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神经干细胞向大鼠和小鼠大脑的动脉内传递:对脑缺血的应用

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Neuroscience

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Summary

报告缺血性中风后,通过普通胡萝卜动脉(小鼠)或外体皮动脉(大鼠)提供神经干细胞的方法,可适应注射溶液或悬浮液。注射的细胞广泛分布于整个脑帕伦奇玛,在分娩后可检测到长达30天。

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Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

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Abstract

神经干细胞(NSC)疗法是中风、创伤性脑损伤和神经退行性疾病的新兴创新疗法。与颅内分娩相比,NSC的动脉内给法侵入性较小,在脑腹皮瘤中产生更分散的NSC分布。此外,动脉内分娩允许大脑循环中的第一通效应,减少细胞在周围器官(如肝脏和脾脏)中诱捕的可能性,这是与周围体外注射相关的并发症。在这里,我们详细介绍了小鼠和大鼠通过普通胡萝卜动脉(小鼠)或外体胡萝卜动脉(大鼠)在缺血性中风后将NSC传递到缺血性中风的异化半球的方法。使用标有 GFP 的 NSC,我们说明了在缺血损伤发生后 1d、1 周和 4 周内在整个啮齿动物异半球中实现的广泛分布,在缺血损伤场址内或附近具有较高的密度。除了长期存活,我们还显示G进P标记细胞在4周内分化的证据。此处为 NSC 描述的动脉内输送方法也可用于治疗化合物的施用,因此对多个物种的各种 CNS 损伤和疾病模型具有广泛的适用性。

Introduction

干细胞(SC)疗法在治疗神经系统疾病方面有着巨大的潜力,包括中风、头部创伤和痴呆症1、2、3、4、5、6。,3,4,5,61,然而,向患病大脑提供外源性SCs的一种有效方法仍然存在问题,2、6、7、8、9、10、11、12、13。6,7,8,9,10,11,12,13通过外周传递途径(包括静脉注射(IV)或内丙酮注射)输送的SC在微循环中受到第一通过滤,特别是在肺、肝、脾和肌肉8、9、13、14,9,13中,14增加了非靶区细胞积累的机会。侵入性脑内注射方法导致局部脑组织损伤和注射,部位,,2、6、8、14、15、16附近的8,1415SCs分布非常有限6我们最近建立了一种基于导管的动脉内注射方法,以提供外源性神经SC(NSC),本文在焦点缺血性中风的啮齿动物模型中进行了描述。我们诱导瞬态(1小时)缺血-再灌注损伤在一个半球使用硅橡胶涂层灯丝遮挡左中脑动脉(MCA)在小鼠或大鼠17,18,19。17,18,19在这个模型中,我们通过激光多普勒或激光斑点成像17,19,在ipilater半球观察到大约75-85%的脑血流(CBF)抑郁症19产生一致的神经缺陷17,18,19。17,18,19

为节省时间,视频设置为以两倍于正常速度和常规外科手术,如皮肤准备和伤口闭合缝合,以及使用和设置电动注射器泵不介绍。在啮齿动物实验中风的中脑动脉闭塞(MCAO)模型的背景下,证明了NSC动脉内传递的方法。因此,我们包括瞬态缺血性中风手术,以便稍后演示如何使用同一动物的前手术部位进行第二次手术,即动脉内注射。通过评估外源性NSC的分布和生存,证明了啮齿动物中风模型中动脉内NSC交付的可行性。NSC治疗对降低脑病理和神经功能障碍的疗效将分别报告。

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Protocol

有关动物主题的所有程序都得到肯塔基大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准,并采取了适当的照顾,以尽量减少与手术相关的压力或疼痛。

