새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Biochemistry

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Summary

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

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Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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Abstract

광범위한 전체 게놈 시퀀싱은 많은 잠재적 단백질을 제공하는 많은 오픈 판독 프레임(ORFs)을 확인했습니다. 이 단백질은 세포를 위한 중요한 역할을 할 수 있고 새로운 세포 프로세스를 해명할 수 있습니다. 단백질 중, 키나아제는 세포 신호 통로에 속하고 세포 성장, 분열, 분화, 운동성 및 죽음과 같은 세포의 운명에 중요한 많은 프로세스를 켜거나 끄는 능력을 가진 주요 배우입니다.

본 연구에서는 새로운 잠재적 키나아제 단백질LIMK2-1에 초점을 맞추게 되었습니다. 우리는 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 그것의 존재를 입증했습니다. 우리는 coimmunocipation 실험을 사용하여 상류 조절 단백질과의 상호 작용을 평가했습니다. 동면역침전은 두 표적 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있는 매우 강력한 기술이다. 그것은 또한 미끼 단백질의 새로운 파트너를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 미끼 단백질은 그것의 서열에 설계된 꼬리표를 통해서 또는 항체를 통해서 구체적으로 그것을 표적으로 하기 위하여 정제될 수 있습니다. 이들 단백질 복합체는 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔)에 의해 분리되고 질량 분석법을 사용하여 확인될 수 있다. 면역침전성 LIMK2-1은 또한γ[32P] ATP 라벨링에 의해 시험관내에서의 키나아제 활성을 시험하기 위해 사용되었다. 이러한 잘 확립된 분석기는 많은 상이한 기판을 사용할 수 있고, 미끼의 돌연변이 된 버전은 특정 잔기의 역할을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 매우 민감하고 정량적이기 때문에 약리학적 제제의 효과도 평가될 수 있다. 그럼에도 불구하고 방사능 처리에는 특별한 주의가 필요합니다. 키나아제 활성은 또한 변형된 아미노산의 인포 군을 표적화하는 특이적 항체로 평가될 수 있다. 이러한 종류의 항체는 모든 인광 변형 잔기에서 시판되지 않는다.

Introduction

수십 년 동안, 수많은 신호 경로 해명 되었습니다 및 세포 분열 등 중요 한 세포 프로세스에 그들의 참여, 분화, 운동성, 프로그램된 세포 죽음, 면역 및 신경 생물학, 표시 되었습니다. 키나아제는 종종 그들의 활성화 또는 불활성화를 미세하게 조절하고 외부 자극1,2,3에반응하는 일시적인 다목적 복합체의 일부이기 때문에 이러한 신호 경로에서 중요한 역할을 한다. 키나아제의 돌연변이 및 dysregulation는 수시로 인간에 있는 질병으로 이끌어 내고, 그러므로 과거40 년 4.

이러한 맥락에서, 그들의 업스트림 레귤레이터 또는 다운스트림 기판과의 키나제 상호 작용을 감지하고 새로운 파트너를 식별할 수 있어야 합니다. 친화성 정제 및 면역 침전은 단백질 복합체의 분리를위한 매우 강력한 기술5. 상기 미끼 단백질 또는 키나아제는 펩티드를 표적화하는 항체와 공유하여 상업적인 비드의 사용을 허용하는 특이적 펩티드 서열로 태그화될 수 있다. 이 물질은 실험 6,7,8에서높은 재현성을 허용한다. 내인성 단백질은 또한 미끼 단백질을 직접 표적화하는 항체를 사용하여 면역침전될 수 있다. 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 아가로즈 비드에 가교또는 단순히 용해액을 추가하기 전에 이들 비드로 배양될 수 있다. 용해 완충제는 상호 작용을 잃지 않고 단백질 용해를 허용하고 단백질 분해를 피하기 위해 최적화되어야합니다. 이 접근의 중요한 결점은 상호 작용이 세포 lysis에 검출된다는 것입니다; 따라서, 과도 또는 약한 상호 작용, 세포 외 컨텍스트를 필요로 하는 그들과 함께 놓칠 수 있습니다. 다른 기술은 근접 결선 분석 (PLA) 9, 생체 간연결 보조 친화 정화 (XAP)10,생물 발광 공명 에너지 전송 (BRET) 또는 Förster 공명 에너지와 같은 세포에서 직접 작동하도록 사용될 수있다 전송 (FRET)11,12. 또한, 면역 침전은 표면 플라스몬 공명, 등온 적정 열량 열량 계열 계열 또는 마이크로 스케일 열열염과 같은 물리적 기술이 필요한 결합의 열역학 상수를 결정하는 데 적합하지 않습니다. 13,14.

키나아제 활성은 여러 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 본 명세서에서, 우리는 인광 특이적 항체 및시험관 내 γ[32 P] ATP(아데노신 트리포스페이트) 라벨링에 초점을 맞췄다. 인광 특이적 항체는 단백질 내의 특정 잔기의 인산염 변형을 표적으로 한다. 그(것)들은 세포 용해 후에 서쪽 Blot 또는 ELISA (효소 연결된 면역흡착 분석) 면역물분석, 및 유세포 측정 또는 면역 형광을 사용하여 온전한 세포에 사용될 수 있습니다. 그들의 단점은 표적 단백질의 돌연변이 버전을 사용하여 평가될 수 있는 특이성의 그들의 부족을 포함할 수 있고, 그들의 그들의 모든 단백질에 대해 상업적으로 이용가능하지 않다. 시험관내γ[32P] ATP 라벨링은 매우 견고하고, 잘 확립되고, 매우 민감한 방법15이다. 면역침전성 또는 재조합 단백질이 사용될 수 있고, 상이한 기질이 시험될 수 있다. 약물의 효과 또한이 방법은 정량으로 평가 될 수 있습니다. 주요 단점은 접근 방식과 관련된 방사능에 주의해서 처리해야 한다는 것입니다. 형광 또는 발광 펩타이드 기질의 측정과 인산화 시 변경된 형광/발광 특성을 활용하는 대체 방법도 가능합니다. 이러한 방법은 또한 표적 키나아제의 잠재적 억제제일 수 있는 분자의 스크리닝에서 요구되는 높은 처리량을 허용한다. 실제로, 키나제는 제약 회사가 추구하는 가장 큰 약물 표적 군수 중 하나를 나타냅니다16.

