단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Biochemistry

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Summary

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

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Abstract

화학 및 바이오 컨쥬게이션 기술은 최근 몇 년 동안 급속히 개발되어 단백질 폴리머의 구축을 허용하고 있습니다. 그러나, 제어 된 단백질 중합 과정은 항상 도전이다. 여기에서, 우리는 합리적으로 통제된 순서에 있는 단계별로 중합된 단백질을 건설하기 위한 효소 방법론을 개발했습니다. 이 방법에서, 단백질 단면제의 C-말단은 OaAEP1(Oldenlandiaaffinis asparaginis asparaginyl endopeptidases)을사용하여 단백질 컨쥬게이션을 위한 NGL인 반면, N-말단은 클레이브 가능한 TEV(담배 에칭 바이러스) 분열 부위와 L(ENLYFQ/GL)을 임시 N-단말 보호를 위한 것이다. 결과적으로, OaAEP1은 한 번에 하나의 단백질 단량체만 을 첨가할 수 있었고, 그 후 TEV 프로테아제는Nh 2-Gly-Leu를 노출시키기 위해 Q와 G 사이의 N-종단을 갈라졌다. 그런 다음 장치는 다음 OaAEP1 결찰에 대한 준비가 됩니다. 엔지니어링 된 다단백질은 원자력 현미경 검사법 기반 단일 분자 힘 분광학 (AFM-SMFS)을 사용하여 개별 단백질 도메인을 전개하여 검사됩니다. 따라서, 이 연구는 다단백질 공학 및 고정화를 위한 유용한 전략을 제공한다.

Introduction

합성 중합체에 비해, 천연 다중 도메인 단백질은 잘 제어 된 수와 하위 도메인1의유형과 균일 한 구조를 갖는다. 이 기능은 일반적으로 향상된 생물학적 기능 및 안정성2,3을이끈다. 시스테인 계이황화 결합 결합 및 재조합 DNA 기술과 같은 많은 접근법은, 다중 도메인4,5,6,7과같은 중합 단백질을 구축하기 위해 개발되었다. 그러나, 전자 방법은 항상 무작위 및 통제되지 않는 서열을 초래하고, 후자의 방법은 독성 및 대형 단백질의 과발현어려움 및 보조 인자 및 기타 섬세한 효소로 복잡한 단백질의 정제를 포함한 다른 문제를 초래한다.

이러한 과제를 충족시키기 위해, 우리는 프로테아제 TEV8,9와결합된 단백질 리가세 OaAEP1을 사용하여 단계적으로 폴리머/폴리단백질에 대한 단백질 단량체를 결합하는 효소 방법을 개발합니다. OaAEP1은 엄격하 고 효율적인 엔도 펩 티 다아제. 2개의 단백질은 N-종단이 글리-루 잔기(GL)이고 다른 하나는 C-종단이 NGL 잔기10인경우 30분 이내에 OaAEP1에 의해 2개의 테르미니를 통해 Asn-Gly-Leu 서열(NGL)으로 공유적으로 연결될 수 있다. 그러나, OaAEP1의 사용은 단백질 단량체를 연결하는 것만이 시스테인 계 커플링 방법과 같은 조절되지 않은 서열을 가진 단백질 중합체로 이끈다. 따라서, 우리는 ENLYFQ/G-L-POI로 착유류 잔류물을 더한 탈착식 TEV 프로테아제 부위를 가진 단백질 단위의 N-종단을 디자인합니다. TEV 분열 전에, N-단말은 OaAEP1 결찰에 참여하지 않을 것이다. 그리고 추가 OaAEP1 결찰과 호환되는 N-종점의 GL 잔기는 TEV 절단 후에 노출됩니다. 따라서, 우리는 비교적 잘 조절된 서열을 가진 다단백질의 순차적 효소 생합성 방법을 달성하였다.

여기서, 우리의 단계적 효소 합성 방법은 서열 조절 및 조절되지 않는, 단일 분자 연구를 위한 단백질 고정화를 포함하여 다단백질 샘플 준비에 사용될 수 있으며, 특히 같은 복잡한 시스템에 대해서도 금속 단백질.

더욱이, AFM 기반 SMFS 실험을 통해 단일 분자 수준에서 단백질 중합체 구조 및 안정성을 확인할 수 있습니다. AFM, 광학 핀계 및 자기 트위저를 포함한 단일 분자 힘 분광법은 생체 분자를 기계적으로 조작하고 안정성을 측정하는 나노 기술의 일반적인 도구입니다11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. 단 하나 분자 AFM은 단백질 (un)접이식21,22,23,24,25,수용체 -리간드 상호 작용26,27,28,29,30,31,32,33,34, 34의연구에 널리 사용되어 왔다. 35,무기 화학 결합20,36,37,38,39,40,41 ,42,43 및 금속 리간드 결합 금속 단백질44,45,46,47,48,49,50 . 여기서, 단일 분자 AFM은 상응하는 단백질 전개 신호에 기초하여 합성된 다단백질 서열을 검증하는데 사용된다.

