肿瘤靶向免疫调节副病毒的设计与评价

Cancer Research

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Summary

该协议描述了一个详细的工作流程, 用于产生和体外表征的结肠病毒的免疫调节剂的表达, 使用麻疹病毒编码双特异性 t 细胞引擎为例。应用和适应其他载体平台和转基因将加速新的免疫病毒疗法的发展, 用于临床翻译。

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Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (143), e58651, doi:10.3791/58651 (2019).

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Abstract

成功的癌症免疫治疗有可能实现长期的肿瘤控制。尽管最近在临床上取得了成功, 但仍然迫切需要针对个别肿瘤免疫特征量身定制的安全有效的治疗方法。结肠病毒能够诱导抗肿瘤免疫反应以及肿瘤受限的基因表达。该方案描述了免疫调节结肠病媒的产生和体外分析。以麻疹疫苗病毒编码双特异性 t 细胞发动机为例, 一般的方法可以适应其他病毒种类和转基因。所介绍的工作流包括重组病毒的设计、克隆、抢救和传播。包括分析载体的复制动力学和裂解活性以及离体免疫调节剂的功能的方法, 从而促进新的药物的产生, 以便在临床前模型中进一步发展, 并最终实现临床翻译。

Introduction

肿瘤病毒 (ova) 正在开发为抗癌疗法, 专门在肿瘤细胞内复制并杀死肿瘤细胞, 同时保持健康组织的完整。现在, 人们普遍认为, 在大多数情况下, 结肠病毒治疗 (ovt) 并不完全依靠病毒的有效复制和传播来完全的肿瘤裂解, 而是需要额外的作用机制来成功治疗, 包括血管和间质靶向, 重要的是, 免疫刺激1,2,3,4。虽然许多早期的 ov 研究使用了未经修改的病毒, 但目前的研究受益于生物理解的提高、可能含有新的 ov 的病毒生物库以及基因工程为创造先进的 ov 而提供的可能性平台5,6,7

鉴于免疫治疗最近的成功, 免疫调节转基因在孤儿和易受要求的基因工程中特别感兴趣.与全身给药相比, 接受 OV-infected 的肿瘤细胞有针对性地表达此类基因产物可降低毒性。定位是通过使用固有的同源性病毒或通过修改病毒取向8来实现的。局部免疫调节增强了 ovt 的多方面抗肿瘤机制。此外, 这一策略有助于质疑病毒、肿瘤细胞和宿主免疫系统之间的相互作用。为此, 该协议提供了一个适用和可调整的工作流程, 用于设计、克隆、抢救、传播和验证编码此类转基因的阴道副粘病毒 (特别是麻疹病毒) 载体。

免疫反应的调节可以通过针对癌症免疫周期9不同步骤各种转基因产品来实现, 包括增强肿瘤抗原识别 [例如, 肿瘤相关抗原 (taas) 或诱导剂。主要组织相容性复合体 (mhc) i 类分子] 超过支持树突状细胞成熟, 有效的抗原表达 (细胞因子);招募和激活所需的免疫细胞, 如细胞毒性和辅助 t 细胞 [趋化因子, 双特异性 t 细胞引擎 (bte)];针对调节 t 细胞、骨髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和癌症相关成纤维细胞 (抗体、bte、细胞因子) 等抑制细胞;防止效应细胞抑制和衰竭 (检查点抑制剂)。因此, 有大量的生物制剂可供选择。有必要评估这种病毒编码的免疫调节剂, 使其了解治疗效果和可能的协同作用, 并了解各自的机制, 以改善癌症治疗。

否定意义单链 rna 病毒的特点是几个特点, 有利于他们作为结肠病媒使用。其中包括自然转子组织、大基因组能力的转基因 (超过 5kb)10,11, 有效的传播, 包括合胞形成, 和高免疫原性12。因此, ov 平台基于犬疫病毒13、腮腺炎病毒14、新城疫病毒15、仙台病毒16、17、simian病毒 518 和Tupaia 副粘病毒19已开发。最突出的是, 麻疹减毒活株 (mv) 在临床前和临床发展方面取得了 2021个进展。这些病毒株几十年来一直被用于常规免疫接种, 安全记录非常好.此外, 由于对粘病毒的严格的细胞质复制, 没有插入诱变的风险。一个基于抗基因组 cdna 的多功能反向遗传学系统, 允许将转基因插入到额外的转录单位 (atu) 是11,23,24。目前正在临床试验中评估编码钠-碘化物对称性 (mv-nis) 以用于成像和放射治疗或可溶性癌胚抗原 (mv-cea) 作为病毒基因表达替代标记的 mv 载体 (nct02962167, nct0207994,nct02192775、nct01846091、nct023234713、nct00440814、nct002700230、nct03456908、nct000408590 和 NCT00408590)。安全给药已经确认, 以前的研究报告了抗肿瘤疗效的病例 25,26,27,28, 29,30 (由 msaouele. 各项) 审查, 为已经开发并在临床上进行测试的更多结肠麻疹病毒铺平了道路. mv 编码免疫调节分子针对不同步骤的癌症免疫周期已被证明延迟肿瘤生长和/或延长生存期的小鼠, 有证据表明免疫介导的疗效和长期保护免疫记忆在合成鼠标模型。vtor 编码的转基因包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (gm-csf)32,33,幽门螺杆菌中性粒细胞活化蛋白34, 免疫检查点抑制剂 35,白细胞介素-12 (il-12)36、taas37和 bte38, 将肿瘤表面抗原与 cd3 交叉连接, 从而通过多克隆 t 细胞诱导抗肿瘤活性, 而不考虑 t 细胞受体特异性和共同刺激 (图 1)。为这些结构获得的有希望的临床前结果需要进一步的转化努力。

talimogene laherparepvec (t-vec) 是美国食品药品监督管理局 (fda) 和欧洲药品管理局 (ema) 批准的唯一一种经美国食品和药物管理局批准的 i 型单纯疱疹病毒。导致2015年底批准的第三阶段研究不仅显示了肿瘤内注射部位的疗效, 而且还显示了晚期黑色素瘤39的同期效应 (即非注射病变的缓解).此后, t-vec 进入了其他肿瘤实体的额外试验 (例如,非黑色素瘤皮肤癌、nct03458117; 胰腺癌、nct03086642), 并评估综合疗法, 特别是免疫检查抑制剂 (nct0292978625, nct0325636444, nct02509507, nct026263508, nct0292667016, nct026266000, nct0296378, nct01740297, rias e. 40).

