Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Biochemistry

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Summary

Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.

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Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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Abstract

La secuenciación extensa del genoma entero ha identificado muchos marcos de lectura abiertos (ORF) que proporcionan muchas proteínas potenciales. Estas proteínas pueden tener funciones importantes para la célula y pueden desentrañar nuevos procesos celulares. Entre las proteínas, las quinasas son los principales actores, ya que pertenecen a las vías de señalización celular y tienen la capacidad de activar o desactivar muchos procesos cruciales para el destino de la célula, como el crecimiento celular, la división, la diferenciación, la motilidad y la muerte.

En este estudio, nos centramos en una nueva proteína quinasa potencial, LIMK2-1. Demostramos su existencia por Western Blot usando un anticuerpo específico. Evaluamos su interacción con una proteína reguladora aguas arriba utilizando experimentos de coinmunoprecipitación. La coinmunoprecipitación es una técnica muy potente capaz de detectar la interacción entre dos proteínas diana. También se puede utilizar para detectar nuevos socios de una proteína de cebo. La proteína de cebo puede ser purificada ya sea a través de una etiqueta diseñada para su secuencia o a través de un anticuerpo dirigido específicamente a ella. Estos complejos proteicos pueden separarse por SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidGel Gel) e identificarse mediante espectrometría de masas. El LIMK2-1 inmunoprecipitado también se utilizó para probar su actividad de quinasa in vitro mediante el etiquetado de ATP de32P. Este ensayo bien establecido puede utilizar muchos sustratos diferentes, y las versiones mutadas del cebo se pueden utilizar para evaluar el papel de residuos específicos. Los efectos de los agentes farmacológicos también pueden evaluarse ya que esta técnica es altamente sensible y cuantitativa. No obstante, el manejo de la radiactividad requiere especial precaución. La actividad de la quinasa también puede evaluarse con anticuerpos específicos dirigidos al grupo fosfo del aminoácido modificado. Este tipo de anticuerpos no están disponibles comercialmente para todos los residuos modificados fosfo.

Introduction

Durante muchas décadas, numerosas vías de señalización se han aclarado y su participación en procesos celulares cruciales como la división celular, diferenciación, motilidad, muerte celular programada, inmunidad y neurobiología, se ha demostrado. Las quinasas desempeñan un papel importante en estas vías de señalización, ya que a menudo regulan finamente su activación o inactivación y forman parte de complejos versátiles transitorios que responden a estímulos externos1,2,3. La mutación y la desregulación de las quinasas a menudo conducen a enfermedades en los seres humanos, y por lo tanto se han convertido en uno de los objetivos farmacológicos más importantes en los últimos cuarenta años4.

En este contexto, es importante ser capaz de detectar la interacción de la quinasa con sus reguladores aguas arriba o sustratos aguas abajo e identificar nuevos socios. La purificación de afinidad y la inmunoprecipitaciónson técnicas muy potentes para el aislamiento de complejos proteicos 5. La proteína de cebo o quinasa puede ser etiquetada con una secuencia de péptidos específica que permite el uso de cuentas comerciales covalentemente junto con anticuerpos dirigidos al péptido. Este material permite una alta reproducibilidad en los experimentos6,7,8. Las proteínas endógenas también pueden inmunopreciarse utilizando anticuerpos dirigidos directamente a la proteína de cebo. Los anticuerpos pueden estar reticulados a cuentas de agarosa de proteína A o proteína G o simplemente incubados con estas cuentas antes de añadir lisato. Los amortiguadores de lisis deben optimizarse para permitir la solubilización de proteínas sin perder la interacción y evitar la degradación de las proteínas. Un inconveniente importante de este enfoque es que la interacción se detecta sobre la lisis celular; por lo tanto, pueden perderse las interacciones transitorias o débiles, junto con las que requieren contexto subcelular. Otras técnicas se pueden utilizar para trabajar directamente en la célula, como el ensayo de ligadura de proximidad (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) o F-rster Resonance Energy Transferencia (FRET)11,12. Además, la inmunoprecipitación no es adecuada para determinar las constantes termodinámicas de la unión, para las que se requieren técnicas físicas como la Resonancia de Plasmón superficial, la Calorimetría de Valoración Isotérmica o la Termoresis microescala 13,14.

La actividad de la quinasa puede evaluarse utilizando múltiples técnicas. En este documento, nos centramos en los anticuerpos fosfo-específicos y el etiquetado in vitro deATP(Trifosfato de adenosina). Los anticuerpos fosfo-específicos se dirigen a la modificación fosfato de un residuo particular dentro de una proteína. Se pueden utilizar en Western Blot o ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) después de la lisis celular, para la inmunohistoquímica, y también en células intactas utilizando citometría de flujo o inmunofluorescencia. Sus inconvenientes pueden incluir su falta de especificidad, que puede ser evaluada usando una versión mutada de la proteína objetivo, y su no estar disponible comercialmente para todas las proteínas. El etiquetado ATP in vitro á[32P] es un método muy robusto, bien establecido y altamente sensible15. Se pueden utilizar proteínas inmunopreciadas o recombinantes, y se pueden probar diferentes sustratos. Los efectos de los medicamentos también pueden evaluarse ya que este método es cuantitativo. Su principal inconveniente es que la radiactividad asociada con el enfoque requiere manejo con precaución. Los métodos alternativos también son posibles basados en la medición de sustratos de péptidos fluorescentes o luminiscentes y aprovechando las propiedades fluorescentes/luminiscentes alteradas al fosforilación. Estos métodos también permiten un alto rendimiento, que es necesario, por ejemplo, en el cribado de moléculas que pueden ser inhibidores potenciales de la quinasa diana. De hecho, las quinasas representan una de las mayores clases de objetivos farmacológicos perseguidos por las compañías farmacéuticas16.