본 연구에서, 우리는 LIMK2-1 단백질에 초점을 맞췄다(LIMK2-1은 Lin11, Isle1, Mec3 키나아제 이소폼 2-1을 의미합니다). LIMK2 키나아제 단백질은 1995년17년에처음 기술되었다. LIMK2의 세 가지 이소폼은 LIMK2a, LIMK2b 및 LIMK2-1의 대체 접합에 의해 생성됩니다. 현재, LIMK2-1은 단일 연구18에서mRNA 수준에서만 기재되어 있다. 본 명세서에서, 우리는 강력한 생화학적 접근법을 사용하여 분자 수준에서 이러한 잠재적인 새로운 키나아제 단백질을 특성화한다. 첫째, 우리는 LIMK2-1이 실제로 합성된다는 것을 보여줍니다. 그것의 2개의 대응과 유사하게, LIMK2a 및 LIMK2b는, 상류 키나아제 ROCK (로-관련 단백질 키나아제)와 상호 작용한다. LIMK2-1은 미엘린 염단백질(MBP)에 키나아제 활성을 가지고 있지만, LIM 키나아제의 정식 기질인 코필린에는 적용되지 않는다는 것을 보여준다.

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Protocol

1. 형질 혈하기위한 세포 준비

주의: 세포 배양의 모든 단계는 전용 실험실에서 수행되어야 하며, 세포는 Class 2 미생물 캐비닛 내에서 조작됩니다.

  1. DMEM 의 10 mL (덜베코의 수정 된 독수리 매체)에서 Ø 10cm 플레이트에서 10 % 태아 종아리 혈청을 보충 한 종자 HEK-293 (인간 배아 신장) 세포. 3~5일 동안 5%CO2미만에서, 37°C에서, 세포가 ~90% 합류에 도달할 때까지 배양한다.
  2. 콜라겐 R로 Ø 10cm 플레이트를 처리하여 플라스틱 플레이트에 세포 접착력을 높입니다.
    1. 10cm 플레이트에 인산염염수산완충액(PBS)으로 희석한 콜라겐 R 용액 5mL를 첨가합니다. 액체를 플레이트 의 전체 표면에 중첩시.
    2. 생물 안전 성 캐비닛 내에서 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오.
    3. 콜라겐 용액을 제거하고 폐기하십시오. PBS 5 mL을 추가하고 접시 표면 전체에 펴서 제거하고 폐기하십시오. 이 세척을 한 번 반복하십시오.
    4. 10% 태아 송아지 세럼으로 보충된 DMEM 8 mL을 첨가합니다. 준비된 플레이트를 생체 안전 성 캐비닛 내에 보관하십시오.
  3. HEK-293 플레이트를 생체 안전 성 캐비닛 내에서 1.1 단계에서 가져 가라. 접시에서 매질을 제거하고 전용 표백제 휴지통에 버리십시오. 보충 된 DMEM 의 2 mL을 추가하고 거품을 피하지 않도록주의, 1 mL 마이크로 파이펫의 흐름을 사용하여 그들을 분리하는 세포를 플러시.
  4. 15 mL 튜브에 세포를 수집하고 보충 된 DMEM의 4 mL을 추가합니다. 10 mL 파이펫으로 균질화하고 위아래로 3 번 피펫을 피펫으로 처리하십시오.
  5. 이 세포 용액의 2 mL를 복용하고 1.2.4 단계에서 보충 된 DMEM을 함유 한 콜라겐 처리 플레이트에 추가하십시오.
  6. 5%CO2 및 37°C에서 인큐베이터에서 24시간 동안 성장한다. 세포는 형질전환 시 50-80 % 유동해야합니다.

2. 과도 변환

  1. 접시에서 매질을 제거하고 전용 표백제 휴지통에 버리고 신선한 보충제 DMEM 10 mL을 추가하십시오. 형질전환 혼합물을 준비하면서 37°C에서 인큐베이터에 플레이트를 다시 넣습니다.
  2. 15 mL 튜브에 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA(트리스(hydroxymethyl)아미노메탄, EDTA를 위한 에틸렌디니트리로이트라아세트산 용액 450 μL과 2.5 MCaCl2 용액50 μL을 첨가합니다. 반전으로 혼합합니다.
  3. 전용 플라스미드로 형질전환된 박테리아의 액체 배양에 미디 제제로부터 제조된 플라스미드 DNA(Deoxyribonucleic acid)의 10 μg를 첨가한다. 반전으로 혼합합니다.
  4. 소용돌이에 매끄러운 교반하에, BES 완충 식염수 2x 농축액의 500 μL을 추가합니다 (조성물: BES, 10.7 g/L, NaCl, 16.0 g/L,Na2HPO4,0.27 g/L; BES는 N,N-Bis(2-하이드록세틸)-2-아미노에탄설포닉산, N,N-비스(2-하이드록스예틸)타우린)을 서서히 떨어뜨립니다.
  5. 생체 안전 성 캐비닛 내의 실온에서 최소 15 분 (최대 45 분)동안 배양하십시오. 소용돌이하지 말고 섞지 마십시오! DNA와 칼슘 인산염 사이의 복잡한 형성을 방해하지 않도록 튜브를 매우 신중하게 이동합니다.
  6. 2.1단계에서 안전 캐비닛으로 플레이트를 가져 가라. DNA 복합체를 매우 신중하게 추가하고 한 방울씩 떨어 뜨려 서 판 표면 전체의 세포에 떨어 뜨립니다.
  7. 37°C에서 인큐베이터에서 24~72시간 동안 배양하였다. 일반적으로 최대 단백질 발현은 48시간 이내에 도달합니다.

3. 리시스

참고: 단백질 분해를 방지하기 위해 얼음과 차가운 완충제를 사용하여 섭취하십시오.

  1. 용해 버퍼 준비: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 50 mM NaF, 10 mMM 파이로포스페이트, 1 mM Na3VO4,20 mM p-니트로페닐 인산염, 20 mM β-글리세로포스페이트, 10 μg/mL 아프로틴, 0.05g , 1 μg/mL leupeptin, 및 1 mM PMSF (페닐메틸설포닐 불소). 각 형질 감염된 플레이트에 대해 약 4 mL의 용해 완충제가 필요합니다.
  2. 인큐베이터에서 형질 감염된 세포로 플레이트를 제거하십시오. 얼음에 넣어.
    참고 :이 단계에서는 "일반"벤치에서 작업 할 수 있습니다.
  3. 미디어를 제거하고 전용 표백제 휴지통에 버리십시오.
  4. 차가운 PBS의 3 mL로 두 번 세척 : 형질 감염된 세포를 분리하지 않도록 플레이트 드롭의 측면에 3 mL의 PBS를 추가하고, 판의 표면에 퍼뜨리고, PBS를 제거하고 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 끝에서, 다음 단계에 대한 용해 버퍼 희석을 방지하기 위해 플레이트를 기울여 PBS의 나머지 부분을 신중하게 제거하십시오.
  5. 형질 감염된 세척 된 세포에 500 μL의 냉매 완충제를 추가하십시오. 접시 의 표면에 모두 확산.
  6. 얼음에 10 분 동안 배양. 때때로 (적어도 두 번) 버퍼를 플레이트 표면 전체에 다시 퍼십시오.
  7. 세포를 스크랩하고 미세 원심 분리튜브에서 수집합니다.
  8. 4 °C에서 10,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
  9. 새로운 미세 원심 분리튜브에 상급체를 수집합니다. 이 분율은 리세이트(전체 세포 추출물)에 해당한다. 세포막 파편에 해당하는 펠릿을 폐기하십시오.
  10. 새로운 미세 원심 분리관 (약 50 μL)에이 분획의 aliquot를 수집합니다. 이 분획은 "TOTAL 분획" 또는 "세포 Lysate" 또는 "전체 세포 추출물"에 해당하여 형질감염된 단백질이 웨스턴 블롯에 의해 발현되는지 여부를 분석할 수 있습니다.
    참고: 이 시점에서 샘플은 웨스턴 블롯 해석에 직접 사용할 수 있습니다. Laemmli 버퍼는 시료에 첨가되어야 하며, 95°C에서 5분 동안 가열하고, 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 적절한 SDS-PAGE에 적재되어야 합니다. 샘플은 또한 -80°C에서 보관될 수 있다.

4. 면역 침전

  1. 적절한 항체와 결합된 아가로즈 비드를 부드럽게 재중단시킴: HA (인간 인플루엔자 헤마글루티닌), 플래그, 또는 GFP (녹색 형광 단백질) 매끄러운 반전.
  2. 마이크로파이펫에서 200 μL 팁의 끝을 잘라 구슬이 팁에 들어갈 수 있도록 합니다. 비드의 정확한 볼륨을 취할 수 있도록 팁을 포화 여러 번 아래로 비펫.
  3. 미세 원심 분리튜브에 40 μL의 구슬을 가져 가라.
  4. TENET (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100) 버퍼의 500 μL을 추가합니다. 반전으로 혼합합니다. 4 °C에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. TENET 의 500 μL을 추가합니다. 회전 식 휠에서 4 °C에서 적어도 1 시간 동안 배양하십시오.
    참고: TENET의 이 사전 인큐베이션 단계를 통해 비특이적 상호 작용을 줄이고 배경 신호를 줄일 수 있습니다.
  5. 500 μL의 lysis 버퍼로 구슬을 두 번 씻으하십시오.
    1. 4°C에서 1,000 x g에서 2분.
    2. 조심스럽게 상급 버퍼를 제거하고 폐기하십시오.
      참고: 세척 단계에서 구슬을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
    3. 500 μL의 라시스 버퍼를 추가합니다. 튜브를 반전시켜 균질화합니다.
    4. 4.5.1- 4.5.3 단계를 반복합니다.
  6. 4°C에서 1,000 x g에서 2분 간 원심분리기. 상급 버퍼를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오.
  7. 회전 휠상에서 4°C에서 2~4시간 동안 3.9단계에서 용해된 비드를 인큐베이션한다.
  8. 면역 침전된 구슬을 씻습니다.
    참고: 이 시점에서, 면역침전된 비드는 용해 완충물로 5회 세척한 다음, Laemmli 완충물로 용출될 수 있다. 용리액은 웨스턴 블롯 분석에 사용되거나 -80°C에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 비드는 라이징 버퍼로 2회 세척한 다음 키나아제 버퍼와 함께3회 세척하여 γ[32 P] ATP 라벨링을 수행할 수 있다.

5. Coimmunocipation 분석

  1. 4.7단계에서 면역침전된 비드를 포해 완충액으로 세척한다.
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
    3. 500 μL의 라시스 버퍼를 추가합니다. 튜브를 반전시켜 균질화합니다.
    4. 5.1.1-5.1.3단계를 네 번 반복합니다.
  2. 용출성
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 구슬의 열망을 피하기 위해 해밀턴 주사기로 상급물의 마지막 방울을 제거하고 상급을 버립니다.
    3. 4x Laemmli 완충액 40 μL(200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% 글리세롤, 0.5 M β-메르카페탄올, 0.02% 브로모페놀 블루)을 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 눌러 균질화합니다.
    4. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
    5. 실온에서 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
    6. 해밀턴 주사기로 상반신을 제거하고 새로운 미세 원심 분리튜브에 수집하십시오. 이 분수는 -80 °C에서 저장될 수 있거나 웨스턴 블롯에 의해 직접 분석될 수 있는 "Eluate"에 해당합니다.

6. 키나제 분석

  1. 키나아제 완충제 준비: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES는 4-(2-하이드록세틸)-1-피페라진에탄설포닉산, 150mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM MnCl2,50 mM NaF, 1 mM Na3VO4,20 mM β-글리세로 포스페이트, 1 μg/mL leupeptin, 및 1 mM PMSF. 키나아제 완충제의 약 2 mL는 각 면역 침전 상태에 대해 요구된다.
  2. 4.7 단계에서 면역 침전 된 비드를 500 μL의 lysis 완충액으로 두 번 씻으하십시오.
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. 500 μL의 라시스 버퍼를 추가합니다. 반전으로 균질화.
    3. 6.2.1 및 6.2.2 단계를 반복합니다.
  3. 500 μL의 키나아제 완충제으로 면역침전된 비드를 세 번 세척한다.
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. 500 μL의 키나아제 버퍼를 추가합니다. 반전으로 균질화.
    3. 6.3.1 단계와 6.3.2 단계를 두 번 반복합니다.
  4. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
  5. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. 구슬의 열망을 피하기 위해 해밀턴 주사기로 상급물의 마지막 방울을 제거하고 상급을 버립니다.
  6. 면역침전된 비드에 40 μL의 키나아제 버퍼를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 눌러 구슬을 다시 일시 중단합니다.
  7. 안전한 잠금 튜브에서γ[32P] ATP 라벨링(최종 부피는 22.5 μL, 키나아제 완충액으로 완성)을 위한 혼합물을 준비한다.
    1. 22.5 μL의 최종 부피에 도달하기 위해 키나아제 버퍼의 필요한 부피를 추가합니다.
    2. 마이크로파이펫의 20 μL 팁 끝을 잘라냅니다. 면역침전된 비드를 6.6단계에서 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 재중단한다. 이 구슬의 10 μL을 안전 잠금 튜브에 수집합니다.
    3. 10 μM 스톡 솔루션에서 ATP를 추가하여 피날레 농도50 mM에 도달하십시오. 처리된 샘플의 수에 따라, 키나아제 버퍼내의 ATP의 스톡 용액의 희석은 부피가 정확한지 확인하기 위해 1~ 2 μL의 피펫을 허용하도록 제안된다.
    4. 기질 2.5 μg(본 연구 사례에서 코필린 또는 미엘린 기본 단백질, MBP)를 첨가합니다.
  8. 5 μCi의γ[32P] ATP(3,000 Ci/mmol)를 첨가하여 반응을 개시한다. 위아래로 천천히 파이펫팅하여 섞으세요.
    주의: 이 시점부터 는 신중한 예방 조치, 전용 보호 및 적절한 통제 (방사성 방패, 가이거 카운터, 특정 폐기물 수집, 개인 유방 및 방사능 조작 전용 안전 장소에서 작업을 수행해야합니다. 손가락 배지는 방사성 노출, 필터 팁을 감지합니다.
  9. 30 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
  10. 5 x Laemmli 완충액의 6 μL로 반응을 멈춥시다.
  11. 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
  12. 실온에서 5 분 동안 10,000 x g의 원심 분리기.
  13. SDS-PAGE에 로드합니다. 마이그레이션을 진행합니다.
    참고: 자유 γ[32 P]ATP의 최전선이 이동 탱크의 오염을 피하기 위해 젤을 빠져나가지 않도록 주의하십시오.
  14. 실온에서 젤을 염색하십시오.
    1. 유리 판에서 젤을 제거합니다.
    2. 실온에서 물에 세 개의 욕조를 진행합니다.
    3. 실온에서 쿠마시 블루로 밤새 젤을 염색합니다.
    4. 실온에서 물로 여러 세척 욕조로 젤을 스테인.
  15. 젤을 플라스틱 랩으로 감쌉입니다.
  16. 형광체 화면에 하룻밤 이상 노출.
  17. 표지 된 밴드를 감지하기 위해 형광체 이미지에서 화면을 읽습니다.

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Representative Results

LIMK2-1 단백질 합성
LIMK2-1은 데이터 뱅크에서 언급되지만, 지금까지 하나의 논문만이 mRNA18의존재를 보여주었다. LIMK2a 및 LIMK2b의 두 호몰로그와 비교하여, LIMK2-1은 단백질 포스파타제 1 억제 도메인(PP1i)으로 확인된 추가 C-말단 도메인을 가지고 있다. 우리는 이 도메인의 펩티드, 아미노산 671-684(도1A)를표적으로 하는 항체를 설계하였다.
인간 단백질 데이터베이스에 대한 BLAST 연구는 단 하나의 단백질, PHI-1(포스파타제 홀로효소 억제제 1)만이 이 12개의 아미노산 서열과 강한 서열 유사성을 가지고 있음을 보여주었다. 그러나 PHI-1은 75 kDa (즉, 두 가지를 방해해서는 안)로 예상되는 LIMK2-1에서 멀리 떨어진 SDS-PAGE 겔에서 23 kDa로 마이그레이션됩니다. 우리는 LIMK2-1, LIMK2a 또는 LIMK2b로 형질감염된 HEK-293 세포에 대해 이 항체를 먼저 검증하고 항PP1i 항체가 형질감염된 LIMK2-1(pCMV-LIMK2-1) 및 HA 태그LIMK2-1을 인식할 수 있었다는 것을 보여주었지만, 상호 반응하지는 않았다. 형질전환 된 HA 태그 LIMK2a 또는LIMK2b (그림 1B). 우리는 LIMK2 이소폼의 HA 태그 버전으로 형질 감염된 HEK 세포에서 내인성 LIMK2-1의 밴드를 관찰했습니다(항 PP1i 블롯의 화살표로 표시; 그림1B)를 참조하십시오. 둘째, 항PP1i 항체에 의해 유도된 신호가 LIMK2의 3가지 접합 변이체를 표적화하는 siRNA를사용하여 LIMK2-1에 특이적인지 여부를 확인하였다(도 1C). LIMK2 siRNA의 존재하에서, 관심 대역에서 재현가능하고 현저한 감소가 관찰되었다(도 1C의화살표로 표시) 대조군 조건에 비해, 항체가 LIMK2-1에 특이적임을 시사한다. 이에 따라, 우리는 다른 세포주 추출물에서 LIMK2-1을 검출하기 위해 항 PP1i 항체를 사용했습니다: HEK-293 (인간 배아 신장 세포), HeLa (인간 상피 자궁 경부 세포), 및 C6 (쥐 뇌 신경교 세포). 이들 세포는 1% 트리톤 X-100을 함유하는 용해 완충제에서 중단된다. 실리코 분석에서, LIMK2-1은 호미니대 영장류 특이적19로나타났다. 항PP1i 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석은 LIMK2-1이 HEK-293 및 HeLa에서 발현되는 것으로 나타났지만 실리코연구에서 예상한 대로 C6 세포주에서는 나타나지 않는 것으로 나타났다(도 1D). 이 실험은 다양한 인간 조직과 함께 반복되었다, LIMK2-1 단백질의 수준은 조직에 따라 변화 것을 보여주는: 가장 높은 수준은 간에서 발견되었다, 췌장에서 낮은 수준, 고환과 폐에서 가장 낮은. LIMK2-1은 뇌 조직에서 검출되지않았다(도 1E). 우리는 간을 제외한 모든 조직 샘플에서 낮은 분자량 밴드를 관찰, 아마 이러한 상용 샘플의 용해 조건으로 인해 전체 단백질의 저하를 제안 (이 용해 버퍼는 억제제의 칵테일을 포함 우리가 집에서 만든 버퍼에서 사용하는 수많은 프로테아제 및 인산염 억제제보다 효율적일 수 있습니다. 이 데이터는 인간 LIMK2-1 단백질이 시험된 조직에서 다르게 합성되고 다르게 발현된다는 것을 보여줍니다.