这不仅表明了结肠免疫治疗的潜力, 而且还需要进一步研究, 以确定卓越的 ovt 和免疫调节的优越组合。合理设计额外的载体并为临床前试验开发这些载体是这项工作的关键。这也将促进对潜在机制的了解, 并对更个性化的癌症治疗进展产生影响。为此, 本出版物介绍了用于靶向癌症免疫治疗的副粘病毒的修饰和开发方法, 更具体地说, 介绍了编码 t 细胞参与抗体的结肠化麻疹病毒的方法 (图 2)。

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Protocol

请注意:[o]、[p] 和 [m] 分别表示适用于: 一般的 ovs、(大多数) 副粘病毒或 mv 的子部分。[b] 表示 bte 转基因的特定部分。

1将免疫导管编码的转基因感染克隆到麻疹病毒载体中

  1. [o] 设计插入序列。
    1. [o] 根据文献研究或基因屏幕等探索性数据, 决定一个感兴趣的免疫调节剂41 , 并从相关数据库 (如 genbank、欧洲核苷酸档案或国际 immunogenecics 信息系统 (imgt)。
    2. [o] 在转基因序列中添加其他特征 (图 3)。前面的 kozak 序列和特定物种的密码子优化可以增强表达式。分泌物需要信号序列。包括编码 n-和/或 c 末端蛋白标记的序列, 用于检测和纯化42。包括要插入到矢量中的限制站点。
      请注意:[m] 额外的转录单位 (atu) 窝藏 mv 聚合酶基因启动和停止信号是必要的转基因表达从重组 mv 基因组。在11个之前开发了合适的抗基因组 cdna 载体, 由 cmv 启动子控制, 并包含具有独特限制位点的 atu, 以便在确定的位置引入正感转导。[p] 转基因的充分定位至关重要, 因为它影响病毒复制和转基因表达, 因为副粘病毒43的表达梯度典型。引入接近抗基因组 3 ' 端的 atu (即在p基因的领先位置或下游) 通常会导致高转基因表达, 而牺牲了病毒复制的减少。当使用h基因下游的 atu 时, 可以预期复制增加, 转基因表达水平降低。包括麻疹病毒在内的几种副粘病毒基因组的包装需要每个核壳蛋白44结合6个核苷酸。对于将转基因插入此类病毒, 请确保完整基因组中的核苷酸数量可被6个可分。这也被称为 "六条规则"45,46。如有必要, 在插入物中加入额外的核苷酸 (kozak 序列上游或停止密码子的下游), 而不引入帧移位或过早停止密码子。[m] 避免转基因中类似于 mv 基因启动 (aggrncmargw) 和停止 (rttawaaaa) 信号和 rna 编辑序列 (aaaaggg) 的特定序列。这种协商一致的顺序已经公布 (例如, 见 parks 等人47)。
    3. [o] 使用标准分子克隆48购买所需序列的寡核苷酸或从可用序列组装.
      请注意:[o] 对于转基因的 pcr 扩增, 设计一个正向引物, 包括插入物的上游限制位点和前15-20 核苷酸, 以及一个反向引物, 包括插入物的最后15-20 核苷酸, 然后是下游限制网站。
  2. [o] 克隆插入到编码病毒 (反) 基因组的 dna 中。
    1. [o] 通过标准分子克隆技术 (即酶限制, 然后是 dna 结扎) 将插入 rna 病毒的 dna载体或 dna 反基因组克隆。
      1. [o] 通过使用不兼容的限制位点或在结扎前消除磷酸化, 防止矢量的重结扎。
      2. [o] 通过琼脂糖凝胶电泳和随后使用市售试剂盒纯化结扎产物。一般情况下, 最佳结扎效率是在 3: 1 摩尔比的插入矢量。
    2. [o] 将结扎产物转化为适合有效回收大型质粒的合格细菌 (即执行大肠杆菌49休克), 并通过菌落 pcr 50 识别隐藏正确 dna 的细菌克隆.
    3. [o] 使用市售的 dna 制备试剂盒从单个细菌克隆中分离扩增 dna。用适当的限制性酶 (例如, mv 基因组的 HindIII) 控制消化来确认基因组的完整性。通过测序确认转基因的正确插入和完整性。
      请注意:[m] 对于插入 mv h-atu的转基因, 使用以下引物进行 sanger 测序: h-9018 [正向引物, 结合到 h 开放阅读框架 (orf) 中 mv 基因组9018的 mv 基因组位置]: 5 ' gtgtgggggggggggactcaatc 3 ';l-9249 + (反向底漆, 结合 mv 基因组位置9249在l orf): 5 ' cagggggcactacg 3 '。

