Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en bra modell att studera axonal och intracellulär transport. Här beskriver jag ett protokoll för in vivo inspelning och analys av axonal och intraflagellar transport i C. elegans.
Abstract
Axonal transport och intraflagellar transport (IFT) är avgörande för axon och flimmerhåren morfogenes och funktion. Kinesin superfamiljen proteiner och dynein är molekylära motorer som reglerar anterograd och retrograd transport, respektive. Dessa motorer använder mikrotubulära nätverk som skenor. Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en kraftfull modellorganism att studera axonal transport och IFT i vivo. Här beskriver jag ett protokoll för att observera axonal transport och IFT i levande C. elegans. Transporterade gods kan visualiseras genom att tagga Last proteiner med hjälp av fluorescerande proteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP). C. elegans är transparent och GFP-märkta Last proteiner kan uttryckas i specifika celler under-specifika initiativtagare. Levande maskar kan fastställas av mikrokulor på 10% agarosgel utan att döda eller anesthetizing maskar. Under dessa förhållanden, Last rörelse direkt kan observeras i axoner och flimmerhåren levande C. elegans utan dissektion. Denna metod kan tillämpas till observation av någon last molekylen i alla celler genom att ändra målproteiner eller de celler som de uttrycks i. Mest grundläggande proteiner som molekylära motorer och adapter proteiner som är involverade i axonal transport och IFT bevaras i C. elegans. Jämfört med andra modellorganismer, kan mutanter erhållits och underhålls lättare i C. elegans. Kombinera denna metod med olika C. elegans mutanter kan klargöra molekylära mekanismer för axonal transport och IFT.
Introduction
Levande cellen bildbehandling är ett viktigt verktyg för att analysera intracellulära transport. I neuronala cellbiologi är analyser av axonal transport med levande cell imaging nödvändiga för att förstå neuronal funktion och morfogenes1. Defekter i axonal transport ligger bakom flera neurodegenerativa sjukdomar2. Kinesin superfamiljen proteiner och dynein axonal transport anterogradely och utföra retrogradely, respektive1,2.
Cilierna är en annan mobilfack där det mikrotubulära nätverket och människohandel maskiner är högt utvecklade3. Proteinsyntes maskiner är inte lokaliserade i flimmerhåren, vilket innebär att ciliär proteiner måste transporteras från cytoplasman till flimmerhår tips. Cilier-specifika kinesin och dynein, kallas kinesin-2 och cytoplasmiska dynein-2, respektive, transportera komponenterna i flimmerhåren4, i ett fenomen som kallas intraflagellar transport (IFT)5. Nedskrivning av IFT orsakar ett spektrum av sjukdomar som kallas ciliopathies6. Således krävs analys av IFT mekanismen av levande cell imaging att förstå grundläggande mekanismer ciliär bildandet och patogenes.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en bra modell att studera axonal transport och IFT7,8,9. För att observera IFT, har Chlamydomonas varit allmänt används som en modell organism5,6. Chlamydomonas är en encellig organism, skulle förhållandet av IFT med åldrande, nervcellernas funktion och beteende vara svåra att analysera. Dessutom har viktiga genetiska tekniker såsom CRISPR/Cas9 inte tillämpats på Chlamydomonas. I högre modellorganismer, såsom möss och Drosophila, orsakar störningar av axonal transport och IFT ofta dödliga fenotyper eftersom axonal transport och IFT är väsentliga för morfogenes och homeostas av djur 10, 11. När det gäller möss behövs cellkultur och transfection generellt att iaktta axonal transport och IFT, vilket kräver många färdigheter och omfattande tid12,13. Dessutom förloras en hel del viktiga fysiologiska sammanhang i odlade celler och cellinjer. Eftersom nervsystemet inte är avgörande för överlevnaden av maskar, C. elegans mutanter som axonal transport eller IFT störs är ofta inte dödliga7,9,14. Axonal transport och IFT kan observeras direkt i vivo utan dissektion eftersom C. elegans är transparent och det är därför lätt att observera GFP-märkta markörer.