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Protocol

1. 단백질 생산

  1. 유전자 클론
    1. 관심 있는 단백질(POI)을 코딩하는 유전자를 구매하는 유전자: 유비퀴틴, 루브루독신(RD)51,셀룰로오스 결합 모듈(CBM), 도커린-X 도메인(XDoc) 및 루미노크코커스 플라베파시에서응집성,담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELPs).
    2. 중합효소 연쇄 반응을 수행하고 상이한 단백질 단편으로부터 유전자를 재조합하기 위한 3제한 소화 효소 시스템 BamHI-BglII-KpnI를 사용한다.
    3. 직접 DNA 시퀀싱으로 모든 유전자를 확인합니다.
  2. 단백질 발현 및 생산
    1. PQE80L-POI 또는 pET28a-POI 플라스미드로 대장균 BL21(DE3)을 변환하여 발현합니다.
    2. 각 항생제 (예를 들어, 100 μg / mL 암피실린 나트륨 소금 또는 50 μg / mL, 카나마이신)와 함께 LB 배지의 15 mL로 하나의 단일 식민지를 선택합니다. 16-20 시간 동안 37 °C에서 200 rpm에서 배양물을 계속 흔들어.
    3. 하룻밤 배양액을 LB 배지 800 mL(1:50 희석)로 희석한다. 루브레독신의 경우, 1,800 x g에서배양을 원심 분리한 다음 M9 배지 15 mL에서 다시 일시 중단하십시오 (0.4 % 포도당, 0.1 mM CaCl2,2 mM MgSO4로보충), 다음 M9 배지의 800 mL로 희석하십시오.
    4. 배양이 0.6의 600 nm (OD600)에서광학 밀도에 도달 할 때까지, 200 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 배양. 단백질 발현 시험을 위한 사전 유도 제어로서 배양물의 100 μL 샘플을 저장한다.
    5. IPTG를 1 mM의 최종 농도에 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 200 rpm에서 4 시간 동안 37°C에서 배양을 흔든다. 단백질 발현 시험을 위한 유도 후 제어로서 배양물의 100 μL 샘플을 예약하였다.
    6. 배양물을 4°C에서 25분 동안 13,000 x g에서 배양하고 정제 전에 -80°C에서 보관한다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
  3. 관심 있는 단백질의 정제
    1. 용해 완충액 25 mL (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 함유 DNase, RNase, PMSF)에서 세포를 다시 중단하고 초음파 처리기 (15 % 진폭)를 사용하여 얼음에 30 분 동안 용해시하십시오.
    2. 4°C에서 40분 동안 19,000 x g에서 세포 용해를 명확히 합니다.
    3. Co-NTA 또는 Ni-NTA 친화성 컬럼의 1 mL(침대 볼륨)을 포장하고 10개의 컬럼 볼륨(CV)의 초순수와 10개의 CV(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazole, pH 7.4)의 중력 흐름으로 열을 세척합니다.
    4. 중력 흐름에 의해 컬럼을 통해 서상단백질을 3회 전달한다.
    5. 50개의 CV로 컬럼에 세척 버퍼를 부어 오염 단백질을 멀리 합니다.
    6. 얼음 차가운 용출 완충제 (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 7.4)의 3 CV로 결합 된 단백질을 용출하십시오. 루브레독신 단백질에 관해서, 4°C에서 pH 8.5에서 음이온 교환 컬럼을 이용한 음이온 교환 정제가 더 필요하다.
    7. 샘플을 SDS-PAGE로 분석합니다.

2. 커버 슬립 및 캔틸레버 표면의 기능화

  1. 기능화된 커버슬립 표면 준비
    1. 40 mL의 초순수에 크롬산 칼륨 20 g을 녹입니다. 360 mL의 농축 황산을 유리 막대로 칼륨 크롬산용액에 천천히 넣고 부드럽게 저어 염색산을 준비합니다.
      주의: 여기에 사용되는 화학 물질과 최종 크롬산은 부식성이 강하고 산성입니다. 적절한 보호 장비로 작업하십시오. 이 용액은 농축 된 황산을 첨가 할 때 열을 방출하므로 천천히 추가하고 냉각을위한 적절한 일시 정지를 의미합니다.
    2. 크롬산 처리로 80°C에서 30분 동안 유리 커버슬립을 세척하고 활성화합니다. 커버슬립을 1% (v/v) APTES 톨루엔 용액으로 실온에서 1시간 동안 완전히 담그면서 빛으로부터 보호합니다.
    3. 톨루엔과 절대 에틸 알코올로 커버 슬립을 세척하고 질소 스트림으로 커버 슬립을 건조.
    4. 커버슬립을 80°C에서 15분간 인큐베이션한 다음 실온으로 식힙니다.
    5. 2개의 고정화 커버슬립 사이에 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용액에 200 μL의 설포-SMCC(1 mg/mL)를 넣고 빛으로부터 보호된 1시간 동안 배양합니다.
    6. 커버슬립을 DMSO로 먼저 씻은 다음 절대 에틸 알코올로 세척하여 잔류 설포-SMCC를 제거합니다.
    7. 질소 스트림에서 커버 슬립을 건조.
    8. 200 μM GL-ELP50nm-C단백질 용액의 파이펫 60 μL을 기능화된 커버슬립 상에 상하여 약 3시간 동안 배양한다.
    9. 미반응 GL-ELP50nm-C를 제거하기 위해 초순수로 커버슬립을 세척합니다.
      참고: 기능화된 커버립은 4°C에서 약 2주 간 보관할 수 있습니다.
  2. 기능화된 캔틸레버 표면 준비
    1. 혈장 산 처리로 캔틸레버를 80 °C에서 10 분 동안 청소하십시오.
    2. 1% (v/v) APTES 톨루엔 용액으로 아미노 실란화로 캔틸레버를 기능화한 다음 설포-SMCC에 활용하기 전에 캔틸레버를 80°C에서 15분 동안 굽습니다.
    3. C-ELP50nm-NGL을1.5시간 동안 설포-SMCC의 말미미드 그룹과 표면에 연결한다.
    4. 초순수로 커버슬립에 반응되지 않은 C-ELP50nm-NGL을씻어내주세요.
    5. 20-30 분 동안 25 °C에서 200 nM OaAEP1을 함유한 50 μM GL-CBM-XDoc 단백질 용액의 200 μL에 기능화된 캔틸레버를 담급전시. 그런 다음 AFM 완충액(100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4)을 사용하여 미반응 단백질을 씻어내도록 하였다.
      참고: 캔틸레버와 커버슬립의 표면 화학은 비슷합니다.

3. 통제된 순서를 가진 단계별 다단백질 준비

  1. 결찰부 Coh-tev-L-POI-NGL을 OaAEP1에 의해 커버슬립 표면에 고정된 GL-ELP50nm에 30분 동안 연결합니다.
  2. 15-20 mL의 AFM 버퍼 (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4)를 사용하여 미반응 단백질을 씻어 내보소소하십시오.
  3. TEV 프로테아제 100 μL(0.5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] 글리세롤, pH 8.0)을 추가하여 25°C에서 1시간 동안 TEV 인식 부위에서 단백질 유닛을 갈라주세요.
  4. 15-20 mL의 AFM 버퍼를 사용하여 잔류 단백질을 씻어 내보하십시오.
  5. 결찰부 Coh-tev-L-POI-NGL을 OaAEP1에 의해 GL-Ub-NGL-유리에 30분 동안 연결합니다.
  6. 3.3 ~ 3.5 N-1번 단계를 반복하여 유리표면에 GL-(Ub) n-NGL을 구성하는 단백질을 생성한다. Coh-tev-L-(Ub) n-NGL-Glass로서 단백질-폴리머에 응집력을예비하기 위해 마지막 TEV 절단 반응을 생략한다.

4. AFM 실험 측정 및 데이터 분석

  1. AFM 측정
    1. 10 mM CaCl2 및 5 mM 아스코르브 산으로 챔버에 AFM 버퍼 1 mL을 추가합니다.
    2. 실험을 위해 기능화된 AFM 프로브의 D 팁을 선택합니다. 각 실험 전에 정확한 스프링상수(k)값으로 AFM 버퍼의 캔틸레버를 교정하기 위해 평칸파티션 정리를 사용합니다.
    3. 캔틸레버 팁을 샘플 표면에 부착하여 응집력/도커린 쌍을 형성합니다.
    4. 표면에서 400nm·s-1의 일정한 속도로 캔틸레버를 후퇴시. 그 동안 4000Hz의 샘플 속도로 힘 확장 곡선을 기록합니다.
  2. 데이터 분석
    1. JPK 데이터 처리 선택 강제 확장 추적을 사용합니다.
    2. 소프트웨어를 사용하여 추적을 분석합니다. 폴리머 탄성의 웜 유사 사슬(WLC) 모델로 곡선을 맞추고 개별 단백질 전개 피크에 대해 전개력과 윤곽 길이 증분을 얻습니다.
    3. 가우시안 모델과 전개력의 히스토그램을 맞추어 전개력(&Fu>)과 윤곽 길이 증분(&ΔLc>)의 가장 가능한 값을 얻습니다.

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Representative Results

OaAEP1 결찰에 의해 인접한 단백질 사이에 도입된 NGL 잔기는 전개력(&F u>)및 윤곽 길이 증분(&ΔL c>)으로서 중합체의 단백질 단량체 안정성에 영향을 미치지 않을 것이며(<ΔL c>)는 이전 연구와 비교할 수 있다(그림1). 루브레독신 단백질의 정제 결과는 도 2에나타내고 있다. TEV 절단 후 단백질을 증명하기 위해 제어 서열과 함께 단백질 중합체를 구성하기 위해 다음OaEP1 결찰과 호환되고 시공은 고효율이며, 도 3은 참조로서 SDS-PAGE 이미지를 제공한다. 기능화된 캔틸레버 및 커버슬립 제제의 단계는 도 4에설명되어 있다. 표지 슬립에 대한 효소 생합성 및 폴리단백질의 고정은 도 5에나타내고 있다. 이 프로토콜을 사용하여, 조절된 서열을 가진 단백질 중합체가 AFM 기반 SMFS 실험에 적합하고 구축될 수 있다.

Figure 1
그림 1: OaAEP1에 의해 만들어진 다단백질의 AFM 기반 SMFS 측정. (A)Ub의 전형적인 톱니와 같은 힘 연장 곡선(파란색의 곡선 1)은 ~23 nm의 예상 ΔLc로 나타내졌습니다. (B)산란플롯은 Ub 전개력(202±44 pN, 평균 ±s.d., n=198) 및 ΔLc(23±2 nm, 평균 ±s.d.) 사이의 관계를 제시한다. 이 그림은 Ref.8에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL 및 GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL의 UV-Vis 흡광도 스펙트럼. Fe(III)-형태 Rd(왼쪽 스펙트럼, 갈색, PDB 코드:1BRF)는 495 nm 및 579 nm에서 전형적인 UV-Vis 흡수 피크를 제시했으며 Zn 형태는 그렇지 않았다(오른쪽 스펙트럼, 와인, PDB 코드: 1IRN). 이 그림은 Ref.8에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: Ub 이량체를 구축하기 위해 TEV 프로테아제 및 OaAEP1을 사용하여 단계적으로 소화 및 결찰의 SDS-PAGE 겔 결과. 레인 1-4는 Coh-tev-L-Ub, TEV 분열, 순수 sfGFP-TEV 프로테아제 및 정제 산물(GL-Ub)의 결과 단백질 혼합물을 나타내보였다. 레인 5-7은 (레인 5) 또는 (레인 6) OaAEP1 및 순수한 OaAEP1과 함께 (레인 5) 및 코테브-L-Ub-NGL 결찰 혼합물을 절단된 GL-Ub 및 코테브-L-NGL 결찰 혼합물을 나타내었습니다. 이 그림은 Ref.8에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 유리 커버슬립과 캔틸레버를 기능화하기 위한 각 단계를 설명하는 프로세스 차트. 크로믹산에 의한 세척 및 활성화 후, 커버슬립 및 캔틸레버는 GL-ELP 50nm-C가 커버슬립과 결합하는 마지막 단계를 제외하고, C-ELP50nm-NGL이캔틸레버와 결합하는 마지막 단계를 제외하고는 유사한 기능화 과정을 공유한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 표면의 다단백질 고정화를 위한 각 단계를 설명하는 공정 차트. 왼쪽 위 공정 흐름 다이어그램은 커버슬립에 제어된 서열을 가진 다단백질의 단계별 구축을 보여줍니다. 오른쪽 상단 다이어그램은 AFM 측정에 사용되는 기능화 캔틸레버의 제조를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: AFM 기반 SMFS에 의해 합리적으로 제어된 서열을 가진 단백질 중합체의 전형적인 전개 흔적. (A)Ub의 전형적인 톱니와 같은 힘 연장 곡선은 예상대로 ~ 23 nm의 ΔLc를 제시했다. (B)Rd의 전형적인 힘 연장 곡선은 예상대로 ~ 13 nm의 ΔLc를 제시했다. (C)청색 피크가 Ub의 전개 이벤트를 의미하는 (Ub-Rd)n 단백질 혼합물의 전형적인 힘 연장 곡선은 적색이 Rd를 의미한다. 이 그림은 Ref.8에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
보충 도 1: SDS-PAGE 겔은 두 반응물 사이의 상이한 비율하에서 단백질 결찰 효율을 초래한다. 결찰 효율은 비율이 1 대 1일 때 20%였고 10 대 1의 비율로 75%에 도달하였다. 이 그림은 Ref.8에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 효소 생합성 및 다단백질의 고정화를 위한 프로토콜을 기술하고 AFM 기지를 둔 SMFS에 의하여 polyprotein 디자인을 확인했습니다. 이 방법론은 폴리 단백질 공학 및 고정4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61을위한 이전 방법을 보완하는 설계 된 서열로 단백질 폴리머를 구축하는 새로운 접근 법을 제공합니다.

다단백질 시공7,62,소형 단백질 단량체 간의 결찰에 대한 우리의 방법베이스에 대한 고전적인 재조합 DNA 방법론과 비교. 따라서, 다단백질 시공을 위한 대형 또는 독성 단백질 분자의 발현을 허용한다. 부가적으로, 단백질 단량체의 정제를 컨쥬게이션하기 전에 허용한다.

단백질 중합을 위한 분자간 이황화 결합을 형성하는 널리 사용되는 이중 시스테인 방법과 비교하여4,OaAEP1 및 TEV 프로테아제를 모두 사용하는 효소 학적 방법은 상대적으로 제어 된 서열과 정의 된 연결 기하학을 가진 다단백질을 초래합니다. 그리고 그것은 시스테인을 사용 하지 않습니다., 많은 단백질에 대 한 필수 기능 잔류물은.

우리의 방법은 주로 sortase 계 단백질 이형59와유사합니다. 당사의 방법의 독특한 특징은 OaAEP1 기반 단백질 결찰이 훨씬 더 효율적이므로, 따라서 합리적인 수율10,53을가진 단백질 펜타머의 구성을 허용한다는 것입니다. 또한 결찰을 위해 더 적은 잔류물이 필요하며 더 짧은 3잔기 NGL 링커를 생성합니다. 그 결과, 새로 형성된 NGL 링커가 개별 단백질 단량체의 안정성에 영향을 미치지 않거나 임의의 부자연스러운 단백질-단백질 상호작용을 유도하지 않기 때문에 "링커 효과"를 나타내지 않는다. 그럼에도 불구하고, 우리는 모든 방법이 자신의 장점과 단점을 가지고 있다고 생각합니다. 예를 들어, 고전적인 재조합 DNA 방법은 단백질 단량체 사이에 임의의 잔류물을 첨가하지 않으며 결찰을 위한 임의의 효소의 사용을 필요로 하지 않는다. 그리고 이중 시스테인 방법은 단백질 중합을 위해 간단하고 용이하다. 따라서, 그들은 모두 다른 실험 요구 사항에서 유용 할 수 있습니다.

다단백질을 단계적으로 구성하려면 반응하지 않은 단백질을 완전히 제거하는 것이 중요합니다. AFM 버퍼의 충분한 볼륨과 반응 표면을 신중하게 청소하기에 충분한 시간을 가지고. 그렇지 않으면, 잔류 단백질 또는 프로테아제는 추가 합성 반응에 영향을 미칠 것이다.

OaAEP1 결찰의 효율은 TEV 절단 효율이 거의 완료됨에 따라 우리의 방법에 대한 중요한 한계입니다 (96%). 결찰 효율을 향상시키기 위해 두 반응물, GL 단백질 및 단백질-NGL 사이의 비율을 높이는 것이 중요합니다. 우리의 연구는 단백질-NGL이 GL 단백질에 10배일 때, 효율성이 20%에서 증가한다는 것을 보여줍니다 (비율은 1 에 1) 75%(보충그림 1). 자유 반응제가 버퍼로 세척하여 멀리 이동할 수 있기 때문에 표면에 고정된 반응물을 소비하는 것이 중요합니다. 부가적으로, N-또는 C-말미닌이 용액에 노출되는지 여부는 또한 결찰에 중요한 요소이다. 인식된 사이트를 포함하는 링커를 각 단말에 추가하여 단말에게 노출시키는 선택적 접근법이다.

결국, 우리의 프로토콜은 설계된 순서로 단백질을 융합하는 효소 적 방법입니다. 그것은 또한 단 하나 분자 연구 결과에 있는 결합 그리고 고정한 단백질 견본에 대한 대체 접근을 제공합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 21771103, 21977047), 장쑤성 자연 과학 재단 (그랜트 번호) . BK20160639) 및 장쑤성 황추앙 프로그램.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

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References

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