1. 注射导管和手术钩的准备

  1. 构造喷射导管(图1)。收集必要的材料,包括:MRE010、MRE025和 MRE050 管材、20 G、26 G 和 27 G 注射针(图2A)、600砂纸、超胶和双组分 5 分钟环氧树脂。
    1. 在针轮毂 1 厘米时切割 20 G 和 26 G 针,并在砂纸上抛光端(图 2B)。用 10 mL 的双蒸馏水冲洗针头以清洁针孔。
      注: 使用两种不同的设计 ( 图 1) .设计 1 具有单个连接器,用于注入溶液或悬架。设计 2 具有 20 G 和 26 G Luer 锁连接器,用于注射细胞(20 G 针)和冲洗死体积(26 G 针),以确保交付全容量的 NSC 溶液。
  2. 设计1:将一个3-4厘米长的 MRE010 导管插入 15 厘米长的 MRE025 导管中,并用超级胶水固定。
    1. 将 MRE025 管的另一端连接到 MRE050 导管段,使用超级胶水进行安全保护。将一根钝化的 20 G 针插入 MRE050 导管的剩余端,用超级胶水固定(图 1)。
    2. 使用环氧树脂胶水进一步强化连接点。此导管设计最适合注射试剂(如化学或药物溶液或其他生物制剂(如细胞因子)。
  3. 设计2:将一个3-4厘米长的 MRE010 导管插入 15 厘米长的 MRE025 导管中,并用超级胶水固定。
    1. 将 MRE025 管的另一端连接到 MRE050 导管段,使用超级胶水进行安全保护。将一根钝的 20 G 针插入 MRE050 导管的剩余端,用超级胶水固定。
    2. 将一根钝化的 26 G 针插入第一针尖附近的 MRE050 管中,按照注射流的方向,用超胶水固定(图 1 和图 2C)。用透明环氧树脂强化针头和 MRE050 管段(图 2C)。这种设计允许注射车辆溶液通过针2(26G)后NSC注射通过针1(20G)冲洗在导管的死体积进入大脑循环,实现更精确的控制注射量。
    3. 使用 20 G 针头进行 NSC 注射,以尽量减少对 NSC 的损害,这可能会对生存能力产生不利影响。
  4. 施工后,用10mL的双蒸馏水冲洗导管,然后用70%乙醇冲洗,然后浸泡在70%乙醇中过夜。
  5. 手术前,从 70% 乙醇中取出导管,用 10 mL 的无菌 PBS 冲洗,并将其放在自动处理手术工具箱中,用于储存和运输。
  6. 手术钩的准备
    1. 从 27 G 针头上切割 1.5- 2 厘米长的针轴,并在砂纸上抛光两端,直到变暗。然后使用一个小的止血夹将轴弯曲成一端的挂钩,并在另一端弯曲成环状。
    2. 插入一个10-15厘米长的 MRE025 导管通过环,并用清晰的手术胶带固定(图2D)。使用相同方法制作 2 个挂钩。
    3. 将所有挂钩和导管系统浸泡在 70% 乙醇中,直到使用。

2. 动物准备:交付、住房、环境适应

  1. 在这项研究中使用了雄性和雌性C57BL/6只小鼠(10-12周,n=10/时间点)和威斯塔大鼠(10-12周,n=10)。
  2. 把它们放在一个环境控制的动物中,用食物和水。
  3. 让他们在中风手术前至少1周适应环境。
    注:一只老鼠和一只老鼠在中风手术后以1:0死亡,一只老鼠在NSC注射前3天被安乐死,因为严重瘫痪,由于人道原因。

