OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولًا لاقتران مونومر البروتين بواسطة الإنزيمات التي تشكل بروتين البوليمر مع تسلسل يتم التحكم فيه وشل حركته على السطح لإجراء دراسات مطياف قوة أحادية الجزيء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد تم تطوير تقنيات الشبهة الكيميائية والبيولوجية بسرعة في السنوات الأخيرة وتسمح ببناء البوليمرات البروتينية. ومع ذلك ، فإن عملية بلمرة البروتين التي تسيطر عليها هي دائما تحديا. هنا ، قمنا بتطوير منهجية أنزيمية لبناء البروتين المبلمر خطوة بخطوة في تسلسل يتم التحكم فيه بعقلانية. في هذه الطريقة، C-terminus من مونومر البروتين هو NGL لاقتران البروتين باستخدام OaAEP1(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases)1) في حين أن N-terminus كان TEV قابل للفك (فيروس التبغ حفر) موقع الانقسام بالإضافة إلى L (ENLYFQ/GL) لحماية N-المحطة الطرفية المؤقتة. وبالتالي، كان OaAEP1 قادرة على إضافة مونومر بروتين واحد فقط في وقت واحد، ومن ثم البروتياز TEVمتشبثة ن-تالتيموس بين س وG لفضح NH 2-Gly-Leu. ثم الوحدة جاهزة لربط OaAEP1 المقبل. يتم فحص البروتين متعدد البروتين المهندس من خلال مجال البروتين الفردي المتكشف باستخدام المجهر الذري القائم على النسخة الطيفية أحادية الجزيء (AFM-SMFS). لذلك ، توفر هذه الدراسة استراتيجية مفيدة لهندسة البروتين المتعدد والتجميد.

Introduction

بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية ، والبروتينات الطبيعية متعددة المجالات لديها بنية موحدة مع عدد وتسيطر عليها بشكل جيد ونوع من النطاقات الفرعية1. هذه الميزة عادة ما يؤدي إلى تحسين الوظيفة البيولوجية والاستقرار2،3. وقد تم تطوير العديد من النهج، مثل السيستين المستندة إلى اقتران السندات ثنائي كبريتيد وتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، لبناء مثل هذا البروتين المبلمرة مع مجالات متعددة7. ومع ذلك ، فإن الطريقة الأولى تؤدي دائمًا إلى تسلسل عشوائي وغير منضبط ، والأخيرة تؤدي إلى مشاكل أخرى ، بما في ذلك صعوبة التعبير المفرط للبروتينات السامة والكبيرة الحجم وتنقية البروتين المعقد مع العامل المساعد والإنزيمات الحساسة الأخرى.

لمواجهة هذا التحدي، ونحن تطوير طريقة الأنزيمية التي تترافق مونومر البروتين معا للبوليمر / البروتين المتعدد بطريقة تدريجية باستخدام بروتين ليغاز OaAEP1 جنبا إلى جنب مع TEV البروتياز8،9. OaAEP1 هو endopeptidase صارمة وفعالة. يمكن ربط بروتينين covalently كما Asn-Gly-Leu تسلسل (NGL) من خلال اثنين من التالتيني من قبل OaAEP1 في أقل من 30 دقيقة إذا كان N-terminus هو بقايا جلي ليو (GL) والآخر منها C-terminus هو مخلفات NGL10. ومع ذلك ، فإن استخدام OaAEP1 فقط لربط مونومر البروتين يؤدي إلى بروتين البوليمر مع تسلسل غير المنضبط مثل طريقة الاقتران القائمة على السيستين. لذلك ، نقوم بتصميم N-terminus لوحدة البروتين مع موقع بروتياز TEV قابل للإزالة بالإضافة إلى بقايا الليسين كـ ENLYFQ/G-L-POI. قبل انشقاق TEV، لن تشارك محطة N في ربط OaAEP1. ومن ثم يتم كشف بقايا GL في N-terminus ، والتي تتوافق مع ربط OaAEP1 ، بعد انشقاق TEV. وهكذا، حققنا طريقة التركيب الحيوي الأنزيمي متتابعة من البروتين المتعدد مع تسلسل تسيطر عليها بشكل جيد نسبيا.

هنا ، يمكن استخدام طريقة التوليف الأنزيمية خطوة بخطوة في إعداد عينة البروتين ، بما في ذلك تسلسل تسيطر عليها وغير المنضبط ، وتجميد البروتين للدراسات جزيء واحد كذلك ، وخاصة بالنسبة للنظام المعقد مثل metalloprotein.

وعلاوة على ذلك، تسمح لنا تجارب SMFS المستندة إلى AFM بتأكيد بناء البوليمر البروتيني واستقراره على مستوى الجزيء الواحد. الفئاب الطيفي أحادية الجزيء، بما في ذلك AFM، ملاقط بصرية وملاقط مغناطيسي، هو أداة عامة في تكنولوجيا النانو للتلاعب بالجزيء الحيوي ميكانيكيا وقياس استقرارها11،12،13،14،15،16،17،18،19،20. وقد استخدمت على نطاق واسع AFM جزيء واحد في دراسة البروتين (الأمم المتحدة) قابلة للطي21،22،23،24،25، وقياس قوة مستقبلات ليغاند التفاعل26،27،28،29،30،31،32،33،34 ،34، 35، السندات الكيميائية غير العضوية20،36،37،38،39،40،41،42،43والمعادن ligand السندات في metalloprotein44،45،46،47،48،49، 50 . هنا، يتم استخدام AFM جزيء واحد للتحقق من تسلسل البروتين متعدد البروتين توليفها على أساس إشارة البروتين تتكشف المقابلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنتاج البروتين

  1. استنساخ الجينات
    1. شراء الجينات الترميز للبروتين الفائدة (POI): Ubiquitin، Rubredoxin (RD)51،وحدة السليلوز ملزمة (CBM)، dockerin-X المجال (XDoc) والتماسك من فلافيلولاينس Ruminococcus،التبغ حفر فيروس (TEV) البروتياز، الإيلاستين مثل البولي ببتيدات (ELPs).
    2. أداء تفاعل البوليميراز واستخدام ثلاثة قيود نظام انزيم الهضم BamHI-BglII-Kpn I لإعادة دمج الجين من شظايا البروتين المختلفة.
    3. تأكيد جميع الجينات عن طريق تسلسل الحمض النووي المباشر.
  2. البروتينات التعبير والإنتاج
    1. تحويل E. القولونية BL21 (DE3) مع pQE80L-POI أو pET28a-POI plasmid للتعبير.
    2. اختر مستعمرة واحدة في 15 مل من متوسط LB مع المضادات الحيوية ذات الصلة (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام/مل أمبسيسيلين ملح الصوديوم أو 50 ميكروغرام/مل، كاناليسين). الحفاظ على هز الثقافات في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
    3. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى 800 مل من متوسط LB (1:50 تخفيف). لrubredoxin، الطرد المركزي الثقافة في 1800 × ز،ثم إعادة تعليق في 15 مل من M9 المتوسطة (تستكمل مع 0.4٪ الجلوكوز، 0.1 mM CaCl2 mM MgSO4)،ومن ثم تمييع ه إلى 800 مل من M9 المتوسطة.
    4. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية بينما تهتز عند 200 دورة في الدقيقة، حتى تصل الثقافة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD600)من 0.6. حفظ عينة 100 ميكرولتر من الثقافة كتحكم ما قبل التعريفي لاختبار التعبير البروتيني.
    5. حث التعبير البروتين عن طريق إضافة IPTG إلى تركيز نهائي من 1 mM ويهز الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. حجز عينة 100 ميكرولتر من الثقافة كتحكم ما بعد التعريفي لاختبار التعبير البروتيني.
    6. الطرد المركزي الثقافة في 13،000 ز لمدة 25 دقيقة في 4 °C وتخزينها في -80 درجة مئوية قبل التنقية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
  3. تنقية البروتين من الفائدة
    1. إعادة تعليق الخلايا في 25 مل من العازلة ليسيس (50 mM تريس، 150 mM NaCl، درجة الحموضة 7.4 التي تحتوي على DNase، RNase، PMSF) واستخدام سونيكاتور (15٪ السعة) لlyse لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    2. توضيح خلية ليسات في 19،000 ز لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    3. حزمة 1 مل (حجم السرير) من Co-NTA أو Ni-NTA عمود التقارب وغسل العمود مع 10 مجلدات العمود (CV) من المياه فائقة النقاء ومن ثم 10 السير الذاتية من العازلة غسل (50 mM تريس، 150 mM NaCl، 2 mM imidazole، pH 7.4) عن طريق تدفق الجاذبية.
    4. تمرير البروتين supernatant من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية لمدة ثلاث مرات.
    5. صب العازلة غسل على العمود مع 50 السير الذاتية لنقل البروتينات الملوثة بعيدا.
    6. Elute البروتين ملزمة مع 3 السير الذاتية من الجليد الباردة elution العازلة (20 mM تريس، 400 mM NaCl، 250 mM imidazole، درجة الحموضة 7.4). عندما يتعلق الأمر ببروتينات الروبيدوكسين ، من الضروري تنقية تبادل الأنيون باستخدام عمود تبادل الأنيون عند درجة الحموضة 8.5 عند 4 درجات مئوية.
    7. تحليل العينة بواسطة SDS-PAGE.

2. وظيفية من غطاء وسطح cantilever

  1. إعداد سطح المنسب ة وظيفياً
    1. حل 20 غرام من كرومات البوتاسيوم في 40 مل من الماء فائق النقاء. إضافة ببطء 360 مل من حمض الكبريتيك المركزة إلى محلول كرومات البوتاسيوم مع قضيب زجاجي يحرك بلطف وإعداد حمض الكروميك.
      تنبيه: المادة الكيميائية المستخدمة هنا وحمض الكروميك النهائي هو تآكل بقوة والحمضية. العمل مع معدات الحماية المناسبة. الحل النشرات الحرارة عند إضافة حمض الكبريتيك المركزة، مما يعني بطيئة إضافة ووقفة مناسبة للتبريد.
    2. تنظيف وتفعيل غطاء زجاجي في 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عن طريق العلاج حمض الكروميك. تزج تماما في coverslips 1 ٪ (v / v) APTES حل toluene لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتهم من الضوء.
    3. غسل الغطاء مع التولوين والكحول الإيثيل المطلق وتجفيف الغطاء مع تيار من النيتروجين.
    4. احتضان الغطاء عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    5. أضف 200 ميكرولتر من السلفو-SMCC (1 ملغم/مل) في محلول ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) بين ملفين معطلتين واحتضان لساعة واحدة محمية من الضوء.
    6. اغسل قسيمة التغطي مع DMSO أولاً ثم مع الكحول الإيثيلي المطلق لإزالة السلفو-SMCC المتبقية.
    7. جفف القسيمة تحت تيار من النيتروجين.
    8. Pipet 60 μL من 200 μM GL-ELP50nm-Cمحلول البروتين على قسيمة تغطية وظيفية واحتضان لحوالي 3 ساعة.
    9. غسل غطاء مع الماء فائق النقاء لإزالة غير متفاعل GL-ELP50nm-C.
      ملاحظة: القسائم الوظيفية قادرة على حوالي أسبوعين تحت التخزين عند 4 درجات مئوية.
  2. إعداد سطح الكانتيليفر الوظيفي
    1. تنظيف cantilevers في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة عن طريق العلاج حمض الكروميك.
    2. وظيفية cantilever بواسطة الأمينية سيلانة مع 1٪ (v/ v) APTES حل التولوين ومن ثم خبز cantilever في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاقتران إلى سلفو-SMCC.
    3. ربط C-ELP50nm-NGLإلى السطح مع مجموعة maleimide من sulfo-SMCC لمدة 1.5 ساعة.
    4. غسل بعيدا C-ELP50nmغير متفاعل - NGL على قسيمة الغطاء عن طريق المياه فائقة النقاء.
    5. تزج cantilever وظيفية في 200 ميكرولتر من 50 μM GL-CBM-XDoc محلول البروتين التي تحتوي على 200 nM OaAEP1 في 25 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. ثم استخدم AFM العازلة (100 mM تريس، 100 mM NaCl، درجة الحموضة 7.4) لغسل البروتين غير متفاعل.
      ملاحظة: كيمياء السطح من cantilevers وغطاء متشابهة.

3. إعداد متعدد البروتين خطوة بخطوة مع تسلسل الخاضعة للرقابة

  1. ربط وحدة الربط Coh-tev-L-POI-NGL إلى GL-ELP50nm المعطل على سطح قسيمة الغطاء بواسطة OaAEP1 لمدة 30 دقيقة.
  2. استخدام 15-20 مل من العازلة AFM (100 mM تريس، 100 mM NaCl، درجة الحموضة 7.4) لغسل أي بروتينات غير متفاعل.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من البروتياز TEV (0.5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] الجلسرين, درجة الحموضة 8.0) لتشبث وحدة البروتين في TEV التعرف على الموقع لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية.
  4. استخدام 15-20 مل من العازلة AFM لغسل البروتينات المتبقية.
  5. ربط وحدة الربط Coh-tev-L-POI-NGL بـ GL-Ub-NGL-Glass بواسطة OaAEP1 لمدة 30 دقيقة.
  6. كرر الخطوات 3.3 إلى 3.5 N-1 مرات لبناء البروتين GL-(Ub)ن-NGL على سطح الزجاج. حذف رد فعل انشقاق TEV الماضي لتحفظ تماسك على البروتين البوليمر كما كو-تيف-L-(Ub) ن-NGL-زجاج.

4- قياس تجربة AFM وتحليل البيانات

  1. قياسات AFM
    1. إضافة 1 مل من العازلة AFM إلى الغرفة مع 10 mM CaCl2 و 5 mM حمض الأسكوربيك.
    2. اختر طرف D من مسبار AFM الوظيفي للتجربة. استخدم نظرية التقسيم المتساوي لمعايرة الكانتيليفر في المخزن المؤقت AFM بقيمة ربيعية ثابتة دقيقة(k)قبل كل تجربة.
    3. إرفاق تلميح cantilever إلى سطح العينة لتشكيل زوج Cohesin / Dockerin.
    4. اسحب الكانتيليفر بسرعة ثابتة تبلغ 400 نانومتر·1 من السطح. في هذه الأثناء، سجل منحنى تمديد القوة بمعدل عينة 4000 هرتز.
  2. تحليل البيانات
    1. استخدم معالجة بيانات JPK حدد آثار ملحق القوة.
    2. استخدام البرمجيات لتحليل الآثار. تناسب المنحنيات مع الدودة مثل سلسلة (WLC) نموذج مرونة البوليمر والحصول على قوة تتكشف وزيادة طول كفاف للبروتين الفردية تتكشف الذروة.
    3. تناسب المخططات البيانية للقوات التي تتكشف مع النموذج الغاوسي للحصول على القيم الأكثر احتمالا من القوة تتكشف (< Fu> ) وزيادة طول كفاف (< ΟLc> ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لن تؤثر بقايا NGL التي تم إدخالها بين البروتينات المجاورة من قبل ربط OaAEP1 على استقرار مونومر البروتين في البوليمر حيث أن القوة المتكشفة (u> ) ، وزيادة طول كفاف (< ΟLc> ) قابلة للمقارنة مع الدراسة السابقة(الشكل 1). تظهر نتيجة تنقية بروتين الروبيدوكسين في الشكل 2. لإثبات البروتين بعد انشقاق TEV متوافق مع ربط OaAEP1 التالي لبناء البوليمر البروتين مع تسلسل التحكم والبناء هو عالية الكفاءة، الشكل 3 يوفر صورة SDS-PAGE كمرجع. يتم وصف خطوات إعداد cantilever وظيفية وcoverslip في الشكل 4. يتم عرض عملية التركيب الحيوي الأنزيمية التدريجية وشل حركة البروتين المتعدد البروتين على قسيمة الغلاف في الشكل 5. استخدام هذا البروتوكول، يمكن بناء البوليمر البروتين مع تسلسل تسيطر عليها ومناسبة لتجارب SMFS المستندة إلى AFM.

Figure 1
الشكل 1: قياسات SMFS المستندة إلى AFM من البروتين المتعدد التي بناها OaAEP1. (A)نموذجي ة مثل المنشار منحنى قوة التمديد من Ub (منحنى 1 في الأزرق) وقد أظهرت مع المتوقع من 23 نانومتر. (ب)مؤامرة مبعثر يعرض العلاقة بين قوة Ub تتكشف (202 ± 44 pN، متوسط ± s.d.، ن = 198) وLc (23 ± 2 نانومتر، متوسط ± s.d.). وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية من GL-GB1-Fe (III)-Rd-NGL و GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. قدم Fe (III) - شكل Rd (الطيف الأيسر ، الملون باللون البني ، رمز PDB: 1BRF) قمم امتصاص UV-Vis النموذجية عند 495 نانومتر و 579 نانومتر في حين أن شكل Zn لم يفعل ذلك (الطيف الأيمن ، الملون بالنبيذ ، رمز PDB: 1IRN). وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: SDS-PAGE نتائج هلام الهضم خطوة بخطوة والربط باستخدام بروتياز TEV وOaAEP1 لبناء ديمر Ub. وأظهرت الممرات 1-4 Coh-tev-L-Ub، وخليط البروتين نتيجة من انشقاق TEV، نقية SFGFP-TEV بروتياز والمنتجات النقية (GL-Ub). وأظهرت الممرات 5-7 مشور GL-Ub وCoh-tev-L-Ub-NGL خليط الربط مع (حارة 5) أو بدون (حارة 6) OaAEP1 وOaAEP1 نقية. وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مخطط العملية الذي يصف كل خطوة لتعمل القسائم الزجاجية وcantilever. بعد التنظيف والتنشيط بواسطة حمض الكروم، وcoverslip وcantilever حصة عملية وظيفية مماثلة، باستثناء الخطوة الأخيرة التي GL-ELP50nm-Cالأزواج مع غطاء في حين C-ELP50nm-NGLالأزواج مع cantilever. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مخطط العملية الذي يصف كل خطوة لشل البروتين المتعدد على السطح. أعلى اليسار مخطط تدفق العملية يظهر بناء خطوة بخطوة من polyprotein مع تسلسل تسيطر عليها على قسيمة الغلاف. الرسم البياني العلوي الأيمن يظهر إعداد cantilever وظيفية المستخدمة في قياسات AFM. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: آثار نموذجية تتكشف من البوليمرات البروتين مع تسلسل تسيطر عليها بعقلانية من قبل SMFS المستندة إلى AFM. (أ)نموذجي ة مثل المنشار منحنى قوة التمديد من Ub قدم ΟLج من ~ 23 نانومتر كما هو متوقع. (ب)نموذجي منحنيات قوة التمديد من Rd قدم Cمن ~ 13 نانومتر كما هو متوقع. (C)نموذجي منحنيات قوة التمديد من (Ub-Rd)ن خليط البروتين الذي يعني الذروة الزرقاء الأحداث التي تتكشف Ub في حين أن الأحمر يعني Rd. وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل التكميلي 1: نتائج هلام SDS-PAGE لكفاءة ربط البروتين تحت نسبة مختلفة بين اثنين من المواد المتفاعلة. وكانت كفاءة الربط 20٪ عندما تكون النسبة 1 إلى 1 ووصلت إلى 75٪ بنسبة 10 إلى 1. وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد وصفنا بروتوكولًا لعملية التركيب الحيوي الأنزيمي وشل حركة البروتين المتعدد البروتين وتحققنا من تصميم البروتين المتعدد بواسطة SMFS المستندة إلى AFM. توفر هذه المنهجية منهجًا جديدًا لبناء البروتين البوليمر في تسلسل مصمم ، والذي يكمل الأساليب السابقة لهندسة البروتين المتعدد البروتين والتجميد4،6،52،53،54،55،56،57،58،59،60،61.

بالمقارنة مع منهجية الحمض النووي المؤتلف الكلاسيكية لبناء البروتين المتعددالبروتين 7،62، قواعد أسلوبنا على الربط بين مونومرات البروتين الصغيرة. وبالتالي ، فإنه يسمح بالتعبير عن جزيئات البروتين كبيرة الحجم أو السامة لبناء البروتين المتعدد البروتين. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح لتنقية مونومر البروتين قبل الاقتران.

بالمقارنة مع طريقة ثنائية السيستين المستخدمة على نطاق واسع تشكيل السندات ثنائي الجزيئات ديسولفيدي لبلمرة البروتينلدينا طريقة الأنزيمية باستخدام كل من OaAEP1 وTEV نتائج البروتياز في البروتين المتعدد مع تسلسل تسيطر عليها نسبيا والهندسة اتصال محددة. وأنه لا يستخدم السيستين، وهو بقايا وظيفية أساسية لكثير من البروتينات.

أسلوبنا هو في الغالب مماثلة لاقتران البروتين القائم على الأورهاز59. الميزة الفريدة لطريقتنا هي أن ربط البروتين القائم على OaAEP1 هو أكثر كفاءة بكثير ، وبالتالي يسمح ببناء pentamer البروتين مع عائد معقول10،53. كما أنه يحتاج إلى عدد أقل من المخلفات للربط وينتج عنه رابط NGL أقصر من ثلاث مخلفات. ونتيجة لذلك، فإنه لا يظهر أي "تأثير الرابط" كما الرابط NGL شكلت حديثا لا يؤثر على استقرار مونومر البروتين الفردية أو حث أي تفاعل البروتين البروتين غير طبيعي. ومع ذلك، نعتقد أن لجميع الأساليب مزاياها وعيوبها. على سبيل المثال، لا تضيف طريقة الحمض النووي المؤتلف الكلاسيكية أي بقايا بين مونومر البروتين ولا تتطلب استخدام أي إنزيم للربط. وطريقة ثنائية السيستين بسيطة وسهلة لبلمرة البروتين. وبالتالي، يمكن أن تكون مفيدة في جميع المتطلبات التجريبية المختلفة.

لبناء لدينا خطوة بخطوة من البروتين، فمن الأهمية بمكان لإزالة البروتين غير متفاعل تماما. خذ كمية كافية من المخزن المؤقت AFM ووقت كاف لتنظيف السطح التفاعل بعناية. خلاف ذلك، فإن البروتين المتبقية أو البروتياز تؤثر على مزيد من ردود الفعل التوليف.

كفاءة ربط OaAEP1 هو حد حاسم لطريقتنا كما كفاءة انشقاق TEV كاملة تقريبا (96٪). من الأهمية بمكان رفع النسبة بين اثنين من المواد المتفاعلة، GL-البروتين، والبروتين-NGL، لتحسين كفاءة الربط. تظهر دراستنا أنه عندما يكون البروتين-NGL عشرة أضعاف إلى GL-البروتين، وتزداد الكفاءة من 20٪ (النسبة هي 1 إلى 1) إلى 75٪(الشكل التكميلي 1). من الأهمية بمكان أن تستهلك المتفاعل، الذي تم شل حركته على السطح كما يمكن نقل reactant الحرة بعيدا عن طريق الغسيل مع العازلة. بالإضافة إلى ذلك، ما إذا كان يتعرض N-أو C-التأني إلى الحل هو أيضا ً عامل حاسم في الربط. وهو نهج اختياري لفضح المحطة الطرفية عن طريق إضافة رابط يحتوي على الموقع المعترف به إلى المحطة الطرفية المعنية.

في النهاية، بروتوكولنا هو طريقة أنزيمية لاقتران البروتينات في تسلسل مصمم. كما أنه يوفر نهجا بديلا للزوجين وشل عينات البروتين في دراسات جزيء واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21771103، 21977047)، مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (المنحة رقم BK20160639) وبرنامج شوانغتشوانغ في مقاطعة جيانغسو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276, (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8, (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1, (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9, (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41, (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10, (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139, (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8, (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13, (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137, (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1, (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355, (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11, (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12, (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264, (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197, (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19, (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55, (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9, (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11, (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3, (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135, (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58, (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39, (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134, (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139, (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9, (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52, (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30, (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57, (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29, (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49, (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27, (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5, (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2, (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47, (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116, (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28, (17), 174003 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics