Author Produced

Внутриархивная доставка нейронных стволовых клеток крыс и мышей мозга: Применение к церебральной ишемии

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Метод доставки нервных стволовых клеток, адаптируемых для инъекционных решений или суспензий, через общую сонную артерию (мышь) или внешнюю сонную артерию (крысу) после ишемического инсульта сообщается. Инъекционные клетки широко распределены по всей паренхиме мозга и могут быть обнаружены до 30 г после родов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Терапия нервной стволовыми клетками (NSC) является новым инновационным методом лечения инсульта, черепно-мозговой травмы и нейродегенеративных расстройств. По сравнению с внутричерепной доставки, внутриартерационной администрации NSCs является менее инвазивным и производит более диффузное распределение NSCs в мозге parenchyma. Кроме того, внутриартеральная доставка позволяет эффект первого прохода в циркуляции мозга, уменьшая потенциал для захвата клеток в периферических органах, таких как печень и селезенка, осложнение, связанное с периферическими инъекциями. Здесь мы подробно методологии, как у мышей и крыс, для доставки NSCs через общую сонную артерию (мышь) или внешней сонной артерии (крысы) в ipsilateral полушария после ишемического инсульта. Используя NSCs с маркировкой GFP, мы иллюстрируем широкое распространение, достигнутое во всем ипсианом полушарии грызунов в 1 г, 1 неделю и 4 недели после доставки постишемических, с более высокой плотностью в или вблизи места ишемической травмы. В дополнение к долгосрочному выживанию, мы показываем доказательства дифференциации Клеток, обозначенных GFP, на 4 недели. Подход внутриартературной доставки, описанный здесь для НСУ, может также использоваться для администрирования терапевтических соединений и, таким образом, имеет широкую применимость к различным моделям травматизма и болезней ЦНС в различных видах.

Introduction

Терапия стволовыми клетками (SC) обладает огромным потенциалом в качестве лечения неврологических заболеваний, включая инсульт, травму головы и слабоумие1,,2,,3,,4,,5,,6. Тем не менее, эффективный метод доставки экзогенных ОВ в больной мозг остается проблематичным2,6,7,,8,9,10,11,12,13. SCs поставляется через периферические маршруты доставки, в том числе внутривенные (IV) или внутриперитонные (IP) инъекции, подлежат первому проходу фильтрации в микроциркуляции, особенно в легких, печени, селезенки и мышц8,9 ,139,,14, увеличивая шансы накопления клеток в нецелевых областях. Инвазивный внутрицерковный метод инъекций приводит к локализованному повреждению тканей головного мозга и очень ограниченному распределению ОВ вблизи места инъекции2,,6,,8,,14,,15,,16. Недавно мы создали метод внутриартериальной инъекции на основе катетера для доставки экзогенных нейронных ОВ (НСК), который описан здесь в модели грызунов фокусного ишемического инсульта. Мы вызываем переходные (1 ч) ишемии реперфузии травмы в одном полушарии с помощью силиконовой резиновой покрытием нити захлепыть левой средней мозговой артерии (MCA) в мыши или крысы17,18,19. В этой модели мы воспроизводили примерно 75-85% депрессии мозгового кровотока (CBF) в ipsilateral полушария с лазерным доплером или лазерной пятнышко изображения17,19, уступая последовательного неврологического дефицита17,18,19.

Для экономии времени, видео установлен играть в два раза нормальной скорости и рутинных хирургических процедур, таких как подготовка кожи и раны закрытия с швом и использования и установки моторизованного шприц насоса не представлены. Метод внутриартерационной доставки НСК демонстрируется в контексте окклюзии средней мозговой артерии (МКАД) модели экспериментального инсульта у грызунов. Поэтому мы включаем транзиторную процедуру ишемического инсульта, чтобы потом продемонстрировать, как проводится вторая операция, внутриартеральная инъекция, с использованием предыдущего хирургического участка на том же животном. Осуществимость внутриартературной доставки НСК в моделях грызунов демонстрируется путем оценки распределения и выживаемости экзогенных НСК. Эффективность НСК-терапии для ослабления патологии мозга и неврологической дисфункции будет сообщено отдельно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры по животным были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными (IACUC) Университета Кентукки, и была приняты надлежащие меры для минимизации стресса или боли, связанных с хирургическим вмешательством.