3. 小鼠和大鼠神经干细胞的培养

注:NSC 是按照既定协议20 进行隔离和培养的

  1. 鼠标
    1. 从E18胚胎皮层中分离野生型(WT)和GFP标记的NSC,从时间怀孕雌性C57BL/6小鼠与GFP阳性雄性小鼠交配(B6 ACTb-EGFP)。要识别GP(+)胚胎,请使用 FITC 通道在荧光显微镜上观察收获的胚胎。GFP (+) 胚胎产生绿色荧光信号,而 WT 胚胎只显示微弱的自动荧光(图 3A)。
  2. 大 鼠
    1. 将 NSC 与年轻成年 WT 大鼠的补助区 (SVZ) 隔离。按照制造商的指示21在注射前用DII标记它们
  3. 培养小鼠或大鼠NSC,直到它们发展成神经球,并在球体直径达到100μm左右时通过它们(图3B)。使用 NSC 在通道 3 和 5 之间进行喷射。
  4. 使用胚胎干细胞标记面板验证其干细胞特性(图3C)。
  5. 注射当天,收集NSC球体,与细胞分离溶液分离,在无钙和无镁PBS中悬浮至107个细胞/mL的浓度,并放在湿冰上直到注射。

4. 手术准备

  1. 手术前,在商业 MCAO 缝合线上用银色标记笔标记一个点,从尖端的 9 mm(用于鼠标)或 15 mm(用于大鼠),用于手术内插入长度的参考。每次手术前,将手术工具(剪刀、钳子)和器械进行消毒,并在手术间用玻璃珠消毒器进行热消毒。
  2. 通过吸入诱导有5%异氟兰的动物麻醉,用1-2%等氟兰保持麻醉。通过观察一般情况(呼吸模式、胡须运动和自发的身体矫正姿势)、角膜反射和对手趾捏的反应来评估麻醉深度。
  3. 将动物苏平放在加热垫上,用β丁溶液进行剪裁和擦洗,然后用70%乙醇,在动物上准备手术地点。在手术过程中,使用眼科软膏(如人工泪膏),保护动物的眼睛免受干燥。
  4. 让外科医生用细菌磨砂彻底擦洗他们的手,并戴上口罩、无菌手套和干净的实验室外套。

5. 中脑动脉闭塞(MCAO)中风手术

注:在小鼠或大鼠的一个半球中诱导缺血性中风的手术相似,即缝合线被引入内腹动脉(ICA),以遮挡血流(图4)17、18、19、22。17,18,19,22Figure 4然而,选择缝合插入的动脉因后续干细胞注射所需的可用操作空间而有所不同。大鼠在外皮管 (ECA) 部分有充足的空间,允许进行两次单独的顺序手术(中风和 NSC 注射),但小鼠没有,需要替代方法。中风引起的脑血流变化,脑梗塞大小和神经缺陷已经报告,如作者以前的报告17,18,19。,18,19

  1. 为了诱发缺血性中风,在颈椎部位开始用中线切口进行小鼠和大鼠手术,并隔离左普通胡萝卜动脉(CCA)、ECA和ICA(图4)。注意不要伸展、置换或挤压 CCA 或迷走神经。由于动脉的选择和手术步骤不同,因此对小鼠和大鼠的MCAO手术将分别描述。
  2. 鼠标的 MCAO 手术( 图 4A
    1. 在 CCA 下放置三个编织的 6-0 尼龙缝合线(图 4A,步骤 1),并制作一个紧密的手术结,使用近端字符串尽可能远离分叉来遮挡容器(图 4A,步骤 2)。向下修剪缝合端。
    2. 在 CCA 的端侧做一个滑点(注意:不要过度拧紧,因为它将在步骤 6 中释放),并在两个拧紧的结之间松开一个滑点(图 4A,步骤 2)。
    3. 用微切口(图4A,步骤3)在CCA上的近结附近切一个小切口(±1/4-1/3的圆周),并小心插入商用硅橡胶涂层7-0实心尼龙缝合线(图4A,步骤4)。用中间的细绳固定此缝合线,足够紧固(图 4A,步骤 5),以确保切口没有血液泄漏,并且有机硅橡胶涂层尼龙丝没有通过 ICA 回流移动,同时仍然允许缝合线在钳子的轻轻推动下向 ECA 推进。
    4. 松开上部(脱毛)滑点(图4A,步骤6),将尼龙缝合推进到 ICA 中,直到其尖端通过 9 mm 的分叉(使用缝合线上的银标记作为参考)。拧紧上两个滑点,以确保缝合和防止血液回流。
    5. 提取灯丝1小时后(图4A,步骤7)和用中间结的CCA,以防止出血(图4A,步骤5-7以相反的顺序,最终结果,如步骤8所示)。松开上结。用4-0手术缝合关闭伤口。
  3. MCAO 大鼠手术 (图 4B
    1. 在 ECA 下放置两个编织的 6-0 尼龙缝合线(图 4B,步骤 1),并尽可能在远端打一个紧结(图 4B,步骤 2)。
    2. 将血管夹放在 ICA 和 CCA 上,以遮挡动脉血流(图 4B,步骤 3)。滑轮可以用作容器夹的备用。
    3. 用微切口在 ECA 上做一个小切口(图4B,步骤 3-4),插入涂有 6-0 尼龙丝的商业硅橡胶(图 4B,步骤 5),并在 ECA 上用滑点正确固定。
    4. 松开 ICA 上的容器夹,将灯丝推进到 ICA 中,直到银标记 (15 mm) 到达分叉(图 4B,步骤 6),然后用 ECA 上的第 2节固定缝合线(图4B,步骤 6)。
    5. 缺血1小时后,取出这种灯丝并开裂以防止出血(图4B,步骤7),从CCA中去除血管夹(最后结果,如步骤8),用4-0手术缝合关闭伤口。

