Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

Neuroscience

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Summary

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

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Swale, D. R., Gross, A. D., Coquerel, Q. R., Bloomquist, J. R. Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster . J. Vis. Exp. (141), e58375, doi:10.3791/58375 (2018).

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Abstract

A maioria dos inseticidas disponíveis atualmente alvo do sistema nervoso e mutações genéticas das proteínas neurais invertebradas muitas vezes produzem consequências deletérias, no entanto, os métodos atuais para gravar a atividade do sistema nervoso de um indivíduo animal é caro e trabalhoso. Esta sucção preparação do eléctrodo de terceiro ínstar larval sistema nervoso central de Drosophila melanogaster, é um sistema tractable para testar os efeitos fisiológicos dos agentes neuroativos, determinando o papel fisiológico de vário neural caminhos para a atividade do CNS, bem como a influência das mutações genéticas a função neural. Esta preparação ex vivo requer apenas moderada dissecando a habilidade e conhecimentos eletrofisiológicos gerar reprodutíveis gravações de atividade neuronal dos insetos. Uma grande variedade de moduladores químicos, incluindo peptídeos, então pode ser aplicada diretamente ao sistema nervoso em solução com o soro fisiológico para medir a influência sobre a atividade de CNS. Tecnologias novas, genéticas, tais como o sistema de GAL4/UAS, podem ser aplicadas isoladamente ou em conjunto com agentes farmacológicos para determinar o papel dos canais iônicos específicos, transportadores ou receptores de artrópodes função CNS. Neste contexto, os ensaios aqui descritos são de interesse significativo para toxicologistas inseticida, insetos fisiologistas e biólogos do desenvolvimento para o qual d. melanogaster é um organismo modelo estabelecido. O objetivo do presente protocolo é descrever um método eletrofisiológico para permitir a medição de electrogenesis do sistema nervoso central no inseto modelo, Drosophila melanogaster, que é útil para testar uma diversidade de científica hipóteses.

Introduction

O objetivo geral desta abordagem é permitir aos investigadores medir rapidamente a electrogenesis do sistema nervoso central (CNS) no inseto modelo, Drosophila melanogaster. Este método é confiável, rápido e eficiente para realizar experimentação fisiológica e toxicológica. O CNS é essencial para a vida e, portanto, as vias fisiológicas críticas para adequada função neural tem sido explorada extensivamente na tentativa de compreender ou modificar função neural. Caracterização das vias sinalização dentro do CNS artrópodes permitiu a descoberta de várias classes químicas de inseticidas que perturbam a função neural invertebrada para induzir a mortalidade enquanto limitação das consequências fora do alvo. Assim, a capacidade de medir a atividade neural de insetos é de interesse significativo para o campo da fisiologia e toxicologia de insetos, desde que o sistema nervoso é o tecido-alvo da maioria dos inseticidas implantado1. Ainda, continuou o crescimento do conhecimento fundamental e aplicado sobre o sistema nervoso do inseto requer técnicas avançadas de neurofisiológicas que estão limitadas a viabilidade, uma vez que as técnicas atuais são de trabalho intensivo e exigem uma despesa elevada, inseto linhas de células neurais são limitadas, e/ou acesso limitado para as sinapses centrais da maioria dos artrópodes. Atualmente, a caracterização da maioria das proteínas neurais inseto requer o alvo a ser clonado e heterologously expressa para subsequentes fármacos e eletrofisiológicas gravações, como foi descrito para os canais de potássio de inseto retificador para dentro2 , inseto ryanodine receptor3, mosquito K+ de voltagem-sensíveis canais4e outros. Para atenuar o requisito de expressão heteróloga e o potencial de baixa expressão funcional, Bloomquist e colegas vistos induzir um fenótipo neuronal em Spodoptera frugiperda (Sf21) células cultivadas como um novo método para insecticida descoberta5,6. Esses métodos fornecem uma abordagem válida para o desenvolvimento da nova química, no entanto, muitas vezes criam um gargalo intransponível para a caracterização de agentes farmacológicos, identificar mecanismos de resistência ao inseticida e caracterização dos princípios fisiológicos fundamentais. Aqui, descrevemos um método ex vivo que permite a gravação da atividade elétrica de um inseto de modelo que tem genética maleável7,8,9 e testes padrões da expressão conhecida de neural complexos de10,11,12 para permitir a caracterização dos mecanismos de resistência a nível do nervo, o modo de ação de drogas recentemente desenvolvidas e outros estudos toxicológicos.