I området i närheten finns det flera protokoll att immobilisera C. elegans, till exempel med en mikroflödessystem enhet15, agaros pads med anestesi16eller mikrokulor17. Införandet av anestesi kan hämma människohandel händelserna i nervceller15. En klar nackdel för metoden mikroflödessystem-enhet är att förbereda en mikroflödessystem enhet inte är alltid lätt. Istället är immobilisering av agaros kuddar och mikrokulor ett bekvämt och enkelt sätt att utföra time lapse imaging i C. elegans. Här beskriver jag detta grundläggande protokoll för att immobilisera C. elegans och visualisera axonal transport och IFT i vivo i C. elegans. Jämfört med de andra metoderna, den metod som beskrivs här kräver inte särskild utrustning och är mycket billigare och lättare att utföra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provberedning
- Generera en transgena C. elegans stam av intresse med hjälp av transgena metoder 18. Alternativt skaffa lämpliga stammar från Caenorhabditis genetik Center (CGC). För att visualisera axonal transport av synaptiska vesikelproteinet prekursorer, använda den transgena linje wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Att observera IFT, få de transgena linje mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Dessa stammar som används i detta protokoll.
Obs: Antingen extrachromosomal array, genomisk integration eller ens GFP inpressning verk. För att minska bakgrunden signaler, använda cell-specifika initiativtagare, i stället för pan-neuronala initiativtagare.
Obs: Underhåll av maskar beskrivs i andra protokoll 20. Stammar bibehölls på gräsmattor av Escherischia coli OP50 mataren på nematoder tillväxt medium (NGM) plattor (1,7% (w/v) agaros, 50 mM NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL kolesterol, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 på 60 mm diameter plast rätter) vid 20 ° C. - Växa maskar vid 20 ° C på NGM tallrikar till varje livscykelstadium av avmaskar.
Obs: En kan observera både axonal transport- och IFT i något skede. Sen L4 till ung vuxen är en bra positiv kontroll eftersom flera publikationer har använt dessa stadier och visualiserade människohandel händelser 14 , 21 , 22 , 23.
2. Beredning av 10% agaros
Obs: många leverantörer tillhandahåller liknande produkter såsom agar agar pulver och agaros. Använda elektrofores grade agar (gel styrka > 1200 g/cm 2). Billigt agar pulver fungerar inte eftersom den resulterande gel inte är tillräckligt stark för att immobilisera maskar.
- Mix 0,4 g agaros i 4 mL destillerat vatten (DW) i ett glasrör (1,5 x 10,5 cm). Lägga locket på glasröret för att undvika avdunstning.
- Sätta glasröret på en 95 ° C värme block för 90 min. Dessutom förbereder en annan glasrör (1,5 x 10,5 cm) fylld med DW och hålla den på 95 ° C. sätta en Pasteur Pipettera i 95 ° C DW ( figur 1 A). En hel del små bubblor kommer att ses i agaros röret och lösningen ska vara grumligt. Lämna det tills lösningen blir klar. Sedan blanda genom pipettering upp och ner tills agar lösningen blir homogena.
Obs: Mikrovågor kan inte användas för att förbereda 10% agaros lösning när gjorda av DW och agaros. Små bubblor som orsakas av mikrovågor förhindra agaros smältning. Stelnad 10% agarosgel kan dock enkelt smältas igen med en mikrovågsugn. Glasrör innehållande 10% agarosgel kan vara beredda i förväg och förvaras vid 4 ° C i minst 6 månader. Om att göra så, smälta beståndet i mikrovågsugn när det behövs och börja från steg 3 i detta protokoll.
Obs: Agaros gradvis förlorar förmågan att stelna om inkuberas vid 95 ° C under en lång tid eller efter upprepade stelning och smältning. Om detta händer, förbereda nya 10% agaros.
3. Beredning av agaros Pad
- använda den värmde Pasteur Pipettera bereddes i steg 2.2, placera 2 droppar 10% agaros på en 76 x 22 mm bild.
- Snabbt täcka med en andra 76 x 22 mm 2 bild innan agarosen drop stelnar som visas i figur 1 B och tryck ner på den andra bilden att platta agaros lösningen. Tjockleken bör vara 0,5-1 mm.
