Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Biochemistry

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Summary

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.

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Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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Abstract

O sequenciamento do genoma inteiro extenso identificou muitos quadros de leitura abertos (ORFs) que fornecem muitas proteínas potenciais. Estas proteínas podem ter papéis importantes para a célula e podem desvendar novos processos celulares. Entre as proteínas, as cinases são atores principais como eles pertencem a vias de sinalização celular e têm a capacidade de ligar ou desligar muitos processos cruciais para o destino da célula, como o crescimento celular, divisão, diferenciação, motilidade, e morte.

Neste estudo, nós focamos em uma proteína potencial da quinase nova, LIMK2-1. Nós demonstramos sua existência por Western blot usando um anticorpo específico. Nós avaliamos sua interação com uma proteína de regulamento ascendente usando experimentos da coimunoprecipitação. A coimunoprecipitação é uma técnica muito poderosa capaz de detectar a interação entre duas proteínas alvo. Ele também pode ser usado para detectar novos parceiros de uma proteína de isca. A proteína da isca pode ser purificada quer através de uma etiqueta projetada para sua seqüência ou através de um anticorpo especificamente direcioná-lo. Estes complexos proteicos podem então ser separados por SDS-PAGE (gel de PolyAcrylamide do sulfato do Dodecyl do sódio) e identificados usando a espectrometria maciça. Immunoprecipitated LIMK2-1 foi usado igualmente para testar sua atividade da quinase in vitro pela rotulagem do ATP de γ [32P]. Este ensaio bem estabelecido pode usar muitos substratos diferentes, e versões mutadas da isca podem ser usadas para avaliar o papel de resíduos específicos. Os efeitos dos agentes farmacológicos também podem ser avaliados, uma vez que esta técnica é altamente sensível e quantitativa. No entanto, o manuseio de radioatividade requer cautela especial. A atividade da quinase pode igualmente ser avaliada com os anticorpos específicos que visam o grupo do phospho do aminoácido modificado. Estes tipos de anticorpos não estão disponíveis comercialmente para todos os resíduos de fosho modificados.

Introduction

Durante muitas décadas, inúmeras vias de sinalização foram elucidadas e seu envolvimento em processos celulares cruciais, como divisão celular, diferenciação, motilidade, morte celular programada, imunidade e neurobiologia, tem sido demonstrado. As quinases desempenham um papel significativo nessas vias de sinalização, pois muitas vezes regulam finamente sua ativação ou inativação e fazem parte de complexos versáteis transitórios que respondem a estímulos externos1,2,3. A mutação e o desregulação das quinases conduzem frequentemente às doenças nos seres humanos, e tornaram-se conseqüentemente um dos alvos os mais importantes da droga sobre os 40 anos passados4.

Neste contexto, é importante ser capaz de detectar a interação quinase com seus reguladores upstream ou substratos a jusante e identificar novos parceiros. A purificação de afinidade e a imunoprecipitação são técnicas muito poderosas para o isolamento de complexos proteicos5. A proteína ou quinase da isca pode ser etiquetada com uma seqüência específica do peptide permitindo o uso de grânulos comerciais covalentemente acoplado com os anticorpos que alvejam o peptide. Este material permite uma alta reprodutibilidade em experimentos6,7,8. As proteínas endógenas também podem ser imunoprecipitadas usando anticorpos direcionados diretamente à proteína de isca. Os anticorpos podem ser reticulados aos grânulos de agarose da proteína A ou da proteína G ou simplesmente incubado com estes grânulos antes de adicionar o lysate. Os buffers de Lise devem ser otimizados para permitir a solubilização de proteínas sem perder a interação e evitar a degradação da proteína. Uma desvantagem principal desta aproximação é que a interação está detectada em cima da lise da pilha; Conseqüentemente, as interações transientes ou fracas, junto com aquelas que exigem o contexto subcellular podem ser perdidas. Outras técnicas podem ser usadas para trabalhar diretamente na célula, como o ensaio de ligadura de proximidade (PLA)9, a purificação de afinidade assistida por ligação cruzada in vivo (xap)10, transferência de energia de ressonância de BIOLUMINESCÊNCIA (BRET) ou energia de ressonância de Förster Transferência (fret)11,12. Além disso, a imunoprecipitação não é apropriada para determinar as constantes termodinâmicas da ligação, para as quais são necessárias técnicas físicas como ressonância Plasmon superficial, Calorimetria de Titulação Isotérmica ou Termoforese em microescala 13,14.

A atividade da quinase pode ser avaliada usando várias técnicas. Nisto, nós focamos em anticorpos phospho-específicos e in vitro γ [32P] ATP (triphosphate de adenosina) que etiquetam. Os anticorpos phospho-específicos alvejar a modificação do fosfato de um resíduo particular dentro de uma proteína. Podem ser usados no borrão ocidental ou no ELISA (ensaio enzima-lig de ImmunoSorbent) após o lysis da pilha, para immunohistochemistry, e igualmente em pilhas intactas usando a citometria ou a imunofluorescência do fluxo. Suas desvantagens podem incluir sua falta de especificidade, que pode ser avaliada usando uma versão mutada da proteína alvo, e sua não estar disponível comercialmente para todas as proteínas. In vitro γ [32P] a rotulagem ATP é um método muito robusto, bem estabelecido e altamente sensível15. Proteínas imunoprecipitadas ou recombinantes podem ser usadas, e diferentes substratos podem ser testados. Os efeitos das drogas também podem ser avaliados, pois esse método é quantitativo. Sua principal desvantagem é que a radioatividade associada à abordagem requer manuseio com cautela. Os métodos alternativos são igualmente possíveis baseados na medida de substratos fluorescentes ou luminescentes do peptide e aproveitando-se de propriedades fluorescentes/luminescentes alteradas em cima do phosphorylation. Tais métodos também permitem alta taxa de transferência, o que é necessário, por exemplo, na triagem de moléculas que podem ser potenciais inibidores da quinase-alvo. De fato, as quinases representam uma das maiores classes de alvos de drogas perseguidos pelas empresas farmacêuticas16.