Mosca da fruta, d. melanogaster, é um organismo modelo comum para a definição de sistemas neurais insetos ou mecanismo de inseticida de ação e estabeleceu-se como um organismo modelo adequado para o estudo de toxicológicos13, farmacológico14 ,15, neurofisiológica16e fisiopatológicos17,18,19,20 processos de vertebrados. D.melanogaster é um inseto holometábolos que realiza a metamorfose completa, incluindo um estágio larval e pupal antes de atingir a fase adulta reprodutiva. Durante todo o processo do desenvolvimento, o sistema nervoso sofre remodelação significativa nas fases de vida diferentes, mas o CNS larval será o foco desta metodologia. O CNS larval totalmente desenvolvido é anatomicamente simples com segmentos torácicos e abdominais que são fundidos e formam o gânglio ventral, que representa uma matriz de neuromeric repetidas e quase idênticas unidades21,22. Decrescente de nervos motores originam-se da extremidade caudal do gânglio subesophageal e descer para inervar os músculos da parede do corpo e órgãos viscerais das larvas. A Figura 1 descreve a anatomia do larval Drosophila CNS.

A Drosophila barreira hematoencefálica (BBB) se desenvolve no final da embriogênese e é formada por subperineurial células gliais (SPG)21. As células SPG formam numerosos processos filopodia, como que se espalham para estabelecer uma folha contígua, muito plana, endoteliais, como que cobre a inteira de Drosophila CNS23. A Drosophila BBB tem semelhanças com o BBB vertebrado, que inclui a preservar a homeostase do microambiente neural, controlando a entrada de nutrientes e de xenobióticos no CNS21. Este é um pré-requisito para a transmissão neural confiável e função, ainda a proteção do SNC por BBB restringe a permeação de drogas sintéticas, a maioria dos peptídeos e outros xenobióticos24,,25, que apresenta potencial problemas quando caracterizar potências de moduladores da pequeno-molécula. O método usa uma transecção simples para romper essa barreira e fornecer acesso farmacológico pronto para as sinapses centrais.
A maior força da metodologia descrita é a simplicidade, reprodutibilidade e relativamente elevado-throughput capacidade inerente a este sistema. O protocolo é relativamente fácil de dominar, a instalação requer pouco espaço, e apenas uma entrada financeira inicial é necessário que é reduzido para reagentes e consumíveis. Além disso, o método descrito é completamente alteráveis para registrar a atividade de nervo central decrescente da mosca doméstica, Musca domestica26.

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Protocol

1. equipamentos e materiais

  1. Prepare os componentes necessários (listados na Tabela de materiais) do equipamento para realizar gravações de eletrodo de sucção da drosófila CNS eletrofisiologia.
    Nota: Antes da experimentação, é necessário construir câmaras para dissecação de CNS da drosófila e deve ser usado para banhar os gânglios em soro fisiológico durante as gravações. Um resumo passo a passo da construção da câmara é fornecido abaixo.
  2. Prepare a câmara larval.
    1. Derreta a cera negra com uma chapa quente.
    2. Despeje uma câmara que tem um volume máximo de 2-2,5 mL, 2 mL de cera derretida.
    3. Deixe a cera esfriar e endurecer por aproximadamente 2 h.
    4. Use uma lâmina de barbear para cortar um buraco na cera endurecida que irá realizar um volume de 500 µ l, que tem uma superfície de aproximadamente 0,5 cm2 e uma profundidade de aproximadamente 0,25 cm.

2. equipamento e configuração de Software

Nota: A configuração da gravação extracelular é brevemente descrita abaixo.

  1. Prepare o equipamento para dissecção e gravação.
    1. Posicione a preparação do tecido, microscópio, eletrodo de sucção, Micromanipuladores, fonte de luz dentro da gaiola de Faraday para reduzir o ruído e eliminar campos elétricos externos (Figura 2).
    2. Conectar-se (de preferência solda) solo e fios positivos no blindado jacaré que será conectado ao titular do banho e microeletrodos, respectivamente.
      Nota: Fios expostos e soldados podem ser cobertos com papel de alumínio para reduzir o ruído.
    3. Conectar o chão e os fios positivos a entrada 1 do AC/DC amplificador diferencial.
    4. Conecte o sistema de aquisição de dados para o amplificador diferencial AC/DC, ligando um cabo de baioneta Neill-Concelman (BNC) de entrada 1 do sistema de aquisição de dados para a saída do canal 1 do amplificador.
      Nota: Recomenda-se incorporar um eliminador de ruído de 50/60 Hz entre o software de aquisição de dados e o amplificador. O uso de um conector T BNC é necessária.
    5. Se desejado, incluem um monitor de áudio para a instalação conectando 1 entrada do monitor áudio para 1 do software de aquisição de dados de entrada.
    6. Encha a seringa de 10 mL com solução salina e conectá-lo à porta do porta-eletrodo de pressão.
      Nota: Verifique se não há bolhas de ar entre a seringa, a pelota de Ag/AgCl e a abertura do eletrodo.
  2. Prepare o software para dissecção e gravação.
    Nota: O contorno dos métodos para a configuração do software é baseado no software aquisição/análise constantes da Tabela de materiais que irá digitalizar a saída elétrica crua e converter os dados para frequência de spike. No entanto, outro software pode ser usado e várias conversões de gravação podem ser usadas.
    1. Abra o software de aquisição/análise.
    2. Clique em "configurar" na barra de ferramentas principal e selecione "configurações de canal", que irão abrir uma caixa de diálogo.
    3. Reduza o número de canais totais de três.
    4. Para o canal 1, selecione um intervalo de 100 mV.
    5. Para o canal 2, clique na guia "cálculo" que vai abrir um menu drop-down. Selecione "medições cíclicas", que serão aberta uma segunda caixa de diálogo.
    6. Selecione o canal 1 como a fonte. Na medição do menu suspenso, selecione ponto de unidade em eventos. Finalmente, na área configurações de detecção, o menu drop-down selecione limiar simples.
    7. Para converter a atividade elétrica em uma trama de taxa expressada em hertz, o canal 3rd deve ser definido no modo aritmético: na janela de entrada, digite em "1000*smoothsec(ch2,2)". Em seguida, selecione como as unidades suspensa hertz do menu.
      Nota: Gravações bem sucedidas podem ser realizadas com várias configurações diferentes de gravação, mas "Unidade spike em eventos e limiar simples" é provavelmente o mais fácil, uma vez que permite o ajuste do limiar acima a atividade de fundo para cada indivíduo gravação. Gravações sob a configuração de "Custom-fonte entrada" aumentam a reprodutibilidade dos dados assumindo que a atividade de fundo não é diferente entre as gravações.
    8. Feche as caixas de diálogo para retornar à tela principal. O eixo y deve ser expresso em Hz e o eixo x no tempo.

3. dissecar e preparar o Larval Drosophila CNS

Nota: Métodos para dissecação de CNS larval são claramente ilustrados no Hafer e Schedl27, mas esses métodos publicados anteriormente reduzem o comprimento dos neurônios descendentes que são importantes para medir a frequência de pico. Aqui, um método adicional é delineado para excisar o CNS larval que mantém há muito tempo, neurônios decrescentes intactos.

  1. Preparação da solução salina.
    1. Preparar a dissecção e a solução salina de gravação o seguinte no mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic ácido (HEPES); titula-se pH de 7.25.
  2. Disse o larval Drosophila CNS.
    1. Identificar e extrair um errante de terceiro ínstar Drosophila melanogaster do frasco de cultura e lugar em 200 µ l de soro fisiológico (Figura 3A).
    2. Segure os ganchos de boca com uma pinça fina e agarrar o abdómen dos vermes com um segundo par de pinças (Figura 3B).
      Nota: Não aplique demasiada pressão no abdômen pois isto pode resultar em rasgar da fina camada cuticular o verme.
    3. Puxe gentilmente os ganchos de boca e o abdômen em diferentes direções para separar a extremidade caudal do verme da região de cabeça e expor as vísceras da larva (Figura 3).
      Nota: O CNS vai ser entrelaçada com a traqueia e aparelho digestivo. Não corte o CNS, longe de qualquer tecido, para evitar cortar os nervos periféricos decrescentes.
    4. Provoca o CNS fora do trato digestivo e traqueia com pinça (Figura 3D).
    5. Se necessário, rompa a barreira hemato-encefálica por manualmente cruza o CNS posterior dos lóbulos cerebrais com Vannas para primavera.
      Nota: Isto deve ser feito com base nas propriedades físico-químicas do produto químico a ser utilizado. A linha vermelha na Figura 4A é o ponto de transecção sugerido e o CNS necrosante com intactos troncos nervosos periféricos descendentes mostrado na Figura 4B. O CNS necrosante é pronto para experimentação após a conclusão da etapa 3.2.5.