6. 恢复

  1. 中风手术后,将动物放在加热垫上,直到它们完全恢复知觉。
  2. 通过皮下注射提供镇痛。将动物返回家中的笼子里,获得水和食物。

7. 动脉内注射

  1. 用70%乙醇清洗整个导管,浸泡过夜,直到使用。注射前,用无菌注射器连接针头的 Luer 锁,用 10 mL 的无菌 PBS 清洗导管系统的整个流明侧。
  2. NSC 注射的时间窗口和准备
    注:根据经验和来自其他研究团队的报告,NSC注射的时间对于受试者和外源的NSC的生存至关重要。在我们的试点研究中,在早期时间点注射NSC(再灌注后前6小时内)导致更高的死亡率。因此,我们测试了后期注射时间点,确定了中风后2d(48小时)至3d(72小时)之间的时间窗口对动物来说是安全的和可容忍的,并且有效地实现了NSC的腹内分布。
    1. 将小鼠注射器泵注射速率设置为 20 μL/min,小鼠为 50 μL/min。注射速度过快或持续时间过长可能导致全身体积过载,小鼠比小鼠更容易感染。
    2. 简言之,在中风手术后3天,用异氟兰麻醉动物,并把它们放在加热垫上。
    3. 重新打开颈椎伤口并再次暴露非洲经委会、国际妇女和再加伤委员会(图5,步骤1)。与中风手术一样,根据物种确定注射路线。利用 CCA 在小鼠中注射 NSC,利用 ECA 进行大鼠23
  3. 通过小鼠中的 CCA 进行动脉内注射
    1. 在 CCA 下放置两个 6-0 编织尼龙缝合线。创建一个松散的滑点,每个滑点与每个从上一个中风手术的分叉和下结之间(图5,步骤2)。
    2. 拧紧上滑点,然后在下结上方做一个小切口(图5,步骤3)。插入 MRE010 导管穿过切口(图 5,步骤 4),并在中间结中固定,而不会阻塞喷射流(图5,步骤 5)。释放上结和调整导管位置时,应看到导管中的血回流。
    3. 将容器夹放在 ECA 上,在 20 μL/min 下通过导管注入 1 x 106 GFP-NSC,用注射器泵注射 5 分钟,然后以相同的速度用 50-100 μL 的 PBS 冲洗。
    4. 注射后,用上滑结将切口上方的CCA粘附,并提取 MRE010 导管(图5,步骤6)。拧紧并修剪中间结和上结。从 ECA 上拆下容器夹。请参阅图5 中的最后图像,步骤 7。
    5. 用4-0手术缝合关闭伤口。
    6. 在加热垫和皮下镇痛注射上提供充分恢复后,将动物返回家中的笼子。
  4. 通过大鼠的 ECA 动脉注射
    1. 使用容器夹暂时遮挡 ECA 和 CCA(图 5,步骤 2)。
    2. 在 ECA 的近端做一个小切口(图5,步骤 3),插入 MRE010 导管,并用结固定(图5,步骤 4)。
    3. 拆下两个容器夹,在 50 μL/min 的 100 μL PBS 中注入 5 x 106 NSC 2 分钟,然后使用电动注射器泵以相同的速度用 50-100 μL 的 PBS(图 5,步骤 5)冲洗。
    4. 注射后,再次用容器夹封住 CCA 和 ECA,并在注射导管退出后将 ECA 在第二个切口的近端(图 5,步骤 6)起立。
    5. 拆下两个血管夹(图5,步骤7),用4-0手术缝合线关闭伤口。
    6. 在加热垫和皮下镇痛注射上提供充分恢复后,将动物返回家中的笼子。
  5. 组织学分析
    1. 从接受缺血性中风的小鼠和大鼠身上收集大脑,然后注射NSC或车辆溶液后安乐死和心内灌注与4%的半甲醛在1d(小鼠和大鼠),7d(小鼠)和30d(小鼠)注射后。这四组动物由5只NSC和5个车辆注射动物组成。
    2. 修复大脑过夜和冷冻保存在30%蔗糖3d。
    3. 将大脑嵌入 OCT,在 40 μm 厚度下切片,并检查使用细胞特异性标记进行免疫后 NSC 的分布,包括胶质纤维酸蛋白(GFAP、星形细胞)、Tuj1(成熟神经元)和双皮质蛋白(DCX,未成熟的神经元)。
      注:由于缺乏表达GP的老鼠菌株,我们使用DI,一个瞬态荧光标签,用于大鼠NSC,它只允许相对短期的观察。因此,在大鼠中风后,只在1天时检查NSC分布。

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Representative Results

在缺血性大脑中很容易检测到标有GPC的NSC,主要是在缺血性半球,特别是在五角细胞和沿着损伤边缘(图6)。在成像和分析过程中,检查员是单盲的。

例如,在注射后 1 d 时,在小鼠海马体内检测到 NSC。即使在这个早期点(图6A),NSC的子集也显示了凹陷陀螺中未成熟的神经元标记DCX的共表达(图6A)。

在中风后10天(NSC注射后7天),在分圈和皮层损伤边缘(分水岭区)的外源性GPC-NSC观察到最高密度(图6B)。值得注意的是,注射后7天,许多GPC-NSC也表示DCX(由蓝色圆圈显示),表明它们的神经元命运。与接受车辆溶液注射的动物相比,NSC注射也增加了半球的DCX染色(红色)。

注射后30天,在受伤的皮层中仍检测到NSC,其中一部分显示胶质标记GFAP(图6C)或成熟神经元标记Tuj1(图6D),表明外源NSC有可能分化成胶质或神经元的命运,并在受伤的大脑存活长达1个月。

Figure 1
图1:注射导管的示意图设计。我们介绍两种设计,设计1用于复合溶液注射,设计2用于细胞注射。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:为NSC注射和手术钩准备导管。A) 导管结构材料:MRE010、MRE025和 MRE050 导管长度分别为 3 厘米、约 10-15 厘米和 3 厘米。(B) 切断针头,抛光至钝。(C) 连接每个段,用超级胶水固定,然后嵌入两个针路锁和 MRE050 段环氧树脂增强。(D) 使用27G针轴和 MRE025 导管制作手术钩。比例线: 5毫米。请点击这里查看这个数字的较大版本。

