新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Biochemistry

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Summary

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。

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Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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Abstract

広範な全ゲノムシーケンシングは、多くの潜在的なタンパク質を提供する多くのオープンリーディングフレーム(ORF)を同定しました。これらのタンパク質は、細胞に重要な役割を持ち、新しい細胞プロセスを解明する可能性があります。タンパク質の中でも、キナーゼは細胞シグナル伝達経路に属し、細胞の成長、分裂、分化、運動性、死など、細胞の運命に不可欠な多くのプロセスをオンまたはオフにする能力を持つ主要なアクターです。

本研究では、新しい潜在的なキナーゼタンパク質LIMK2-1に着目した。我々は、特定の抗体を用いてウェスタンブロットがその存在を実証した。我々は、共免疫沈殿実験を用いて上流調節タンパク質との相互作用を評価した。共免疫沈殿は、2つの標的タンパク質間の相互作用を検出できる非常に強力な技術です。また、餌タンパク質の新しいパートナーを検出するために使用されてもよいです。餌タンパク質は、その配列に対して設計されたタグを介して、またはそれを特異的に標的とする抗体を介して精製されてもよい。これらのタンパク質複合体は、SDS-PAGE(ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル)によって分離され、質量分析法を用いて同定され得る。免疫沈殿LIMK2-1はまた、γ[32P]ATP標識によってインビトロでのキナーゼ活性試験するためにも使用された。この確立されたアッセイは、多くの異なる基板を使用し、また、餌の変異バージョンを使用して、特定の残基の役割を評価するために使用され得る。薬理学的薬剤の効果は、この技術は、非常に敏感かつ定量的であるため、評価されることもできます。それにもかかわらず、放射能処理には特に注意が必要です。キナーゼ活性はまた、修飾アミノ酸のリン群を標的とする特異的抗体で評価されてもよい。これらの種類の抗体は、すべてのリン修飾残渣について市販されているわけではない。

Introduction

何十年もの間、多数のシグナル伝達経路が解明され、細胞分裂、分化、運動性、プログラムされた細胞死、免疫および神経生物学などの重要な細胞プロセスへの関与が示されている。キナーゼは、多くの場合、活性化または不活性化を細かく調節し、外部刺激1、2、3に応答する一過性汎用性の高い複合体の一部であるとして、これらのシグナル伝達経路において重要な役割を果たす。キナーゼの突然変異および調節不変は、しばしばヒトの疾患を引き起こすため、過去40年間で最も重要な薬物標的の一つとなっている4.

この文脈では、上流のレギュレータや下流の基板とのキナーゼ相互作用を検出し、新しいパートナーを特定できることが重要です。アフィニティ精製および免疫沈殿は、タンパク質複合体5の単離のための非常に強力な技術である。餌タンパク質またはキナーゼは、ペプチドを標的とする抗体と共有結合した市販ビーズの使用を可能にする特定のペプチド配列でタグ付けされてもよい。この材料は実験6、7、8の高い再現性を可能する。内因性タンパク質は、餌タンパク質を直接標的とする抗体を用いて免疫沈殿することもできる。抗体は、タンパク質Aまたはタンパク質Gアガロースビーズに架橋されるか、または単にリサートを添加する前にこれらのビーズでインキュベートされてもよい。溶解バッファーは、相互作用を失うことなくタンパク質可溶化を可能にし、タンパク質の劣化を避けるために最適化する必要があります。このアプローチの主な欠点は、相互作用が細胞リシス時に検出されるということです。したがって、一時的または弱い相互作用は、細胞内のコンテキストを必要とする相互作用と共に見逃される可能性があります。その他の技術は、近接リゲーションアッセイ(PLA)9、生体内架橋支援親和性精製(XAP)10、生物発光共鳴エネルギー伝達(BRET)またはフェルスター共鳴エネルギーなどの細胞で直接働くために使用することができる。転送 (FRET)11,12.さらに、免疫沈殿は、表面プラズモン共鳴、イソテル微量カロリーム、マイクロスケール熱泳動などの物理的な技術が必要とされる結合の熱力学的定数を決定することは適切ではありません。13、14.

キナーゼ活性は、複数の技術を用いて評価されてもよい。本明細損では、ホスホ特異的抗体およびインビトロγ[32P]ATP(アデノシン三リン酸)標識に焦点を当てた。リン特異的抗体は、タンパク質内の特定の残留物のリン酸修飾を標的とする。それらは、細胞リシス後のウェスタンブロットまたはELISA(酵素結合免疫ソルベントアッセイ)、免疫組織化学、およびフローサイトメトリーまたは免疫蛍光を用いた無傷の細胞に使用することができる。彼らの欠点は、標的タンパク質の変異バージョンを使用して評価することができ、特異性の欠如を含むことができ、およびそれらのすべてのタンパク質に市販されていない。インビトロγ[32P]ATP標識は、非常に堅牢で、確立された、高感度な方法15である。免疫沈殿タンパク質または組換えタンパク質を使用して、異なる基質を試験してもよい。薬物の効果は、この方法が定量的であるとしても評価されてもよい。その主な欠点は、アプローチに関連する放射能は慎重に処理する必要がある点です。蛍光または発光ペプチド基質の測定に基づいて、リン酸化時に変化した蛍光/発光特性を利用する代替方法も可能です。このような方法はまた、高いスループットを可能にし、これは、例えば、標的キナーゼの潜在的な阻害剤でありうって可能な分子のスクリーニングにおいて必要とされる。実際、キナーゼは製薬会社16が追求する最大級の薬剤標的の1つである。