1. Подготовка инъекционных катетеров и хирургических крючков

  1. Построить инъекционный катетер(рисунок 1). Соберите необходимые материалы, включая: MRE010, MRE025, и MRE050 трубки, 20 G, 26 G и 27 G инъекции иглы (Рисунок 2A), 600 песка наждачной бумагой, суперклей и двухкомпонентной 5-минутной эпоксидной смолы.
    1. Вырезать 20 G и 26 G иглы на 1 см от иглы концентратор и полировать конец на наждачной бумаге(Рисунок 2B). Промыть иглы с 10 мл двойной дистиллированной воды для очистки иглы скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используются два различных дизайна (Рисунок 1) используются. Дизайн 1 имеет один разъем и используется для впрыска растворов или суспензий. Дизайн 2 имеет 20 G и 26 G Luer блокировки разъемы для инъекций клеток (20 G иглы) и флеш мертвого объема (26 G иглы) для обеспечения доставки полного объема НСК-содержащих раствора.
  2. Дизайн 1: Вставьте катетер длиной 3-4 см MRE010 в катетер ДЛИНой 15 см и закрепите суперклеем.
    1. Подключите другой конец трубки MRE025 к сегменту катетера MRE050 и закрепите суперклеем. Вставьте притупленную 20 Г иглу в оставшийся конец катетера MRE050 и закрепите суперклеем(рисунок 1).
    2. Дальнейшее укрепление сайтов соединения с эпоксидным клеем. Эта конструкция катетера является оптимальной для инъекций реагентов (например, химических или лекарственных растворов или других биологических препаратов, таких как цитокины).
  3. Конструкция 2: Вставьте катетер длиной 3-4 см в катетер MRE010 длиной 15 см и закрепите суперклеем.
    1. Подключите другой конец трубки MRE025 к сегменту катетера MRE050 и закрепите суперклеем. Вставьте притупленную иглу 20 G в оставшийся конец катетера MRE050 и закрепите суперклеем.
    2. Вставьте притупленную иглу 26 G в трубку MRE050 возле кончика первой иглы, следуя направлению потока инъекций, и закрепите суперклеем(рисунок 1 и рисунок 2C). Укрепите как иглы, так и сегмент трубки MRE050 с прозрачной эпоксидной смолой(рисунок 2C). Эта конструкция позволяет инъекции раствора транспортного средства через иглу 2 (26 G) после инъекции NSC через иглу 1 (20 G), чтобы промыть мертвый объем в катетер в циркуляцию мозга, достижение более точного контроля объемов инъекций.
    3. Используйте 20 G иглы для инъекций NSC для того, чтобы свести к минимуму ущерб NSCs, которые могут негативно повлиять на жизнеспособность.
  4. После строительства, промыть катетеры с 10 мл двойной дистиллированной воды, а затем 70% этанола, а затем впитать их в 70% этанола на ночь.
  5. Перед операцией удалите катетеры из 70% этанола и заподощите 10 мЛ стерильных PBS и поместите их в автоклаведную хирургическую коробку для хранения и транспортировки.
  6. Подготовка хирургических крючков
    1. Вырезать 1,5- 2 см длиной иглы вал от 27 G иглы, и польский обоих концах на наждачной бумаге до скучной. Затем используйте небольшой гемостатический зажим, чтобы согнуть вал в крючок на одном конце и кольцевая форма на другом конце.
    2. Вставьте 10-15 см в длину MRE025 катетер через кольцо и обеспечить с четкой хирургической лентой(Рисунок 2D). Сделайте еще 2 крючка с помощью того же метода.
    3. Замочите все крючки и катетерные системы в 70% этанола до использования.

2. Подготовка животных: Доставка, жилье, адаптация к окружающей среде

  1. В этом исследовании были использованы самцы и самки мышей C57BL/6 (10-12 недель, n'10/time point) и wistar крыс (10-12 недель, n'10).
  2. Дом их в экологически контролируемых животных виварий с пищей и водой ad libitum.
  3. Позвольте им адаптироваться к окружающей среде по крайней мере за 1 неделю до операции инсульта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна мышь и одна крыса умерли в 1 г после операции инсульта и одна мышь была усыплена на 3 d после инсульта до инъекции НСК по гуманным причинам из-за тяжелого паралича.

3. Культура мыши и крысы нервных стволовых клеток (NSCs)

ПРИМЕЧАНИЕ: NSCs были изолированы и культурные следующие установленный протокол20.

  1. Мыши
    1. Изолировать дикий тип (WT) и GFP-помеченные NSCs из эмбриональной коры E18 от приурочен-беременности женщин C57BL/6 мышей в паре с GFP-положительных мышей мужского пола (B6 ACTb-EGFP). Чтобы определить эмбрионы GFP (Я), наблюдайте за собранными эмбрионами на флуоресценции микроскоп с помощью канала FITC. Эмбрионы GFP (Я) дают зеленый сигнал флуоресценции, в то время как эмбрионы WT показывают только слабую автоматическую флуоресценцию(рисунок 3A).
  2. Крыса
    1. Изолировать НСК из субвентрикулярной зоны (СВЗ) молодых взрослых крыс WT. Этикетка их с DiI незадолго до инъекции в соответствии с инструкциями производителя21.
  3. Культура мыши или крысы NSCs, пока они не развиваются в нейросферы, и прохождение их, когда диаметр сферы достигает около 100 мкм (Рисунок 3B). Используйте НСК для инъекций между проходами 3 и 5.
  4. Проверить их свойства стволовых клеток с помощью эмбриональной панели маркера стволовых клеток (Рисунок 3C).
  5. В день инъекции собирайте сферы НСК и разъединяйте с раствором клеточного отсоединения, приостанавливайте в кальцие и магние ПБС до концентрации 107 клеток/мЛ, и выделяйте на мокрый лед до инъекции.