2. 抢救重组麻疹病毒颗粒编码免疫调节剂

  1. [o] 根据相应病毒的标准协议,通过病毒生成细胞的转染从 (反) 基因组 dna 中生成重组病毒颗粒。遵循无菌条件下的工作指南。在头套下进行细胞培养, 特别是在二级生物安全柜中涉及病毒的所有步骤。
    1. [m] 为抢救麻疹病毒从 cdna23,24, 板材 mv 生产商 (非洲绿色猴子肾脏获得的 vero) 细胞均匀地在6井板材24小时在转染之前。种子 2 x 10 5 细胞在2毫升 dulbecco 的修饰鹰的培养基 (dmem) 含有10% 的胎牛血清 (fbs) 每口井达到65–75% 的融合在转染时。
      请注意:[p] 如果细胞在病毒引起的合胞形成之前过度生长, 则减少细胞数量。
    2. [p] 用 dna 对病毒抗基因组进行转染细胞, 需要辅助质粒, 如果需要, 还需要编码荧光记者的质粒来评估转染效率。
      1. [m] 将编码麻疹病毒反基因组的5微克重组 dna、编码麻疹病毒 n 和 l 蛋白的哺乳动物表达质粒中的 500 ng、编码为 p 蛋白的 100 ng (每个质粒) 和一个总体积为 200μl dmem 的荧光记者。
      2. 加入18.6μl 脂质体转染试剂, 立即通过闪烁管混合, 并在室温 (rt) 下孵育25分钟。
      3. [p] 每口将培养基更换为 1.8 ml 的 dmem、2% fbs、50μgl 卡那霉素 (或其他防止污染的抗生素), 然后将转染混合液滴入井中, 小心旋流。在 37°c, 5% co 2 下隔夜培养细胞.第二天将培养基更换为2毫升新鲜 dmem、2% fbs 和50μgml 卡那霉素;当介质变成酸性时, 重复此操作。
        注意事项:[o] 根据生物安全法规处理细胞和材料, 因为通过以下步骤进行的转染可能会产生病毒。适当处置 (潜在的) 传染性废物。
  2. [p] 收集和传播病毒颗粒。
    1. [p] 每天用显微镜观察细胞的报告基因表达和合胞形成 (图 4)。当由20个或更多细胞组成的大合胞时, 或当细胞变得过于密集时 (即它们开始在多层中生长时, 通常在7-9天之后), 收获病毒。
      请注意:[p] 如果在给定的矢量构造中没有观察到合胞, 这不一定意味着救援失败。然而, 由于感染病毒可能存在于样本中, 转移到新鲜的生产者细胞进行传代。
    2. [p] 种子约 1.5 x10 6 生产细胞在 12 ml 的 dmem 与 10% fbs, 在10厘米的菜肴24小时前, 预期收获, 或 2.5 x 10 6细胞每个板4-6 在病毒的传代前达到65-75 的融合, 在接种病毒的时候达到65-75 的融合离子。
    3. [p] 为了收集病毒后代, 使用细胞刮刀从盘子中仔细刮掉粘附细胞, 并将含有细胞的上清液转移到离心管中。在 2, 500 x g和4°c 条件下离心 5分钟, 清除细胞碎片。
      请注意:刮伤的细胞可以在不离心的情况下直接转移, 以最大限度地进行病毒传播, 代价是不理想的培养条件和潜在的显微镜伪影。
      注意: 刮刮电池时, 避免溢出介质。最大限度地减少气溶胶的形成。
    4. [p] 将无细胞上清液从一步2.2.3 与无血清介质混合到最终体积为4毫升来制备接种。用接种剂取代生成细胞上的培养基, 在37°c 和 5% co 2 下孵育细胞至少2小时。用10% 的 fbs 加入6毫升的 dmem, 并在一夜之间孵育细胞, 然后用10% 的 fbs 将培养基改为12毫升。
    5. [p] 每天至少观察两次细胞, 并在合胞爆发前收获病毒 (即,当膜破裂变得可见时)。要收获病毒的第一次传播, 从盘子中取出上清液, 加入600μl 的无血清培养基, 用细胞提升机刮细胞, 然后转移到干净的管中。
      请注意:[m] 根据病毒株5152和感染的进展, 将被感染细胞的板转移到 32°c, 以促进病毒复制和传播。一般来说, mv schwarz 菌株在37°c 时传播良好, 而感染 edmonston b 毒株病毒的细胞转移到 32°c, 导致合胞形成速度较慢, 但滴度较高。
      请注意:[p] 在收获过程中不允许细胞层干燥, 因为这将降低病毒颗粒的传染性。虽然在丢弃受感染细胞的上清液时丢失了一些病毒, 但从细胞层可以获得较高的滴度。
    6. [p] 立即将病毒悬浮液冻结在液氮中。在-80°c 下存放至少 24小时, 以确保彻底冻结。如果需要, 将中断该过程的时间延长到几天。
    7. 在37°c 下解冻, 释放病毒颗粒。在 2, 500 x g 和4°c 下, 通过涡旋和离心器进行5分钟的同质化。将上清液转移到贴有标签的低温管, 并储存在-80°c。
      请注意:[o] 将病毒存储在适合以后实验的适当大小中, 因为它们优先解冻一次, 并立即使用。[p] 在4°c 下, 进一步的冻融循环或储存在4°c 后, 可显著降低病毒滴度。
    8. [p] 在进一步传代前一天, 在15厘米的盘子中, 种子 4 x10 6 在dmem 中的12毫升中, 有10% 的 fbs。接种与病毒在多种感染 (moi) 0.03。在每个板的8毫升无血清培养基中, 在孵育细胞至少2小时后, 将培养基换成10% 的 fbs, 用多个培养基进行扩展。
    9. 收获, 如步骤2.2.5 中所述, 当合胞已扩散到整个细胞层。按照步骤 2.2.6 2.2.7 中的说明, 将获得的悬浮液集中在50毫升管和工艺中。
      请注意:[o] 在收获前, 要在视觉上检查所有板材是否有细菌和真菌污染, 这一点至关重要。一般情况下, 通过多重 pcr 定期检查所有细胞系是否含有支原体或不定毒。
  3. [p] 评估病毒滴度.使用96孔板测定每副组中病毒库存的滴度。对每个病毒救援的三个个体等价物进行滴定, 并使用平均值计算实验中使用的病毒悬浮量。
    1. [p] 在 dmem 中, 用10% 的 fbs 将生成单元格、计数和调整为每 ml 1.5 x10 5 单元。
    2. [p] 将具有 10% fbs 的 dmem 的移液90μl 放入96孔板的每口井中。
    3. [p] 将病毒库存的一个位数中的10μl 添加到板第一列的所有8口井中, 通过向上和向下移液至少10次进行彻底混合。
    4. [p] 对病毒进行连续10倍的稀释。使用多通道管道将每口井的10μl 从第一柱转移到第二列。通过上下移液彻底混合, 并在每个稀释步骤中使用新鲜的移液吸头。从最后一列的每口井中丢弃10μl。
      请注意:每个96孔板允许12个连续稀释步骤。[m] 对于 mv 载体, 10倍稀释的8步通常是足够的, 因为通过步骤2.2 中描述的传播方法很少获得 1 x 10 9 细胞感染单元 (ciu)/ml 以上的滴度。[p] 无病毒控制井可用于比较和监测污染。
    5. [p] 在每口井中加入100μl 的细胞悬浮液, 在37°c 孵育, 5% co2孵育 48小时. 确保悬浮液中没有细胞团块, 以实现细胞的均匀分布。
    6. [p] 使用光学显微镜检查是否有合胞。在具有含有可见合胞的最高稀释因子的柱的每口井中计数合胞。
    7. [p] 通过将合胞总数除以 8, 计算该列中每口井的平均合胞数。将该平均值乘以各列的稀释系数, 第一列53从每毫升 10 2 (参见图 5为例)