本研究では、LIMK2-1タンパク質(LIMK2-1はLin11、アイル1、Mec3キナーゼアイソフォーム2-1を表す)に着目した。LIMK2キナーゼタンパク質は、1995年17月に最初に記載された。LIMK2の3つのアイソフォームは、LIMK2a、LIMK2bおよびLIMK2-1の代替スプライシングによって生成される。現時点では、LIMK2-1は単一の研究18においてmRNAレベルでのみ記載されている。本明細物では、堅牢な生化学的アプローチを用いて、この潜在的な新しいキナーゼタンパク質を分子レベルで特徴付ける。まず、LIMK2-1が実際に合成されたことを示す。LIMK2aおよびLIMK2bの2つの対応するのと同様に、上流のキナーゼROCK(Rho関連タンパク質キナーゼ)と相互作用する。LIMK2-1はミエリン基本タンパク質(MBP)にキナーゼ活性を有するが、LIMキナーゼの正規基質であるコフィリンには活性を示す。

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Protocol

1. トランスフェクションのための細胞製剤

注意:細胞培養のすべてのステップは、専用の実験室で行う必要があり、細胞はクラス2の微生物学的キャビネット内で操作されます。

  1. 種子HEK-293(ヒト胚性腎臓)細胞を10mLのDMEM(ダルベッコの改変イーグルス培地)で10cmプレートに入れ、10%の胎児子牛血清を補充した。5%CO2の下で3〜5日間培養し、37°Cで、細胞が約90%の合流に達するまで。
  2. コラーゲンRでØ 10 cmプレートを処理し、プラスチックプレートへの細胞接着性を高める。
    1. コラーゲンRの溶液の5 mLを加え、10cmプレートにリン酸生理食塩分バッファー(PBS)で200倍希釈した。プレートの表面全体に液体をオーバーレイします。
    2. バイオセーフティキャビネット内で少なくとも1時間室温でインキュベートします。
    3. コラーゲン溶液を取り出し、捨てます。PBSの5 mLを追加し、プレートの表面全体に広げ、それを削除し、廃棄します。この洗浄を1回繰り返します。
    4. 10%の胎児の子牛の血清を補充したDMEMの8 mLを加える。準備されたプレートは、バイオセーフティキャビネット内に保管してください。
  3. バイオセーフティキャビネット内のステップ1.1からHEK-293プレートを取ります。プレートから媒体を取り出し、専用の漂白剤のゴミ箱に捨てます。添加したDMEMの2 mLを追加し、1 mLマイクロピペットの流れを使用してそれらを取り外すために細胞をフラッシュし、泡を作ることを避けるために注意してください。
  4. 15 mLチューブで細胞を収集し、補足DMEMの4 mLを追加します。10mLのピペットで均質化し、上下に3回ピペットを打ち込みます。
  5. この細胞溶液の2 mLを取り、ステップ1.2.4から補充されたDMEMを含むコラーゲン処理プレートに追加します。
  6. 5%CO2および37°Cでインキュベーターで24時間成長する。細胞はトランスフェクション時に50〜80%のコンフルエントでなければなりません。

2. 一時的なトランスフェクション

  1. プレートから培地を取り出し、専用の漂白剤ゴミ箱に捨て、新鮮なサプリメントDMEMを10mL加えます。トランスフェクション混合物を調製しながら、37°Cでプレートをインキュベーターに戻します。
  2. 15 mLチューブに、10mMトリス-HCl pH 7.5/1 mM EDTA(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、エチレンジニトリロテトラセチン酸用EDTA溶液の450 μL、2.5M CaCl2溶液の50μLを添加します。反転によって混合します。
  3. 専用プラスミドで形質転換した細菌の液体培養にミディ製剤から調製したプラスミド系DNA(デオキシリボ核酸)を10μg添加する。反転によって混合します。
  4. 渦上の滑らかな攪拌の下で、BESバッファド生理食塩水2x濃縮物の500 μLを加える(組成:BES、10.7 g/L、NaCl、16.0 g/L、Na2HPO 4、0.27 g/L;BESはN,N-ビス(2-ヒドロキセチル)-2-アミノエタンスルホン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)タウリンをゆっくりと低下させます。
  5. バイオセーフティキャビネット内の室温で少なくとも15分間(最大45分)インキュベートします。渦を混ぜないで!DNAとリン酸カルシウムの複雑な形成を妨げないように、チューブを非常に慎重に動かします。
  6. ステップ2.1から安全キャビネットにプレートを取ります。DNA複合体を非常に慎重に追加し、プレートの表面全体の細胞にドロップしてドロップします。
  7. インキュベーターで24~72時間インキュベートを37°Cでインキュベートします。通常、最大タンパク質発現は48時間以内に到達する。