Figure 3
图3:GFP(+)神经干细胞培养。A) 使用 FITC 通道用荧光显微镜识别 GFP (+) 胚胎。(B) 分离和培养皮质 NSC,直到它们形成神经球。比例线: 100 μm. (C) 使用干细胞标记面板检查神经球特性。比例线: 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:小鼠或大鼠分步中脑动脉闭塞(MCAO)中风手术的示意图图像。有关详细的外科手术,请参阅视频。ICA,内胡萝卜动脉;非洲经委会,外部胡萝卜动脉;CCA,常见的胡萝卜动脉。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:小鼠或大鼠动脉内神经干细胞注射的示意图图像。有关详细的外科手术,请参阅视频。ICA,内胡萝卜动脉;非洲经委会,外部胡萝卜动脉;CCA,常见的胡萝卜动脉。绿色箭头指示喷射过程中的流动方向。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:缺血脑神经干细胞(NSC)的分布、生存和分化。A) 注射后1天,在海马体内检测GPC(+)NSC。干细胞荧光绿色;双皮质 (DCX) 免疫污,以红色显示。白色箭头表示具有 DCX 表达式的 GFP (+) NSC。(B) 在假对症控制(无注射)和车辆(I-R)或NSC(I-R+NSC)注射小鼠后,GFP(+)细胞和DCX标记细胞的原理图图以10d。缺血侮辱的地形图在上一个示意图中描述,其中较浅和较深的橙色分别表示受到缺血挑战的区域和坏死核。蓝带表示"分水岭"区域。灰色矩形描绘了拍摄 (C) 和 (D) 的图像的位置.(C,D)外源性 NSC 可以在分娩后 30 d 中区分为胶质命运 (GFAP, C) 或神经元命运 (Tuj1, D) 。在接受车辆注射的中风动物(CD中的车辆)的感染动物的感染(GFP)通道中未观察到任何显著信号,而在NSC注射小鼠中,存活的GGFP-NSC被可视化,并用GGFAP(C)或Tuj1(D)染色进行结肠化。CD箭头指示 2 个通道的叠加。比例线: 20 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

神经系统疾病的干细胞治疗仍处于早期探索阶段。一个主要问题是,没有既定的方法,充分交付SC或NSC到大脑。

虽然静脉注射(IV)、内皮内(IP)或腹内/脑内注射后,在大脑中可以检测到外源性SC/NSC,但每种分娩方法都有缺点。脑内可检测的种群估计在外周注射(IV或IP)时非常低,只占注射或注入细胞的一小部分。脑内注射产生非常焦的分布,并可能直接诱发脑损伤2,6,7,8,9,10,11,12,13。,6,7,8,9,10,11,12,13因此,我们测试了动脉内注射的可行性,作为缺血性中风后NSC分娩的替代方法。这种方法通过中风侮辱后通过静脉脑灌注提供 NSC。如果中风后早期注射,外源性NSC可以穿过被破坏的血脑屏障(BBB),从而在整个大脑中实现广泛的分布。动脉注射的一个优点是,它利用中枢神经系统内的第一通效应,最大限度地发挥外源NS在大脑中沉淀的潜力,与细胞首先通过肺和肝脏等过滤器官的丰富微循环的外围传递途径形成鲜明对比。

此处描述的动脉内方法用途广泛,可适应不同类型的输送模式和伤害或疾病模型。虽然在目前的研究中只进行一次动脉内注射,但 MRE025导管可以连接到一个嵌入皮下微端口,通过该端口,动物可以接受重复的动脉内注射12。此外,采用更简单的单流明设计,这种注射方法可用于溶液12、23中的试剂输送。如果需要提供多种治疗,可以使用双流明设计同时或顺序使用第二种药物或化合物提供初始溶液。对于用于神经退化或创伤性脑损伤的啮齿动物模型的应用,如果不需要第一次中风手术,可以在 ECA 上进行小鼠注射导管安装手术(与大鼠相同的方案,适当调整小鼠在步骤 7.4 中的注射量和速率),以避免脑血流通过 CCA 的潜在干扰。