3. 确定病毒载体编码免疫调节剂的复制能力和细胞毒性能力

  1. [o] 利用一步或多步生长曲线 (gc) 比较生成的重组病毒和未修饰载体的复制动力学。对于一步 gc, 病毒后代是在同时感染所有细胞 (理论上, 100% 感染) 后评估的。多步 gc 开始于受感染细胞的低百分比, 以跟踪几轮病毒复制。
    1. [m] 为了分析麻疹病毒复制动力学, 种子 1 x10 5 vero 细胞在 1 ml 的 dmem 与 10% fbs 每井12孔板在感染前一天。作为技术复制, 每个感兴趣的时间点至少有两口井。
    2. [o] 在低 moi 或在高 moi 为一步 gc [m] 感染细胞 (分别为 vero 细胞上的 mv 复制的0.03 和 3)。将培养基更换为300μl 的无血清培养基, 其中含有相应数量的病毒, 在37°c 孵育, 在25°c 孵育至少 2小时. 取出接种物, 加入1毫升的 dmem 与10% 的 fbs, 并继续孵育.
    3. [p] 在感染后的12、24、36、48、72和96小时等相关时间点, 通过直接将细胞刮入培养基来收获病毒后代。将每口井的内容物输送到单独的管, 在液氮中进行夹头冻结, 并在-80°c 下储存, 直到滴定。
      请注意:[p] 复制的样本可以在此步骤中汇集, 以分析平均滴度。
    4. [p] 从所有时间点收集样本。在37°c 下同时解冻, 以评估病毒后代。在 2, 500 x和4°c 条件下离心5分钟的涡旋和颗粒细胞碎片。
    5. [p] 如上文所述, 计算每个构造和时间点的平均滴度。随着时间的推移, 绘制滴度。比较有插入和不插入的转基因的载体的生长曲线, 不同的转基因, 或在不同位置插入的转基因 (见图 6a)。
  2. [o] 比较免疫调节剂编码和未修饰病毒的溶栓活性。
    1. [o] 从可能的方法中选择, 包括阻抗测量、乳酸脱氢酶 (ldh) 释放试验或代谢型比色细胞活力测定 [例如, 3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基四唑 (mtt)) 和 2, 3-倍基 (2-甲氧基-4-硝基-5-磺酰基)-2h-thrazoli-5-羧基 (xtt) 分析]。
      1. [m] 为了使用 xtt 法分析麻疹病毒载体的细胞毒性, 如步骤3.1.1 中所述, 种子 vero 细胞。包括为每个时间点复制的未受感染控件。
        请注意:[o] 在同一样品上的不同时间点进行 xtt 检测可以限制技术错误, 但反复清洗和暴露于 xtt 试剂会影响活细胞的数量。阻抗为连续测量提供了另一种读数。
    2. [m] 按照步骤3.1.2 中所述, 以1的 moi 感染 vero 单元格。
      请注意:[m] 对于不太宽松的靶细胞 (如一些小鼠肿瘤细胞系) 的感染, 可能需要3或5的较高 moi。
    3. [o] 在感兴趣的时间点 (例如,感染后12、24、36、48、72和96小时) 准备所需数量的 xtt 试剂 (即每口300μl 加10% 的过剩)。避免光线照射。
    4. [m] 在每个时间点, 从相应的井中去除介质。在黑暗中替换为300μl 的 xtt 试剂, 并在37°c 时孵育。当控制井中的试剂变成深红色 (通常需要15分钟至 2小时), 并在-20°c 冻结时收集上清液。
      请注意:[o] 孵化时间取决于病毒的结构、细胞类型、密度和细胞病理效应。
    5. [o] 收集所有样品后, 同时解冻。将每个样品的100μl 传输到96孔板, 并在 450 nm 处测量光学吸收率, 以 630 nm 为参考波长。
    6. [o] 绘制时间点 (x 轴) 与样本相对于对照的光学吸收率, 表明代谢活动是细胞活力 (y 轴) 的代用因素。随着时间的推移降低相对吸收性意味着病毒细胞毒性 (见图 6b)。

