observado, RNAi é mais simplesmente incluído no ensaio de crescimento vermes nas placas do multiwell onde cada bem contém um clone de RNAi diferente. Devido à alta viscosidade do ágar e pequenos volumes envolvidos, é difícil conseguir enchimento uniforme, livre de bolhas de placas de 96 poços sem equipamento especializado. Além disso, secagem as estirpes bacterianas carregando o RNAi também pode ser um problema, como os exteriores poços secos mais rápido do que poços internos, levando à não-uniformidade e significativo potencial de rachamento de ágar. Como mencionado acima, isso incentiva vermes de entocar, reduzindo o número de animais disponíveis para triagem e riscos de entupimento maquinaria de manipulação de líquido. Para ambas estas razões, placas de 24 poços são mais fáceis de trabalhar do que as placas de 96 poços. Embora isso reduz a taxa de transferência do ensaio, melhora a confiabilidade e sugere-se, particularmente para telas iniciais.

Finalmente, o ensaio foi modificado o ensaio para substituir p. aeruginosa com E. faecalis. (Em princípio, substituição com outras espécies bacterianas deve não prever dificuldades desnecessárias, desde que apropriadas de cultivo e das condições de exposição são identificadas.) O fator mais importante a considerar é que os requisitos de mídia do patógeno, tanto para o crescimento e desenvolvimento e para a indução de virulência. Por exemplo, o patógeno Gram positivo, oportunista E. faecalis requer meios ricos em nutrientes (como BHI) e incubação em temperaturas mais altas em comparação com p. aeruginosa14,26. Tendo esses fatores em consideração, adaptação do ensaio de usar E. faecalis foi simples. Como observado por p. aeruginosa, vimos matar dependente do tempo (Figura 7). Curiosamente, o momento da morte era semelhante ao ensaios publicados anteriormente usado pre-infecção em placas agar26, apesar da ausência desta etapa, o que pode sugerir que os mecanismos envolvidos na patogênese variam.

Figure 1
Figura 1: esquema para líquido-baseado c. elegans – ensaio de infecção p. aeruginosa . As etapas que envolvem a preparação e propagação nematoide são no lado esquerdo, preparação bacteriana são à direita. As etapas que envolvem ambos estão centralizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Assassinato de c. elegans por p. aeruginosa é específico e requer adequada nutrição bacteriana. (A) c. elegans morte na presença de e. coli e p. aeruginosa. (B) morte de c. elegans , na presença de p. aeruginosa com (direita) e sem meios de matar lenta (esquerdos) adicionados à mistura (ou seja, S só basal). Basal de S é um media mínimos e não contém os nutrientes necessários para o crescimento bacteriano e impede a produção de pyoverdine. (C) c. elegans morte na presença de diferentes preparados p. aeruginosa. p < 0,01, baseado no Student t-teste. Barras de erro representam no MEV mostrou 10 poços foram usados por replicar biológica por condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: C. elegans resistência à p. aeruginosa depende de vias de imune do hospedeiro. Um painel de knockdowns de RNAi selecionados foi tratado com 1,10-fenantrolina (um quelante química que imita a exposição a p. aeruginosa em líquido) ou p. aeruginosa (A) (B). p < 0,01, #p < 0.05, baseado no Student t-teste. Barras de erro representam no MEV mostrou 10 poços foram usados por replicar biológica por condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: C. elegans matança por p. aeruginosa é robusta e depende da concentração bacteriana. Imagens representativas (A-B) (A) e (B) a quantificação da morte de c. elegans após exposição a concentrações diferentes de p. aeruginosa por 72 h. p-valores foram calculados com base na do aluno t -teste. Barra de escala em (A) é de 1 mm. 16 poços foram usados por replicar biológica por condição. BF: Campo brilhante, FL: fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: processamento de dados aquisição e imagem de um ensaio com um sinal forte. (A) de imagens representativas dos vivo (controle negativo) e mortos (controle positivo) c. elegans. (B) análise estatística dos controles positivos e negativos com base no método de aquisição de dados, modo de processamento e número de poços analisados. Fluorescência (C) foi analisada por vermes de quatro poços individuais de uma placa de 96 poços (dois positivos e dois poços de controlo negativo). Cada bem contida ~ 100 minhocas. Cada ponto no gráfico representa um único verme, mostrando o tempo de voo (que se correlaciona com mas, devido o bobinamento de vermes vivos, representa apenas imperfeitamente tamanho) e a medido fluorescência para os vermes que são manchados com Sytox Orange. Vermes de controlo positivo pre-foram mortos por exposição ao calor. Devido a mudanças na tensão e a forma de vermes mortos (como pode ser visto no(na), vermes mortos aparecem mais haste-como e tem poucas curvas do corpo) comparado a suas contrapartes vivas, vermes mortos têm um TOF mais tempo. p-valores foram calculados com base no Student t-teste. Barra de escala no(na)é 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: processamento de dados aquisição e imagem de um ensaio com um sinal moderado. (A) imagens representativas de c. elegans , carregando um repórter inducible da rosa-1::GFP e um marcador de constitutiva de mCherry (para normalizar a expressão dos genes da matriz extracromossômico). C. elegans expostos ao DMSO (controle negativo) ou 1,10-fenantrolina (controle positivo). (B) análise estatística dos controles positivos e negativos com base no método de aquisição de dados, modo de processamento e número de poços analisados. (C) quatro poços individuais de uma placa de 96 poços (dois positivos e dois poços de controlo negativo) foram analisados usando o fluxo vermimetry. p-valores foram calculados com base no Student t-teste. Barra de escala no(na)é 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: C. elegans matança por E. faecalis é robusto e tempo dependente. Imagens representativas (A-B) (A) e (B) a quantificação da morte de c. elegans após exposição à E. faecalis. p < 0,01, baseado no Student t-teste. 10 poços foram usados por replicar biológica por condição. Barras de erro representam a barra de escala no MEV mostrou em (A) é 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este ensaio (ou ensaios semelhantes onde outros agentes patogénicos são substituídos por p. aeruginosa ou E. faecalis) são útil para uma variedade de finalidades, incluindo a descoberta de medicamentos. Também é útil para abordar questões biológicas fundamentais, tais como a identificação de fatores de virulência, a elucidação das vias de defesa do hospedeiro e determinando as máquinas reguladoras envolvidas na interação patógeno-hospedeiro.