3. リシス

注:氷の上で、そしてタンパク質の劣化を防ぐためにコールドバッファーで作業します。

  1. 準備リシスバッファー: 50 mM トリス-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% トリトン X-100, 50 mM NaF, 10 mM ピロリン酸ナトリウム, 1 mM Na3VO4,20 mM p-ニトロフェニルリン酸, 20 mM β-グリセロリン酸, 10 μg/mL アプロチン, 0.0μg/mL、1 μg/mLルペプチン、および1 mM PMSF(フェニルメチルスルホニルフッ化物)。トランスフェクトされたプレートごとに約4mLのリシスバッファーが必要です。
  2. インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を持つプレートを取り出します。氷の上に置いて
    注:このステップから、「通常の」ベンチで作業することが可能です。
  3. メディアを取り外し、専用の漂白剤のゴミ箱に捨てます。
  4. 冷たいPBSの3 mLで2回洗浄する:トランスフェクトされた細胞を取り外すことを避けるために、プレートドロップの側面にPBSの3 mLを追加し、プレートの表面全体に広げ、PBSを除去し、それを廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。最後に、次のステップのためのリシスバッファー希釈を防ぐためにプレートを傾けることによって、PBSの残りの部分を慎重に取り除きます。
  5. トランスフェクト洗浄細胞に500 μLの冷たいリシスバッファーを追加します。プレートの表面全体に広げます。
  6. 氷の上で10分間インキュベートします。時々(少なくとも2回)、プレートの表面全体にバッファを再び広げます。
  7. 細胞をスクラップし、マイクロ遠心管でそれらを収集します。
  8. 4°Cで10,000 x gで10分間遠心分離機。
  9. 新しいマイクロ遠心管で上清を収集します。この画分は、ライサート(全細胞抽出物)に相当する。細胞膜破片に相当するペレットを捨てる。
  10. この分画のアリコートを新しいマイクロ遠心管(約50μL)に集めます。この画分は、「総画分」または「細胞リサート」または「全細胞抽出物」に対応し、トランスフェクトされたタンパク質がウェスタンブロットによって発現されるかどうかの分析を可能にする。
    注: この時点で、サンプルはウェスタン ブロット解析に直接使用できます。Laemmliバッファをサンプルに加え、95°Cで5分間加熱し、10,000 x gで5分間遠心分離し、適切なSDS-PAGEにロードする必要があります。試料は-80°Cで保存することもできる。

4. 免疫沈殿

  1. 適切な抗体と相まってアガロースビーズを穏やかに再中断:HA(ヒトインフルエンザヘマグルチニン)、フラグ、またはGFP(緑色蛍光タンパク質)を滑らかな反転によって再び再び中断する。
  2. マイクロピペットから200μLの先端の端を切り取り、ビーズが先端に入るようにします。ビーズを上下に数回ピペットし、ビーズの正しいボリュームを取るために先端を飽和させる。
  3. マイクロ遠心管に40μLのビーズを取ります。
  4. TENET (30 mM トリス-HCl pH 7.5、120 mM NaCl、5 mM EDTA、1% トリトン X-100) バッファーを追加します。反転によって混合します。4 °Cで1,000 x gで2分間遠心分離機。慎重に上清を取り除き、廃棄します。TENET の 500 μL を追加します。回転ホイール上の4°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
    注:TENETのこのインキュベーション前のステップは、非特異的相互作用を減らし、バックグラウンド信号を減少させる。
  5. 500 μL のリシスバッファーでビーズを 2 回洗います。
    1. 4°Cで1,000 x gで遠心2分。
    2. 慎重に上清バッファーを取り外し、廃棄します。
      注:これらの洗浄手順中にビーズを吸引しないように注意してください。
    3. 500 μL のリシスバッファーを追加します。チューブを反転して均質化します。
    4. 手順 4.5.1 ~ 4.5.3 を繰り返します。
  6. 4°Cで1,000 x gで2分間遠心分離機。上清バッファーを慎重に取り外し、廃棄します。
  7. 回転ホイールで4°Cで2~4時間、ステップ3.9からリザートでビーズをインキュベートします。
  8. 免疫沈殿ビーズを洗浄します。
    注:この時点で、免疫沈殿ビーズは、ライシスバッファーで5回洗浄し、次にLaemmliバッファーでelemmliを放熱してもよい。溶出物は、ウェスタンブロット分析に使用したり、-80°Cで保存したりしてもよい。あるいは、ビーズは、ライシスバッファーで2回洗浄し、次にキナーゼバッファーで3回洗浄し、γ[32P]ATP標識を行う。

5. コイノチノシプチ化解析

  1. 工程4.7から免疫沈殿ビーズをリシスバッファーで洗浄します。
    1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
    2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。
    3. 500 μL のリシスバッファーを追加します。チューブを反転して均質化します。
    4. 手順 5.1.1-5.1.3 を 4 回繰り返します。
  2. 溶出
    1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
    2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。ビーズの吸引を避けるためにハミルトン注射器で上清の最後の滴を取り除き、上清を廃棄します。
    3. 4xレームリバッファーの40 μLを加える(200 mMトリス/HCl pH 6.8、4%SDS、40%グリセロール、0.5M β-メルカプトエタノール、0.02%ブロムフェノールブルー)。チューブを軽く叩いて均質化します。
    4. 室温で5分間インキュベートします。
    5. 室温で10,000 x gで5分間遠心分離機。
    6. ハミルトン注射器で上清を取り出し、新しいマイクロ遠心管に集めます。この画分は、-80°Cで保存するか、またはウェスタンブロットによって直接分析されてもよい「溶出」に対応する。