4. 分析从受感染细胞中分离的病毒编码免疫调节剂的活性

  1. [o] 分离病毒感染靶细胞表达的分泌的转基因产物。
    1. [p] 让病毒产生细胞在 t175 瓶中生长到70% 的融合。
    2. [p] 从细胞中取出培养基, 用12毫升 pbs 清洗两次, 去除血清。在12毫升无血清培养基中, 用0.03 的 moi 接种病毒细胞, 在37°c 和 5% co 2 中孵育过夜.将培养基更换为12毫升的新鲜无血清介质。
      1. [m] 对于 edmonston b 病毒, 在40小时后将细胞从37至32°c 转移, 再孵育 24小时, 以促进感染, 并防止合胞的过早爆发。根据病毒株5152和合胞进展, 孵育温度和时间可能会调整, 以获得最佳的蛋白质产量和纯度。
    3. [p] 在合胞爆发前, 在未分离细胞的情况下, 小心地收集上清液。最理想的情况是, 合胞已扩散到整个细胞层。在50毫升管中池上清液。
      请注意:[p] 为了有效纯化转基因产物, 在收获受感染细胞的上清液时, 避免合胞爆裂, 并最大限度地减少细胞碎片。
    4. [p] 在 2, 500 x g 和4°c 下离心 5分钟, 通过0.22μm 过滤器, 从上清液中清除细胞碎片. 根据滤液的总体积, 这可以使用注射器或真空泵进行。
    5. [o] 使用适当的纯化方法分离转基因产物。使用 ni-nta 迷你自旋柱 38, 用六组氨酸 (他的) 标签纯化蛋白质, 如这里所述 (步骤4.1.5.1 – 4.1.5.4)。
      请注意:[o] 快速和在冰上执行所有步骤。预冷缓冲液和预冷却离心机至4°c。
      1. [o] 用 pbs、200 mm 氯化钠和咪唑在最终浓度为 10 mm (洗涤缓冲液 1, wb1)、20 mm (洗涤缓冲液 2, wb2) 和 500 mm (洗液缓冲液, eb) 时, 用 pbs、200 mm 氯化钠和咪唑制备100毫升的缓冲液。将 wb1 和 wb2 的 ph 值调整为 8.0, 将 eb 的 ph 值调整为7.0。根据要纯化的蛋白质, 可能需要调整咪唑浓度。
      2. [o] 具有 600μl wb1 的平衡柱和 800 x g 的离心机 2分钟, 盖子打开。
      3. [o] 将600μl 过滤的上清液加载到列上。允许将他的标记蛋白与色谱柱状结合, 在 200 x g的离心下, 用闭合的盖子进行5分钟的离心。加载和结合可重复到每列总共300μg 的他标记的蛋白质。
      4. [o] 用 wb1 洗三次, 用 wb2 洗一次, 或者直到流经是无色的。加入600μl 的缓冲液, 以 800 x的速度旋转 2分钟, 盖上开盖。
      5. [o] 通过在 800 x g 处执行两个洗脱步骤, 使用300μl 的 eb 和离心 2分钟, 将蛋白质洗成新鲜的管
      6. [o] 根据产品尺寸使用离心过滤器进行脱盐和浓缩产品。将 pbs 添加到15毫升的体积中,并通过离心过滤 10分钟, 速度为 4, 000 x g。重复此操作, 直到达到所需的纯度和浓度。为了增加蛋白质浓度, 通过离心40分钟将最终体积减少到约 200μl, 在 4, 000 x
  2. [o] 确认产品的纯度和标识。
    1. [o] 使用标准比色法 (如双氯酸 (bca) 或布拉德福德检测 54,55) 定量分离株中的总蛋白含量。[m] 典型值的范围可以是每一个被感染细胞的 ml 上清液的1–3微克转基因产物。
    2. [o] 对于蛋白质分离物的相对定量,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 分离, 并进行库莫西染色56
    3. [o] 通过使用针对蛋白质或相关肽标记57的特定抗体进行免疫印迹, 确认纯化产物同一性。
    4. [o] 使用适当的技术分析蛋白质结合特异性, 这些技术可能包括酶联免疫吸附法 (elisa) 或流式细胞术 (见图 7)。细胞结合可以通过最近描述的磁下拉法确认38
      请注意:[o] 使用适当的控件。在细胞结合检测中, 包括不表达目标分子的细胞的负对照 (如图9所示) 和非靶向蛋白代孕物 (图 8)。在流式细胞术实验中, 包括阳性、阴性和同型对照 (图 7)。
      1. [o] 共同培养靶细胞和分离蛋白以允许结合。[b] 为了将 bte 与从人体血液中分离出的外周血单个核细胞 (pbmc) 结合分析 58, 在100μl 的 pbs 中孵育 2.5 x10 6 bte 细胞, 并在冰上孵育1% 的 fbs (结合缓冲液, bb) 1小时。
      2. [b] 用1毫升的 bb 清洗细胞, 去除未结合的蛋白质。以 300 x离心 5分钟, 丢弃上清液, 并在100μl 的 bb 中重新悬浮颗粒。添加生物素化抗体, 以感兴趣的蛋白质或相关的肽标记为靶点, 在冰上孵育30分钟。对于带有流感血凝素 (ha) 标签的 bte, 请使用100纳克抗 ha-生物素 (克隆 3f10)。
      3. [b] 用 bb 1 毫升清洗细胞两次, 并在 80μl bb 中重新悬浮。加入20μl 的链球耦合磁微珠, 在4°c 下孵育15分钟。
      4. [b] 清洗一次, 去除多余的珠子, 并在500μl 的 bb 中重新悬浮颗粒, 辅以 2 mm edta (柱状缓冲液, cb)。
      5. [b] 根据供应商的手册, 用柱子和磁性支架隔离电池。
        1. [b] 平衡允许500μl 的 cb 通过重力流穿过柱。
          请注意:[b] 柱不能干燥。小心移液和脱水的缓冲器, 以避免气泡。
        2. [b] 在色谱柱下放置一根干净的管, 并将细胞珠悬浮液涂在色谱柱上。每次清洗500微米的 cb 清洗柱三次。收集悬浮液和至少在管内的第一步清洗步骤的流动样品, 然后存放在冰上。
        3. [b] 由磁场保留的磨珠细胞。为此, 从磁性支架上取下柱, 将其放置在干净的管上, 添加1毫升的 cb, 然后使用柱塞将缓冲液通过柱快速推入管中。把管子放在冰上。
      6. [b] 在 16, 000 x g 和4°c 的情况下, 将含有流经和洗脱样品的离心管20分钟。在放射免疫沉淀法 (ripa) 缓冲液中丢弃上清液和裂解细胞 (建议: 75μl)。执行 sds页 56
      7. [b] 使用合适的原代抗体进行免疫印迹。抗体可能针对转基因产物或细胞蛋白 (例如, β-肌动蛋白,图 8) 来评估 bte 细胞结合。
  3. [o] 评估孤立免疫调节剂的免疫功能。
    1. [o] 根据编码免疫调节剂的特性确定相关检测方法。关于预期的免疫调节活性, 评估细胞增殖、迁移、成熟、活化或细胞毒性的方法可以应用。
      请注意:[o] 细胞增殖可以通过 cfse59标签或 ki67 染色60进行分析。可进行转井或划痕实验来分析细胞迁移61。细胞的成熟和激活可以用适当的染色协议来评估各自的标记。[b] 评估 bte 介导的细胞毒性的可用技术包括阻抗测量和铬释放分析。如果选择铬释放分析, 在处理放射性物质时, 请注意适当的安全措施。
    2. [b] 作为一种非放射性替代品, 下面详细介绍了如何通过 ldh 释放分析来评估 bte 诱导的细胞介导的细胞毒性 (如前一篇简短的38)。
      1. [b] 确定要在实验期间测试的条件 (例如图 9 )。时间点 (小时至天)、免疫调节剂 (pgml 到μg/ml) 和目标细胞比效应 (例如, 在1:50 至50:1 之间) 的浓度可以改变。始终准备样品的三重奏。
      2. [b] 包括没有蛋白质和没有效应细胞的样品, 控制单个细胞类型 (t sp 和 esp) 的自发 ldh 释放, 目标细胞最大裂解控制 (tmax ),在读出之前添加洗涤剂, 培养基仅控制, 并为 t最大值的音量控制。
        请注意:[b] 目标细胞所需数量和孵育时间可能会有所不同。在没有效应细胞和免疫调节剂的情况下执行初始测试运行, 以确定最佳参数。包括 tsp和 t最大样本和相应的控件来评估不同的细胞数量和时间点。
      3. [b] 分离免疫效应细胞 (例如, 通过密度梯度离心人体血液, 从小鼠脾细胞62中获得 pbmcs58或阴性选择小鼠 t 细胞)
      4. [b] 在 u 底部96孔板中, 根据步骤 4.3.2 (例如,每口井 5 x 10 立方米) 的种子靶细胞。
      5. [b] 将所分离的蛋白质以所需浓度添加到相应的样品中。以所需的比例添加免疫效应细胞。在每口井100μl 的总体积中添加介质。
      6. [b] 在4.3.2 步骤确定的时间框架内孵育, 通常为4至 48小时 (未受刺激的 pbmc 为 24小时, 新分离的小鼠 t 细胞为 48小时; 较短的孵育时间可适用于预设定免疫细胞), 为37°c 和 5% co 2
      7. [b] 在采集样品前 45分钟, 在含有 t最大样品的井中加入10μl 的10倍裂解溶液和相应的介质控制。继续孵育。
      8. [b] 将细胞向下旋转 250 x g , 每次 4年, 将每个上清液的50μl 转移到一个平底96孔板上。不要转移细胞以避免细胞结合的 ldh。
      9. [b] 根据制造商的要求准备基板溶液。在每口井中加入 50μl, 并在黑暗中孵育30分钟或直到 t最大样本变成深红色。
      10. [b] 在每口井中加入50μl 的停止溶液。通过离心 1分钟, 4, 000 x, 并手动使用空心针, 去除气泡。测量490纳米的光学吸收率。
      11. [b] 计算每个样本的% 特定裂解值。
        1. [b] 计算具有和不具有解的介质控件的复制平均值。分别从实验样品和 t最大值和自发释放控制中减去得到的值。使用这些背景校正值进行进一步计算。
        2. [b] 计算背景校正 t最大值、tsp和 esp控件的平均值。使用这些平均值, 下面的公式会产生每个样本的特定裂解百分比:

          Equation 1
        3. [b] 与非靶向对照对照样品比较, 绘制出的比裂解值与蛋白质浓度或 e:t 比并进行比较。

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Representative Results

图 1显示了结肠麻疹病毒编码双特异性 t 细胞器的作用机制。图 2显示了描述此协议工作流的流程图。图 3 显示了一个改良的细胞性麻疹病毒基因组的示例。这提供了应用于麻疹病毒反基因组的具体变化的视觉表示和插入的转基因的特殊特征。典型的麻疹病毒引起的合胞症如图 4所示。请注意在收获救援时的高细胞密度 (a, b), 这表明在重复实验时, 细胞数量可能会减少。孵化温度和-时间可以优化, 以便在 vero 细胞 (c, d) 上进行过细胞化, 从而改善合胞在板上的扩散。图 5代表了典型滴定试验的结果。在图 6中, 显示了接种未经修饰 (mv) 和 bte 编码的感冒麻疹病毒 (mv-h-mcd3xcd20) 后的一步生长曲线 (a) 和相对细胞活力 (b)。当 vero 细胞上比较载体的生长曲线出现相似时, 转基因编码病毒的裂解活性在小鼠肿瘤细胞系中滞后。图 7提供了在五种不同稀释物中用 bte 培养的靶向抗原表达细胞的流式细胞仪数据, 表明 bte 由细胞以与浓度相关的方式结合。图 8代表了 bt 相关细胞的磁下拉后的典型免疫印迹。使用非目标 bte (n1, n2) 拉下没有产生可检测到的细胞数量, 而在洗脱部分中观察到表明结合细胞的带, 以确定 bte 样本 (t1, t2)。bte 介导的、靶向抗原特异性和浓度依赖性的小鼠 t 细胞毒性是用图9中具有代表性的 ldh 释放分析显示的。

Figure 1
图 1: 结肠麻疹病毒编码双特异性 t 细胞传感器 (mv-bte) 的作用机制.肿瘤细胞感染 (感染: 灰色, 未感染: 浅蓝色) 与 mv-bte 后病毒复制和传播整个肿瘤, 导致肿瘤细胞裂解和免疫刺激。同时, bte [由从 t 细胞 (黄色) 上的 cd3 抗体中提取的两个单一链和肿瘤表面抗原 (蓝色) 组成] 由病毒感染细胞在当地产生和分泌。bt 介导的与肿瘤细胞的交联诱导休眠的多克隆 t 细胞激活, 导致肿瘤细胞的进一步杀伤。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 流程图描述了编码免疫调节转基因的新型病毒载体的设计、生成和评估工作流程.步骤1至4反映了议定书的各个部分。项目符号点指示相关的注意事项和子步骤。由于过程的经验性质, 在工作流的任何步骤中都可能需要进行调整或改进。此外, 实验结果可以导致新的假设, 并激发额外载体或组合治疗的发展。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 麻疹病毒基因组的示意图表示.增强的绿色荧光蛋白 (egfp) 被编码在引线 (ld) 序列下游的一个额外转录单元中。n、p、m、f、h 和 l 分别指定编码麻疹病毒结构蛋白、核蛋白、p 蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素蛋白和大蛋白 (聚合酶) 的基因, 这些基因在可视化中表现出不同的表达以上。一个双特异性 t 细胞引擎 ( bte ) 转基因入到一个额外的转录单位 ( atu ) 下游的 h 开放阅读框架。转基因编码一个米诱导肽有效分泌, 以及流感血凝素 (ha) 和六组氨酸 (他的) 蛋白标记的检测和纯化。分别针对 cd3 和 cd20 的可变重 (vh) 和轻链 (vl) 域基因编码通过含有甘氨酸 (g) 和丝氨酸 (s) 残基的肽链剂序列连接。转基因序列之前有一个科扎克序列。在编码区域的下游, 还包括了额外的核苷酸, 以符合六项规则。插入盒式磁带的两侧是两个限制点, 允许插入到相应的 atu 中。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 麻疹病毒引起的合胞症.(A、B)用 cdna 对 vero 细胞进行转染, 以挽救编码增强绿色荧光蛋白 (transfected) 和双特异性 t 细胞引擎 (bte) 的重组麻疹病毒, 以小鼠 cd3 和人 cd20 为靶点。荧光合胞体 (白色箭头) 的存在表明感染性病毒的成功挽救。(C, D)麻疹病毒在救援后被采集并在维罗细胞上传播 (第1段)。大的合胞形成, 并已开始爆裂 (黄色箭头)。通过相位对比 (b、d) 和荧光显微镜在激发80毫秒 (a) 和100毫秒 (c) 后获得图像。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 滴定法的代表性结果.在 vero 细胞上滴定第三批 mv-h-mcd3xcd20, 一种 bt 编码的感冒麻疹病毒。在96孔板上进行了10倍的连续稀释, 从 1. 1 柱每井10μl 病毒悬浮液开始, 第7栏不可见合胞, 如零所示。在第6栏的下一次最低稀释病毒悬浮液中, 平均每口井观察到6个合胞, 最终每株病毒悬浮液约为 6 x 107个细胞感染单位 (ciu)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6重组麻疹病毒的复制动力学和裂解活性.(a) vero 细胞感染未修饰的结肠炎麻疹病毒 (mv) 或编码双特异性 t 细胞吞没 (mv-h-mcd3xcdcd20) 后, 在1的 moi 中产生了一步生长曲线。病毒后代的滴度在感染后的指定时间点进行评估, 表明类似的病毒复制动力学。显示了8个样本的平均值和标准偏差 (每个时间点两个生物复制中的四个技术复制)。(b) 仅用培养基 (模拟) 或表明病毒1的 moi 接种后, 对 mc38 小鼠结直肠癌细胞的细胞活力进行了评估, 这些细胞稳定地表达了人类癌胚抗原和 mv 受体 cd46 (mc38-cea-cd46)。xtt 细胞活力测定是在指定的时间点进行的。在未修饰载体的早期时间点观察到细胞活力的降低。在12小时的时间点上, mv-h-mcd3xcd20 的数值超过 100%, 在感染后不久就会被观察到, 这可能是由于病毒悬浮液中存在的细胞应激或细胞衍生因素造成的。显示每个时间点的平均值加上三个技术副本的标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 由麻疹病毒感染细胞表达的双特异性 t 细胞发动机 (bte) 的靶向细胞结合。人本应本组织细胞淋巴瘤细胞内生表达 cd20 (granta-519), 用人免疫球蛋白 g 孵育 fc 受体, 然后分别用2、4、6、8或 10μl (a) 纯化的 mcd3hcdcd20 bte 溶液孵育。利用针对 bte 相关 ha 标记的植物菊酯 (pe) 共轭抗体检测 bte 结合细胞。染色细胞的百分比与 bte 浓度相关。(b) 控制绑定的选择性和特异性。这里展示的是一个独立实验的控制, 包括一个样本, 每个细胞不是与 bte 培养, 而是只有 bte 靶向抗体 (控制抗体与细胞的非特异性结合) 或 bte, 已知与感兴趣的细胞结合, 然后用 bte 靶向抗体 (阳性对照) 或同型抗体孵育。如果可用, 不表达所选择的目标抗原的同源细胞可用于进一步验证结合选择性。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 受麻疹病毒编码 bte 束缚的人外周血单个核细胞的磁拉下。细胞分别用两批不同的人 t 细胞靶向 (t1, t1) 或非靶向对照 bte (n1, n1) 进行培养。bte 结合细胞被保留在列使用磁珠, 颗粒和裂解。免疫印迹法检测溶酶中的β-肌动蛋白。洗脱样品中的带强度表示相对 bt-细胞结合。流经样本确认所有样本中存在细胞。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 麻疹病毒编码 bte 的细胞毒性活性.用小鼠 t 细胞以1:50 的比例孵育靶向肿瘤细胞 (每口井 5 x 10 b16-cd20-cd46 细胞)。在表明浓度下添加了先前从 mv-h-mcd3xcd20 感染细胞上清液中纯化的 bte。48小时后, 采用 ldh 释放法对靶细胞的相对裂解进行了评估, 缺乏 bte 靶向抗原 (b16-cd46) 的细胞可作为评价抗原特异性细胞毒性的参考。显示了每个样品三个技术副本的平均值加上标准偏差。目标抗原表达细胞是以 bte 浓度相关的方式进行特别裂解的。bte 产物的纯度和靶向抗原表达水平影响细胞杀伤。在本例中, 在相对较高的 bte 浓度为1μgml 的情况下, 达到了15% 的特异性细胞杀伤。这是这种具有较长共同孵化时间和次优 t 细胞培养条件的实验设置的典型值。在其他环境中, 使用从受 mv 感染的上清液中纯化的 bte 达到了60% 的特定杀伤, 达到了 bte 浓度为 100 ngml 和更高的 38的高原。这表明, 反直觉, 这种检测的极限是小于100% 的特异性, 这可以用 t最大对照中的不同生长动力学来解释, 与共培养样品相比。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