4. Хирургическая подготовка

  1. Перед операцией отметьте точку на коммерческом шве MCAO серебряной маркерной ручкой на 9 мм (для мыши) или 15 мм (для крыс) от наконечника для хирургического ссылки длины вставки. Автоклав хирургические инструменты (ножницы, щипцы) и инструменты перед каждой операцией, и тепло стерилизовать их в стеклянный шарик стерилизатор между операциями.
  2. Индуцировать анестезию у животных с 5% изофлуран через ингаляцию и поддерживать анестезию с 1-2% изофлуран. Оцените глубину анестезии путем наблюдения за общими состояниями (дыхание, движение усов и спонтанная коррекция осанки тела), рефлектор роговицы и реакция на щепотку ног.
  3. Положите животное на спине на грелку, и подготовить хирургическое место на животных путем отсечения и очистки с бетадин раствор следуют 70% этанола. Защитите глаза животного от высыхания, применив во время операции офтальмологическую мазь (например, искусственную слезоточивую мазь).
  4. У хирургов тщательно скраб руки с бактериозицидным скрабом и носить маску, стерильные перчатки, и чистый лабораторный слой.

5. Операция по окклюзии средней мозговой артерии (MCAO)

ПРИМЕЧАНИЕ: Операции по индуцировать ишемический инсульт в одном полушарии мыши или крысы похожи тем, что шов вводится во внутреннюю сонную артерию (ICA) для окклюде кровотока (Рисунок 4)17,18,19,22. Тем не менее, артерия, выбранная для вставки шва, отличается в зависимости от имеющегося места работы, необходимого для последующей инъекции стволовых клеток. Крыса имеет достаточно места во внешнем сегменте сонной артерии (ЭКА), чтобы разрешить две отдельные, последовательные операции (инсульт и инъекция НСК), но мышь не делает, требуя альтернативного подхода. Инсульт индуцированных изменений мозгового кровотока, мозг инфаркта размера и неврологических дефицитов были зарегистрированы, как и в предыдущих докладах авторов17,18,19.

  1. Чтобы вызвать ишемический инсульт, начните операции на мышах и крысах с разрезом средней линии на области шейки матки, а также изоляцией левой общей сонной артерии (CCA), ECA и ICA(рисунок 4). Упражнение осторожность, чтобы не растягивать, вытеснять или сжать CCA или блуждающего нерва. Поскольку выбор артерий и хирургических шагов отличаются после этого, MCAO хирургии на мышь и крыса будет описана отдельно.
  2. MCAO хирургии на мышке (Рисунок 4A)
    1. Поместите три плетеные 6-0 нейлоновые швы под CCA(Рисунок 4A, шаг 1), и сделать один жесткий хирургический узел, чтобы окклюзии судна как можно дальше от бифуркации, как это возможно, используя проксимальную строку (Рисунок 4A, шаг 2). Обрезать шов концы.
    2. Сделайте slipknot на дистальной стороне CCA (осторожно: не чрезмерно затягивать, как он будет выпущен в шаге 6) и один свободный slipknot между двумя затянутыми узлами(Рисунок 4A, шаг 2).
    3. Вырезать небольшой разрез (я 1'4 - 1/3 окружности) близко к проксимальному узлу на CCA с микросциссорами(рисунок 4A, шаг 3), и тщательно вставьте коммерческий силиконовый резиновый покрытием 7-0 твердых нейлоновых шов(рисунок 4A, шаг 4). Безопасный этот шов с средней строки, ужесточение достаточно (Рисунок 4A, шаг 5), чтобы обеспечить не утечка крови из разреза и не движение силиконовой резины покрытием нейлоновой нити на задний поток из ICA, в то же время позволяет продвижение шва к ECA с нежным толчок пинцетом.
    4. Отпустите верхний (дистальный) slipknot(Рисунок 4A, шаг 6) и заранее нейлоновый шов в ICA, пока его кончик проходит бифуркации на 9 мм (с использованием серебряного маркера на шве в качестве ссылки). Затяните два верхних slipknots для обеспечения шва и предотвращения обратного потока крови.
    5. Снимите нить 1 ч позже(Рисунок 4A, шаг 7) и ligate CCA с помощью среднего узла для предотвращения кровотечения(Рисунок 4A, шаги 5-7 в обратном порядке, окончательные результаты, как видно в шаге 8). Отпустите верхний узел. Закройте рану хирургическим швом 4-0.
  3. MCAO хирургии на крысы (Рисунок 4B)
    1. Поместите два плетеные 6-0 нейлоновых швов под ECA(Рисунок 4B, шаг 1), и сделать один плотный узел в дистальном конце, насколько это возможно(Рисунок 4B, шаг 2).
    2. Поместите зажимы сосуда на ICA и CCA, чтобы окклюзии артериального кровотока(Рисунок 4B, шаг 3). Slipknot может быть использован в качестве альтернативы для судна клип.
    3. Сделайте небольшой разрез на ECA с микросциссорами(рисунок 4B,шаги 3-4), вставьте коммерческую силиконовую резину с покрытием 6-0 нейлоновой нити(рисунок 4B, шаг 5), и закрепите правильно с slipknot на ECA.
    4. Отпустите зажим судна на ICA, заранее нити в ICA до серебряного маркера (15 мм) достигает бифуркации(рисунок 4B, шаг 6), а затем обеспечить шов с2-го узла на ECA(Рисунок 4B, шаг 6).
    5. После 1 ч ишемии, снять эту нить и ligate разрез для предотвращения кровотечения(Рисунок 4B, шаг 7), удалить зажим сосуда из CCA (окончательный результат, как в шаге 8), и закрыть рану с 4-0 хирургического шва.