En este estudio, nos centramos en la proteína LIMK2-1 (LIMK2-1 significa Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). La proteína quinasa LIMK2 fue descrita por primera vez en 199517. Tres isoformas de LIMK2 son producidas por empalme alternativo: LIMK2a, LIMK2b y LIMK2-1. En la actualidad, LIMK2-1 sólo se ha descrito a nivel de ARNm en un solo estudio18. Aquí, caracterizamos esta nueva proteína quinasa potencial a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos. En primer lugar, demostramos que LIMK2-1 está sintetizado. Al igual que sus dos homólogos, LIMK2a y LIMK2b, interactúa con la quinasa rock (proteína quinasa asociada a Rho). Demostramos que LIMK2-1 tiene una actividad quinasa en Myelin Basic Protein (MBP), pero no en la cofilina, el sustrato canónico de las quinasas LIM.

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Protocol

1. Preparación celular para la transfección

ADVERTENCIA: Todos los pasos del cultivo celular deben realizarse en un laboratorio dedicado, y las células se manipulan dentro de un gabinete microbiológico de clase 2.

  1. Células de semilla HEK-293 (riñón embrionario humano) en placas de 10 cm en 10 ml de DMEM (medio de águilas modificadas de Dulbecco) suplementadas con 10% de suero fetal. Cultivo durante 3 a 5días por debajo del 5% co2, a 37 oC, hasta que las células alcancen una confluencia del 90 %.
  2. Tratar placas de 10 cm con colágeno R para aumentar la adhesión celular a las placas de plástico.
    1. Añadir 5 ml de una solución de colágeno R, 200 veces diluido en tampón de fosfato salino (PBS) en una placa de 10 cm. Superponga el líquido sobre toda la superficie de la placa.
    2. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h dentro del armario de bioseguridad.
    3. Retire la solución de colágeno y deséchela. Añadir 5 ml de PBS, extenderlo por toda la superficie de la placa, retirarlo y desecharlo. Repita este lavado una vez.
    4. Añadir 8 ml de DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Mantenga las placas preparadas dentro del gabinete de bioseguridad.
  3. Lleve las placas HEK-293 del paso 1.1 dentro del gabinete de bioseguridad. Retire el medio de las placas y deséchelo en una basura de lejía dedicada. Añadir 2 ml de DMEM suplementado, y lavar las células para separarlas utilizando el flujo de un micropipeta de 1 ml, teniendo cuidado de evitar hacer espuma.
  4. Recoger las células en un tubo de 15 ml y añadir 4 ml de DMEM suplementado. Homogeneizar con una pipeta de 10 ml, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces.
  5. Tome 2 ml de esta solución celular y agréguelas a las placas tratadas con colágeno que contengan DMEM suplementado del paso 1.2.4.
  6. Crecer durante 24 horas en la incubadora a 5% co2 y 37 oC. Las células deben ser 50-80% confluentes en el momento de la transfección.

2. Transfecciones transitorias

  1. Retire el medio de las placas, deséchelo en una basura de lejía dedicada y agregue 10 ml de DMEM fresco complementado. Vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37oC mientras prepara la mezcla de transfección.
  2. En un tubo de 15 ml, añadir 450 ml de una solución de 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris significa Tris(hidroximetil)aminometano y EDTA para ácido etilenodinitrilotetraacético) y 50 ml de una solución de 2,5 M CaCl 2. Mezclar por inversión.
  3. Añadir 10 g de ADN plasmipsódico (ácido desoxirribonucleico) preparado a partir de una preparación midi sobre un cultivo líquido de bacterias transformadas con el plásmido dedicado. Mezclar por inversión.
  4. Bajo agitación suave en un vórtice, añadir 500 l de concentrado de solución salina 2x tamponada BES (composición: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, Na2HPO4, 0,27 g/L; BES significa N,N-Bis(2-hidroxietilo)-2-ácido aminoetanosulfónico, N,N-Bis(2-hidroxietilo)taurino) lentamente gota a gota.
  5. Incubar durante al menos 15 min (hasta 45 min) a temperatura ambiente dentro del armario de bioseguridad. No vórtice, no mezclar! Mueva los tubos con mucho cuidado para no perturbar la compleja formación entre el ADN y el fosfato cálcico.
  6. Lleve las placas del paso 2.1 al armario de seguridad. Añadir los complejos de ADN con mucho cuidado, gota a gota, en las células por toda la superficie de la placa.
  7. Incubar durante 24 a 72 horas en la incubadora a 37oC. Por lo general, la expresión máxima de proteínase alcanza en un plazo de 48 horas.

3. Lisis

NOTA: Trabaje sobre hielo y con tampón frío para evitar la degradación de las proteínas.

  1. Preparar tampón de lisis: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM de pirofosfato sódico, 1 mM Na3VO4, 20 mM de fosfato de p-nitrofenil, 20 mM de glucerofosfato, 10 g/ml de aprotinin, 0,05 g/mdicáácido ometa, ácido aprotina de 0,05 g/mdic, 0,05 g/módico, ácido okail de 0,05 g/mdic, 0,05 g/módico, 0,05 g/módico de ometafosfato, 0,05 g/mdicáto, 0,05 g/m. , 1 g/ml de leupeptina y 1 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonil). Se requieren alrededor de 4 ml de tampón de lisis para cada placa transinfectada.
  2. Retire las placas con células transinfectadas de la incubadora. Ponlos en hielo.
    NOTA: A partir de este paso, es posible trabajar en un banco "normal".
  3. Retire el medio y deséchelo en una basura de lejía dedicada.
  4. Lavar dos veces con 3 ml de PBS frío: añadir 3 ml de PBS en el lado de la placa gota a gota para evitar separar las células transinfectadas, se extendió por toda la superficie de la placa, eliminar PBS y desecharlo; repetir este paso una vez más. Al final, retire cuidadosamente el resto de PBS inclinando la placa para evitar la dilución tampón de lisis para el siguiente paso.
  5. Añadir 500 ml de tampón de lisis fría en las células lavadas transinfectadas. Esparcirlo por toda la superficie de la placa.
  6. Incubar durante 10 minutos sobre hielo. De vez en cuando (al menos dos veces), extienda de nuevo el tampón por toda la superficie de la placa.
  7. Desguace las células y recógelas en un tubo de microcentrífuga.
  8. Centrífuga durante 10 min a 10.000 x g a 4oC.
  9. Recoger sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga. Esta fracción corresponde al lisado (extracto de celda entera). Deseche el pellet que corresponde a los desechos de membrana celular.
  10. Recoger una alícuota de esta fracción a un nuevo tubo de microcentrífuga (alrededor de 50 l). Esta fracción corresponde a la "fracción TOTAL" o "Lisato celular" o "Extracto de célula sin gas" que permite el análisis de si las proteínas transinfectadas son expresadas por Western Blot.
    NOTA: En este punto, las muestras se pueden utilizar directamente para los análisis de Western Blot. El tampón de Laemmli debe añadirse a la muestra, que luego se calienta a 95 oC durante 5 min, se centrifuga a 10.000 x g durante 5 min y se carga en SDS-PAGE adecuado. Las muestras también pueden almacenarse a -80 oC.

4. Inmunoprecipitación

  1. Resuspenda suavemente las perlas de agarosa junto con el anticuerpo apropiado: HA (Human influenza hemagglutinin), Flag o GFP (Green Fluorescent Protein) mediante una inversión suave.
  2. Corte el extremo de una punta de 200 ml de un micropipeta para permitir que las cuentas entren en la punta. Pipetear las perlas hacia arriba y hacia abajo varias veces para saturar la punta para asegurarse de tomar el volumen correcto de cuentas.
  3. Tomar 40 s de perlas en un tubo de microcentrífuga.
  4. Añadir 500 l de TENET (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) tampón. Mezclar por inversión. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g a 4oC. Retire cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo. Añadir 500 l de TENET. Incubar durante al menos 1 hora a 4oC en una rueda giratoria.
    NOTA: Este paso de preincubación en TENET permite reducir las interacciones no específicas y así disminuir la señal de fondo.
  5. Lave las perlas dos veces con 500 ml de tampón de lisis.
    1. Centrífuga 2 min a 1.000 x g a 4oC.
    2. Retire el tampón de sobrenadante cuidadosamente y deséchelo.
      NOTA: Tenga cuidado de no aspirar perlas durante estos pasos de lavado.
    3. Añadir 500 l de tampón de lisis. Homogeneizar invirtiendo el tubo.
    4. Repita los pasos 4.5.1- 4.5.3.
  6. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g a 4oC. Retire con cuidado el tampón de sobrenadante y deséchelo.
  7. Incubar perlas con el lisado del paso 3.9 durante 2 a 4 horas a 4oC en una rueda giratoria.
  8. Lave las cuentas inmunopreciadas.
    NOTA: En este punto, las cuentas inmunoprecipitadas pueden lavarse cinco veces con el tampón de lisis, y luego eluyentes con el tampón de Laemmli. El eluido puede utilizarse para análisis de Western Blot o almacenarse a -80 oC. Alternativamente, las perlas se pueden lavar dos veces con el búfer de lisis y luego tres veces con el búfer de quinasa para realizar el etiquetado de ATP de32P.

5. Análisis de inmunoprecipitación

  1. Lave las cuentas inmunopreciadas del paso 4.7 con el tampón de lisis.
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo.
    3. Añadir 500 l de tampón de lisis. Homogeneizar invirtiendo el tubo.
    4. Repita los pasos 5.1.1-5.1.3 cuatro veces.
  2. Elución
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Retire las últimas gotas de sobrenadante con una jeringa de Hamilton para evitar la aspiración de las cuentas y deseche el sobrenadante.
    3. Añadir 40 l de tampón de 4x Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% glicerol, 0.5 M -mercaptoetanol, 0.02% azul bromofenol). Homogeneizar tocando suavemente el tubo.
    4. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Centrífuga durante 5 min a 10.000 x g a temperatura ambiente.
    6. Con una jeringa Hamilton, retire el sobrenadante y recójalo en un nuevo tubo de microcentrífuga. Esta fracción corresponde al "Eluato", que puede ser almacenado a -80 oC, o analizado directamente por Western Blot.