LIMK2-1은 업스트림 키나아제 락과 상호 작용합니다.
LIMK2-1 호몰로그, LIMK2a 및 LIMK2b는 상류 키나아제 록에 의해 조절된 것으로 설명되었다. 우리는 동면역침전 실험을 사용하여 ROCK과 LIMK2-1의 상호 작용을 평가하였다. HEK 세포는 cMyc 태그가 달린 ROCK1 및 LIMK2 이소폼의 HA 태그 버전 중 하나 또는 관련없는 HA 태그단백질 Larp6를 코딩하는 벡터로 공동 형질감염되었다. Larp6는 비특이적 상호 작용의 검출을 허용하는 음성 제어역할을 합니다. 세포를 용해시키고 항-HA 면역침전을 수행하였다. 용해물 (전체 세포 추출물) 및 면역 침전물은 항 HA 및 항 cMyc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석되었습니다. 2에 도시된 바와 같이(왼쪽 패널; Lysates), 형질감염된 벡터에 의해 코딩된 각각의 상이한 단백질은 잘 발현된다. LARP6뿐만 아니라 LIMK2의 3개의 이소폼은 효율적으로 면역침전(그림2,오른쪽 하단 패널; Eluates). 용리에서, ROCK은 검출되고 따라서 LIMK2의 3개의 이소폼으로 coimmunocipated, 그러나 Larp6(그림 2, 오른쪽 상단 패널; Eluates). 이것은 ROCK이 LIMK2의 세 가지 이소폼과 상호 작용한다는 것을 보여 주며, 특히 새롭게 특징지어지는 ISOFORM LIMK2-1과 상호 작용한다는 것을 보여줍니다. 이 상호 작용은 음성 대조군(Larp6)이 ROCK과 상호 작용하지 않기 때문에 특정합니다.

본 명세서에서, 우리는 항-HA 항체로 수행된 면역 침전에 대한 데이터를 제시한다; 그러나, 상호작용은 cMyc 항체와 접합된 구슬로 ROCK을 면역침전시키고 LIMK coimmunocipitation을 검출하기 위해 HA 항체로 용루를 분석함으로써 반대 방향으로 시험될 수 있다.

키나아제 활동
그대로 세포에 인포스코필린
LIMK2-1, LIMK2a 및 LIMK2b의 상동체는 세린3에 액틴 탈중합 인자인 인산화 코필린을 나타내고 있습니다. 코필린의 인-세린3를 특이적으로 표적화하는 항체를 사용하여, 우리는 LIMK2 이소폼 중 하나를 과발현하는 HEK 세포에서 내인성 인산화물의 수준을 측정하여 LIMK2 키나아제 활성을 연구하였다. HEK 세포는 HA 태그가 지정된 LIMK2 이소폼 중 하나를 인코딩하는 벡터로 형질전환되거나, 또는 음성 대조군으로서 상응하는 빈 벡터를 인코딩하였다. 세포를 용해시키고, 상이한 용해물을 항인-세린3 코필린 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. LIMK2a 및 LIMK2b의 과발현은 대조군 조건에 비해 인광 코필린 수준에서 유의하고 재현 가능한 증가를 유도한 반면, LIMK2-1의 존재는 검출 효과가 없었다(그림3,왼쪽 패널).

우리는 N-말단 HA 태그에 의한 가능한 간섭을 배제하기 위해 3개의 LIMK2 이소폼 및 LIMK2-1의 태그가 지정되지 않은 버전의 C-말단 YFP 태그(Yellow 형광 단백질) 버전으로 동일한 실험을 반복하였다. 결과는 3개의 이소폼의 HA 태그가 지정된 버전을 사용하여 얻은것과 동일하였다(그림 3, YFP 태그가 지정된 버전을 보여주는 오른쪽 패널). 형질감염 효율은 유세포측정을 사용하여 LIMK 이소폼의 YFP 태그버전에 대해 평가되었고, 이러한 결과는 단백질 발현의 차이 때문일 수 있음을 배제하기 위해 서있다. 3개의 이소폼은 LIMK2-1의 경우 54%, LIMK2b의 경우 49%, LIMK2b의 경우 43%로 유사한 형질 감염 효율을 보였습니다.