- Snabbt spola Pasteur pipetten genom pipettering 95 ° C DW upp och ner tills agar lösningen tvättas ut. Annars kommer Pipettera blir igensatta av agarosgel. Lämna den pipett stående i 95 ° C DW.
- Vänta på 1 min. Agaros pad bildar och blir grumligt. Skjut sedan, bilderna apart för hand ( figur 1 C).
4. Montering av maskar
Obs: även små mängder mask rörelse förhindra bra observation. Levamisol har traditionellt använts för att förhindra att masken rörelse på agaros pad 24 , 25. Dock Levamisol hämmar neuronala receptorer i C. elegans, och därför kan påverka människohandel händelser i nervceller 15. Med hjälp av polystyren mikrokulor beskrivs härär en bra alternativa 17.
- i stereo Mikroskop utrustat med en skjutbar spegel genomlysning, överföra ~ 30 transgena maskar att uttrycka de lämpliga markörerna till en ny NGM tallrik utan bakterier använder en platina tråd plocka.
Obs: En platina tråd pick är gjord av platina tråd och Pasteur-pipett (5 tum) och spetsen av platina tråd var tillplattad. Beredning av platina tråd plockar och hantering av maskar med dessa beskrivs i Wormbook (http://www.wormbook.org). - Lämnar plattan för 1 min. bakterier tas automatiskt bort från ytor av maskar som maskarna flytta på NGM agarosgel utan bakterier.
- Put a 0,5-1,0 µL droppe av 2,6% 100 nm diameter polystyren mikrokulor i vatten på agar pad ( figur 1 D). Överför 10-20 maskar från bakteriefria NGM plattan till mikrokulor. Släpp och sprida maskar med hjälp av platina tråd plocka för att undvika överlappning mellan mask organ ( figur 1 E).
- Lägg på ett täckglas över 2 22 x 40 mm ( figur 1 F). Tryck försiktigt att avlägsna luftbubblor, men undvika förkrossande maskar. Provet är nu klar för imaging.
Obs: Eftersom ingen anestesi administreras, maskar är fasta endast genom den friktion kraft som genereras av agar pad, polystyren mikrokulor och täckglas 17. Förekomsten av mataren bakterier och/eller för mycket lösning kommer att göra den friktion kraften svagare.
Obs: Olika storlekar av coverslips (t.ex., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) arbete. Dock större coverslips kan förhindra nedsänkning vatten eller olja från de objektiv som läcker in prover under observation.
5. Observation
Obs: imaging parametrarna (lasereffekt, viktökning, binning, etc.) kommer att variera för varje Mikroskop system och kamera. Här widefield Mikroskop utrustad med en snurrande bricka confocal scanner och en digitala CCD-kamera används.
- Inställd temperaturkontroll av scenen på 20 ° C, eller justera rumstemperaturen till 20 ° C.
- Sätta prov bilden på Mikroskop scenen. Använd 100 x (numerisk bländare = 1,3 eller bättre) objektiv.
- Leta efter de områden som anges i figur 2 A (för wyIs251 och axonal transport) eller figur 2 B (för mnIs17 och IFT) som positiva kontroller . Andra områden kan analyseras som väl 22.
- Uppsättning parametrar (CCD vinst = 200, Binning = 1 eller 2, lasereffekt på 488 nm = 1,0-1,3 mW). Utföra tid förflutit inspelning på 4 bildrutor/s för upp till 1 min. Spara filer som mutli-TIFF format.
Obs: Om GFP signaler försvinner och det är svårt att fortsätta att observera GFP::RAB-3 eller OSM-6::GFP för 30 s, laser strömmen är för stark. I så fall minska laser strömmen. Omvänt, om ingen vesikulär rörelse registreras, laser strömmen är för svag. I så fall, öka lasereffekten. - Observera en annan mask och upprepa 5.3 och 5.4. Observationerna kan pågå i upp till 20 min, men varje mask bör registreras endast en gång för att undvika effekterna av pHoto skador.