Embora o ensaio de matança líquida de p. aeruginosa é robusto, existem vários pontos onde deve ser dada atenção cuidadosa para minimizar a possibilidade de falha. Em primeiro lugar, como se observa, a placa bacteriana fonte para p. aeruginosa inoculações deve permanecer fresca, para que as bactérias perdem virulência, apesar do crescimento durante a noite em LB. Em segundo lugar, é a chave para certificar-se que o cálcio e magnésio são adicionados à p. aeruginosa , matando os ensaios. Sem ele, virulência será significativamente comprometida. Finalmente, é interessante notar que minhocas criadas em HT115 (para ensaios baseados em RNAi) morrerá significativamente mais tarde do que vermes criados na OP50 (s. Kirienko, comunicação pessoal). Por esta razão, se mudando para estudos baseados em RNAi, é importante determinar empiricamente o melhor ponto de tempo para o ensaio.

Para matar os ensaios com p. aeruginosa ou E. faecalis, é crucial para garantir que haja uma alimentação adequada para o desenvolvimento dos vermes de fase L1 até que estejam prontos para serem usados no ensaio. Fome, mesmo no curto prazo, é conhecida para ativar um número de vias de defesa do hospedeiro, como o DAF-2/DAF-16 insulina/IGF sinalização rede27. Nossos dados sugerem que o DAF-16/FOXO já ligeiramente é ativado pelo sendo cultivadas em líquido20, e ativação adicional é altamente indesejável, como DAF-16/FOXO promove amplo espectro patógeno resistência23.

Finalmente, é fundamental usar minhocas completamente estéril em qualquer ensaio que se baseia na mortalidade como uma leitura. Se vermes são férteis, sendo em líquido provoca dificuldades na postura de ovos. Como resultado, alguns dos embriões eclodem dentro do pai, eventualmente causando a sua morte. Por esta razão, geralmente usamos uma lesão genética, tais como glp-4(bn2)28, e que demonstra um fenótipo estéril completamente penetrante para estes ensaios. O uso de produtos químicos que impedem o desenvolvimento embrionário, mas ainda permitir que a postura de ovos, como 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), deve ser evitado como eles também podem interferir com o desenvolvimento e crescimento bacteriano.

Em geral, encontrámo-lo muito útil para planejar vários pontos de tempo para análise. Embora o ensaio é robusto e o timing é geralmente consistente, estocásticas e imperceptíveis alterações podem mudar a hora da morte no ensaio dentro de 2-4 horas. Quando a solução de problemas é necessária, muitas vezes é útil considerar primeiro a mais simples das respostas; ou seja, preparar a mídia fresca, descartar as culturas bacterianas mais recentes e re-raia estirpes bacterianas de ações congeladas, etc , só muito raramente estas medidas não restaurar o ensaio da funcionalidade.

Devido a relativa simplicidade do método, uma grande variedade de modificações pode ser facilmente executada. Mudando os vermes de um fundo uniforme glp-4(bn2) para telas de RNAi de alta produtividade, tais como aqueles que descrevemos aqui, é útil para a identificação das vias de resposta do hospedeiro para uma ampla variedade de xenobióticos e substâncias químicas tóxicas. Por exemplo, adicionando o mesmo produto químico ou toxina em cada poço de RNAi placas (por exemplo, Cry5B de toxina, fenantrolina, etc.), percursos que alteram a sensibilidade a estas toxinas podem ser facilmente identificados. Estes tipos de telas também podem ser usados para identificar redes de defesa contra qualquer da panóplia de patógenos que infectam c. elegans.

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Disclosures

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado pela prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (CPRIT) prêmio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e pelo nacional institutos de saúde K22 AI110552 atribuído a NVK. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

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