체외 키나아제 검사
그런 다음 γ[32 P] ATP로 시험관내 라벨링에 의해LIMK2 이소폼의 키나아제 활성을 연구하였다. 도 4A는 이러한 시험관내 라벨링의 일반적인 계획을 나타낸다. HEK 세포는 LIMK2 이소폼의 HA 태그버전 중 하나 또는 관련없는 단백질 인 Larp6로 형질감염되었고, 이는 음성 대조군으로 사용되었다. 항-HA 면역침전제의 키나아제 활성은 γ[32 P] ATP의 존재 하에서 기질로서재조합 GST-코필린을 사용하여 측정하였다. HA-면역침전형 Larp6는 코필린에 대한 키나제 활성을 나타내지 않았다. HA-면역침전증 LIMK2a 및 LIMK2b 인산화코필린반면, LIMK2-1은 하지않았다(도 4B). 재조합 코필린 및 γ[32 P] ATP(도4D)의존재시 GFP 트랩 비드로 면역침전된 3개의이소폼의 YFP 태그 버전을 사용하여 유사한 결과를 얻었다.

그런 다음 LIMK2-1에 키나아제 활성이 없는지 또는 코필린에 대한 활동이 손상되었는지 여부를 테스트했습니다. 우리는 코필린 대신 수많은 단백질 키나아제에 대한 효율적인 기질인 미엘린 베이직 단백질(MBP)을 사용하여 시험관 내 라벨링 실험을 반복했습니다. HA 태그 버전의 존재하에서 분석이 수행되었을 때 대조군 조건에서 높은 배경 신호가 있었다: 음성 대조군, HA-면역침전된 Larp6, 인산화된 MBP의 강한 신호를 생성하였으나, 키나아제() 그림4C). 우리는 이 단백질의 YFP 태그버전을 사용하여 이 문제를 극복했습니다. 이러한 조건하에서, 대조군(YFP 단독)의 배경은 낮았고, 보다 구체적인 연구가 수행될 수 있도록 하였다. GFP-LIMK2a, LIMK2b 및 LIMK2-1은 LIMK2-1의 활성이 낮았지만 MBP를 향한 키나아제 활성을 보였다(도4D). 그러나, LIMK2-1은 또한 이러한 조건 하에서 면역침전이 덜 효율적으로 하였다(쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 염색 및 웨스턴 블로팅 참조). 따라서, 3개의 이소폼은 인포스포-MBP가 CBB 염색에 의해 면역침전된 LIMK2 수준으로 정규화되었을 때 MBP에 대한 비교 가능한 활성을 보였다(도4D,하부 패널). 면역 침전물은 또한 MBP에 활동이 LIMK2s로 coimmunoprecipated되었을 것이다 ROCK의 존재 때문일 수 있었다는 것을 확인하기 위하여 항체 를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석되었습니다. LIMK2 면역침전제에서 ROCK 신호를 감지할 수 없었습니다. 그래서 MBP 인산화는 ROCK 때문이 아니라 LIMK2s에 기인합니다.

전반적으로, 이러한 데이터는 LIMK2a와 LIMK2b가 코필린과 MBP에서 유사한 활동을 하고 있음을 보여줍니다. LIMK2-1은 다른 두 이소폼에 필적하는 MBP를 향한 키나아제 활성을 나타내지만, 코필린에는 좋은 기판이 아니다.

Figure 1
도 1: LIMK2-1 단백질의 존재에 대한 증거. (A) 인간 LIMK2의 세 가지 이소폼의 회로도. LIMK2 이소폼은 엔트레즈 유전자: LIMK2-1 (NP_001026971.1), LIMK2a (NP_005560.1), LIMK2b (NP_057952.1)에 기재되어 있다. LIMK2의 다양한 도메인은 도시된다: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM'(짧은 LIM 도메인), PDZ (PSD95, Dlg1, Zo-1), S/P (세린 프롤린 풍부), 키나제 (짧은 키나아제 도메인), 및 PP1i (단백질 포스파아제 1 억제). 항 PP1i 항체 설계를 위해 선택된 서열은 적색으로 도시된다. (B와C) 항-LIMK2-1 항체의 유효성검사. (B) HEK-293 세포는 태그가 지정되지 않은 LIMK2-1(pCMV-LIMK2-1) 또는 LIMK2의 HA 태그가 지정된 이소폼 중 하나로 형질감염되었다. 용액은 지시된 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 분석되었다. (C) HEK-293 세포를 LIMK2 siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염하였다. 리세이트는 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. LIMK2-1은 다양한 인간 세포주(D) 및 조직(e)에서 발현된다. HEK-293, HeLa 및 C6 세포는 1% 트리톤-X100 용해 완충액에서 중단되었다. 조직 추출물을 구입하고 이의 샘플을 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 이 수치는 Vallee 외, 생화학 저널, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: LIMK2의 세 가지 이소폼은 ROCK1과 상호작용합니다. HEK-293 세포는 cMyc 태그가 달린 ROCK1 및 3개의 HA 태그가 있는 LIMK2 이소폼(2-1, 2a, 2b) 또는 관련없는 단백질, Larp6 중 하나로 공동 형질감염되었다. 용액염 및 항-HA 면역침전액은 웨스턴 블로팅을 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: LIMK2-1은 온전한 세포에서 코필린을 향한 키나아제 활성이 없다. HEK-293 세포는 3개의 HA 태그가 있는 LIMK2 이소폼(1, 2a, 2b) 또는 빈 부모 벡터, pcDNA3(왼쪽 패널) 중 하나또는 YFP 태그가 지정된 LIMK2 이소폼 또는 YFP 단독(오른쪽 패널) 중 하나로 형질감염되었다. 리세이트는 웨스턴 블로팅을 받았다. 인광코필린 과 코필린의 비율의 정량화는 오른쪽 그래프에 나타내고 있다. 모의 형질감염된 세포의 인광-코필린 대 코필린 비율을 100으로 정규화하였다. 각 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ±SE를 나타낸다. 이 수치는 Vallee 외, 생화학 저널 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: LIMK2-1은 MBP를 인산화하지만 코필린을 향한 시험관내 키나아제 활성이 없다. (A) 체외 라벨링에서 Γ[32 P] ATP의 일반적인 계획. (B) LIMK2-1은 시험관 내에서 코필린을 인산화하지않는다. HEK-293 세포는 3개의 HA 태그가 있는 LIMK2 이소폼(2-1, 2a, 2b) 중 하나 또는 관련없는 HA 태그단백질 인 Larp6, 음성 대조군으로 형질감염되었다. 항-HA 면역침전성 단백질 및 GST-코필린을 키나제 분석실험에 사용하였다. 항-HA 면역침전제는 또한 항-HA 면역블롯팅 및 쿠마시 블루 염색을 실시하였다. (C) HA 태그면역침전은 MBP가 기판으로 사용될 때 강한 배경 신호를 가진다. HEK-293 세포는 3개의 HA 태그가 있는 LIMK2 이소폼(2-1, 2a, 2b) 중 하나 또는 관련없는 HA 태그단백질 인 Larp6, 음성 대조군으로 형질감염되었다. 항-HA 면역침전성 단백질 및 MBP를 키나아제 분석실험에 사용하였습니다. 항-HA 면역침전제는 또한 항-HA 면역블롯팅 및 쿠마시 블루 염색을 실시하였다. (D) 3개의 LIMK2 이소폼은 미엘린 염단백질(MBP)을 향한 키나아제 활성을 가지고 있다. HEK-293 세포는 YFP 태그가 달린 LIMK2 이소폼(2-1, 2a, 2b) 또는 YFP 단독 중 하나로 형질감염되었다. 항-GFP 면역침전형 LIMK2 이소폼 및 코필린 또는 MBP를 키나제 분석실험에 사용하였다. 항-GFP 면역침전제는 또한 항-GFP 면역블롯팅 및 쿠마시 블루 염색을 행하였다. 인-코필린 및 포스포-MBP의 정량화는 하단 그래프에 나타내고 있다. 항GFP 면역침전형 LIMK2a로 수득된 포스포코필린 수준을 100으로 정규화하였다. 각 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ±SE를 나타낸다. 이 수치는 Vallee 외, 생화학 저널, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