6. Ensayo Kinase

  1. Preparar el tampón de quinasa: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES significa 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesácido ácido sulfónico), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM -glicerofosfato, 1 g/mL leupeptina, y 1 mM PMSF. Se requieren alrededor de 2 ml del tampón de quinasa para cada condición de inmunoprecipitación.
  2. Lave las cuentas inmunopreciadas del paso 4.7 dos veces con 500 ml de tampón de lisis.
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Añadir 500 l de tampón de lisis. Homogeneizar por inversión.
    3. Repita los pasos 6.2.1 y 6.2.2.
  3. Lave las cuentas inmunopreciadas tres veces con 500 ml de tampón de quinasa.
    1. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Añadir 500 l de tampón de quinasa. Homogeneizar por inversión.
    3. Repita los pasos 6.3.1 y 6.3.2 dos veces.
  4. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4oC.
  5. Retire con cuidado el sobrenadante y deséchelo. Retire las últimas gotas de sobrenadante con una jeringa de Hamilton para evitar la aspiración de las cuentas y deseche el sobrenadante.
  6. Añadir 40 l de tampón de quinasa a las cuentas inmunopreciadas. Resuspenda las perlas tocando suavemente el tubo.
  7. Preparar la mezcla parael etiquetado de ATP de 32 P ( el volumen final es de 22,5 l, completo con tampón de quinasa) en un tubo de bloqueo seguro.
    1. Agregue el volumen requerido de tampón de quinasa para alcanzar un volumen final de 22,5 l.
    2. Corte el extremo de una punta de 20 ml de un micropipeta. Resuspenda las cuentas inmunopreciadas del paso 6.6 pipeteando varias veces. Recoger 10 l de estas perlas en el tubo de bloqueo seguro.
    3. Añadir ATP a partir de una solución de stock de 10 M para alcanzar los 50 mM de concentración final. De acuerdo con el número de muestras tratadas, se sugiere una dilución de la solución de stock de ATP en el tampón de quinasa para permitir pipetear de 1 a 2 l, para asegurarse de que el volumen es correcto.
    4. Añadir 2,5 g de sustrato (cofilina o proteína básica de mielina, MBP en el presente caso de estudio).
  8. Agregue 5 ci de32 P] ATP (3.000 Ci/mmol) para iniciar la reacción. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente.
    ADVERTENCIA: A partir de este punto, el trabajo debe realizarse en un lugar de seguridad dedicado a las manipulaciones de radiactividad con precaución, protecciones específicas y controles adecuados (escudos radioactivos, contador Geiger, recogida de residuos específicos, senos personales y insignias de los dedos para detectar la exposición radiactiva, puntas de filtro).
  9. Incubar durante 20 min a 30oC.
  10. Detenga la reacción con 6 l de búfer de 5x Laemmli.
  11. Calentar a 95oC durante 5 min.
  12. Centrífuga a 10.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  13. Cargar en un SDS-PAGE. Continúe con la migración.
    NOTA: Tenga cuidado de que la primera línea de ATP libre de32P no salga del gel para evitar la contaminación del tanque de migración.
  14. Mancha el gel a temperatura ambiente.
    1. Retire el gel de las placas de vidrio.
    2. Proceda con tres baños en agua a temperatura ambiente.
    3. Mancha el gel durante la noche con Coomassie Blue a temperatura ambiente.
    4. Destain el gel con varios baños de lavado con agua a temperatura ambiente.
  15. Envuelva el gel con una envoltura de plástico.
  16. Exponer durante una noche o más en una pantalla de fosforimager.
  17. Lea la pantalla en un fosforimager para detectar bandas etiquetadas.

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Representative Results

La proteína LIMK2-1 se sintetiza
LIMK2-1 se menciona en los bancos de datos, pero hasta ahora sólo un documento ha demostrado la existencia de su ARNm18. En comparación con sus dos homólogos, LIMK2a y LIMK2b, LIMK2-1 tiene un dominio C-terminal adicional identificado como un dominio inhibidor de la fosfatasa 1 de la proteína (PP1i). Diseñamos un anticuerpo que apunta a un péptido de este dominio, los aminoácidos 671-684 (Figura1A).
La investigación de BLAST contra bases de datos de proteínas humanas mostró que sólo una proteína, PHI-1 (inhibidor de la holoenzima fosfatasa 1), tiene una fuerte similitud de secuencia con esta secuencia de 12 aminoácidos. Sin embargo, PHI-1 migra a 23 kDa en geles SDS-PAGE, lejos de LIMK2-1, que se espera que migre alrededor de 75 kDa (es decir, los dos no deben interferir). Validamos este anticuerpo en primer lugar para las células HEK-293 transfectó con LIMK2-1, LIMK2a o LIMK2b y mostramos que el anticuerpo anti-PP1i era capaz de reconocer las células transfectóticas LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) y CON la etiqueta HA LIMK2-1, pero no reaccionó cruzadamente con transetiquetado HA-etiquetado LIMK2a o LIMK2b (Figura 1B). Observamos una banda de LIMK2-1 endógenos en células HEK transllenadas con versiones con etiqueta HA de las isoformas LIMK2 (indicadas por una flecha en la mancha anti-PP1i; Figura 1B). En segundo lugar, comprobamos si la señal inducida por el anticuerpo anti-PP1i era específica de LIMK2-1 utilizando siRNA dirigida a las tres variantes empalmadas de LIMK2 (Figura1C). En presencia de LIMK2 siRNA, se observó una disminución reproducible y significativa en la banda de interés (indicada por una flecha en la Figura 1C)en comparación con las condiciones de control, lo que sugiere que el anticuerpo es específico de LIMK2-1. Después de esto, usamos el anticuerpo anti-PP1i para detectar LIMK2-1 en diferentes extractos de línea celular: HEK-293 (Células renales embrionarias humanas), HeLa (células de cervix epitelial humano) y C6 (células gliales del cerebro de la rata). Estas células se interrumpen en el tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100. Utilizando el análisis de silico, LIMK2-1 demostró ser específico de primate sin Hominidae 19. El análisis de Western Blot utilizando el anticuerpo anti-PP1i mostró que LIMK2-1 parecía expresarse en HEK-293 y HeLa, pero no en las líneas celulares C6 como se esperaba en estudios de silico (Figura1D). Estos experimentos se repitieron con varios tejidos humanos, mostrando que los niveles de proteína LIMK2-1 variaban dependiendo del tejido: los niveles más altos se encontraron en el hígado, los niveles menores en el páncreas, y los más bajos en los testículos y el pulmón. LIMK2-1 no fue detectable en el tejido cerebral (Figura1E). Observamos bandas de menor peso molecular en todas las muestras de tejido excepto en el hígado, lo que sugiere la degradación de la proteína completa probablemente debido a las condiciones de lisis de estas muestras comerciales (este tampón de lisis contiene un cóctel de inhibidores no especificados en el hoja de datos, que puede ser menos eficiente que los numerosos inhibidores de la proteasa y la fosfatasa que estamos utilizando en nuestro tampón casero). Estos datos muestran que la proteína humana LIMK2-1 se sintetiza y se expresa de manera diferente en los tejidos analizados.