Neste estudo, nós focamos na proteína LIMK2-1 (LIMK2-1 significa Lin11, Isle1, Mec3 isoforma da quinase 2-1). A proteína da quinase LIMK2 foi descrita pela primeira vez em 199517. Três isoformas de LIMK2 são produzidas por splicing alternativo: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Presentemente, LIMK2-1 foi descrito somente no nível do mRNA em um único estudo18. Nisto, nós caracterizamos esta proteína nova potencial da quinase no nível molecular usando aproximações bioquímicas robustas. Em primeiro lugar, demonstramos que LIMK2-1 é de fato sintetizado. Semelhante às suas duas contrapartes, LIMK2a e LIMK2b, interage com a quinase ascendente ROCK (proteína quinase associada a Rho). Nós mostramos LIMK2-1 tem uma atividade da quinase na proteína básica de myelin (MBP), mas não no cofilin, o substrato canônico de LIM kinases.

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Protocol

1. preparação da pilha para o transfection

Cuidado: todas as etapas da cultura da pilha devem ser executadas em um laboratório dedicado, e as pilhas são manipuladas dentro de um armário microbiológico da classe 2.

  1. Semente HEK-293 (rim embrionário humano) células em placas de Ø 10 cm em 10 mL de DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles médio) suplementado com 10% de soro de bezerro fetal. Cultura para 3 a 5 dias 5% CO2, em 37 ° c, até que as pilhas alcancem a confluência de ~ 90%.
  2. Trate as placas do Ø 10 cm com colagénio R para aumentar a adesão da pilha às placas plásticas.
    1. Adicionar 5 mL de uma solução de colágeno R, 200 vezes diluído em tampão salino de fosfato (PBS) numa placa de Ø 10 cm. Sobreponha o líquido sobre toda a superfície da chapa.
    2. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h no armário de biossegurança.
    3. Remova a solução de colágeno e descarte-a. Adicionar 5 mL de PBS, espalhá-lo por toda a superfície da placa, removê-lo e descartá-lo. Repita esta lavagem uma vez.
    4. Adicione 8 mL de DMEM suplementado com o soro fetal da vitela de 10%. Mantenha as placas preparadas dentro do gabinete de biossegurança.
  3. Tome HEK-293 placas da etapa 1,1 dentro do gabinete de biossegurança. Retire o meio das placas e descarte-o em um lixo de lixívia dedicado. Adicionar 2 mL de DMEM suplementado, e lave as células para desanexá-los usando o fluxo de uma micropipeta de 1 mL, tendo o cuidado de evitar fazer espuma.
  4. Colete as células em um tubo de 15 mL e adicione 4 mL de DMEM suplementado. Homogeneizar com uma pipeta de 10 mL, pipetando para cima e para baixo 3 vezes.
  5. Tome 2 mL desta solução da pilha e adicione-as às placas colagénio-tratadas que contêm DMEM suplementado da etapa 1.2.4.
  6. Cresça por 24 horas na incubadora em 5% CO2 e 37 ° c. As células devem ser 50-80% confluentes no momento da transfecção.

2. Transfections transientes

  1. Remova o meio das placas, descarte-o em um lixo de lixívia dedicado e adicione 10 mL de DMEM recém-suplementado. Põr para trás as placas na incubadora em 37 ° c ao preparar a mistura do transfection.
  2. Em um tubo de 15 mL, adicione 450 μL de um EDTA de 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM (Tris significa tris (hidroximetil) aminometano, e EDTA para ácido etilenedinitrilotetraacético) solução e 50 μL de uma solução de 2,5 M CaCl2 . Misture por inversão.
  3. Adicionar 10 μg de DNA plasmídico (Ácido desoxirribonucleico) preparado a partir de uma preparação MIDI em uma cultura líquida de bactérias transformadas com o plasmídeo dedicado. Misture por inversão.
  4. agitação suave em um Vortex, adicione 500 μL de concentrado de soro fisiológico tamponado de BES (composição: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na2HPO4, 0,27 g/l; BES representa N, N-bis (2-Hydroxyethyl)- -2-aminoetanoesulfonic ácido, N, N-bis (2-Hydroxyethyl) taurine) lentamente gota a gota.
  5. Incubar durante pelo menos 15 min (até 45 min) à temperatura ambiente dentro do gabinete de biossegurança. Não vórtice, não misture! Mova os tubos com muito cuidado para não perturbar a complexa formação entre DNA e fosfato de cálcio.
  6. Leve as placas da etapa 2,1 para o gabinete de segurança. Adicione os complexos de DNA com muito cuidado, gota a gota, para as células em toda a superfície da placa.
  7. Incubar por 24 a 72 horas na incubadora em 37 ° c. Geralmente a expressão máxima da proteína é alcançada dentro de 48 horas.

3. lise

Nota: trabalhe no gelo, e com amortecedores frios para impedir a degradação da proteína.