4. extracelular gravação de Drosophila CNS.

  1. Prepare-o CNS para gravação.
    1. Puxe um eletrodo de pipeta de vidro dos capilares de vidro de borosilicato para uma resistência de 5-15 mΩ.
    2. Insira o CNS necrosante na câmara de cera que contém 200 µ l de solução salina. Prenda um pino de inseto não revestido com o grampo de jacaré soldado ao fio terra e insira o pino no soro fisiológico para completar o circuito.
    3. Usando os Micromanipuladores, Oriente o eletrodo à extremidade caudal do SNC necrosante. Elimine a gravação do ruído de fundo, ajustando o nível do limiar do software de aquisição/análise antes de contatar a troncos nervosos periféricos.
    4. Atrair qualquer convenientes nervos periféricos para o eletrodo de sucção, aplicando leve pressão negativa na seringa.
      Nota: A linha de base, frequência de disparo é correlacionada com o número de neurônios atraídos para o eletrodo onde mais neurônios muitas vezes resultam em aumento da resistência do eléctrodo.
  2. Começa a gravação extracelular de CNS decrescente a atividade do nervo.
    1. Iniciar a gravação do software de aquisição de dados e monitorar a linha de base disparando com frequência. Permitir que a taxa de queima equilibrar por 5 min antes da coleta de base de dados de taxa de queima.
    2. Descarte a preparação e a gravação se o padrão de disparo do tratamento controle não é um padrão de ruptura semelhante ao mostrado na Figura 5A.
      Nota: Padrão alterado de fuzilamento sugere atividade anormal ou instável do gerador de padrão central, que pode alterar a função neural.
    3. Depois de 5 min, acrescentar 200 µ l de soro fisiológico + veículo para trazer o volume total da câmara a 400 µ l para começar a disparar taxas de controle de gravação.
    4. Depois de linha de base foi estabelecido (3-5 min), retirar a 200 µ l de solução salina e adicionar 200 µ l do agente experimental solubilizado em solução salina.
      Nota: Dimetilsulfóxido (DMSO) é o solvente recomendado para compostos lipofílicos e não deve exceder 0,1% v/v.
    5. Aplicam-se as concentrações de drogas de forma serial (baixa para alta concentração) e gravar cada concentração por um período de seleção de tempo (determinado pelo investigador baseado nas propriedades químicas de drogas29). Etiqueta neste ponto do tempo de aplicação da droga do software de aquisição e análise, incluindo um comentário que inclui a droga e a concentração final.
      Nota: Após 30-50 min após a dissecação, disparando a atividade do SNC diminuirá em cerca de 10-20%, portanto, devem efectuar-se controlos adequados e tratamentos com drogas não devem ultrapassar este período de tempo.
  3. Analise os dados.
    Nota: Múltiplas análises podem ser executadas sobre os dados coletados, tais como mudanças no potencial de ação rajadas29, amplitude de forma de onda do pico e curso do tempo e determinar as frequências de pico média após drogas tratamento26,30 , 31 , 32. o mais comum é determinar a influência de uma droga tem para as frequências de pico média durante um período especificado de tempo, que é descrito abaixo.
    1. Tabulate frequências de pico média selecionando toda a região de interesse (ou seja, o período de tempo de tratamento da Toxicodependência) e determinar as frequências de pico médio automaticamente através do "Datapad" localizado na barra de ferramentas principal da aquisição/análise software.
    2. Determine a frequência de pico média do SNC após tratamento medicamentoso para a frequência de média pico do controle do veículo (linha de base). Calcular a variação percentual de disparar taxa após tratamento medicamentoso pela fórmula: (frequência de frequência/linha de base tratada) × 100.
    3. Use o disparo de frequências ou por cento de média pico de controle para cada concentração para construir uma curva de resposta de concentração com o padrão de software de gráficos.
    4. Realizar análise estatística (por exemplo, unpaired t-teste) para determinar o significado entre pontos de tempo, as concentrações ou tratamentos com drogas.
      Nota: Existem dois métodos principais para gerar e analisar curvas concentração-resposta. O primeiro método é uma concentração por preparação individual. Aqui, a taxa de aumento da concentração única é normalizada a taxa de aumento da linha de base para cada preparação. Os benefícios são reduzidos corrida para baixo da preparação devido ao reduzido tempo de gravação, enquanto as armadilhas são aumentadas dissecação tempo porque esse método será composto de 5-7 preparações individuais de CNS por concentração, e barras de erro maior sobre os dados em média conjunto. O segundo método é várias concentrações por preparação individual. Aqui, a taxa de pico para cada uma das 3-5 concentrações são normalizados para a mesma taxa de pico de linha de base. Os benefícios são menos tempo de dissecação e menor variabilidade entre Replica para concentrações de droga, enquanto as armadilhas são a exigência de um impacto de drogas e desconhecido de ação rápida de tratamentos anteriores concentração de droga em tratamentos químicos subsequentes.

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Representative Results

Atividade espontânea dos nervos periféricos decrescentes decorrentes do sistema nervoso central de Drosophila pode ser gravada utilizando eletrodos de sucção extracelulares com reprodutibilidade consistente. Atividade espontânea do excisado e necrosante Drosophila CNS produz um padrão cíclico de rebentar com 1-2 s do disparo com aproximadamente 1 s de perto a actividade quiescente. Por exemplo, o CNS é perto quiescente (1-2 Hz) para 0,5-1 s, seguido de uma explosão (100-400 Hz) para aproximadamente 1 s e em seguida, retorna a um estado quiescente próximo (1-2 Hz) para 0,5-1 s (Figura 5A). Este padrão de disparo é repetido cada 2-3 s. A frequência de descarga média pico de Drosophila CNS varia de aproximadamente 20-50 Hz durante um período de 3-5 min, quando o limite é definido apenas acima do ruído da linha de base. A linha de base, frequência de disparo é correlacionada com o número de neurônios periféricos atraídos para o eletrodo e o selo formado entre o orifício do eletrodo e os gânglios ventrais. Importante, aplicação do DMSO solvente químico em uma concentração final de 0,1% não altera a frequência de descarga de pico da drosófila CNS (Figura 5A).

Esta preparação eletrofisiológica fornece um método para caracterizar as propriedades excitatórias ou depressoras de várias pequenas moléculas na frequência de pico de um sistema neural inseto bem caracterizada. Propoxures, um conhecido inibidor da acetilcolinesterase inseto (dor), é um neuroexcitant e aumentaram a frequência de descarga de pico da necrosante Drosophila CNS de forma concentração-dependente (Figura 5B). Pelo contrário, o ácido gama - aminobutírico (GABA), um neurotransmissor inibitório conhecido atuando sobre o canal de inseto cloreto mediada por GABA, é um neurodepressant e reduziu a frequência de descarga de pico de forma concentração-dependente (Figura 5 ). Quer dizer a descarga de pico frequências podem ser determinadas em todo o período de tempo para cada concentração permitir a construção de uma curva de resposta de concentração para determinar a concentração eficaz de 50% (CE50) para obter uma resposta. Aqui, o propoxures foi mostrado para ter um CE50 de 338 nM (intervalo de confiança de 95% (IC): 241-474; hillslope: 1,8; r2: 0,77) com uma concentração de 1 µM, produzindo excitação máxima de Drosophila CNS na atividade de 300% do controle (Figura 5D)26. GABA é mostrado para ter um IC50 de 1,1 mM (95% CI: 0,7-1,5; hillslope: 1,5; r2: 0.95) com inibição máxima de 5 milímetros (Figura 5E).

Muitas vezes, sondas moleculares de sistemas neurais não são capazes de ser usado em ensaios toxicológicos ou fisiológicos devido à sua falta de propriedades físico-químicas adequada que permitem a penetração da barreira hemato-encefálica. Por exemplo, tacrina monomérica é um potente inibidor de (ca. 200 nM) de insetos dor33, ainda não altera a frequência de pico da intacta Drosophila CNS (figura 6A). No entanto, rompimento da lamela neural e a barreira hemato-encefálica através de transecção posterior dos lóbulos cerebrais resultou em um aumento de imediato perto da frequência de pico da drosófila CNS após exposição a 100 µM monomérico tacrina ( Figura 6B). Dados semelhantes foram descritas anteriormente,30.