结肠免疫治疗 (即 ovt 与免疫调节相结合) 为癌症治疗带来了巨大的希望, 需要进一步开发和优化编码免疫调节蛋白的结肠病毒。该协议描述了生成和验证此类载体的方法, 以便在相关的临床前模型中进行后续测试, 并将其潜在的未来临床翻译为新的抗癌疗法。

许多不同的结肠病毒平台具有明显的优势是可用的63。除了癌症特异性、病媒安全性、制造要求、肿瘤细胞裂解的有效性和免疫反应的诱导外, 克隆能力也是使用特定结肠瘤成功矢量化的关键。不幸的是, 目前缺乏对不同的孤儿和易受感染者的直接比较, 应继续进行, 以确定个人患者的最佳治疗方案。这可以通过促进新型转基因编码载体的合理开发和测试来促进, 如 mv-bte。鉴于 mv 的有益特性 (即反组织 、安全性、共同性、免疫原性、基因改造的可行性), 本协议侧重于这种结肠病媒介, 它可以推广到其他 ov, 特别是副粘病毒.

为了合理选择潜在相关的免疫调节剂作为候选转基因 (步骤 1.1.1), 彻底了解癌症免疫周期至关重要, 因此系统的文献研究不可或缺。此外, 大规模屏幕虽然成本很高, 但对确定新目标很有价值 (例如, 见 patel 等, 41)。

对于重组 ovs 的设计, 应考虑所需的表达式配置文件。在 rna 病毒的情况下, 基因表达在 rna 水平上由各自的聚合酶控制。在设计用于插入 mv 基因组的转基因盒 (步骤 1.1.2) 时, 避免类似于 mv 聚合酶基因启动的序列停止信号和 rna 编辑位点, 并遵循六种规则, 对于成功的载体开发至关重要。此外, 副粘病毒基因表达水平对应于基因组内的定位, 这是由表达梯度43引起的。一般来说, 转基因在上游位置的定位会增加表达, 而牺牲了较少复制的程度。然而, 这些参数也取决于各自转基因的大小、结构和顺序。因此, 本协议中描述的方法的一个局限性是需要对新的向量设计进行经验测试。在特定情况下, 可能需要调整转基因序列或定位, 以实现所需的载体特征 (图 2)。对检查点抗体插入物不同位置的系统比较显示了h-atu(未公布的数据) 的最佳结果。由于 bte 插入物具有相当的性质 (大小和免疫球蛋白域), 因此对 mv-bte 载体进行了类似克隆38。

从病毒 cdna 中抢救传染性颗粒 (步骤 2.1) 可能需要多次尝试某些结构。调整细胞数量可以优化细胞密度, 以形成合胞。虽然一定的密度是有效的细胞间传播和细胞膜融合所必需的, 但接触抑制可减少病毒复制。此外, 传染性颗粒的数量可能不足以诱导可见细胞融合。然而, 由于病毒可以存在于没有合胞的情况下, 然而, 救援样本可以被采集并转移到新鲜的生产者细胞, 以实现潜在的繁殖。由于 dna 质量差或转染试剂不合适或退化, 转染效率低下是典型的问题, 分别通过产生新的 dna 制剂和检测不同的试剂来相对容易评估和补救。

成功的病毒传播 (步骤 2.2) 在很大程度上取决于决定病毒复制和细胞裂解的条件。建议使用低通道数的生成细胞, 并需要定期检查受感染的细胞是否有合胞进展。调整细胞数量、温度和孵育时间可能需要平衡病毒传播和细胞增殖.

所述病毒生产方法的一个关键局限性是从粗细胞裂解物中制备病毒悬浮液。研究人员应该意识到, 病毒悬浮液含有细胞因子。病毒颗粒可以通过密度梯度/蔗糖垫层超离心浓缩, 而牺牲了感染性颗粒的总数, 也可能增加残留的细胞浓度。病毒也可以从受感染的细胞上清液中浓缩, 提高纯度, 但降低总收率。gmp 和大规模生产的副粘病毒通常是使用多层生成细胞在灯丝网中播种在生物反应器中, 以提高滴度产量63。精确的监测、连续的介质交换、无血清条件以及随后的过滤步骤确保了所产生病毒的高纯度。

通过所述的合胞计数方法评估病毒滴度 (步骤2.3 和 3.1) 并不精确, 但在使用足够数量的技术复制时, 很容易执行, 而且足够准确。在评估 OV-mediated 的细胞毒性 (步骤 3.2) 时, 需要考虑可用检测的局限性。代谢检测不区分实验治疗的细胞静态和细胞分裂效应。为了测量细胞分裂, 可以进行 ldh 释放试验。然而, 这两种类型的检测都可能受到粗细胞裂解物病毒制剂含量的影响 (图 6)。

受病毒感染的细胞 (步骤 4.1) 所表达的蛋白质分离在产量和纯度上可能有很大差异, 这取决于所使用的转基因和病毒以及技术准确性。因此, 蛋白质纯化的质量控制是评价相关实验结果的关键。

由于对涵盖各种可能的免疫调节剂的潜在功能检测的详尽描述超出了本出版物的范围, 本议定书侧重于用于测量细胞毒性的体外方法 (步骤 4.3)。细胞细胞毒性, 特别是 cd8 + t 细胞的毒性, 是免疫肿瘤控制成功免疫疗法的重要介质 64.这对目前使用抗体增强抗肿瘤免疫反应的免疫治疗方法具有重要意义, 尤其是双特异性 t 细胞发动机。通过结肠病媒的局部 bte 表达在几项临床前研究中取得了可喜的结果, 包括 rna38和 dna 病毒65,66, 67,68

由于生物体中肿瘤、病毒、转基因产物和宿主免疫系统的复杂相互作用, 在细胞培养中验证免疫调节器编码的结肠炎载体不足以预测治疗结果。重要的是, 拟议的矢量和免疫调节剂功能的孤立评估, 分别是必不可少的概念证明, 但未能描述潜在的协同作用和复杂的相互作用, 在肿瘤微环境中。在相关的体内模型中测试毒性和有效性对于进一步开发新型重组载体结构至关重要, 但并不容易完成。定期监测猕猴等非人类灵长类动物的免疫安全性, 并使用小鼠模型进行生物分布和功效分析20,69。然而, 这些模型中的许多在宿主组织和宿主的许可性的病毒受体的表达方面有局限性, 有些模型只是没有充分模仿 ov、肿瘤和免疫微环境的复杂相互作用。因此, 必须认真考虑适当的模式。

mv-bte 治疗以前已被评估在人类异种移植和同种性小鼠模型。在 bt 编码 mv38处理的小鼠血清中, 没有发现 bte 转基因产物, 这表明即使在没有进一步衰减自然非透水疫苗株病毒的情况下, 也能成功地预防全身暴露。局部表达对于在系统管理时毒性的 ovc 编码免疫调节剂至关重要。如有必要, 可通过重新靶选择 707172和微 rna 的去靶向来增强肿瘤特异性来增强肿瘤特异性 7374 (由鲁伊斯和罗素75 审查)。可能会进行更多的修改, 以优化特定治疗用途的载体 (由 miest 和 cattaneo76 审查), 包括为诊断目的插入转基因基因77、78或前药物转换, 以最大限度地减少化疗副作用 79,80, 引入安全开关81, 并针对肿瘤间质或血管 (例如, 通过双特异性抗体82)。

除了病毒载体的基因改造, 结合方案与嵌合抗原受体 (car) t 细胞转移83, 化疗 84,85, 86,放射治疗87,88,89进一步增加了 ovt 的曲目。由于 mv 免疫非常普遍, 因此开发了规避抗体中和的策略, 包括将包膜糖蛋白交换为相关的副粘病毒90, 聚合物包膜, 利用细胞载体传播病毒和短暂的免疫抑制 (由 russell 等审查)。先进的 ov 免疫治疗方案的进一步发展需要在适当的动物模型中, 用病人的材料, 并最终在可控的临床试验中测试安全性和治疗效果。

考虑到可能的组合过多, 全面测试是不可行的。数学建模可以通过预测硅胶的处理结果来帮助确定潜在组合方案的优先次序以及它们各自的剂量和调度 (圣地亚哥等人回顾了 91岁)。在测试新颖、合理设计的载体的有效性时, 伴随声音的翻译研究有助于更深入地了解潜在的病毒学和免疫学过程。这对于生成适当的模式、关于进一步潜在目标的信息以及在整个领域取得进展至关重要。总之, 深入了解这一工作领域的矢量设计、生成和表征的相关方法, 将加速开发, 并为未来临床翻译的新型疗法的探索提供支持。

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Disclosures

c. e. engeland 被列为海德堡大学拥有的 rna 癌症免疫病毒治疗专利的共同发明者。海德布切尔没有什么可透露的。

Acknowledgments

这些方法是在海德堡国家肿瘤疾病中心的盖伊·ungerechts 博士教授领导的病毒治疗小组中建立的。我们感谢他和实验室小组的所有成员, 特别是托比亚斯·斯派克博士、鲁塔·维纳尔德博士、朱迪思·弗斯特、比尔吉特·霍耶勒和杰西卡·阿尔伯特。这项工作得到了其他 kröner-fre舍尼-弗雷斯尼乌斯基金会 (给予 c. e. engeland 的赠款 2015_A78) 和德国国家科学基金会 (dfg, 给予 c. e. eneland en 11192-1) 的支持。j. p. w. heidbuechel 获得了赫尔姆霍兹国际癌症研究研究生院的津贴。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche Life Science, Mannheim, Germany 4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot K1231
Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden, Germany 28704
NEB 10-beta Competent E. coli New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany C3019I
LB medium after Lennox Carl Roth, Karlsruhe, Germany X964.1
Ampicillin Carl Roth, Karlsruhe, Germany HP62.1
QIAquick Miniprep Kit QIAGEN, Hilden, Germany 27104
Restriction enzyme HindIII-HF New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen, Darmstadt, Germany 31966-021
Fetal bovine serum (FBS) Biosera, Boussens, France FB-1280/500
FugeneHD Promega, Mannheim, Germany E2311 may be replaced by transfection reagent of choice
Kanamycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany K0129
Vero cells ATCC, Manassas, VA, USA CCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg available upon request
Granta-519 DSMZ, Braunschweig, Germany ACC 342
Opti-MEM (serum-free medium) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) PromoKine, Heidelberg, Germany PK-CA20-300-1000 includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns QIAGEN, Hilden, Germany 31014
Sodium chloride Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.3
Imidazole Carl Roth, Karlsruhe, Germany I5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa Merck, Darmstadt, Germany UFC901024
BCA Protein Assay Kit Merck Milipore 71285-3
IgG from human serum Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I4506
Anti-HA-PE Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-257 RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody BD Biosciences, Heidelberg, Germany 555749 RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 12158167001 RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-090-485
MS Columns Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
MiniMACS Separator Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-303
RIPA buffer Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA MB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega, Mannheim, Germany G1780 includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifter Corning, Reynosa, Mexico 3008
10 cm dishes Corning, Oneonta, NY, USA 430167
15 cm dishes Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 639160
96-well plates, U-bottom TPP, Trasadingen, Switzerland 92097
96-well plates, flat bottom Neolab, Heidelberg, Germany 353072
6-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353046
12-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353043
50 mL tubes nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany 02-572-3001
T175 cell culture flasks Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot 159910
0.22 µm filters Merck, Darmstadt, Germany SLGPM33RS

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References

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