6. Восстановление

  1. После операции по инсульту поместите животных на грелку до тех пор, пока они полностью не приретают сознание.
  2. Обеспечить анальгезию через подкожную инъекцию. Верните животных в свои домашние клетки с доступом к воде и пищевой рекламе libitum.

7. Внутриартеральная инъекция

  1. Вымойте весь катетер с 70% этанола и замочить на ночь до использования. Непосредственно перед инъекцией подключите замок иглы Luer стерильным шприцем и промойте всю люменную сторону катетерной системы 10 мЛ стерильных PBS.
  2. Временное окно и подготовка к инъекциям НСК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на опыте и отчетах других исследовательских групп, сроки инъекций НСК имеют решающее значение для выживания как субъектов, так и экзогенных НСЦ. В нашем экспериментальном исследовании, инъекции NSCs на ранних точках времени (в течение первых 6 ч после реперфузии) привели к более высокой смертности. Таким образом, мы протестировали более поздние точки времени инъекций и определили временной промежуток между 2 d (48 h) до 3 d (72 h) после инсульта является безопасным и терпимым для животных, и эффективен в достижении внутрипаренхимального распределения NSCs. Результаты, представленные здесь от животных, полученных НСК инъекции на 3 d после травмы.
    1. Установите скорость инъекции шприца насоса на 20 мл/мин для мышей и 50 мл/мин для крыс. Чрезмерная скорость или продолжительность инъекций может привести к системной перегрузке объема, к которой мыши более уязвимы, чем крысы.
    2. Короче говоря, в 3 д после операции инсульта, анестезировать животных с изофлураном и положите их на грелку.
    3. Вновь открыть рану шейки матки и разоблачить ECA, ICA и CCA снова (Рисунок 5, шаг 1). Как и в операциях инсульта, определить маршрут инъекции на основе вида. Используйте CCA для инъекций НСК в мышь, и ECA длякрысы 23.
  3. Внутриартеральная инъекция через CCA в мыши
    1. Поместите два 6-0 плетеные нейлоновые швы под CCA. Создайте свободный slipknot с каждым из них между бифуркации и нижних узлов от предыдущей операции инсульта(Рисунок 5, шаг 2).
    2. Затяните верхний slipknot, а затем сделать небольшой разрез над нижним узлом(рисунок 5, шаг 3). Вставьте катетер MRE010 через разрез(рисунок 5,шаг 4) и закрепите средним узлом, не блокируя поток впрыска(Рисунок 5,шаг 5). Обратный поток крови должен быть виден в катетере при высвобождении верхнего узла и регулировке положения катетера.
    3. Поместите зажим сосуда на ECA, введите 1 х 106 GFP-NSCs через этот катетер на 20 л/мин в течение 5 минут с помощью насоса шприца, а затем заподлицо с 50-100 мл PBS с той же скоростью.
    4. После инъекции, ligate CCA выше разреза с верхней скольжения узел и снять катетер MRE010(Рисунок 5, шаг 6). Затяните и обрежьте средний узел и верхний узел. Снимите зажим сосуда от ECA. Обратитесь к окончательному изображению на рисунке 5, шаг 7.
    5. Закройте рану хирургическим швом 4-0.
    6. После обеспечения адекватного восстановления на грелке и подкожной обезболивающей инъекции, вернуть животных в их домашнюю клетку.
  4. Внутриартеральная инъекция через ЭКА в крысах
    1. Временно окклюзия ECA и CCA с зажимами сосудов(Рисунок 5, шаг 2).
    2. Сделайте небольшой разрез на проксимальной стороне ECA(рисунок 5,шаг 3), вставьте катетер MRE010 и закрепите узлом(рисунок 5, шаг 4).
    3. Удалите оба зажима сосуда, введите 5 х 106 НСЦ в 100 мл PBS при 50 мл/мин в течение 2 минут, а затем заподлицо с 50-100 мл PBS(Рисунок 5, шаг 5) с той же скоростью, используя моторизованный насос шприца.
    4. После инъекции, окклюзии CCA и ECA с сосудами снова и ligate ECA на проксимальной стороне второго разреза после снятия инъекционного катетера(Рисунок 5, шаг 6).
    5. Удалите два сосуда клипы(Рисунок 5, шаг 7) и закрыть рану с 4-0 хирургического шва.
    6. После обеспечения адекватного восстановления на грелке и подкожной обезболивающей инъекции, вернуть животных в их домашнюю клетку.
  5. Гистологический анализ
    1. Соберите мозги у мышей и крыс, которые получили ишемический инсульт с последующим введением НСЦ или транспортного раствора после эвтаназии и интракардиальной перфузии с 4% параформальдегидом при 1 д (мышь и крыса), 7 d (мышь) и 30 d (мышь) после инъекции. Каждая из этих четырех групп состояла из 5 НСК и 5 транспортных средств, впрыснутых животных.
    2. Исправить мозги на ночь и криоконсервать в 30% сахарозы для 3 d.
    3. Встраивать мозги в OCT, нарезать толщиной 40 мкм, и изучить распределение NSCs после иммуносеи с клеточными специфическими маркерами, в том числе глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP, астроциты), Tuj1 (зрелые нейроны), и doublecortin (DCX, незрелые нейроны).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за отсутствия штамма крысы, который выражает GFP, мы использовали DiI, переходный флуоресцентный ярлык, для крыс NSCs, который позволяет только относительно краткосрочные наблюдения. Следовательно, распределение NSC было только расмотрено на 1 d после хода в крысах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GFP-помеченные NSCs были легко обнаружены в ишемическом мозге, в основном в ипсиаманом полушарии, особенно в полутени и вдоль обод травмы (Рисунок 6). Эксперт был однослеп в ходе визуализации и анализа.