본 명세서에서, 우리는 분자 수준에서 새로운 단백질, LIMK2-1을 특성화하기 위해 강력한 생화학 적 도구를 사용하였으며, 그 서열및 그 상동체, LIMK2a 및 LIMK2b20에기초하여 키나아제인 것으로 여겨진다.

첫째, 우리는 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 수준에서 LIMK2-1의 존재를 입증했습니다. 그 후 LIMK2a와 LIMK2b, LIMK2-1의 상동체를 조절하는 것으로 알려진 업스트림 키나아제 ROCK1과의 상호 작용을 평가했습니다. 마지막으로, 우리는 생체외 γ[32 P] ATP 라벨링을통해 LIMK2-1의 잠재적키나아제 활성을 평가하였고, 특정 인광 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의한 셀룰로에서.

리시스 버퍼 조성물
웨스턴 블롯에 의해 그(것)들을 분석하기 위하여 단백질을 공부할 때, lysis 완충조성에 관하여 특별한 주의가 요구됩니다. 몇몇 파라미터는 고려되어야 한다: (i) 세제 유형 및 농도21,및 (ii) 프로테아제 억제제.

용해 완충조성물은 가능한 한 많이 추출하고 웨스턴 블롯에 의한 검출을 허용하기 위해 거의 완전한 용해화를 용이하게 하기 위해 표적 단백질에 적응되어야 한다. 수용성 단백질의 경우, 온화한 조건(예: 낮은 농도의 경도 세제)은 종종 이를 달성하기에 충분합니다. 막 단백질에 대 한, 강한 조건은 일반적으로 종종 필요. 세제의 다른 종류가 존재 : (i) 이온성, 예민한 나트륨 도데실 황산나트륨 (SDS), 세틸 트리메암모늄 브로마이드 (CTAB), (ii) 폴리에틸렌 글리콜 헥사데실 에테르와 같은 비 이온성 (BRIJ), 트리톤, 옥틸 글루코 사이드 (OG), 및 (DDM) iii) 3-[(3-Cholamidopropyl)디메틸람모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) 또는 zwittergents와 같은 zwitterionic. 강한 세제는 상호 작용을 방해할 수 있으며 복합체는 손실 될 수 있습니다. 더욱이, 면역 침전 실험의 경우, 항체는 가혹한 조건에 민감할 수 있다. 유사하게, 효소 활성은 연구된 단백질을 전개하거나 변성시킬 수 있는 세제의 존재에 의해 방해될 수 있다. 사용된 세제의 종류 및 양은 단백질의 특성 및 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 일부 단백질의 경우, 단백질의 활성을 보존하기 위해 매우 제한된 범위의 세제 농도가 허용됩니다. 이 범위 이하의 단백질은 용해성으로 남아 있는 반면, 이 농도 범위 이상에서는 단백질이 더 이상 활성상태가 아닙니다.

프로테아제 억제제는 내인성 프로테아제에 의한 표적 단백질의 분해를 방지하기 위해 용해 완충제에 첨가되어야 한다. 프로테아제 억제제 칵테일은 시판되고 있다. 연구의 시작점으로 사용할 수 있습니다. 문제가 발생하면 -20 °C에 저장된 재고 용액으로부터 일시적으로 제조된 억제제혼합물의 사용을 고려할 수 있다. 이러한 억제제는 세린과 시스테인 프로테아제대상을 지정해야 합니다. PMSF (페닐메틸설포닐 불소)는 일반적으로 사용되지만 수성 용액에서 매우 불안정하며 추출 직전에 추가해야합니다. 금속 로프로티제는 또한 억제되어야한다 : EDTA (에틸렌 디니트리트리 틸로 테아 세트 산) 또는 EGTA (에틸렌 글리콜 비스 (2-아미노 틸레테르)-테트라 아세트산과 같은 금속 킬레이트 시약은 Mg2+에 결합되어이 목적으로 사용됩니다. 그들의 인산화 하 고 따라서 활성화 된 형태로 단백질을 유지 하려면, 그것은 또한 lysis 버퍼에 인 산 억제제 추가 하는 것이 좋습니다. 이러한 억제제는 알칼리성, 산, 세린, 스레오닌 및 티로신 인산염을 표적으로 해야 합니다. 저온 (4 °C)에서 작업하는 것은 또한 프로테오 분해의 속도를 늦추기 위해 권장됩니다.

표적 단백질
본 명세서에서, 우리는 에피토프 태그단백질에 초점을 맞췄다. 태그(Flag, HA, cMyc, GFP 등)는 항체 및 항체 결합 비드가 시판되고 쉽게 재현 가능한 물질이기 때문에 단백질을 검출하고 정제하는 데 매우 유용합니다. 그러나,태그의 크기 및 위치는 표적 단백질6,7,8의활성, 국소화 또는 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 고려되어야 한다. 그것은 또한 내 인 성 단백질으로 작동 하는 것이 가능. 이 경우, 이 특정 단백질을 표적으로 하는 항체를 사용해야 합니다. 이들은 비드(Protein A 또는 Protein G)와 공유(cross-link) 또는 용해물로 인큐베이션된 다음 비드와 결합될 수 있다. 플라스미드에 유전자가 발현되는 태그가 지정된 단백질로 작업할 때 유전자의 돌연변이 발생에 의해 이 단백질의 돌연변이 버전으로 전환하기가 쉽습니다. 그것은 생물학적 기능을 평가 하기 위해 다른 돌연변이에 작동 하는 다음 가능.

면역 침전
면역침전은 표적 단백질 5의 파트너를 분리하는 매우강력한 기술이다. 상호 작용을 보존하기 위해 lysis 완충제 (특히 세제)의 조성은 신중하게 확립되어야합니다 (위 참조). 확인된 두 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있다. 내인성 단백질 또는 과발현 단백질일 수 있다. 단백질이 낮은 풍부도에서 표현될 때, 더 강한 신호를 갖기 위하여 그(것)들을 과발현할 필요가 있을 지도 모릅니다. 비특이적 상호 작용 단백질 또는 오염 물질을 제거하기 위해 면역 침전된 비드의 광범위한 세정이 필요합니다. 면역 침전 효율 또는 공동 면역 침전 파트너의 존재를 결정하기 전에, 다른 파트너가 서양에 의해 전체 세포 용해 또는 입력 분획을 분석하여 용해물에서 잘 발현되고 존재하는지 확인하는 것이 중요합니다. 얼룩. 더욱이, 면역 침전 실험을 사용하여, 표적 단백질의 새로운 파트너를 확인하고 새로운 복합체를 분리하는 것도 가능하다. 이들 새로운 파트너는 질량 분석법에 의해 식별될 수 있다.

이러한 파트너는 추가생물학적 시험을 위한 그것의 완전한 활성을 허용하는 표적 단백질의 활성제로서 중요한 역할을 할 수 있다. 한편, 코푸어로화된 원치 않는 단백질은 확인된 두 파트너 간의 직접적인 상호작용이 아니라, 대신에 공동 면역침전에 의한 검출된 상호작용이 또 다른 알려지지 않은 파트너에 기인한다는 주장으로 사용될 수 있다. 이 특정 한 경우에, 직접 상호 작용의 확실 하 게, 다른 실험 장치 필요, 박테리아에서 정제 포유류 단백질에 작업 등.

키나아제 활동
키나아제 활성은 상이한 기술에 의해 평가될 수 있다. 본 명세서에서, 우리는γ[32P] ATP 표지에 의한 시험관내 분석 및 특이적 인광 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의한 전체 세포 추출물 분석에 초점을 맞췄다. γ[32P] ATP 라벨링은 약한 키나아제 활성(15)의 검출을 허용하는 매우 민감하고 정량적인 기술이다. ATP에서 표적 기질로의 방사능 통합은 효소 활성의 직접적인 측정을 가능하게 한다. 상이한 표적에 대해 연구된 단백질의 키나아제 활성을 평가하기 위해 상이한 기질과 함께 작동할 수 있다. 또한 단백질이 과발현될 때 돌연변이를 통해 키나아제 활성에 중요한 아미노산을 식별할 수도 있습니다. 키나아제 활성은 Mg2+와같은 분음 양이온을 필요로 하며, 이는 키나아제 완충액에 존재해야 한다.

이 방법의 주요 단점은 실험 및 폐기물 수거를위한 전용 시설을 필요로하는 방사능 처리입니다. ADP(adenosine diphosphate)와 같은 반응의 부산물을 검출하는 형광 또는 발광 키트와 같은 대체 방법이 존재한다16. 단백질 인산화는 또한 질량 분광법에 의해 공부될 수 있습니다, 그러나, 이 분석을 위해 더 많은 양의 물자가 요구됩니다. 우리의 경우에, 우리는 우리의 효율성을 증가시키기 위하여 모세관 전기 동공을 사용하여 LIMK2 키나아제 활동을 평가하기 위하여 시도했습니다 그러나 이것은 불행하게도 실패했습니다.

인광특이적 항체는 단백질의 인산화를 연구하는 추가적인 도구이다. 광범위 한 일반적인 항-인 산 세린 및 티로신 항 체 존재, 어떤 단백질의 인지-Ser 또는 인-티르를 인식할 수. 최근, 표적 단백질의 특정 인광 부위를 표적화하는 항체가 널리 개발되고 있으며 일반적으로 인포군과 주변 아미노산을 모두 인식한다. 그들의 특이성은 인광 사이트에 돌연변이된 표적 단백질과 같은 음성 통제로 예를 들면 검사되어야 하기 때문에, 그 같은 항체로 작동하기 시작할 때 특별한 주의가 필요합니다. 항인인 항체로 얼룩을 프로빙 할 때, 차단 용액은 항체와 상호 작용할 수있는 인단백질을 포함하기 때문에 우유가 되어서는 안됩니다. 소 혈청 알부민 (BSA)이 권장되며, 인산염 방출을 방지하기 위해 차단 용액에 인산염 억제제가 첨가 될 수 있습니다. 샘플은 동결 및 해동되지 않아야하며, 오히려 -80 ° C에서 유지되는 aliquots로 준비해야합니다. 실제로, 인광 수정은 불안정합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 라 리그 콘트레 르 암, l'협회 신경 섬유종 에 레클링하우젠, 라 레지온 센터 발 드 루아르에 의해 지원되었다. 유세포 측정 데이터에 대한 오렐리 코슨과 데보라 카사스, 그리고 원고의 철저한 교정을 위해 키론 히크먼-루이스에게 많은 감사를 드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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References

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

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