6. キナーゼアッセイ

  1. キナーゼバッファーを準備する:50 mM HEPES-NaOH pH 7.5(HEPESは4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸を表す)、150 mMNaCl、5mM MgCl 2、5mM MnCl 2、5mM NaF、1mM Na3 VO4、20mmルペプチン、および 1 mM PMSF。各免疫沈殿条件には約2mLのキナーゼバッファーが必要である。
  2. 500 μL のリシスバッファーで、ステップ 4.7 から免疫沈殿ビーズを 2 回洗浄します。
    1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
    2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。500 μL のリシスバッファーを追加します。反転によって均質化します。
    3. 手順 6.2.1 と 6.2.2 を繰り返します。
  3. 500 μL のキナーゼバッファーで免疫沈殿ビーズを 3 回洗浄します。
    1. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
    2. 上清を慎重に取り除き、捨てます。キナーゼバッファーを500μL追加します。反転によって均質化します。
    3. 手順 6.3.1 と 6.3.2 を 2 回繰り返します。
  4. 4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。
  5. 上清を慎重に取り除き、捨てます。ビーズの吸引を避けるためにハミルトン注射器で上清の最後の滴を取り除き、上清を廃棄します。
  6. 免疫沈殿ビーズに40μLのキナーゼバッファーを添加します。チューブを軽くたたいてビーズを再び吊り下げます。
  7. γ[32P]ATP標識(最終容積は22.5μL、キナーゼバッファーを完備)のミックスを安全なロックチューブに用意します。
    1. 22.5 μL の最終体積に達するために、キナーゼバッファの必要な体積を追加します。
    2. マイクロピペットの20 μL先端の端を切る。ステップ6.6から免疫沈殿ビーズを数回上下にピペッティングして再中断する。これらのビーズの10 μLを安全ロックチューブに集めます。
    3. 10 μM ストック溶液から ATP を追加し、フィナーレ濃度の 50 mM に達します。処理されたサンプルの数に応じて、キナーゼバッファー内のATPのストック溶液の希釈は、体積が正しいことを確認するためにピペット1~2μLを可能にすることを示唆している。
    4. 基板の2.5 μgを加える(コフィリンまたはミエリン塩基タンパク質、本研究例ではMBP)。
  8. γ[32P]ATP(3,000 Ci/mmol)の5 μCiを加えて反応を開始します。ゆっくりと上下にピペッティングして混ぜます。
    注意:この時点から、作業は、慎重な予防措置、専用の保護と適切な制御(放射性シールド、ガイガーカウンター、特定の廃棄物収集、個人の胸とと適切な制御と放射能操作専用の安全場所で行う必要があります。放射性暴露を検出するための指バッジ、フィルターチップ)。
  9. 30°Cで20分間インキュベートします。
  10. 5x Laemmliバッファーの6 μLで反応を停止します。
  11. 95°Cで5分間熱します。
  12. 室温で5分間10,000 x gの遠心分離機。
  13. SDS-PAGE にロードします。移行に進みます。
    注:フリーγ[32 P]ATPの最前線が移行タンクの汚染を避けるためにゲルから出ないことに注意してください。
  14. ゲルを室温で染めます。
    1. ガラス板からゲルを取り出します。
    2. 室温で3つの水浴を進めます。
    3. 室温でクマシーブルーで一晩ゲルを染めます。
    4. 温度で水でいくつかの洗浄浴でゲルを汚します。
  15. ゲルをラップで包みます。
  16. 蛍光体の画面上で1泊以上露出します。
  17. リンメージャーの画面を読み取り、ラベル付きバンドを検出します。

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Representative Results

LIMK2-1タンパク質を合成
LIMK2-1はデータバンクで言及されているが、これまでのところ、そのmRNA18の存在を示した論文は1つしかない。LIMK2aおよびLIMK2bの2つのホモログと比較して、LIMK2-1はタンパク質ホスファターゼ1阻害ドメイン(PP1i)として同定された余分なC末端ドメインを有する。このドメインのペプチドを標的とする抗体を設計し、アミノ酸671-684(図1A)を挙げた。
ヒトタンパク質データベースに対するBLAST研究は、PHI-1(ホスファターゼホロエンザイム阻害剤1)のみが、この12アミノ酸配列と強い配列類似性を有することを示した。しかし、PHI-1は、LIMK2-1から遠く離れたSDS-PAGEゲル上の23 kDaで移行し、約75kDaの移行が予想されます(つまり、2つは干渉してはならない)。我々は、LIMK2-1、LIMK2a、またはLIMK2bのいずれかでトランスフェクトされたHEK-293細胞について最初にこの抗体を検証し、抗PP1i抗体がトランスフェクトLIMK2-1(pCMV-LIMK2-1)およびHAタグ付きLIMK2-1を認識できたことを示したが、交差反応しなかった。トランスフェクト HA タグ付き LIMK2a または LIMK2b (図 1B)。我々は、LIMK2アイソフォームのHAタグ付きバージョンでトランスフェクトされたHEK細胞における内因性LIMK2-1のバンドを観察した(抗PP1iブロットの矢印で示す;1B)。第二に、抗PP1i抗体によって誘導されたシグナルが、LIMK2の3つのスプライス変異体を標的とするsiRNAを用いてLIMK2-1に特異的であるかどうかを調べた(図1C)。LIMK2 siRNAの存在下では、対照条件と比較して(図1Cの矢印で示される)目的帯の再現性および有意な減少が観察され、抗体がLIMK2-1に特異的であることを示唆した。その後、抗PP1i抗体を用いて、HEK-293(ヒト胚性腎臓細胞)、HeLa(ヒト上皮子宮頸細胞)、C6(ラット脳グリア細胞)の異なる細胞株抽出物でLIMK2-1を検出しました。これらの細胞は、1%トリトンX-100を含むリシスバッファー内で破壊される。シリコ分析において、LIMK2-1はホミニデ霊長類特異的19であることが示された。抗PP1i抗体を用いたウェスタンブロット分析は、LIMK2-1がHEK-293およびHeLaで発現しているように見えたが、シリコ研究から期待されるC6細胞株では発現していないことが示された(図1D)。これらの実験は様々なヒト組織で繰り返し行われ、LIMK2-1タンパク質のレベルは組織によって異なっていた:最高レベルは肝臓で見つかり、膵臓のレベルは低く、精巣および肺では最も低い。LIMK2-1は脳組織では検出できなかった(図1E)。我々は、肝臓を除くすべての組織サンプルでより低い分子量バンドを観察し、おそらくこれらの市販サンプルのリシス条件に起因する完全なタンパク質の分解を示唆した(このリシスバッファーには、に指定されていない阻害剤のカクテルが含まれている)データシートは、自家製バッファーで使用している多数のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤よりも効率が悪い可能性があります)。これらのデータは、ヒトLIMK2-1タンパク質が、試験された組織において異なる方法で合成され発現していることを示している。

LIMK2-1は、その上流のキナーゼROCKと相互作用します
LIMK2-1ホモログ、LIMK2aおよびLIMK2bは、上流のキナーゼROCKによって規制されていると記載されている。CO免疫沈殿実験を用いてLIMK2-1とROCKとの相互作用を評価した。HEK細胞は、cMycタグ付きROCK1をコードするベクターと、LIMK2アイソフォームのHAタグ付きバージョンのいずれか、または無関係のHAタグ付きタンパク質Larp6のいずれかと共にトランスフェクトされた。Larp6は負のコントロールとして機能し、非特異的相互作用の検出を可能にする。細胞をlyslysし、抗HA免疫沈殿を行った。ライサテス(全細胞抽出物)および免疫沈殿物をウェスタンブロットにより分析し、抗HAおよび抗cMyc抗体を用いた。図 2に示すように(左のパネル;Lysates))は、トランスフェクトベクターによってコードされる異なるタンパク質のそれぞれがよく発現される。LIMK2の3つのアイソフォームとLarp6は、効率的に免疫沈殿している(図2、右下パネル;溶出)。溶出物では、ROCKが検出され、LIMK2の3つのアイソフォームで共免疫沈殿しますが、Larp6(図2、右上パネル)では検出されません。溶出)。これは、ROCKがLIMK2の3つのアイソフォームと相互作用することを示し、特に新たに特徴付けられたアイソフォームLIMK2-1と相互作用することを示しています。この相互作用は、負のコントロール(Larp6)がROCKと相互作用しないため、特異的です。

本明細では、抗HA抗体で行われる免疫沈殿に関するデータを提示する。しかしながら、相互作用は、cMyc抗体と共役したビーズを使用してROCKを免疫沈殿させ、LIMKコイノム沈殿を検出するためにHA抗体を使用して溶出物を分析することによって、逆方向に試験することができる。

キナーゼ活性
無傷細胞中のホスホコフィリン
LIMK2-1、LIMK2aおよびLIMK2bのホモログは、セリン3上のアクチン脱重合因子であるコフィリンをリン酸化することが示されている。コフィリンのホスホセリン3を特異的に標的とする抗体を用いて、LIMK2アイソフォームの1つを過剰発現するHEK細胞における内因性ホスホコフィリンのレベルを測定することにより、LIMK2キナーゼ活性を調べた。HEK細胞は、HAタグ付きLIMK2アイソフォームのいずれか、または対応する空のベクターを負の対照として符号化するベクターでトランスフェクトした。細胞をライスし、抗ホスホセリン3コフィリン抗体を用いてウェスタンブロッティングにより異なるライサーションを分析した。LIMK2aおよびLIMK2bの過剰発現は、制御条件に対するホスホコフィリンレベルの有意かつ再現性の増加を誘発したが、LIMK2-1の存在は検出可能な効果を有しなかった(図3、左パネル)。

我々は、3つのLIMK2アイソフォームのC末端YFPタグ(黄色蛍光タンパク質)バージョンと、N末端HAタグによる干渉の可能性を排除するために、LIMK2-1のタグなしバージョンで同じ実験を繰り返した。結果は、3つのアイソフォームのHAタグ付きバージョンを使用して得られたものと同じでした(図3、YFPタグ付きバージョンを示す右パネル)。トランスフェクション効率は、この結果がタンパク質発現の違いによるものである可能性を排除するために、フローサイトメトリーを用いてYFPタグ付きバージョンのLIMKアイソフォームについて評価した。3つのアイソフォームは、LIMK2-1が54%、LIMK2bが49%、LIMK2bが43%と同様のトランスフェクション効率を示した。

インビトロキナーゼテスト
次に、γ[32P]ATPをインビトロ標識することにより、LIMK2アイソフォームキナーゼ活性を調べた。図4Aは、このインビトロラベリングの一般的なスキームを示す。HEK細胞は、LIMK2アイソフォームのHAタグ付きバージョンまたは無関係タンパク質Larp6のいずれかでトランスフェクトされ、陰性対照として使用された。抗HA免疫沈殿物のキナーゼ活性を、γ[32P]ATPの存在下で基板として組換えGST-コフィリンを用いて測定した。HA-免疫沈殿Larp6はコフィリンにキナーゼ活性を示さなかった。HA-免疫沈殿LIMK2aおよびLIMK2bリン酸化コフィリンは、一方、LIMK2-1はそうしなかった(図4B)。組換えコフィリンおよびγ[32P]ATP(図4D)の存在下でGFPトラップビーズを用いた3つのアイソフォーム免疫沈殿物のYFPタグ付きバージョンを用いて同様の結果を得た。

その後、LIMK2-1にキナーゼ活性がないか、またはコフィリンに対する活性が損なわれたかどうかをテストした。我々は、コフィリンの代わりに多数のタンパク質キナーゼの効率的な基質であるミエリン基本タンパク質(MBP)を用いてインビトロ標識実験を繰り返した。HAタグ付けされたバージョンの存在下でアッセイが行われたときに制御条件に高いバックグラウンド信号があった:負の対照、HA-免疫沈殿Larp6は、キナーゼではないが、リン酸化MBPの強い信号を生成した(4C)。私たちは、これらのタンパク質のYFPタグ付きバージョンを使用して、この問題を克服しました。このような条件下では、対照(YFP単独)の背景が低く、より具体的な研究が行われました。GFPトラップYFP-LIMK2a、LIMK2b、LIMK2-1は、LIMK2-1の活性は低かったものの、MBPに向かってキナーゼ活性を示した(図4D)。しかし、LIMK2-1はまた、これらの条件下で免疫沈殿が不有効であった(クーマッシーブリリアントブルー(CBB)染色およびウェスタンブロッティングを参照)。従って、3つのアイソフォームは、CBB染色によりリン-MBPが免疫沈殿LIMK2レベルに正規化された場合にMBP上で同等の活性を示した(図4D、下パネル)。免疫沈殿物はまた、抗ROCK抗体を用いてウエスタンブロットによって分析され、MBP上の活性がLIMK2sと共免疫沈殿したであろうROCKの存在によるものであるかどうかを確認した。LIMK2免疫沈殿物中のROCKシグナルを検出できませんでした。したがって、MBPリン酸化はROCKによるものではなく、100万ドルのLIMK2sによるものです。

全体として、これらのデータは、LIMK2aとLIMK2bがコフィリンとMBPで同様の活動を持っていることを示しています。LIMK2-1は他の2つのアイソフォームに匹敵するMBPに対するキナーゼ活性を示すが、コフィリンはそれのための良好な基板ではない。

Figure 1
図1:LIMK2-1タンパク質の存在を証明する。(A) ヒトLIMK2の3つのアイソフォームの概略図。LIMK2アイソフォームは、エントレス遺伝子:LIMK2-1(NP_001026971.1)、LIMK2a(NP_005560.1)、LIMK2b(NP_057952.1)に記載されています。LIMK2の様々なドメインが示されている:LIM(Lin11、Isl1、Mec3)、LIM'(短いLIMドメイン)、PDZ(PSD95、Dlg1、Zo-1)、S/P(セリンプロリンリッチ)、キナーゼ(短いキナーゼドメイン)、およびPP1i(タンパク質ホスファターゼ1阻害剤)。抗PP1i抗体設計のために選択された配列は赤で示される。(B および C)抗LIMK2-1抗体の検証(B) HEK-293細胞を、タグなしLIMK2-1(pCMV-LIMK2-1)またはLIMK2のHAタグ付きアイソフォームの1つでトランスフェクトした。ライサテは、示された抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。(C)HEK-293細胞をLIMK2 siRNAまたは対照siRNAのいずれかでトランスフェクトした。ライサテスはウェスタン・ブロットによって分析された。LIMK2-1は、種々のヒト細胞株(D)および組織(E)で発現される。HEK-293,HeLaおよびC6細胞を1%トリトン-X100リシスバッファーで破壊した。組織抽出物を購入し、そのサンプルをウェスタンブロッティングにより分析した。この数字は、Valleeらから変更されました, 生化学ジャーナル, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:LIMK2の3つのアイソフォームはROCK1と相互作用します。HEK-293細胞は、cMycタグ付きROCK1と、3つのHAタグ付きLIMK2アイソフォーム(2-1、2a、2b)または無関係タンパク質Larp6のいずれかと共にトランスフェクトした。ライサテスおよび抗HA免疫沈殿物をウェスタンブロッティングを行った。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:LIMK2-1は、無傷の細胞においてコフィリンに対するキナーゼ活性を有しない。HEK-293細胞は、3つのHAタグ付きLIMK2アイソフォーム(1、2a、2b)のいずれかまたは空の親ベクター、pcDNA3(左パネル)のいずれか、または3つのYFPタグ付きLIMK2アイソフォームまたはYFPの単独(右パネル)のいずれかでトランスフェクトした。ライサテスはウェスタンブロッティングを施した。ホスホコフィリン対コフィリンの比率の定量は、右側のグラフに示されています。模擬トランスフェクト細胞のホスホコフィリン対コフィリン比を100に正規化した。各値は、3つの独立した実験の平均±SEを表す。この数字は、Valleeらから変更されました, 生化学ジャーナル 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:LIMK2-1は、コリジンに対するインビトロキナーゼ活性を有しないが、それはMBPをリン酸化する。(A) インビトロ標識におけるγ[32P]ATPの一般的なスキーム。(B) LIMK2-1はインビトロでコフィリンをリン酸化しない。 HEK-293細胞は、3つのHAタグ付きLIMK2アイソフォーム(2-1、2a、2b)のいずれかまたは無関係のHAタグタンパク質Larp6のいずれかを陰性対照としてトランスフェクトした。抗HA免疫沈殿タンパク質およびGST-コフィリンはキナーゼアッセイに使用された。抗HA免疫沈殿物はまた、抗HA免疫ブロッティングおよびクーマッシーブルー染色を行った。(C) HAタグ付き免疫沈殿は、MBPを基板として使用すると強いバックグラウンド信号を有する。 HEK-293細胞は、3つのHAタグ付きLIMK2アイソフォーム(2-1、2a、2b)のいずれかまたは無関係のHAタグタンパク質Larp6のいずれかを陰性対照としてトランスフェクトした。キナーゼアッセイには抗HA免疫沈殿タンパク質およびMBPが用いられた。抗HA免疫沈殿物はまた、抗HA免疫ブロッティングおよびクーマッシーブルー染色を行った。(D) 3つのLIMK2アイソフォームは、ミエリン基本タンパク質(MBP)に対するキナーゼ活性を有する。HEK-293細胞は、3つのYFPタグ付きLIMK2アイソフォーム(2-1、2a、2b)またはYFPのいずれを単独でトランスフェクトした。抗GFP免疫沈殿LIMK2アイソフォームおよびコフィリンまたはMBPは、キナーゼアッセイに使用された。抗GFP免疫沈殿物はまた、抗GFP免疫ブロッティングおよびクーマッシーブルー染色を行った。ホスホコフィリンとホスホMBPの定量は、下のグラフに示されています。抗GFP免疫沈殿LIMK2aで得られたホスホコフィリンレベルを100に正規化した。各値は、3つの独立した実験の平均±SEを表す。この数字は、Valleeらから変更されました, 生化学ジャーナル, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本明細物では、我々は、その配列およびそのホモログ、LIMK2aおよびLIMK2b20に基づいてキナーゼであると考えられる新しいタンパク質LIMK2-1を分子レベルで特徴付けるために堅牢な生化学的ツールを使用した。

まず、特定の抗体を用いたウエスタンブロット分析を用いてタンパク質レベルでLIMK2-1の存在を実証した。その後、LIMK2aとLIMK2bを調節することが知られている上流のキナーゼROCK1との相互作用を評価した。最後に、特定のホスホ抗体を用いて、インビトロγ[32P]ATP標識およびウエスタンブロットによるセルロ中のLIMK2-1の潜在的なキナーゼ活性を評価した。

リシスバッファー組成
ウエスタンブロットでタンパク質を分析するためにタンパク質を研究する場合、リシスバッファー組成に関しては特に注意が必要です。いくつかのパラメータを考慮する必要があります:(i)洗剤タイプおよび濃度21、および(ii)プロテアーゼ阻害剤。

溶解バッファー組成物は、可能な限り抽出し、ウェスタンブロットによる検出を可能にするために、ほぼ完全な可溶化を容易にするために標的タンパク質に適応する必要があります。可溶性タンパク質の場合、軽度の状態(例えば、低濃度の中性洗剤)は、これを達成するのに十分であることが多い。膜タンパク質の場合、より強い条件がしばしば必要とされます。洗剤の異なるカテゴリが存在する:(i)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、セチルトリメチランモニウム臭化物(CTAB)、(ii)ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル(BRIJ)、トリトン、オクチルグルコシド(OG)、ドデシルマルトシド(DDM)などの非イオン性iii)3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルランモニオ]-1-プロパンスルホン酸(CHAPS)またはツヴィッテルゲンツのようなツヴィッテリオニック。強い洗剤は相互作用を妨げる可能性があり、複合体が失われる可能性があります。また、免疫沈殿実験の場合、抗体は重篤な条件に敏感でありてもよい。同様に、酵素活性は、研究されたタンパク質を展開または変性させる可能性のある洗剤の存在によって妨げられる可能性があります。使用される洗剤の種類と量の両方が、タンパク質の性質および活性に影響を与える可能性があります。一部のタンパク質では、タンパク質の活性を維持するために、非常に制限された範囲の洗剤の濃度が許容されます。この範囲を下回ると、タンパク質は不溶性のままであるのに対し、この濃度の範囲を超えると、タンパク質はもはや活性ではない。

内因性プロテアーゼによる標的タンパク質の分解を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤をリシスバッファーに添加する必要があります。プロテアーゼ阻害剤カクテルは市販されている。これらは、研究の出発点として使用できます。トラブルが発生した場合は、-20°Cで貯蔵されたストック溶液から一時的に調製した阻害剤の混合物の使用を検討する場合があります。これらの阻害剤は、セリンおよびシステインプロテアーゼを標的としなければならない。PMSF(フェニルメチルスルホニルフッ化物)は一般的に使用されますが、水溶液では非常に不安定であり、抽出の直前に添加する必要があります。メタロプロトアーゼも阻害されるべきである:EDTA(エチレンジトリロテトラセチン酸)またはEGTA(エチレングリコールビス(2-アミノエチルトレーザー)-テトラ酢酸)などの金属キレート試薬は、この目的で使用される。タンパク質をリン酸化して活性化した形態に保つために、リン酸酵素阻害剤をリシスバッファーに添加することもお勧めします。これらの阻害剤は、アルカリ性、酸、セリン、スレオニン、およびチロシンホスファターゼを標的としなければなりません。また、低温(4°C)での作業は、乳酸分解の速度を遅くするためにもお勧めします。