LIMK2-1 interactúa con su quinasa ROCK aguas arriba
Los homólogos LIMK2-1, LIMK2a y LIMK2b, han sido descritos como regulados por la quinasa ROCK aguas arriba. Evaluamos la interacción de LIMK2-1 con ROCK mediante experimentos de coinmunoprecipitación. Las células HEK fueron co-infectadas con vectores que codifican cMyc-tagged ROCK1 y cualquiera de la versión con etiqueta HA de LIMK2 isoforms, o la proteína larp6 etiquetada ha no relacionada. Larp6 sirve como un control negativo, permitiendo la detección de interacciones no específicas. Las células se lisaron y se realizó inmunoprecipitación anti-HA. Los lisatos (extractos de células enteras) y los inmunoprecipitados fueron analizados por Western Blot, utilizando anticuerpos anti-HA y anti-cMyc. Como se muestra en la Figura 2 (paneles izquierdos; Lisatos), cada una de las diferentes proteínas codificadas por los vectores transpirados están bien expresadas. Las tres isoformas de LIMK2, así como Larp6, son inmunopreciadas eficientemente (Figura2, panel inferior derecho; Eluados). En los eluidos, ROCK se detecta y por lo tanto coimmunoprecipitado con las tres isoformas de LIMK2, pero no con Larp6 (Figura2, panel superior derecho; Eluados). Esto demuestra que ROCK interactúa con las tres isoformas de LIMK2, especialmente con la isoforma recién caracterizada LIMK2-1. Esta interacción es específica ya que el control negativo (Larp6) no interactúa con ROCK.

En este documento, presentamos datos de la inmunoprecipitación realizada con anticuerpos anti-HA; sin embargo, la interacción puede probarse en la dirección opuesta inmunopreciando ROCK con cuentas conjugadas con anticuerpos cMyc y analizando eluidos con anticuerpos HA para detectar la coinmunoprecipitación LIMK.

Actividad de la quinasa
Fosfo-cofilina en células intactas
Los homólogos de LIMK2-1, LIMK2a y LIMK2b, han demostrado fosforilar la cofilina, un factor de despolimerización de actina, en su Serrine3. Utilizando un anticuerpo dirigido específicamente a la fosfo-serina3 de la cofilina, estudiamos la actividad de la quinasa LIMK2 midiendo el nivel de fosfoco-cofilina endógena en células HEK que sobreexpresan una de las isoformas LIMK2. Las células HEK se transfectó con vectores que codifican una de las isoformas LIMK2 etiquetadas por HA, o el vector vacío correspondiente como un control negativo. Las células fueron lysed, y los diferentes lysates fueron analizados por Western Blotting usando el anticuerpo de cofilina anti-fosfo-Serine3. La sobreexpresión de LIMK2a y LIMK2b indujo un aumento significativo y reproducible de los niveles de fosfocofilina en relación con las condiciones de control, mientras que la presencia de LIMK2-1 no tuvo ningún efecto detectable (Figura3, panel izquierdo).

Repetimos el mismo experimento con una versión con la etiqueta YFP (Yellow Fluorescent Protein) de las tres isoformas LIMK2 y una versión sin etiquetar de LIMK2-1 para descartar posibles interferencias por la etiqueta N-terminal HA. Los resultados fueron idénticos a los obtenidos utilizando versiones etiquetadas por HA de las tres isoformas (Figura3, panel derecho que muestra la versión etiquetada yFP). Se evaluó la eficiencia de la transfección para la versión de isoformas LIMK etiquetadas con YFP utilizando citometría de flujo para descartar que este resultado puede haber sedebido a la diferencia de expresión proteica. Las tres isoformas mostraron una eficiencia de transfección similar: 54% para LIMK2-1, 49% para LIMK2b y 43% para LIMK2b.

Pruebas de quinasa in vitro
Luego estudiamos la actividad quinasa de las isoformas LIMK2 mediante el etiquetado in vitro con ATP de32P. La Figura 4A muestra el esquema general de este etiquetado in vitro. Las células HEK se transfectó con cualquiera de las versiones etiquetadas por HA de las isoformas LIMK2 o la proteína no relacionada, Larp6, que se utilizó como un control negativo. La actividad quinasa de los inmunoprecipitados anti-HA se midió utilizando la cofilina GST recombinante como sustrato en presencia de32P. ATP. HA-inmunoprecipitado Larp6 no mostró actividad quinasa en la cofilina. HA-inmunoprecipitada LIMK2a y LIMK2b cofilinfosa, mientras que LIMK2-1 no lo hizo (Figura 4B). Obtuvimos resultados similares utilizando versiones etiquetadas con YFP de los tres isoformes inmunoprecipitados con perlas de trampa GFP en presencia de cofilin recombinante y ATP de32P(Figura 4D).