Obs: Maskar har observerats i minst 20 min utan betydande brister 7 , 27 , 28. Längre observation kan vara möjligt men haven ' t varit testat ännu. Ett tydligt tecken på neuronala dödsfall är ändringen av neuronala morfologi såsom neurite svullnad. Som svaga GFP signaler kan ses i axoner och dendriter i både wyIs251 och mnIs17, kan neurite morfologi lätt kontrolleras genom att bara titta på axoner eller dendriter. Neuronala morfologi visas i figur 2. - Generera filmfiler.
- Öppna flera TIFF filer med Fiji programvara. Gå till Arkiv > öppna Välj sedan flera TIFF-filen sparats i steg 5,4.
Obs: Fiji kan hämtas på jttps://fiji.sc. Bild J och plugins kan också användas för att generera kymographs. Om att göra så, följ instruktionerna relevanta för den valda plugin. - Klicka på den " Rektangulär markering " ( figur 3 A, pil) och välj området av intresse genom att rita en rektangel med en datormus (gul rektangel i figur 3 A). Gå till bild > stackar > verktyg > göra Substacks och välj den segmentnummer som ingår i filmen. En substack genereras.
- Aktivera substack fönstret genom att klicka och gå till bild > justera > ljusstyrka/kontrast. Ett fönster för att justera ljusstyrka och kontrast visar upp. I fönstret, Skjut upp bar (Minimum) till höger så att bakgrunden signalen försvinner och andra toppen bar (max) till vänster så att rörliga blåsor och partiklar kan ses väl över bakgrunden.
- Gå till bild > stackar > tid Stamper. Filmen är inspelad på 4 bildrutor/s i steg 5,4, tidsintervallet är 0,25 s. Således skriver " 0,25 " i intervallet.
- Generera en movie fil genom att välja Spara som > AVI från menyn Arkiv (Movie 1 och 2).
Obs: Genom att använda lämpliga plugins, du kan spara filen som andra format såsom " mpeg4 " eller " mov " filer.
- Öppna flera TIFF filer med Fiji programvara. Gå till Arkiv > öppna Välj sedan flera TIFF-filen sparats i steg 5,4.
- Generera kymographs.
- Öppna de ursprungliga filmfiler med FIji programvara igen och upprepa steg 5.6.2 och 5.6.3 att justera ljusstyrka och kontrast.
- Klicka " segmenterad linje " ( figur 3 B, pil). Använda en mus, rita en segmenterad linje längs cilier eller axon (gula linjen, i figur 3 B).
- Gå till analysera > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( figur 3 C). Linje bredd fönster visas ( figur 3 D). Typ " 3 " i Linewidth fönstret och klicka på OK ( figur 3 D).
- Kymograph fönstret skapas. Spara bilden i TIFF- eller JPEG-format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Axonal transport i DA9 neuron
Använda den wyIs251 linjen, både anterograd och retrograd axonal transport av GFP::RAB-3 kan spelas samtidigt i DA9 motor neuron. Den genomsnittliga hastigheten för anterograd och retrograd transport i proximala dorsala axonet av DA9 neuron är ca 1,8 och 2,6 μm/s, respektive22. Antalet rörliga blåsor handlar om 0,03 och 0,018 per μm av axon per s. Således för en 30 s observation av 10 μm av DA9 axon använder ett 100 x objektiv, finner du ca 9 och 5 flyttar blåsor i axonet (figur 4 och film 1). Om ingen vesikulär rörelse kan observeras, är det möjligt att laser strömmen är för svag. Förutom lång räckvidd körningar, kort räckvidd rörelse av vesikler pooler kan vara inspelad (film 1). Några blåsor stannar vid dessa vesikler pooler, medan andra tar avstånd från det7,23. Dessa parametrar kan övervakas och används för att analysera mutant fenotyper.
IFT i svansen nervceller
Cilier är lokaliserade till spetsen av dendriter i C. elegans (figur 2B). Den mnIs17 stammen uttrycker GFP-märkta OSM-6, en av de IFT subenheter29. OSM-6 uttrycks i både huvud och svans nervceller19. Medan många huvud cilier är märkta av mnIs17, är bara två cilier tydligt hos svans neuron. Att observera dessa cilier är alltså lättare än huvudet cilier (se också diskussionen). OSM-6::GFP är diffus i neuronala cytoplasman som finns i axon, cell kroppen och dendrite. Men i flimmerhåren, är OSM-6::GFP koncentrerad till flimmerhår och införlivas i rörliga partiklar. Längden på PHA och PHB cilier är cirka 6,5 μm. Anterograde IFT är bifasisk 8,9. Hastigheten på anterograd IFT handlar om 0,7 och 1,3 μm/s i mitten och distala segment av flimmerhår, respektive (figur 5 och Movie 2).
Figur 1 : Demonstration av provberedningen. (A) heta DW, Pasteur Pipettera och 10% agaros på värme block. (B och C) Beredning av agaros kuddar: en agaros pad bildas mellan diabilder (B). Den övre bilden tas bort efter en agaros pad former (C). (D) Schematisk skiss visar hur polystyren pärla lösning är pålagd agaros pad. (E) Schematisk skiss visar hur maskar sätts i polystyren pärla lösningen med en platina tråd plocka. (F), A täckglas (22 x 44 mm2) sätts på agaros pad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Imaging område. (A) Schematisk ritning av DA9 och VA12 nervceller och en representativ bild av wyIs251. I DA9 nervceller har inte mogen synapser i den ventrala axon, commissure och proximala axon. Men synaptiskt vesikelprotein prekursorer transporteras från cellkroppen till synapser via dessa axonal regioner. Regionen som bör observeras framgår av lådor. (B) Schematisk ritning av PHA och PHB nervceller och deras cilier. Regionen som bör observeras framgår av lådor. Skalstapeln = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Generation av filmer och kymographs med Fiji programvara. (A) Klicka på knappen ”Rektangulär markering” (pil) och markera det område som man skulle vilja fokusera på genom att rita en rektangel (gul ruta) för att generera substacks. (B) Klicka på knappen segmenterad linje (pil) och rita en segmenterad linje längs flimmerhåren använder en mus (gula linjen). (C) Välj ”analysera”, ”Multi Kymograph” och ”Multi Kymograph” att starta en plugin att generera kymographs. (S) ingång linewidth, klicka ”OK” och generera kymographs (figur 5 och figur 7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa kymograph av axonal transport av synaptiska vesikelproteinet prekursorer. GFP::Rab-3 rörelse observeras på den proximala asynaptic regionen DA9 neuron och kymograph genererades med Multi Kymograph i Fiji. Vågräta och lodräta staplarna representerar längd och tid, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa kymograph för IFT. OSM-6::GFP observeras i PHA och PHB cilier och denna kymograph genereras från händelsen människohandel i något av dem. Kymograph genererades med Multi Kymograph i Fiji. Vågräta och lodräta staplarna representerar längd och tid, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: representativa film av axonal transport av synaptiska vesikelproteinet prekursorer. GFP::Rab-3 rörelse observeras på den proximala asynaptic regionen DA9 neuron. GFP::Rab-3 är införlivas synaptiskt vesikelprotein prekursorer och transporteras. Här bokförs både anterograd och retrograd axonal transport. Några blåsor stannar men startar om igen. Filmen spelades in på 4 bildrutor/s och spelar på 15 bildrutor/s. ScaLe bar = 5 μm. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 2: representativa film av IFT. OSM-6::GFP observeras i PHA och PHB cilier. OSM-6::GFP inkorporeras i den komplexa IFT och rör sig längs flimmerhåren. Filmen spelades in på 4 bildrutor/s och spelar på 15 bildrutor/s. skalstapeln = 5 μm. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begränsning med avseende på befintliga metoder
Den metod som beskrivs här är optimerad för att observera snabba händelser såsom axonal transport och IFT. Immobilisering är således mer prioriterat än längre inkubation. Medan vi har kunnat iaktta människohandel händelser i minst 20 min utan betydande störning, kanske denna metod inte alltid lämpligt att observera långsamma händelser som kräver längre observationer, som axon töjning och cellmigration. För längre observationer, måste man optimera villkoren genom att minska andelen Agarens (dvsöka vattnet för att undvika uttorkning och att minska trycket som potentiellt orsakar skador). Alternativt, ultrakalla enheten beskrivs ovan15 eller immobilisering av maskar använda agaros kuddar och anestesi kan vara mer passande16 medan biverkningar bör bedömas noggrant.
Kritiska steg i protokollet
För adekvat observation är markörer kritisk. Markörer måste införlivas med blåsor eller partiklar och vara av tillräcklig ljusstyrka. Antingen extrachromosomal matriser eller integrerade linjer kan användas. För visualisering av axonal transport av synaptiska vesikelproteinet prekursorer i DA9 nervceller är wyIs251 stammen användbar7,23. jsIs821 har använts för att iaktta axonal transport i mechanosensory nervceller i vissa studier26,27. När andra nervceller analyseras, bör synaptiskt vesikelprotein proteiner uttryckas i intresserad av nervceller använder cell specifika initiativtagare. Dessa initiativtagare bör vara tillräckligt stark. RAB-3 och SNB-1 används allmänt att märka synaptiskt vesikelprotein prekursorer22,23,26. För att observera IFT, bör komponenterna i den komplexa IFT märkas. Som positiv kontroll är mnIs17 stammen ett bra val29. Flimmerhåren som härrör från 8 celler (ASE, ASG, ASI, ASL, ask, ASK, ADF och ADL) buntas ihop i huvudet (amphid) medan cilia från 2 celler (PHA och PHB) buntas i svansen (Wikimedia). Eftersom OSM-6::GFP uttrycks i alla cilierade neuroner i mnIs17, kan det vara svårt att analysera IFT i detalj i huvudet cilier. Dock i regionen svans, enda PHA och PHB nervceller är märkta och IFT i varje cell kan enkelt lösas. Andra IFT proteiner märkt av fluorescerande proteiner kan användas att iaktta IFT21,28. Om man vill analysera huvud nervceller, skulle cell-specifika initiativtagare vara användbar. Medan huvudet flimmerhåren har varierande morfologier, kan transport händelser vara inspelad29. Genom att korsa mutanter med dessa markörer, kan funktioner av alla gener i axonal transport och IFT vara analyserade i vivo. De parametrar som kan analyseras har beskrivits i tidigare arbete22,23,26,27. GFP är det bästa och primära valet. mCherry och tdTomato kan också använda22, men mCherry är mycket svagare än GFP. tdTomato är en tandem dimer och större än monomera fluorescerande proteiner, vilket ibland påverkar dynamiken i fusion proteiner30. Därför resultaten bör analyseras och tolkas med försiktighet när tdTomato används. mScarlet, en ljus monomer röd fluorescerande protein som nyligen tagits fram, är ett alternativt val31.
Medan spinning disk konfokalmikroskopi används ofta att observera axonal transport och IFT7,21, utrustningen är dyrt och kan vara svårt att komma åt i vissa forskningsmiljöer. Dessa fenomen kan dock också registreras och analyseras i C. elegans med standard fluorescerande Mikroskop, om utrustad med höga NA linser, eftersom C. elegans är en liten och öppen djur och lätt att observera.
Framtida tillämpning
Med liknande immobilisering metod beskrivs här observerades IFT med enda molekyl upplösning i vivo32. Dessutom har utvecklats flera typer av super-resolution mikroskopi. Man kan direkt tillämpa de metoder som beskrivs här till super-upplösning Mikroskopisk analys. Enligt min erfarenhet, Airyscan33 snabb läge fungerar mycket bra för att analysera IFT. Teoretiskt, en snurrande bricka super-upplösning Mikroskop (SDSRM) skulle vara ett bra val som väl34. Sammanfattningsvis, genom att kombinera mutant bibliotek och dessa nya tekniker, den metod som beskrivs bör här vara användbart för att klargöra molekylära mekanismer av axonal transport och IFT i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Författaren tack djupt Dr Asako Sugimoto (Tohoku University) för hennes bra diskussion. wyIs251 var en generös gåva från Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Detta arbete stöds av JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 och #16 H 06536 och Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation och Naito Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B.
- Ishikawa, H., Marshall, W. F.
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S.
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