Например, в 1 г после инъекции, NSCs были обнаружены в гиппокампе мыши. Подмножество NSCs показали совместное выражение незрелых нейрон маркер DCX в зубной извилины даже в этой ранней точке времени (Рисунок 6A).

В 10 г после инсульта (7 г после инъекции НСК) экзогенные GFP-NSCs наблюдались при самой высокой плотности на краю травмы (водораздельная область) в стриатуме и коре головного мозга(рисунок 6B). Примечательно, что к 7 г после инъекции многие GFP-NSCs также выразили DCX (показано синими кругами), что указывает на их нейрональную судьбу. По сравнению с животными, которые получили инъекцию раствора транспортного средства, инъекция NSC также увеличила окрашивание DCX (красный) в ipsilateral полушарии.

На 30 d после инъекции, NSCs все еще были обнаружены в поврежденной коре, и часть из них показала выражение глиального маркера GFAP(Рисунок 6C)или зрелого нейронного маркера Tuj1(Рисунок 6D),что указывает на потенциал экзогенных НСК дифференцировать либо в глиальной или нейронной судьбы, и выжить до 1 месяца в поврежденном мозге.

Figure 1
Рисунок 1: Схематические конструкции инъекционных катетеров. Мы вводим два дизайна, Дизайн 1 для инъекций сложных растворов и дизайн 2 для инъекций клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Подготовка катетера для инъекций НСК и хирургических крючков. (A) Материалы для конструкции катетера: катетеры MRE010, MRE025 и MRE050 на 3 см, 10-15 см и 3 см длины, соответственно. (B) Отрежьте иглы советы и польский до скучной. (C) Подключите каждый сегмент и безопасный с суперклеем, а затем встраите оба иглу Luer замки и MRE050 сегмента в эпоксидной смолы для повышения. (D) Сделать хирургический крюк с помощью 27 G вала иглы и MRE025 катетер. Масштабная планка: 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Культура GFP (яп. ) нервных стволовых клеток. (A) Определить GFP (я) эмбрионы с флуоресценционным микроскопом с помощью канала FITC. (B) Изолировать и культуры корковых NSCs, пока они не образуют нейросферы. Масштабная планка: 100 мкм (C) Изучите свойства нейросферы с помощью панели маркера стволовых клеток. Масштабная планка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Схематические изображения шаг за шагом средней мозговой артерии окклюзии (MCAO) инсульта хирургии на мышь или крысу. Обратитесь к видео для детальной хирургической операции. ICA, внутренняя соная артерия; ЭКА, внешняя соная артерия; CCA, общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Схематические изображения внутриарметных нейронных стволовых клеток (NSC) инъекции в мыши или крысы. Обратитесь к видео для детальной хирургической операции. ICA, внутренняя соная артерия; ЭКА, внешняя соная артерия; CCA, общая сонная артерия. Зеленая стрелка указывает направление потока во время инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Распределение, выживание и дифференциация нервных стволовых клеток (НСЦ) в ишемическом мозге. (A) Обнаружение GFP (Я) NSCs в гиппокампе зубчатая извилина на 1 d после инъекции. Стволовые клетки флуоресцирует зеленый; даблкортин (DCX) иммуностиминг показан красным цветом. Белая стрелка указывает на GFP (Я) NSC с выражением DCX. (B) Схематическая карта Клеток GFP (Я) и DCX помеченных клеток на 10 г после ишемии-Реперфузии (I-R) в фиктивных контроля (без инъекций) и транспортного средства (I-R) или NSC (I-R НКЗ) вводили мышей. Топография ишемического оскорбления изображена в последней схеме, где более светлый и темный оранжевый представляют область, подверженную ишемической проблеме, и некротическое ядро, соответственно. Голубая лента указывает на "водораздел" области. Серые прямоугольники изображают места, где были сделаны изображения для(C)и(D) (C,D) Экзогенные НСК могут дифференцироваться в глиальную судьбу (GFAP, C) или нейрональную судьбу (Tuj1, D) на 30 г после родов. Никаких существенных сигналов не наблюдалось в канале FITC (GFP) в инсульте животных, которые получили инъекцию транспортного средства (транспортное средство в C и D), в то время как в NSC вводили мышей, выживших GFP-NSCs были визуализированы и colocalized с GFAP (C) или Tuj1(D) окрашивания. Стрелки указывают наложения 2 каналов. Масштабная планка: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Терапия стволовыми клетками неврологических заболеваний все еще находится на ранней исследовательской стадии. Одной из основных проблем является отсутствие установленного метода для достаточной доставки НК или НСК в мозг.

Хотя экзогенные CS/NSCs могут быть обнаружены в головном мозге после внутривенного (IV), интраперитонеальной (ИП) или внутрипаренхимальной/внутриребребральной инъекции, каждый подход к доставке имеет недостатки. Обнаруживается населения в головном мозге, по оценкам, очень низкий с периферической инъекции (IV или IP), представляющих лишь небольшую часть клеток вводят или настаивают. Внутримозговые инъекции дает очень фокусное распределение, и может непосредственно вызвать черепно-мозговую травму2,6,7,8,9,10,11,12,13. Поэтому мы проверили целесообразность внутриартерационной инъекции в качестве альтернативного метода доставки НСК после ишемического инсульта. Этот метод обеспечивает NSCs через ipsilateral мозговой перфузии после инсульта оскорбление. Если вводить в начале после инсульта, экзогенные НСК могут пересечь нарушенный гематоэнцефалический барьер (BBB), достижение широкого распределения по всему мозгу. Одним из преимуществ внутриартерационной инъекции является то, что он использует эффект первого прохода в ЦНС, максимизируя потенциал для экзогенных НСК, чтобы поселиться в мозге, в отличие от периферийных маршрутов доставки, в которых клетки впервые проходят через богатые микроциркуляции фильтрации органов, таких как легкие и печень.

Описанный здесь внутриархимехный подход является универсальным и может быть адаптирован для учета различных типов парадигм доставки и моделей травм или болезней. Хотя в текущем исследовании выполняется только одна внутриартеральная инъекция, катетер MRE025 может быть подключен к микропорту, который встроен подкожно, через который животные могут получать повторяющиеся внутриарметные инъекции12. Кроме того, с более простой, одной просветить дизайн, этот метод инъекции может быть использован для доставки реагентов врастворе 12,23. Если доставка нескольких терапевтических требуется, двойной просвет дизайн может быть использован для доставки первоначального решения одновременно или последовательно со вторым препаратом или соединением. Для применения к грызунам моделей нейродегенерации или черепно-мозговой травмы, где нет необходимости в первой операции инсульта, операция по установке инъекционного катетера в мышь может быть выполнена на ECA (тот же протокол, что и для крыс, соответствующим образом корректировки объема инъекции и скорости в шаге 7.4 для мышей), чтобы избежать потенциального нарушения мозгового кровотока через CCA.