  1. Prepare o tampão de Lise: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM pirofosfato de sódio, 1 mM na3vo4, 20 mm p-nitrofenil fosfato, 20 mm β-glicerofosfato, 10 μg/ml aprotinina, 0, 5 μg/ml de ácido okaidic , 1 μg/mL de leupeptina e 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo). Cerca de 4 mL de tampão de Lise são necessários para cada placa transfected.
  2. Retire as placas com células transfectadas da incubadora. Coloque-os no gelo.
    Nota: a partir desta etapa, é possível trabalhar em um banco "normal".
  3. Remova a mídia e descarte-a em um lixo de lixívia dedicado.
  4. Lave duas vezes com 3 mL de PBS frio: Adicionar 3 mL de PBS no lado da placa gota a gota para evitar a desanexação de células transfectadas, espalhados por toda a superfície da placa, remover PBS e descartá-lo; Repita esta etapa mais uma vez. No final, Retire cuidadosamente o resto da PBS inclinando a placa para evitar a diluição do tampão de Lise para o próximo passo.
  5. Adicionar 500 μL de tampão de Lise a frio nas células lavadas transfectadas. Espalhá-lo por toda a superfície da placa.
  6. Incubar por 10 min no gelo. De tempos em tempos (pelo menos duas vezes), espalhe novamente o tampão em toda a superfície da placa.
  7. Sucata as células e recolhê-los em um tubo de microcentrífuga.
  8. Centrifugador por 10 min a 10.000 x g a 4 ° c.
  9. Colete sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga. Esta fração corresponde ao lisado (extrato de células inteiras). Descarte o pellet que corresponde aos detritos da membrana celular.
  10. Colete uma alíquota desta fração para um novo tubo de microcentrífuga (cerca de 50 μL). Esta fração corresponde à "fração TOTAL" ou "lisado de células" ou "extrato de células inteiras", permitindo a análise de se as proteínas transfectadas são expressas por Western Blot.
    Nota: neste ponto, as amostras podem ser usadas diretamente para análises Western Blot. O tampão de Laemmli deve ser adicionado à amostra, que é aquecida então em 95 ° c por 5 minutos, centrifugada em 10.000 x g por 5 minutos, e carregada no SDS-PAGE apropriado. As amostras também podem ser armazenadas em-80 ° c.

4. imunoprecipitação

  1. Gentilmente ressuscitem grânulos de agarose juntamente com o anticorpo apropriado: HA (hemaglutinina da gripe humana), bandeira, ou GFP (proteína fluorescente verde) por inversão suave.
  2. Corte a extremidade de uma ponta de 200 μL de uma micropipeta para permitir que os grânulos entrem na ponta. Pipeta as contas para cima e para baixo várias vezes para saturar a ponta para garantir a tomar o volume correto de grânulos.
  3. Tome 40 μL de grânulos em um tubo de microcentrífuga.
  4. Adicionar 500 μL de TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) tampão. Misture por inversão. Centrifugador por 2 min a 1.000 x g a 4 ° c. Retire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Adicionar 500 μL de TENET. Incubar durante pelo menos 1 hora a 4 ° c numa roda rotativa.
    Nota: esta etapa de pré-incubação no TENET permite reduzir interações não específicas e assim diminuir o sinal de fundo.
  5. Lave os grânulos duas vezes com 500 μL de tampão de Lise.
    1. Centrifugar 2 min a 1.000 x g a 4 ° c.
    2. Remova cuidadosamente o buffer de sobrenadante e descarte-o.
      Nota: Tome cuidado para não aspirar grânulos durante estes passos de lavagem.
    3. Adicionar 500 μL de tampão de Lise. Homogeneizar invertendo o tubo.
    4. Repita os passos 4.5.1-4.5.3.
  6. Centrifugador por 2 min a 1.000 x g a 4 ° c. Remova cuidadosamente o buffer de sobrenadante e descarte-o.
  7. Incubar grânulos com o lisado da etapa 3,9 por 2 a 4 horas em 4 ° c em uma roda de giro.
  8. Lave os grânulos Immunoprecipitated.
    Nota: neste ponto, os grânulos Immunoprecipitated podem ser lavados cinco vezes com o tampão do lysis, e então eluída com tampão de Laemmli. O eluído pode ser usado para análises ocidentais do borrão ou armazenado em-80 ° c. Alternativamente, os grânulos podem ser lavados duas vezes com o tampão do lysis e então três vezes com o amortecedor da quinase para executar a rotulagem do ATP do γ [32P].

5. análises de coimunoprecipitação

  1. Lave as contas imunoprecipitadas da etapa 4,7 com o tampão de Lise.
    1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
    2. Retire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o.
    3. Adicionar 500 μL de tampão de Lise. Homogeneizar invertendo o tubo.
    4. Repita os passos 5.1.1-5.1.3 quatro vezes.
  2. Eluição
    1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
    2. Retire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Retire as últimas gotas de sobrenadante com uma seringa de Hamilton, a fim de evitar a aspiração dos grânulos, e descartar o sobrenadante.
    3. Adicionar 40 μL de 4x tampão de Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glicerol, 0,5 M β-Mercaptoetanol, 0, 2% azul de bromofenol). Homogeneizar tocando suavemente o tubo.
    4. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
    5. Centrifugar durante 5 min a 10.000 x g à temperatura ambiente.
    6. Com uma seringa de Hamilton, retire o sobrenadante e colete-o em um novo tubo de microcentrífuga. Esta fração corresponde ao "Eluate", que pode ser armazenado em-80 ° c, ou diretamente analisado por Western Blot.

6. ensaio quinase

  1. Prepare o tampão da quinase: 50 milímetros HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES significa 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineetanoesulfonic ácido), 150 mM NaCl, 5mm MgCl 2,5 mm MNCL2, 50 mm NAF, 1 mm na3vo4, 20 mm β-glicerofosfato, 1 μg/ml leupeptina e 1 mM de PMSF. Em torno de 2 mL do tampão da quinase é exigido para cada condição da imunoprecipitação.
  2. Lave as contas imunoprecipitadas da etapa 4,7 duas vezes com 500 μL de tampão de Lise.
    1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
    2. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Adicionar 500 μL de tampão de Lise. Homogeneizar por inversão.
    3. Repita os passos 6.2.1 e 6.2.2.
  3. Lave os grânulos Immunoprecipitated três vezes com 500 μL do amortecedor da quinase.
    1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
    2. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Adicionar 500 μL de tampão quinase. Homogeneizar por inversão.
    3. Repita os passos 6.3.1 e 6.3.2 duas vezes.
  4. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
  5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Retire as últimas gotas de sobrenadante com uma seringa de Hamilton, a fim de evitar a aspiração dos grânulos, e descartar o sobrenadante.
  6. Adicionar 40 μL de tampão quinase aos grânulos imunoprecipitados. Ressuspender os grânulos tocando suavemente no tubo.
  7. Prepare a mistura para a rotulagem do ATP do γ [32P] (o volume final é 22,5 μL, termine com tampão da quinase) em um lock-Tube seguro.
    1. Adicione o volume necessário de tampão da quinase para alcançar um volume final de 22,5 μL.
    2. Corte a extremidade de uma ponta de 20 μL de uma micropipeta. Resuspend os grânulos Immunoprecipitated da etapa 6,6 introduzindo com pipting acima e para baixo diversas vezes. Colete 10 μL destes grânulos no tubo do seguro-fechamento.
    3. Adicione ATP de uma solução de estoque de 10 μM para atingir 50 mM de concentração final. De acordo com o número de amostra tratada, uma diluição da solução de estoque de ATP no tampão da quinase é sugerida para permitir a pipeta 1 a 2 μL, para ter certeza de que o volume está correto.
    4. Adicionar 2,5 μg de substrato (cofilina ou myelin Basic protein, MBP no caso do presente estudo).
  8. Adicionar 5 μCi de γ [32P] ATP (3.000 CI/mmol) para iniciar a reação. Misture com pipetagem para cima e para baixo lentamente.
    Cuidado: a partir deste ponto, o trabalho deve ser feito em um local de segurança dedicado para manipulações de radioatividade com precaução cautelosa, proteções dedicadas e controles apropriados (escudos radioativos, contador Geiger, coleta de resíduos específicos, peito pessoal e os emblemas do dedo para detectar a exposição radioativa, pontas de filtro).
  9. Incubar por 20 min a 30 ° c.
  10. Pare a reacção com 6 μL de tampão de 5x Laemmli.
  11. Aqueça a 95 ° C por 5 min.
  12. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  13. Carregar em um SDS-PAGE. Prossiga para a migração.
    Nota: Tome cuidado para que a linha de frente de livre γ [32P] ATP não saia do gel para evitar a contaminação do tanque de migração.
  14. Manchar o gel à temperatura ambiente.
    1. Retire o gel das placas de vidro.
    2. Prossiga com três banhos em água à temperatura ambiente.
    3. Mancha o gel durante a noite com o azul de Coomassie na temperatura ambiente.
    4. Destain o gel com vários banhos de lavagem com água à temperatura ambiente.
  15. Enrole o gel com plástico Wrap.
  16. Expor para uma noite ou mais em uma tela do phosphorimager.
  17. Leia a tela em um phosphorimager para detectar faixas rotuladas.

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Representative Results

A proteína LIMK2-1 é sintetizada
LIMK2-1 é mencionado nos databanks, mas assim distante somente um papel mostrou a existência de seu mRNA18. Comparado a seus dois homologs, LIMK2a e LIMK2b, LIMK2-1 tem um domínio extra do C-terminal identificado como um domínio Inibidório da proteína phosphatase 1 (PP1i). Nós projetamos um anticorpo que segmenta um peptide deste domínio, ácidos aminados 671-684 (Figura 1a).
A pesquisa do BLAST de encontro às bases de dados humanas da proteína mostrou que somente uma proteína, PHI-1 (inibidor 1 do holoenzyme da fosfatase), tem uma similaridade forte da seqüência com esta seqüência de 12 aminoácidos. No entanto, PHI-1 migra em 23 kDa em géis SDS-PAGE, longe de LIMK2-1, que é esperado para migrar cerca de 75 kDa (ou seja, os dois não devem interferir). Nós validamos primeiramente este anticorpo para as pilhas de HEK-293 transfected com LIMK2-1, LIMK2a, ou LIMK2b e mostramos que o anticorpo de anti-PP1i podia reconhecer transfected LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) e HA-etiquetado LIMK2-1, mas não reage cruzada com transfected HA-Tagged LIMK2a ou LIMK2b (Figura 1b). Observamos uma faixa de LIMK2-1 endógena em células de HEK transfected com as versões HA-etiquetadas das isoformas LIMK2 (indicadas por uma seta no borrão anti-PP1i; Figura 1b). Em segundo lugar, verificou-se se o sinal induzido pelo anticorpo PP1i foi específico para LIMK2-1 usando siRNA visando as três variantes emaladas de LIMK2 (Figura 1C). Na presença de LIMK2 siRNA, observou-se uma diminuição reprodutível e significativa da faixa de interesse (indicada por uma seta na Figura 1C) em relação às condições de controle, sugerindo que o anticorpo é específico para o LIMK2-1. Depois disto, nós usamos o anticorpo PP1i para detectar LIMK2-1 em extratos diferentes da linha celular: HEK-293 (pilhas Embryonic humanas do rim), HeLa (pilhas epithelial humanas do colo do útero), e C6 (pilhas do cérebro glial do rato). Estas células são interrompidas no tampão de Lise contendo 1% de Triton X-100. Usando-se na análise do silico, LIMK2-1 foi mostrado para ser Hominidae primata-específico19. A análise de Western blot usando o anticorpo PP1i mostrou que LIMK2-1 pareceu ser expressado em HEK-293 e em HeLa mas não em linhas de célula C6 como esperado dos estudos do silico (Figura 1D). Estes experimentos foram repetidos com vários tecidos humanos, mostrando que os níveis de proteína LIMK2-1 variaram dependendo do tecido: os níveis mais elevados foram encontrados no fígado, menores níveis no pâncreas, e o mais baixo no Tests e pulmão. LIMK2-1 não foi detectável no tecido cerebral (Figura 1e). Observamos bandas de menor peso molecular em todas as amostras de tecido, exceto fígado, sugerindo a degradação da proteína completa provavelmente devido às condições de Lise dessas amostras comerciais (este tampão de Lise contém um coquetel de inibidores não especificados no folha de dados, que pode ser menos eficiente do que os numerosos inibidores de protease e fosfatase que estamos usando em nosso tampão Home-Made). Estes dados mostram que a proteína LIMK2-1 humana é sintetizada e expressa diferentemente nos tecidos testados.

LIMK2-1 interage com a sua quinase ascendente ROCK
Os homologs LIMK2-1, os LIMK2a e os LIMK2b, foram descritos como regulado pela quinase ascendente rocha. Nós avaliamos a interação de LIMK2-1 com o ROCK usando experimentos de coimunoprecipitação. As pilhas de HEK foram cotransfected com os vetores que codificam cMyc-etiquetaram ROCK1 e qualquer um da versão HA-etiquetada de isoforms LIMK2, ou a proteína HA-marcada não relacionada Larp6. Larp6 serve como um controle negativo, permitindo a detecção de interações não específicas. As células foram lisadas e a imunoprecipitação anti-HA foi realizada. Lisados (extratos de células inteiras) e imunoprecipitados foram analisados por Western blot, utilizando anticorpos anti-HA e anti-cMyc. Conforme representado na Figura 2 (painéis esquerdos; Lysates), cada uma das proteínas diferentes codificadas pelos vetores transfected é expressada bem. As três isoformas de LIMK2, bem como Larp6, são eficientemente imunoprecipitadas (Figura 2, painel inferior direito; Eluates). Nos eluatos, o ROCK é detectado e, portanto, coimunoprecipitado com as três isoformas de LIMK2, mas não com Larp6 (Figura 2, painel superior direito; Eluates). Isto demonstra que a rocha interage com as três isoformas de LIMK2, especial com o isoforma recentemente caracterizado LIMK2-1. Essa interação é específica, uma vez que o controle negativo (Larp6) não interage com o ROCK.

Neste documento, apresentamos dados para a imunoprecipitação realizada com anticorpos anti-HA; Entretanto, a interação pode ser testada na direção oposta por imunoprecipitando o ROCK com grânulos conjugados com anticorpos cMyc e analisando eluatos com anticorpos HA para detectar coimunoprecipitação de LIMK.

Atividade da quinase
Fosho-cofilina em células intactas
Os homólogos de LIMK2-1, LIMK2a e LIMK2b, foram mostrados à cofilina do fosforilar, um fator da despolimerização do actina, em seu Serine3. Usando um anticorpo especificamente visando o phospho-Serine3 da cofilina, estudamos a atividade da quinase LIMK2 medindo o nível de fosfocofilina endógena em células de HEK, superexpressando uma das isoformas LIMK2. As pilhas de HEK foram transfected com os vetores que codificam um dos isoforms LIMK2 HA-etiquetados, ou o vetor vazio correspondente como um controle negativo. As células foram lisadas, e os diferentes lisados foram analisados por western blotting usando o anticorpo antifosho-Serine3 cofilina. A superexpressão de LIMK2a e LIMK2b induziu um aumento significativo e reprodutível nos níveis de fosho-cofilina em relação às condições de controle, enquanto a presença de LIMK2-1 não teve efeito detectável (Figura 3, painel esquerdo).

Nós repetimos o mesmo experimento com uma versão em C-terminal YFP-Tagged (Yellow fluorescente protein) das três isoformas LIMK2 e uma versão não marcada do LIMK2-1 para descartar possíveis interferências pela tag N-terminal HA. Os resultados foram idênticos àqueles obtidos por meio de versões HA-Tagged das três isoformas (Figura 3, painel direito mostrando a versão marcada com o YFP). A eficiência do transfection foi avaliada para a versão de YFP-etiquetada de isoformas de LIMK usando a citometria do fluxo para governar para fora que este resultado pode ter sido devido à diferença da expressão da proteína. As três isoformas mostraram eficiência de transfecção semelhante: 54% para LIMK2-1, 49% para LIMK2b e 43% para LIMK2b.

Testes in vitro quinase
Em seguida, estudamos a atividade quinase das isoformas LIMK2 por rotulagem in vitro com γ [32P] ATP. A figura 4a mostra o esquema geral desta rotulagem in vitro. As pilhas de HEK foram transfected com qualquer uma das versões HA-etiquetadas das isoformas LIMK2 ou da proteína não relacionada, Larp6, que foi usada como um controle negativo. A atividade da quinase dos imunoprecipitados anti-HA foi mensurada com o uso de GST-cofilina recombinante como substrato na presença de γ [32P] ATP. HA-Immunoprecipitated Larp6 não mostrou nenhuma atividade da quinase no cofilin. Cofilina fosforilada LIMK2a e LIMK2b de HA-imunoprecipitada, enquanto LIMK2-1 não (Figura 4B). Obteve-se resultados semelhantes utilizando-se as versões com tag de YFP das três isoformas imunoprecipitadas com grânulos de GFP-Trap na presença de cofilina recombinante e de γ [32P] ATP (Figura 4D).

Nós testamos então se LIMK2-1 não teve nenhuma atividade da quinase ou se sua atividade no cofilina era danificada. Nós repetimos a experiência de rotulagem in vitro usando a proteína básica de myelin (MBP), uma carcaça eficiente para kinases numerosas da proteína, em vez do cofilin. Houve um alto sinal de fundo na condição de controle quando o ensaio foi realizado na presença de versões com tags HA: o controle negativo, HA-Immunoprecipitated Larp6, produziu um forte sinal de MBP fosforilado, embora não seja uma quinase ( Figura 4C). Nós superamos esse problema usando a versão do YFP-Tagged dessas proteínas. Nessas condições, o background no controle (YFP isoladamente) foi baixo, permitindo a realização de estudos mais específicos. GFP-prendido YFP-LIMK2a, LIMK2b, e LIMK2-1 mostraram a atividade da quinase para MBP, embora a atividade de LIMK2-1 fosse mais baixa (Figura 4D). Entretanto, LIMK2-1 era também menos eficientemente Immunoprecipitated estas circunstâncias (Veja o azul brilhante de Coomassie (CBB) que mancha e western blotting). Assim, as três isoformas mostraram atividade comparável na Pam quando a fosho-Pam foi normalizada para níveis de LIMK2 imunoprecipitados por coloração de CBB (Figura 4D, painel inferior). Os imunoprecipitados também foram analisados por Western blot utilizando anticorpos anti-ROCK para verificar se a atividade na Pam poderia ser devida à presença de ROCK, que teria sido coimunoprecipitada com LIMK2s. Não foi possível detectar qualquer sinal de ROCK em imunoprecipitados LIMK2. Assim fosforilação MBP não é devido ao ROCK, mas a LIMK2s por si.

Globalmente, esses dados mostram que LIMK2a e LIMK2b têm atividades semelhantes em cofilina e MBP. Embora LIMK2-1 mostre a atividade da quinase para MBP comparável àquela das outras duas isoformas, o cofilina não é um bom substrato para ele.

Figure 1
Figura 1: evidência para a existência da proteína LIMK2-1. (A) diagrama esquemático das três isoformas de LIMK2. As isoformas LIMK2 são descritas em Entrez gene: LIMK2-1 (NP_ 001026971.1), LIMK2a (NP_ 005560.1), LIMK2b (NP_ 057952.1). Os vários domínios do LIMK2 são mostrados: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM ' (domínio LIM mais curto), PDZ (PSD95, Dlg1, zo-1), S/P (rico em serina prolina), quinase ' (domínio da quinase mais curta) e PP1i (inibidor da proteína fosfatase 1). A seqüência escolhida para o projeto do anticorpo PP1i é mostrada no vermelho. (B e C) Validação do anticorpo anti-LIMK2-1. (B) as células HEK-293 foram transfectadas com LIMK2-1 (PCMV-LIMK2-1) não marcadas ou uma das isoformas com tags ha de LIMK2. Os lisados foram analisados por western blotting utilizando os anticorpos indicados. (C) as células HEK-293 foram transfectadas com LIMK2 siRNA ou controle de siRNA. Os lisados foram analisados por Western Blot. LIMK2-1 é expresso em várias linhas de células humanas (D) e tecidos (e). As células HEK-293, HeLa e C6 foram interrompidas em 1% de tampão de lise de Triton-X100. Os extratos teciduais foram adquiridos e as amostras foram analisadas por western blotting. Este número foi modificado de Vallee et al., The bioquímica Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: As três isoformas de LIMK2 interagem com ROCK1. As células HEK-293 foram cotransfectadas com ROCK1 com a tag cMyc e uma das três isoformas LIMK2 com tags HA (2-1, 2a, 2B) ou a proteína não relacionada, Larp6. Os imunoprecipitados de lysates e anti-HA foram submetidos a western blotting. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: LIMK2-1 não tem atividade quinase em relação à cofilina em células intactas. As pilhas de HEK-293 foram transfected com qualquer um dos três isoformas LIMK2 HA-etiquetados (1, 2a, 2B) ou o vetor parental vazio, pcDNA3 (painel esquerdo), ou com um dos três isoformas do YFP-etiquetado LIMK2 ou YFP sozinho (painel direito). Os lisados foram submetidos a western blotting. A quantificação da razão de fosho-cofilina versus cofilina é mostrada no gráfico à direita. O phospho-cofilina contra a relação do cofilina de pilhas transfected mock foi normalizado a 100. Cada valor representa a média ± SE de três experimentos independentes. Este número foi modificado de Vallee et al., The bioquímica Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
A Figura 4: LIMK2-1 não tem atividade de quinase in vitro em relação à cofilina, embora fosforilatos MBP. (A) esquema geral da rotulagem de γ [32P] ATP in vitro. (B) LIMK2-1 não foscopilato de cofilina in vitro. As pilhas de HEK-293 foram transfected com qualquer um dos três isoformas LIMK2 HA-etiquetados (2-1, 2a, 2B) ou uma proteína HA-etiquetada não relacionada, Larp6, como um controle negativo. As proteínas imunoprecipitadas anti-HA e o GST-cofilin foram utilizados no ensaio quinase. Os imunoprecipitados anti-HA também foram submetidos a imunoblotting anti-HA e coloração azul Coomassie. (C) a imunoprecipitação ha-etiquetada tem um sinal forte do fundo quando MBP é usado como um substrato. As pilhas de HEK-293 foram transfected com qualquer um dos três isoformas LIMK2 HA-etiquetados (2-1, 2a, 2B) ou uma proteína HA-etiquetada não relacionada, Larp6, como um controle negativo. As proteínas imunoprecipitadas anti-HA e MBP foram utilizadas no ensaio quinase. Os imunoprecipitados anti-HA também foram submetidos a imunoblotting anti-HA e coloração azul Coomassie. (D) as três ISOFORMAS LIMK2 têm atividade quinase em relação à proteína básica de MYELIN (MBP). As células HEK-293 foram transfectadas com uma das três isoformas com tags LIMK2 (2-1, 2a, 2B) ou YFP isoladamente. As isoformas imunoprecipitadas LIMK2 e a cofilina ou MBP foram utilizadas no ensaio de quinase. Os imunoprecipitados anti-GFP também foram submetidos a imunoblotting anti-GFP e coloração azul Coomassie. A quantificação do phospho-cofilin e do phospho-MBP é mostrada no gráfico inferior. Os níveis de fosho-cofilina obtidos com o anti-GFP imunoprecipitado LIMK2a foram normalizados para 100. Cada valor representa a média ± SE de três experimentos independentes. Este número foi modificado de Vallee et al., The bioquímica Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste documento, utilizamos ferramentas bioquímicas robustas para caracterizar no nível molecular uma nova proteína, LIMK2-1, que se acredita ser uma quinase baseada em sua seqüência e em seus homologs, LIMK2a e LIMK2b20.

Primeiramente, nós Demonstramos a existência de LIMK2-1 no nível da proteína usando a análise ocidental do borrão com um anticorpo específico. Em seguida, avaliamos sua interação com a quinase upstream ROCK1, que é conhecida por regular LIMK2a e LIMK2b, os homólogos de LIMK2-1. Finalmente, nós avaliamos a atividade potencial da quinase de LIMK2-1 completamente in vitro γ [32P] rotulagem do ATP e no Cellulo por Western blot usando um phospho-anticorpo específico.

Composição do tampão de Lise
Ao estudar proteínas, a fim de analisá-los por Western blot, é necessário um cuidado especial em relação à composição do tampão de Lise. Vários parâmetros devem ser considerados: (i) tipo de detergente e concentração21, e (II) inibidores da protease.

A composição do tampão do lysis deve ser adaptada à proteína do alvo para facilitar sua solubilização próxima completa a fim extraí-la tanto quanto possível e permitir sua deteção por Western Blot. Para proteínas solúveis, as condições leves (por exemplo, um detergente neutro em baixa concentração) são muitas vezes suficientes para conseguir isso. Para proteínas de membrana, as condições mais fortes geralmente são necessárias. Existem diferentes categorias de detergentes: (i) iônico, como o dodecilo sulfato de sódio (SDS), brometo de cetyltrimetilamônio (CTAB), (II) não-iônico, como polietileno glicol, éter hexilílico (BRIJ), Triton, Octylglucosídeo (OG), Dodecilmaltosídeo III) zwitteriônico como 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (Chaps) ou zwittergents. Os detergentes fortes podem interromper interações e os complexos podem ser perdidos. Além disso, para experimentos de imunoprecipitação, os anticorpos podem ser sensíveis a condições severas. Da mesma forma, a atividade enzimática pode ser perturbada pela presença de detergentes que podem desdobrar-se ou desnaturam a proteína estudada. Tanto o tipo como a quantidade do detergente utilizado podem afetar as propriedades e a atividade de uma proteína. Para algumas proteínas, uma gama muito restrita de concentração de detergente é tolerada para preservar a atividade da proteína. Abaixo desta escala a proteína permanece insolúvel visto que acima desta escala da concentração, a proteína é já não ativa.

Os inibidores da protease devem ser adicionados ao tampão de Lise para evitar a degradação da proteína alvo por proteases endógenas. Os cocktails de inibidores da protease estão disponíveis comercialmente. Eles podem ser usados como um ponto de partida de um estudo. Se forem encontrados problemas, pode-se considerar o uso de uma mistura de inibidores extemporariamente preparados a partir de soluções de estoque armazenadas a-20 ° c. Estes inibidores devem visar proteases de serina e cisteína. PMSF (fluoreto de Fenilmetilsulfonyl) é comumente usado, no entanto, é muito instável em solução aquosa e deve ser adicionado pouco antes da extração. As metaloproteases também devem ser inibidas: os reagentes quelantes metálicos, como o EDTA (ácido Etilenedinitrilotetraacético) ou o EGTA (etileno glicol-bis (2-aminoetilether)-ácido tetraacético), que se ligam a mg2 +, são utilizados nesta finalidade. Para manter a proteína em sua forma fosforilada e assim ativada, também é recomendável adicionar inibidores da fosfatase ao tampão de Lise. Esses inibidores devem direcionar fosfatases alcalinas, de ácido, serina, treonina e tirosina. Trabalhar a baixa temperatura (4 ° c) é recomendado igualmente a fim retardar a taxa de proteolysis.

Proteínas alvo
Nisto, nós focamos em proteínas epítopo-etiquetadas. Os Tag (bandeira, ha, CMYC, GFP, etc.) são muito úteis a fim detectar e purificar proteínas, porque os anticorpos e os grânulos acoplados anticorpo estão comercialmente disponíveis e são materiais prontamente reprodutíveis. No entanto, o tamanho e a posição da tag devem ser considerados, pois isso pode afetar a atividade, localização ou função da proteína alvo6,7,8. Também é possível trabalhar com proteínas endógenas. Neste caso, devem ser utilizados anticorpos destinados a esta proteína em particular. Podem ser acoplados aos grânulos (proteína A ou proteína G) covalentemente (cruz-ligação) ou ser incubadas com o lisado e então com os grânulos. Ao trabalhar com proteínas marcadas, cujo gene é expresso em um plasmídeo, é fácil mudar para uma versão mutada desta proteína por mutagenese do gene. Em seguida, é possível trabalhar em diferentes mutantes para avaliar as funções biológicas.

Imunoprecipitação
A imunoprecipitação é uma técnica muito poderosa para isolar os parceiros da proteína-alvo5. A composição do tampão de lise (especialmente detergente) tem de ser cuidadosamente estabelecida para preservar as interações (ver acima). É possível detectar a interação entre duas proteínas identificadas. Pode ser proteínas endógenas ou proteínas sobreexpressas. Quando as proteínas são expressas em baixa abundância, pode ser necessário overexpressá-los, a fim de ter sinais mais fortes. As lavas extensivas de grânulos Immunoprecipitated são exigidas para remover as proteínas não-especificamente de interação ou os contaminadores. Antes de determinar a eficiência da imunoprecipitação ou a presença de parceiro coimunoprecipitado, é importante verificar se os diferentes parceiros estão bem expressos e presentes no lisado analisando o lisado de células inteiras ou a fração de entrada por Western Borrão. Além disso, usando experimentos de imunoprecipitação, também é possível identificar novos parceiros de uma proteína alvo e isolar novos complexos. Estes novos parceiros podem ser identificados por espectrometria de massas.

Esses parceiros podem desempenhar um papel importante como ativadores da proteína alvo, permitindo a sua plena atividade para novos testes biológicos. Por outro lado, proteínas não desejadas copurificadas podem ser usadas como um argumento de que não há interação direta entre dois parceiros identificados, mas, em vez disso, a interação detectada pela coimunoprecipitação é devida a outro parceiro desconhecido. Neste caso específico, para ter certeza de uma interação direta, outro dispositivo experimental é necessário, como trabalhar em proteínas de mamíferos purificadas de bactérias.

Atividade da quinase
A atividade da quinase pode ser avaliada por diferentes técnicas. Nisto, nós focamos na análise in vitro pela rotulagem do ATP de γ [32P] e na análise inteira do extrato da pilha por Western blot usando um phospho-anticorpo específico. γ [32P] a rotulagem do ATP é uma técnica muito sensível e quantitativa permitindo a deteção da atividade fraca15da quinase. A incorporação da radioatividade do ATP ao substrato alvo permite uma medida direta da atividade enzimática a ser feita. É possível trabalhar com diferentes substratos para avaliar a atividade quinase da proteína estudada em diferentes alvos. Também é possível identificar aminoácidos cruciais para a atividade da quinase, mutando-os quando a proteína é superexpressa. A atividade da quinase exige um cátion divalente tal como o magnésio2 +, que tem que estar atual no amortecedor da quinase.

A principal desvantagem desta abordagem é o manuseio da radioatividade, que requer instalações dedicadas para experimentos e para a coleta de resíduos. Existem métodos alternativos, como kits fluorescentes ou luminescentes que detectam subprodutos da reação, como a ADP (difosfato de adenosina)16. A fosforilação protéica também pode ser estudada por espectrometria de massas, porém, uma quantidade maior de materiais é necessária para essas análises. Em nosso caso, nós tentamos avaliar a atividade da quinase LIMK2 usando a electroforese capilar para aumentar nossa eficiência mas esta era infelizmente mal sucedida.

Os anticorpos fosfoespecíficos são uma ferramenta adicional para estudar a fosforilação de uma proteína. Os anticorpos gerais largos do serine e do tyrosine do anti-phospho existem, capazes de reconhecer o phospho-ser ou o phospho-Tyr de todas as proteínas. Nos últimos anos, os anticorpos que visam um phospho-local específico de uma proteína-alvo têm sido amplamente desenvolvidos e, geralmente, eles reconhecem tanto o grupo fosho e os aminoácidos circundantes. O cuidado especial é necessário ao começar trabalhar com tais anticorpos, porque sua especificidade deve ser verific por exemplo com um controle negativo, tal como a proteína do alvo mutado no local do phospho. Ao sondar uma mancha com um anticorpo antifosfoso, a solução de bloqueio não deve ser leite, pois contém fosfocproteínas que podem interagir com o anticorpo. A albumina sérica bovina (BSA) é recomendada, e os inibidores da fosfatase podem ser adicionados na solução de bloqueio para evitar a liberação de fosfato. As amostras não devem ser congeladas e descongelados, mas sim preparadas como alíquotas que são mantidas a-80 ° c. Na verdade, as modificações de fosho são labile.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por la Ligue contre le Cancer, L' Association neurofibromatoses et Recklinghausen, e la Région Centre Val de Loire. Muito obrigado a Aurélie Cosson e Déborah casas para dados de citometria de fluxo, e a Keyron Hickman-Lewis para revisão minuciosa do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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