A continuación, probamos si LIMK2-1 no tenía actividad de quinasa o si su actividad en la cofilina estaba deteriorada. Repetimos el experimento de etiquetado in vitro utilizando Myelin Basic Protein (MBP), un sustrato eficiente para numerosas quinasas proteicas, en lugar de cofilina. Había una señal de fondo alta en la condición de control cuando el ensayo se realizó en presencia de versiones etiquetadas ha: el control negativo, HA-inmunoprecipitado Larp6, produjo una señal fuerte de MBP fosforilado, aunque no es una quinasa ( Figura 4C). Superamos este problema usando la versión etiquetada por YFP de estas proteínas. En estas condiciones, los antecedentes del control (solo YFP) eran bajos, lo que permitía realizar estudios más específicos. YFP-LIMK2a, LIMK2b y LIMK2-1, atrapados por GFP, mostraron actividad quinasa hacia MBP, aunque la actividad de LIMK2-1 fue menor (Figura4D). Sin embargo, LIMK2-1 también fue inmunoprecipitado menos eficientemente en estas condiciones (ver Coomassie Brilliant Blue (CBB) tinción y Western Blotting). Por lo tanto, las tres isoformas mostraron una actividad comparable en MBP cuando el fosfo-MBP se normalizó a niveles de LIMK2 inmunoprecipitados por tinción CBB (Figura4D, panel inferior). Los inmunoprecipitados también fueron analizados por Western Blot utilizando anticuerpos anti-ROCK para comprobar si la actividad en MBP podría deberse a la presencia de ROCK, que habría sido coinmunocida con LIMK2s. No pudimos detectar ninguna señal ROCK en los inmunoprecipitados LIMK2. Así que la fosforilación MBP no se debe a ROCK, sino a LIMK2s per se.

En general, estos datos muestran que LIMK2a y LIMK2b tienen actividades similares sobre la cofilina y el MBP. Aunque LIMK2-1 muestra una actividad quinasa hacia MBP comparable a la de las otras dos isoformas, la cofilina no es un buen sustrato para ella.

Figure 1
Figura 1: Evidencia de la existencia de la proteína LIMK2-1. (A) Diagrama esquemático de las tres isoformas de LIMK2 humano. Las isoformas LIMK2 se describen en Entrez Gene: LIMK2-1 (NP_001026971.1), LIMK2a (NP_005560.1), LIMK2b (NP_057952.1). Los diversos dominios de LIMK2 se muestran: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM' (dominio LIM más corto), PDZ (PSD95, Dlg1, Zo-1), S/P (Serine Proline rich), Kinase' (dominio quinasa más corto) y PP1i (proteína fosfatasa 1 inhibitoria). La secuencia elegida para el diseño de anticuerpos anti-PP1i se muestra en rojo. (B y C) Validación del anticuerpo anti-LIMK2-1. (B) las células HEK-293 fueron transinfectadas con LIMK2-1 sin etiquetar (pCMV-LIMK2-1) o con una de las isoformas etiquetadas con HA de LIMK2. Los lisados fueron analizados por Western Blotting utilizando los anticuerpos indicados. (C) Las células HEK-293 fueron transinfectadas con siRNA LIMK2 o siRNA de control. Los lysates fueron analizados por Western Blot. LIMK2-1 se expresa en varias líneas celulares humanas (D) y tejidos (E). Las células HEK-293, HeLa y C6 se interrumpieron en un tampón de lisis del 1% de Tritón-X100. Se compraron extractos de tejido y las muestras de los mismos fueron analizadas por Western Blotting. Esta cifra fue modificada de Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las tres isoformas de LIMK2 interactúan con ROCK1. Las células HEK-293 fueron co-transtrinfectadas con ROCK1 con etiqueta cMyc y cualquiera de las tres isoformas LIMK2 etiquetadas con HA (2-1, 2a, 2b) o la proteína no relacionada, Larp6. Los lisatos y los inmunoprecipitados anti-HA fueron sometidos a Western Blotting. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: LIMK2-1 no tiene actividad de quinasa hacia la cofilina en células intactas. Las células HEK-293 fueron transfectó con cualquiera de las tres isoformas LIMK2 etiquetadas por HA (1, 2a, 2b) o con el vector parental vacío, pcDNA3 (panel izquierdo), o con cualquiera de las tres isoformas LIMK2 etiquetadas con YFP o YFP sola (panel derecho). Los lysates fueron sometidos a Western Blotting. La cuantificación de la relación entre fosfococo y cofilina se muestra en el gráfico de la derecha. La relación fosfo-cofilina frente a cofilina de células autoperzadas simuladas se normalizó a 100. Cada valor representa la media de se de tres experimentos independientes. Esta cifra fue modificada de Vallee et al., The Biochemical Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: LIMK2-1 no tiene actividad de quinasa in vitro hacia la cofilina, aunque fosforila MBP. (A) Esquema general de etiquetado in vitro de ATP de32P. (B) LIMK2-1 no fosforila lacolina in vitro. Las células HEK-293 fueron transfectó con cualquiera de las tres isoformas LIMK2 etiquetadas con HA (2-1, 2a, 2b) o una proteína no relacionada con la etiqueta HA, Larp6, como un control negativo. En el ensayo de quinasa se utilizaron proteínas inmunopreciadas anti-HA y cofilina GST. Los inmunoprecipitados anti-HA también fueron sometidos a inmunoblotting anti-HA y tinción azul de Coomassie. (C) inmunoprecipitación etiquetada HA tiene una fuerte señal de fondo cuando MBP se utiliza como sustrato. Las células HEK-293 fueron transfectó con cualquiera de las tres isoformas LIMK2 etiquetadas con HA (2-1, 2a, 2b) o una proteína no relacionada con la etiqueta HA, Larp6, como un control negativo. En el ensayo de quinasa se utilizaron proteínas inmunopreciadas anti-HA y MBP. Los inmunoprecipitados anti-HA también fueron sometidos a inmunoblotting anti-HA y tinción azul de Coomassie. (D) Las tres isoformas LIMK2 tienen actividad quinasa hacia la proteína básica de mielina (MBP). Las células HEK-293 fueron transfectó con cualquiera de las tres isoformas LIMK2 etiquetadas con YFP (2-1, 2a, 2b) o YFP sola. En el ensayo de quinasa se utilizaron isoformas LIMK2 inmunopreciadas anti-GFP y cofilina o MBP. Los inmunoprecipitados anti-GFP también fueron sometidos a inmunoblotting anti-GFP y tinción azul de Coomassie. La cuantificación de la fosfocofilina y el fosfo-MBP se muestra en el gráfico inferior. Los niveles de fosfo-cofilina obtenidos con LIMK2a inmunoprecipitado anti-GFP se normalizaron a 100. Cada valor representa la media de se de tres experimentos independientes. Esta cifra fue modificada de Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este documento, hemos utilizado herramientas bioquímicas robustas para caracterizar a nivel molecular una nueva proteína, LIMK2-1, que se cree que es una quinasa basada en su secuencia y en sus homólogos, LIMK2a y LIMK2b20.

En primer lugar, demostramos la existencia de LIMK2-1 a nivel proteico utilizando el análisis de Western Blot con un anticuerpo específico. Después de esto, evaluamos su interacción con la quinasa ascendente ROCK1, que se sabe que regula LIMK2a y LIMK2b, los homólogos de LIMK2-1. Por último, evaluamos la actividad potencial de la quinasa de LIMK2-1 a través del etiquetado in vitro de ATP de32P y en el celulo por Western Blot utilizando un fosfo-anticuerpo específico.

Composición del tampón Lysis
Al estudiar proteínas con el fin de analizarlas por Western Blot, se requiere un cuidado particular con respecto a la composición tampón de lisis. Hay que tener en cuenta varios parámetros: (i) tipo de detergente y concentración21,y ii) inhibidores de la proteasa.

La composición tampón de lisis debe adaptarse a la proteína diana para facilitar su solubilización casi completa con el fin de extraerla tanto como sea posible y permitir su detección por Western Blot. Para las proteínas solubles, las condiciones leves (por ejemplo, un detergente suave a baja concentración) a menudo son suficientes para lograrlo. Para las proteínas de membrana, a menudo se requieren condiciones más fuertes. Existen diferentes categorías de detergentes: (i) iónicos, como el sulfato de dodecilo sódico (SDS), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), (ii) no iónicos como el éter de polietilenglicol hexadecílico (BRIJ), Tritón, octilGlucoside (OG), doDecylMaltoside (DDM) y ( iii) zwitterionic como 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) o zwittergents. Los detergentes fuertes pueden interrumpir las interacciones y los complejos pueden perderse. Además, para los experimentos de inmunoprecipitación, los anticuerpos pueden ser sensibles a afecciones graves. Del mismo modo, la actividad enzimática puede verse perturbada por la presencia de detergentes que pueden desplegar o desnaturalizar la proteína estudiada. Tanto el tipo como la cantidad del detergente utilizado pueden afectar a las propiedades y a la actividad de una proteína. Para algunas proteínas, se tolera un rango muy restringido de concentración de detergente para preservar la actividad de la proteína. Por debajo de este rango la proteína permanece insoluble mientras que por encima de este rango de concentración, la proteína ya no está activa.

Los inhibidores de la proteasa deben añadirse al tampón de lisis para evitar la degradación de la proteína diana por proteasas endógenas. Los cócteles inhibidores de la proteasa están disponibles comercialmente. Se pueden utilizar como punto de partida de un estudio. Si se encuentran problemas, se puede considerar el uso de una mezcla de inhibidores preparados extemporalmente a partir de soluciones de stock almacenadas a -20 oC. Estos inhibidores deben apuntar a las proteasas de serina y cisteína. PMSF (Fluoruro de fenilmetilnil) se utiliza comúnmente, sin embargo es muy inestable en solución acuosa y debe añadirse justo antes de la extracción. También se deben inhibir las metaloproteasas: reactivos quelantes metálicos, como EDTA (ácido etilenodtrilotetraacético) o EGTA (Etilenglicol-bis(2-aminoetilether)-ácido tetraacético), que se unen a Mg 2+, que se unen a Mg2+,que se utilizan en este propósito. Para mantener la proteína en su forma fosforilada y por lo tanto activada, también se recomienda añadir inhibidores de la fosfatasa al tampón de lisis. Estos inhibidores deben dirigirse a las fosfatasas alcalinas, ácidas, serinas, tereoninas y tirosinas. También se recomienda trabajar a baja temperatura (4oC) para reducir la velocidad de proteólisis.

Proteínas objetivo
Aquí, nos centramos en proteínas etiquetadas con epítopos. Las etiquetas (Flag, HA, cMyc, GFP, etc.) son muy útiles para detectar y purificar proteínas, ya que los anticuerpos y las perlas acopladas con anticuerpos están disponibles comercialmente y son materiales fácilmente reproducibles. Sin embargo, el tamaño y la posición de la etiqueta tiene que ser considerado ya que esto puede afectar a la actividad, localización o función de la proteína diana6,7,8. También es posible trabajar con proteínas endógenas. En este caso, se deben utilizar anticuerpos dirigidos a esta proteína en particular. Pueden acoplarse a cuentas (proteína A o proteína G) covalentemente (enlace cruzado) o ser incubados con el lisado y luego con las cuentas. Cuando se trabaja con proteínas etiquetadas, cuyo gen se expresa en un plásmido, es fácil cambiar a una versión mutada de esta proteína por mutagénesis del gen. Entonces es posible trabajar en diferentes mutantes para evaluar las funciones biológicas.

Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación es una técnica muypotente para aislar a los socios de la proteína diana 5. La composición del tampón de lisis (especialmente detergente) debe establecerse cuidadosamente para preservar las interacciones (véase más arriba). Es posible detectar la interacción entre dos proteínas identificadas. Pueden ser proteínas endógenas o proteínas sobreexpresadas. Cuando las proteínas se expresan en baja abundancia, puede ser necesario sobreexpresarlas para tener señales más fuertes. Se requieren lavados extensos de perlas inmunopreciadas para eliminar proteínas o contaminantes que no interactúan específicamente. Antes de determinar la eficiencia de inmunoprecipitación o la presencia de socios coinmunocidas, es importante comprobar que los diferentes socios están bien expresados y presentes en el lisado mediante el análisis de todo el lisado celular o la fracción de entrada por Western Blot. Además, utilizando experimentos de inmunoprecipitación, también es posible identificar nuevos socios de una proteína diana y aislar nuevos complejos. Estos nuevos socios pueden ser identificados por espectrometría de masas.

Estos socios pueden desempeñar un papel importante como activadores de la proteína diana, lo que permite toda su actividad para nuevas pruebas biológicas. Por otro lado, las proteínas no deseadas copurificadas pueden utilizarse como argumento de que no hay una interacción directa entre dos socios identificados, sino que la interacción detectada por coinmunoprecipitación se debe a otra pareja desconocida. En este caso específico, para estar seguro de una interacción directa, se necesita otro dispositivo experimental, como trabajar en proteínas de mamíferos purificadas a partir de bacterias.

Actividad de la quinasa
La actividad de la quinasa puede evaluarse mediante diferentes técnicas. En este documento, nos centramos en el análisis in vitro por el etiquetado de ATP de32P y en el análisis de extracto sortilo por Western Blot utilizando un fosfo-anticuerpo específico. El etiquetado ATP de32P es una técnica muy sensible y cuantitativa que permite la detección de una actividad quinasa débil15. La incorporación de radiactividad de ATP al sustrato objetivo permite realizar una medida directa de la actividad enzimática. Es posible trabajar con diferentes sustratos para evaluar la actividad quinasa de la proteína estudiada en diferentes dianas. También es posible identificar aminoácidos cruciales para la actividad de la quinasa mutando cuando la proteína está sobreexpresada. La actividad de la quinasa requiere un catión divalente como Mg2+,que tiene que estar presente en el tampón de quinasa.

El principal inconveniente de este enfoque es la gestión de la radiactividad, que requiere instalaciones específicas para experimentos y para la recogida de desechos. Existen métodos alternativos, como kits fluorescentes o luminiscentes que detectan subproductos de la reacción, como ADP (difosfato de adenosina)16. La fosforilación proteica también puede ser estudiada por espectrometría de masas, sin embargo, se requiere una mayor cantidad de materiales para estos análisis. En nuestro caso, intentamos evaluar la actividad de la quinasa LIMK2 utilizando electroforesis capilar para aumentar nuestra eficiencia, pero esto lamentablemente no tuvo éxito.

Los anticuerpos fosfoespecíficos son una herramienta adicional para estudiar la fosforilación de una proteína. Existen amplios anticuerpos generales antifosfo no fosfófino de serina y tirosina, capaces de reconocer el fosfo-Ser o fosfo-Tyr de cualquier proteína. En los últimos años, los anticuerpos dirigidos a un fosfo-sitio específico de una proteína diana han sido ampliamente desarrollados y por lo general reconocen tanto el grupo fosfo como los aminoácidos circundantes. Se necesita un cuidado especial al comenzar a trabajar con tales anticuerpos, ya que su especificidad debe ser comprobada, por ejemplo, con un control negativo, como la proteína diana mutada en el sitio de fosfo. Al sondear una mancha con un anticuerpo antifosfo, la solución de bloqueo no debe ser leche, ya que contiene fosfoproteínas que pueden interactuar con el anticuerpo. Se recomienda la albúmina sérica bovina (BSA) y se pueden añadir inhibidores de la fosfatasa en la solución de bloqueo para evitar la liberación de fosfato. Las muestras no deben congelarse y descongelarse, sino prepararse como alícuotas que se mantienen a -80 oC. De hecho, las modificaciones de fosfo son lábiles.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, y la Région Centre Val de Loire. Muchas gracias a Aurélie Cosson y Déborah Casas por los datos de citometría de flujo, y a Keyron Hickman-Lewis por la revisión exhaustiva del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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References

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