標的タンパク質
ここでは、エピトープタグ付きタンパク質に焦点を当てた。タグ(フラグ、HA、cMyc、GFPなど)は、抗体および抗体結合ビーズが市販されており、容易に再現可能な材料であるため、タンパク質を検出して精製するために非常に有用です。しかしながら、タグの大きさおよび位置は、標的タンパク質6、7、8の活性、局在または機能に影響を与える可能性があるため考慮する必要がある。内因性タンパク質を使用することも可能です。この場合、この特定のタンパク質を標的とする抗体を使用する必要があります。それらは、ビーズ(タンパク質Aまたはタンパク質G)に結合して、共生的(架リンク)またはライサテと共にインキュベートし、次いでビーズと結合してもよい。プラスミドで遺伝子が発現するタグ付きタンパク質を使用する場合、遺伝子の変異によってこのタンパク質の変異バージョンに切り替えるのは簡単です。その後、異なる変異体に取り組んで生物学的機能を評価することが可能です。

免疫沈殿
免疫沈殿は、標的タンパク質5のパートナーを単離する非常に強力な技術である。リシスバッファー(特に洗剤)の組成は、相互作用を維持するために慎重に確立されなければならない(上記参照)。2つの同定されたタンパク質間の相互作用を検出することができる。内因性タンパク質または過剰発現タンパク質であってもよい。タンパク質が低い存在量で発現する場合、より強いシグナルを持つためにそれらを過剰発現させる必要があるかもしれません。免疫沈殿ビーズの広範な洗い流しは、非特異的相互作用タンパク質または汚染物質を除去するために必要とされる。免疫沈殿効率または共免疫沈殿パートナーの存在を決定する前に、異なるパートナーがライサート内で十分に発現され、西洋人による入力分率を分析することによって、ライセート中に十分に発現していることを確認することが重要です。しみ。さらに、免疫沈殿実験を用いて、標的タンパク質の新しいパートナーを同定し、新しい複合体を単離することも可能である。これらの新しいパートナーは、質量分析によって同定され得る。

このようなパートナーは、さらなる生物学的試験のための完全な活性を可能にする標的タンパク質の活性化剤として重要な役割を果たしてもよい。一方、共化された不要なタンパク質は、同定された2つのパートナー間の直接的な相互作用が存在しないが、代わりに共免疫沈殿による検出された相互作用が別の未知のパートナーによるものであるという議論として使用することができる。この特定のケースでは、直接相互作用を確実にするために、細菌から精製された哺乳動物タンパク質に取り組むような別の実験装置が必要である。

キナーゼ活性
キナーゼ活性は、異なる技術によって評価されてもよい。本明細書では、γ[32P]ATP標識によるインビトロ分析と、特異的リン抗体を用いたウエスタンブロットによる全細胞抽出解析に焦点を当てた。γ[32P]ATP標識は、弱いキナーゼ活性15の検出を可能にする非常に敏感で定量的な技術である。ATPから標的基板への放射能の取り込みは、酵素活性の直接的な測定を可能にする。異なる基質で働き、異なる標的上の研究タンパク質のキナーゼ活性を評価することが可能です。また、タンパク質が過剰発現した場合にそれらを変異することにより、キナーゼ活性に重要なアミノ酸を同定することも可能です。キナーゼ活性は、Mg2+のような二価陽イオンを必要とし、キナーゼバッファー内に存在する必要があります。

このアプローチの主な欠点は、実験や廃棄物の収集のための専用施設を必要とする放射能の取り扱いです。ADP(アデノシン二リン酸)16などの反応の副産物を検出する蛍光または発光キットなどの代替方法が存在する。タンパク質リン酸化は質量分析法で研究されることもありますが、これらの分析には大量の材料が必要です。我々のケースでは、効率を高めるために毛細血管電気泳動を用いてLIMK2キナーゼ活性を評価しようとしましたが、残念ながら失敗しました。

リン特異的抗体は、タンパク質のリン酸化を研究するためのさらなるツールである。広範な一般的な抗ホスホセリンおよびチロシン抗体が存在し、任意のタンパク質のホスホサーまたはホスホ-Tyrを認識することができる。近年、標的タンパク質の特異的リン部位を標的とする抗体が広く開発され、通常はホスホ群と周囲のアミノ酸の両方を認識している。このような抗体を使用し始める際には、例えばリン部位に変異した標的タンパク質などの陰性対照でその特異性をチェックする必要があるため、特別な注意が必要です。抗ホスホ抗体を用いてブロットを調べるとき、これは抗体と相互作用する可能性のあるリンタンパク質を含むので、ブロッキング溶液はミルクであってはならない。ウシ血清アルブミン(BSA)が推奨され、リン酸放出を防ぐためにブロッキング溶液にホスファターゼ阻害剤を添加してもよい。サンプルは凍結して解凍するのではなく、-80°Cで保存されるアリコットとして調製してください。確かに、リンの改質は不立です。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この研究は、ラ・リーグ・コントル・ル・ガン、ラ・アソシエーション・ニューロフィブロマトース、レックリングハウゼン、ラ・レジオン・センター・ヴァル・ド・ロワールによって支援されました。フローサイトメトリーデータのためのオーレリー・コッソンとデボラ・カサス、そして原稿の徹底的な校正のためのキーロン・ヒックマン・ルイスに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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