Figure 1
Figura 1: extirpado CNS de terceiro ínstar melanogaster da drosófila. As setas apontam para várias estruturas anatômicas do SNC que correspondem aos rótulos. A barra de escala representa 250 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: configuração de eletrofisiologia que é usada para realizar gravações extracelulares. (A) gaiola de Faraday; (B) tabela de vibração; (C) dissecando o microscópio; (D) AC/DC amplificador diferencial; Monitor de áudio (E) ; Eliminador de ruído (F) ; Sistema de aquisição de dados (G) ; (H) laboratório de informática execução gráfico software pro; (I) cabo de fibra óptica com fonte de iluminação externa; Micromanipulador (J) ; (K) titular de microeletrodos com porto de pressão com prato de cera de eletrodo e preparação de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: método de excisão do CNS de larvas de terceiro instar. (A) verme intacta submerso em 200 µ l de solução salina. A seta indica os ganchos de boca que são usados para a separação da parede da corpo. (B) dois pares de pinças são colocados no meio dos vermes e os ganchos de boca para começar a separação da parede da corpo. (C) parede do corpo é separada, aplicando uma pressão leve e contínua para expor as vísceras. (D) CNS é claramente visíveis (setas brancas) e ocasionalmente se confunde com as vísceras. A barra de escala representa 1000 µm, 750 µm, 500 µm e 200 µm para painéis A, B, C e D, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: rompimento da barreira hemato-encefálica por cruza o CNS. (A) CNS intacta com decrescente claramente visível na extremidade caudal de gânglios ventrais de nervos. A linha vermelha indica a localização de cruza o CNS para interromper o BBB. (B) A transecção CNS com a extremidade caudal de gânglios ventrais ainda expondo os neurônios tempo decrescente. Os gânglios ventrais podem ser descartados. A barra de escala representa 200 µm para ambos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: gravações neurofisiológicas de CNS de larvas de terceiro instar de D. melanogaster. Vestígios de descarga do nervo representante antes e após a exposição para o (A) DMSO, propoxures (B) e (C) GABA. Frequências de disparo inicial em picos/s para cada experimento (Hz) são dadas à esquerda de cada traço. Concentração-resposta curvas para propoxures (D) e GABA (E) a descarga de nervo CNS de larvas de d. melanogaster de gravações replicadas (n = 3-5 concentrações por curva, com cada concentração replicado pelo menos 5 vezes). As setas representam o ponto de aplicação da droga. Pontos de dados representam aumento percentual médio de base a taxa de queima e barras de erro representam o desvio padrão. Quando as barras de erro estão ausentes, é porque eles são menores que o tamanho do símbolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: aumento da penetração de tacrina no sistema nervoso após a transecção do SNC. Gravações representativas da (A) intacta e (B) transecção larval CNS exposto a tacrina monomérica, que foi aplicada na seta. Frequências de disparo inicial em picos/s para cada experimento (Hz) são dadas à esquerda de cada traço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os detalhes fornecidos no vídeo associado e texto forneceram etapas-chave a fim de registrar a atividade e o pico de descarga frequência de Drosophila CNS ex vivo. A eficácia de dissecação é o aspecto mais importante do método porque curto ou alguns neurônios descendentes irão reduzir a linha de base disparando a taxa que irá resultar em grandes desvios entre repetições. No entanto, uma vez que tem sido dominada a técnica de dissecação, os dados recolhidos com este ensaio são altamente reprodutível e alteráveis para uma grande variedade de disciplinas. Uma modificação do método descrito é a inclusão de um sistema automatizado profusão que evitará a necessidade de colocar manualmente as soluções salinas e químicas para a câmara de CNS. Inclusão do sistema profusão reduz distúrbios do SNC durante as gravações, que ocasionalmente ocorrerem durante a aplicação de drogas com pipetas manuais.

Esse método eletrofisiológico explora o utilitário da preparação para a incorporação da pesquisa de descoberta de drogas/inseticida. Além disso, esta preparação é passível de sala de aula para demonstração dos conceitos fundamentais em neurofisiologia. O método requer investimento financeiro relativamente modesto e tempo de preparação mínima, proporcionando uma gravação robusta e estável que pode ser empregada para ilustrar a influência de drogas para a função de voar CNS. Por exemplo, os encargos financeiros relativos à plataforma de gravação é um custo inicial de cerca de US $10.000 USD, com menores custos subsequentes (por exemplo, sais de salina, manutenção de colônia de voar, etc.). Além disso, o tempo necessário de preparação de CNS para primeira gravação é cerca de 10 min. Apesar de drosófila são fáceis de manter na cultura dentro de um laboratório ou sala de aula, deve-se notar que este ensaio de eletrodo sucção também pode ser executado usando o CNS da mosca, Musca domesticae provavelmente outras larvas de mosca muscoid , também. O status de Praga de Musca domestica ao gado sugere este ensaio poderiam ser de utilidade significativa para pesquisa programas com o objetivo de caracterizar a sensibilidade neuronal de moscas de populações diferentes ou para determinar a potência do recém desenvolvidos neurotoxicants para eventual controle de infestações.

Além de caracterizar a potência das drogas, esta preparação pode ser usada para caracterizar a influência de mutações genéticas e manipulação sobre a atividade do sistema nervoso de Drosophila . Trabalho anterior mostrou aquele knockdown CNS específicas da codificação gene que o canal de potássio (Kir) retificador para dentro, aumentou a frequência de disparo de base CNS por aproximadamente 2 dobras quando comparado com o controle de moscas31. Estes dados foram combinados com dados farmacológicos para especular, finalmente, que os canais de Kir papel fisiológico servem a função do sistema nervoso de Drosophila .

Embora esta técnica representa um poderoso ensaio para testar diversas hipóteses farmacológicos e fisiológicos, limitações para o ensaio existe e devem ser consideradas. Por exemplo, os dados gerados através de gravações de eletrodo sucção raramente fornecem evidências conclusivas para o exato modo de ação de uma droga ou papel fisiológico preciso para um canal iônico e devem ser estudados em conjunto com mais medições baseadas em células, tais como eletrofisiologia do grampo de remendo. Uma limitação adicional para este método é que os vários receptores e canal de íon sub-tipos não influenciar a taxa de pico de CNS de forma igual. Portanto, é possível que uma modulação de um subtipo do receptor ou canal iônico específico não pode influenciar significativamente a taxa de pico do SNC extirpado, mas na verdade pode ter um efeito crítico na função do sistema nervoso total e/ou integração de sinais.

Embora existam limitações, os dados recolhidos através de gravações de eletrodo sucção fornecem dados de prova de conceito de qualidade e permite aos investigadores gerar hipóteses sobre os mecanismos de ação que podem ser validadas através de tensão-braçadeira eletrofisiologia, análises bioquímicas, ou por meio de testes farmacológicos adicionais. Por exemplo, o último foi realizado para testar a hipótese de que o repelente de insetos, N, N- dietil-3-metilbenzamida (DEET), estava inibindo o sistema octopaminergic em inseto CNS em um esforço para descrever o mecanismo de toxicidade para os mosquitos e voa a26. DEET foi mostrada para ser um neuroexcitant de atividade de CNS de mosca e também alterou o potencial pós-sináptico excitatório evocado na junção neuromuscular, que são colinérgicos e sistemas glutamatérgico, respectivamente,26. Estes dados sugerem que DEET não era susceptível de induzir toxicidade através da inibição colinérgico, como foi sugerido anteriormente34. A frequência de descarga da mosca CNS de gravação após exposição a fentolamina, um antagonista conhecido octopamina, mostrou uma inibição completa do DEET-mediada neuroexcitation, mas não a dos propoxures, que forneceu evidência significativa que DEET foi mais provável que afectam o sistema de octopaminergic do que dor de26. Estes conjuntos de dados publicados destaca-se a variedade de hipóteses e condições experimentais que podem ser investigadas com este método.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Sra. Rui Chen para a dissecção e imagens da drosófila CNS mostrado nas figuras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila melanogaster (strain OR) Bloomington Drosophila Stock Center 2376
Vibration isolation table Kinetic Systems 9200 series
Faraday Cage Kinetic Systems N/A
Dissecting Microscope on a Boom Nikon SMZ800N Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier ADInstruments AM3000H The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor ADInstruments AM3300
Hum Bug Noise Eliminator A-M Systems 726300
Data Acquisition System (PowerLab) ADInstruments PL3504 Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software ADInstruments N/A - Online Download
Fiber Optic Lights Edmund Optics 89-740 Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator World Precision Instruments M325
Microelectrode Holder World Precision Instruments MEH715 Different models are acceptable
BNC cables World Precision Instruments multiple based on size
Glass Capillaries World Precision Instruments PG52151-4
Microelectrode Puller Sutter Instruments P-1000 Also can use Narashige PC-100
Black Wax Carolina Biological Supply 974228
Non-coated insect pins, size #2 Bioquip 1208S2
Fince Forceps Fine Science Tools 11254-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03

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