应考虑这种动脉内注射的一些缺点和潜在的不利后果。动物接受第二次手术,这带有与麻醉或手术相关的并发症的可能性。脑血流经异血CCA是紊乱,虽然暂时(不到几分钟),这可能诱发CBF轻度抑郁症的另一个短暂发作。此外,BBB干扰或开口对于动脉内NSC分娩至关重要,这限制了治疗窗口。在试点研究中,在动脉注射后,在天真的大脑中几乎没有检测到GPC(+)NSC。但是,如果患者能够容忍可以暂时打开 BBB 的药物,如高渗透性硝基醇或盐水,这可用于创建一个 BBB 打开的瞬态窗口,用于以后的 NSC 注射。在初步研究中,我们发现中风后前6小时内的动脉注射导致的死亡率高于单独观察到的中风。这可能与第一次手术后相对较短的恢复期后的第二次侵入性手术有关。或者,在缺血性侮辱之后,受伤的脑血管可能具有较高的收缩倾向,以响应任何额外的刺激,如导管引入、额外的液体加载或在注射后将外源性 NSC 附着到发光壁上。关于中风后NSC分娩的另一个合理关注是,NSC可能形成进一步遮挡或干扰微纤维的浮雕。与之前的报告8,16,24,,24我们没有发现重要的证据,GFP (+)栓塞在微血管,虽然我们确实发现GPC(+)在周围空间(Virchow-Robin空间)注射后的早期。8,优化注射时间窗后,本研究中接受车辆或 NSC 注射的中风组之间的并发症或死亡率没有差异。因此,正确设计的动脉内NSC注射是针对神经系统疾病的一种安全有效的NSC治疗方法。

为了成功进行NSC注射并改善动物效果,在中风手术或NSC注射期间应谨慎处理几个方面。应实行一般手术支持和护理,如角膜保护和核心温度的维护。在这里,我们介绍一些潜在的并发症,这个特定的手术和指导,以尽量减少其发生。

迷走神经会有压力。在手术过程中,迷走神经不应拉伸、压碎、连接或刺激。偶然刺激迷走神经可诱发心律失常,如心动过速、心脏骤停,甚至死亡。

不当放置或紧固缝合线,或错位或滑下血管夹可能导致从 CCA 的近端(从心脏输出)或远端通过威利斯圆的动脉出血。在每个步骤中,确保正确放置血管夹或结,以遮挡血流。如果出血发生,请尝试恢复结或容器夹的正确位置。如果视场与血液模糊,将无菌棉签的尖端放在 CCA 上,并按住压力以阻止血液流动。出血引起的血红蛋白将促进动脉切口的关闭。止血后,拧紧结或将血管夹放在正确的位置,清洁视场中的血液并继续手术。

导管插入可能会造成伤害或并发症。以 45° 角修剪 MRE010 尖端,以便轻松进入动脉上的小切口,而不会诱发任何血管损伤。在极少数情况下,过度锐化的尖端可能会穿透动脉或进入地下室膜和图尼卡外膜之间的空间。为了避免这些伤害,在动脉上做一个合适的尺寸切口。我们建议动脉的周长为 1/4-1/3,该周长足够大,允许导管尖端进入,但血管壁上保留足够的强度,以包裹在导管外。切口太大可能导致切口部位动脉撕裂。轻轻引导 MRE010 导管尖端进入切口。不要强迫导管尖端进入或导管的推进。如有必要,可以使用锋利的钳子提升切口的边缘。相对于动脉以低角度推进导管,使导管和动脉几乎平行。

也有潜在的注射相关并发症。动脉注射的一个常见并发症是体积负荷过大,这可能导致急性心脏过载和肺水肿。快速喷射率可以放大这些风险,并造成损坏的船壁8。因此,应仔细控制速率和总容量。我们建议在短时间(如 5 分钟)内使用 20 μL/min,因为小鼠通常是安全的。如果注意到体积过载的症状,如快速,浅呼吸,粉红色气泡从纳雷斯,或焦虑症样异常运动,注射应停止或中止,并允许动物恢复。另一个可能的并发症是在脑血管系统中形成NSC栓塞。悬浮液不应含有钙或镁,已知钙或镁可促进细胞聚集。为了减少诱导栓塞的机会,应于注射前在显微镜下检查NSC的单细胞悬浮液,以确认没有细胞簇。如果存在细胞簇,用无菌 1 mL 移液滴定,直到实现单细胞悬浮。

本研究确定了小鼠和大鼠动脉内分娩方法的可行性,并揭示了这种在缺血性中风背景下的NSC动脉内注射的几个重要特征。与在脑内注射1、7、9、11、15、16中存活1,7,9,11,15,的NSC相对焦分布相比,我们观察到整个半球的扩散分布,包括皮层、海马和色带。因此,动脉内分娩不仅适合中风,而且适合多种损伤类型或涉及弥漫性脑损伤的疾病。在 MCAO 的设置中,在损伤场边缘发现最集中的 NSC。五角面积外源性 NSC 密度的增加可能是由于通过重新建立的血液灌注和开放 BBB 的附带流量以及 NSC 向受损区域迁移而向该区域输送的增加。虽然四次分娩的SC可以导致扩散分布,但到达大脑的细胞数量估计只占传递总数的一小部分,部分原因是外围器官8,13过滤。根据先前对脑转移12的研究,动脉内注射的白西拉酶标记的D122肿瘤细胞利用第一通效应在脑血管中沉淀下来,并在大脑而不是周围器官中发展转移位点。脑转移位点由于外源肿瘤细胞检测到在脑异体注射后1周使用IPVIS成像系统检测生物发光信号通过完整的头骨和头皮。相比之下,来自周围器官(如肝脏、肺和肌肉)的发光信号(指示与外源肿瘤细胞相关的肿瘤负担)直到动脉注射后3-4周才被检测到。因此,我们预计,在类似情况下,动脉内NSC的传递也将受益于大脑循环的第一通效应,从而与周围器官相比,大大增加大脑的定位。

虽然直接脑内注射可用于向受伤的大脑传递大量细胞,但这种方法会导致细胞损伤或出血,因为针头穿透的帕伦奇玛触发局部神经炎,可能,损害新分娩细胞,14、15、16、25、26,15的生存25,和整合16NSC分娩的动脉内方法是有利的,因为它避免了这种局部的脑损伤和神经炎,并支持,,NSC3,8,9,14,24,8,914的长期生存。我们观察到注射GPF-NSC在注射后30d的时间点在受伤大脑的生存和分化。虽然我们发现NSC已经分化成成熟的神经元和星细胞,但需要详细的研究来确定从GPC-NSC产生的各种细胞类型的相对分布,以及存活到慢性后伤害期的比例。更重要的是,存活的外源性NSC能否与构成性脑细胞相互作用,重建脑网络和改变神经功能尚不清楚,应该探讨。

综合起来,我们引入了动脉内传递方法,将NSC传递到缺血性大脑,证明在缺血半球的长期生存,并分化成神经元和胶质细胞类型。动脉内分娩方法适用于许多物种和多种中枢损伤和疾病模型,可用于其他细胞类型或单一或多种治疗化合物或生物制剂的交付,为神经科学界提供广泛的效用。

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Disclosures

没有。

Acknowledgments

这项研究得到了以下支持:LC的AHA奖14SDG20480186,山西中医药大学2019-QN07的BZ学科创新团队,以及肯塔基脊髓和头部损伤研究信托基金14-12A的KES和LC奖。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

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