Следует учитывать ряд недостатков и потенциальных негативных последствий этой внутриартературной инъекции. У животных проводится вторая операция, которая несет в себе возможность осложнений, связанных с анестезией или хирургическим вмешательством. Мозговой кровоток через ipsilateral CCA нарушается, хотя и временно (менее нескольких минут), что может вызвать еще один переходный эпизод легкой депрессии CBF. Кроме того, нарушение ИЛИ открытие BBB имеет решающее значение для внутриартериальной доставки НСК, что ограничивает терапевтическое окно. В экспериментальном исследовании, почти нет GFP (Я) NSCs были обнаружены в наивном мозге после внутриартерационной инъекции. Однако, если субъект может терпеть лекарства, которые могут временно открыть BBB, такие как высокоосмолальность маннитол или солевой раствор, это может быть использовано для создания переходного окна BBB открытия для инъекции НСК на более поздних точках времени. В предварительных исследованиях мы обнаружили, что внутриартеральная инъекция в течение первых 6 ч после инсульта привела к более высокой смертности, чем наблюдается при инсульте в одиночку. Это может быть связано со второй инвазивной хирургии после относительно короткого периода восстановления после первой операции. Кроме того, после ишемического оскорбления, поврежденные цереброваскатуры могут иметь более высокую тенденцию к сужению в ответ на любые дополнительные стимулы, такие как введение катетера, дополнительная загрузка жидкости, или крепление экзогенных NSCsulature к световой стенке после инъекции. Еще одна разумная озабоченность в отношении доставки НСК после инсульта является то, что НСК может образовывать эмболии, что дальнейшее окклюзии или нарушить микровесы. В соответствии с предыдущими докладами8,16,24, мы не нашли существенных доказательств GFP (Я) эмболии в микроваскулатуре, хотя мы нашли GFP (я) NSCs в периваскулярном пространстве (Virchow-Robin пространстве) в первые дни после инъекции. После того как мы оптимизировали временной промежуток для инъекций, не было никакой разницы в осложнениях или смертности между группами инсульта, которые получили автомобиль или инъекции НСК в текущем исследовании. Поэтому правильно разработанная внутриартеральная инъекция НСК является безопасным и эффективным методом лечения НСК, нацеленного на неврологические заболевания.

Для достижения успешной инъекции НСК и улучшения результатов животных, некоторые аспекты должны быть обработаны с осторожностью во время операции инсульта или инъекции НСК. Следует практиковать общую хирургическую поддержку и уход, такие как защита роговицы и поддержание температуры ядра. Здесь мы вводим некоторые потенциальные осложнения этой конкретной операции и руководства, чтобы свести к минимуму их возникновение.

Там может быть стресс на блуждающий нерв. Во время операции блуждающий нерв не следует растягивать, измельчать, лигать или стимулировать. Случайная стимуляция блуждающего нерва может вызвать аритмию, такую как брадикардия, остановка сердца или даже смерть.

Неправильное размещение или затягивание шва, или неуместность или скольжение сосуда клип может привести к артериальному кровотечению из проксимального конца CCA (от сердечного выброса) или дистального конца через круг Уиллиса. На каждом шагу, убедитесь, что сосуд клип или узлы помещаются должным образом, чтобы окклюзии кровотока. При возникновении кровотечения постарайтесь восстановить правильное расположение узлов или сосудов. Если визуальное поле размыто кровью, положите кончик стерильного ватного тампона на CCA и удерживайте с давлением, чтобы остановить кровоток. Гемоглобин от кровотечения облегчит закрытие разреза на артерии. После того, как кровотечение прекращается, затяните узел или поместите зажим сосуда в нужном месте, очистите кровь в поле зрения и продолжайте операцию.

Возможны травмы или осложнения при вводе катетера. Обрежьте кончик MRE010 под углом 45 градусов, чтобы он мог легко ввести небольшой разрез на артерии, не вызывая повреждения сосуда. В редких случаях, переотхоченный кончик может проникнуть в артерию или войти в пространство между мембраной подвала и tunica externa. Чтобы избежать этих травм, сделать правильный разрез размера на артерии. Мы рекомендуем размер 1/4-1/3 окружности артерии, которая достаточно велика, чтобы позволить вход кончика катетера, но сохраняет достаточную прочность в стенке сосуда, чтобы обернуть вне катетера. Слишком большой разрез может привести к разрыву артерии в месте разреза. Аккуратно направляйте кончик катетера MRE010, чтобы войти в разрез. Не заставляйте ввод кончика катетера или продвижение катетера. При необходимости, острые щипцы могут быть использованы для подъема края разреза. Заранее катетер с низким углом по отношению к артерии, так что катетер и артерия почти параллельны.

Существуют также потенциальные осложнения, связанные с инъекциями. Одним из распространенных осложнений внутриартериальной инъекции является чрезмерная объемная нагрузка, которая может привести к острой сердечной перегрузке и отеку легких. Быстрые темпы инъекций могут усилить эти риски и привести к повреждению стенки судна8. Таким образом, необходимо тщательно контролировать как скорость, так и общий объем. Мы рекомендуем 20 мл/мин как обычно безопасные для мышей при использовании в течение короткого периода, например, 5 минут. Если отмечены симптомы перегрузки объема, такие как быстрое, неглубокое дыхание, розовые пузыри от нарес, или дисфория, как аномальные движения, инъекции должны быть остановлены или прерваны, и животные позволили восстановиться. Еще одним возможным осложнением является образование эмболии НСК в цереброваскулярной системе. Раствор подвески не должен содержать кальций или магний, которые, как известно, способствуют агрегации клеток. Чтобы уменьшить вероятность индуцирования эмболии, одноклеточные суспензии НСК должны быть исследованы под микроскопом непосредственно перед инъекцией, чтобы подтвердить отсутствие клеточных кластеров. Если клеточные кластеры присутствуют, титровать с стерильным 1 mL pipet до тех пор, пока одна ячейка подвески достигается.

Данное исследование устанавливает целесообразность внутриартерационного подхода к доставке мышей и крыс и раскрывает несколько важных особенностей этой внутриартерационной инъекции НСК в контексте ишемического инсульта. По сравнению с относительно фокусным распределением NSCs выживших в мозге parenchyma обычно сообщили с внутричогрином инъекции1,7,9,11,,15,16, мы наблюдали диффузное распределение по всему ипсиамамальном полушарии, в том числе коры, гиппокампа и стриатума. Таким образом, внутриартеральная доставка хорошо подходит не только для инсульта, но и для множественных типов травм или заболеваний, связанных с диффузным повреждением мозга. В условиях MCAO, самая высокая концентрация NSCs были найдены вдоль края места повреждения. Увеличение плотности экзогенных НСУ в зоне полутени может быть обусловлено увеличением доставки в этот регион через побочный поток от восстановленного перфузии крови и открытия BBB, а также миграции НСК в поврежденный район. Хотя IV доставки ТС может привести к диффузному распределению, количество клеток, которые достигают мозга, по оценкам, небольшая часть от общего доставлено, отчасти из-за фильтрации периферических органов8,13. Основываясь на предыдущем исследовании метастазов мозга12, внутриартературных инъекционных люциферазы помечены D122 опухолевых клеток воспользовался эффект первого прохода, чтобы успокоиться в церебральных сосудов и развивать метастатические участки в головном мозге, а не периферических органов. Церебральные метастатические участки из-за экзогенных опухолевых клеток были обнаружены в мозге ипсиаматеральной к инъекции уже через 1 неделю после инъекции с помощью системы визуализации IVIS для обнаружения биолюминесцентного сигнала через неповрежденный череп и кожу головы. В отличие от этого, люминесцентные сигналы (указывающие на опухолевую нагрузку, связанную с экзогенными опухолевыми клетками) из периферических органов, таких как печень, легкие и мышцы, не были обнаружены до 3-4 недель после внутриармерной инъекции. Поэтому, мы ожидаем, что в аналогичном сценарии, внутриартеральная доставка НСК также выиграют от эффекта первого прохода в мозговом кровообращении, чтобы значительно увеличить локализацию мозга по сравнению с периферическими органами.

Хотя прямая внутримозговская инъекция может быть использована для доставки большого количества клеток в поврежденный мозг, подход приводит к повреждению клеток или кровоизлиянию из-за проникновения иглы в паренчиму, что вызывает локализованное нейровоспаление, потенциально ставя под угрозу выживание и интеграцию вновь поставленных клеток14,,15,,16,,25,,26. Внутриартериальный подход для доставки НСК является выгодным в том, что он избегает этого локализованного повреждения мозга и нейровоспаления, и поддерживает долгосрочное выживание NSCs3,8,9,14,24. Мы наблюдали выживание и дифференциацию инъекционных GPF-NSCs в поврежденном мозге в точках времени до 30 d после инъекции. Хотя мы обнаружили, НСК, которые дифференцированы в зрелых нейронов и астроцитов, подробные исследования необходимы для определения относительного распределения различных типов клеток, генерируемых из GFP-NSCs и пропорций, которые выживают в хронический период постинджури. Что еще более важно, является ли выжившие, экзогенные НСК могут взаимодействовать с составными клетками мозга для восстановления мозговой сети и изменения неврологической функции до сих пор неясно, и должны быть изучены.

В совокупности мы вводим внутриарметный метод доставки для доставки НСК в ишемический мозг, демонстрируя долгосрочную выживаемость в ишемическом полушарии и дифференциацию на нейрональные и глиальные типы клеток. Внутриартерационный подход доставки адаптируется для многочисленных видов и нескольких моделей травмы и болезней ЦНС и может быть использован для доставки других типов клеток или одного или нескольких терапевтических соединений или биопрепаратов, обеспечивая широкую полезность для нейронауки сообщества.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни один.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано следующим образом: AHA Award 14SDG20480186 для LC, Тема инновационная команда Шаньси Университета китайской медицины 2019-ЗН07 для B, и Кентукки спинного мозга и головы травмы научно-исследовательский целевой грант 14-12A для KES и LC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics