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Bioengineering

Synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’ADN linéaires

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64236
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 4, 1
1INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 2Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), 3Medical Faculty, University of Würzburg, 4Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole pour la préparation et l’étalonnage tampon d’extraits cellulaires de souches knockout d’exonucléase V d’Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD et ΔrecB) est présenté ici. Il s’agit d’une approche rapide, facile et directe pour l’expression dans les systèmes de synthèse de protéines acellulaires utilisant des modèles d’ADN linéaires.

Abstract

La synthèse protéique acellulaire (CFPS) est récemment devenue très populaire dans le domaine de la biologie synthétique en raison de ses nombreux avantages. L’utilisation de modèles d’ADN linéaires pour CFPS permettra à la technologie d’atteindre son plein potentiel, réduisant ainsi le temps expérimental en éliminant les étapes de clonage, de transformation et d’extraction plasmidique. L’ADN linéaire peut être amplifié rapidement et facilement par PCR pour obtenir des concentrations élevées du modèle, évitant ainsi une toxicité potentielle d’expression in vivo . Cependant, les matrices d’ADN linéaires sont rapidement dégradées par les exonucléases naturellement présentes dans les extraits cellulaires. Plusieurs stratégies ont été proposées pour s’attaquer à ce problème, telles que l’ajout d’inhibiteurs de nucléases ou la modification chimique des extrémités linéaires de l’ADN pour la protection. Toutes ces stratégies coûtent du temps et des ressources supplémentaires et n’ont pas encore atteint des niveaux d’expression protéique proches du plasmide. Un protocole détaillé pour une stratégie alternative est présenté ici pour l’utilisation de modèles d’ADN linéaire pour CFPS. En utilisant des extraits cellulaires de cellules knock-out déficientes en exonucléase, les modèles d’ADN linéaires restent intacts sans nécessiter de modifications finales. Nous présentons les étapes de préparation du lysat cellulaire à partir de la souche Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD par lyse de sonication et étalonnage tampon pour Mg-glutamate (Mg-glu) et K-glutamate (K-glu) spécifiquement pour l’ADN linéaire. Cette méthode est capable d’atteindre des niveaux d’expression protéique comparables à ceux de l’ADN plasmidique dans E. coli CFPS.

Introduction

Les systèmes de synthèse de protéines acellulaires (CFPS) sont de plus en plus utilisés comme méthode rapide, simple et efficace pour l’ingénierie des biocapteurs, la fabrication décentralisée et le prototypage de circuits génétiques1. En raison de leur grand potentiel, les systèmes CFPS sont régulièrement utilisés dans le domaine de la biologie synthétique. Cependant, jusqu’à présent, les systèmes CFPS reposent sur des plasmides circulaires qui peuvent empêcher la technologie d’atteindre son plein potentiel. La préparation de l’ADN plasmidique dépend de nombreuses étapes chronophages lors du clonage et de grandes quantités d’isolement de l’ADN. D’autre part, l’amplification PCR à partir d’un plasmide, ou d’un modèle d’ADN synthétisé, peut être utilisée pour préparer simplement des modèles CFPS en quelques heures 2,3. Par conséquent, l’application de l’ADN linéaire offre une solution prometteuse pour CFPS. Cependant, l’ADN linéaire est rapidement dégradé par les exonucléases naturellement présentes dans les extraits cellulaires4. Il existe des solutions qui répondent à ce problème, telles que l’utilisation de la protéine λ-phage GamS5 ou de l’ADN contenant des sites Chi6 comme agents protecteurs, ou la protection directe de l’ADN linéaire par modification chimique de ses extrémités 2,7,8,9. Toutes ces méthodes nécessitent des suppléments à l’extrait cellulaire, qui sont coûteux et prennent beaucoup de temps. On sait depuis longtemps que le complexe exonucléase V (RecBCD) dégrade l’ADN linéaire dans les lysats cellulaires4. Récemment, nous avons montré que l’ADN linéaire peut être beaucoup mieux protégé dans les lysats contre les cellules assommées pour les gènes exonucléases (recBCD)10.

Dans ce protocole, les étapes de préparation des lysats acellulaires à partir de la souche E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD par lyse par sonication sont décrites en détail. La lyse par sonication est une technique courante et abordable employée par plusieurs laboratoires11,12. Les extraits produits à partir de cette souche n’ont pas besoin de l’ajout d’un composant supplémentaire ou d’une modification du modèle d’ADN pour soutenir l’expression à partir de modèles d’ADN linéaires. La méthode repose sur l’étape essentielle de l’optimisation de la mémoire tampon pour les extraits cellulaires spécifiquement pour l’expression linéaire de l’ADN à partir de promoteurs natifs d’E. coli. Il a été démontré que cette optimisation tampon spécifique pour l’expression linéaire de l’ADN est la clé pour que les promoteurs natifs σ70 produisent des protéines élevées sans protéine GamS ou supplémentation en ADN Chi, évitant même la purification des produits de PCR10. La concentration optimale de Mg-glu pour l’expression linéaire de l’ADN s’est avérée similaire à celle de l’ADN plasmidique. Cependant, la concentration optimale de K-glu a montré une différence substantielle entre l’ADN linéaire et plasmidique, probablement due à un mécanisme lié à la transcription10. La fonctionnalité des protéines exprimées à l’aide de cette méthode a été démontrée pour plusieurs applications, telles que le criblage rapide des commutateurs de maintien et l’évaluation de l’activité des variantes enzymatiques10.

Ce protocole fournit une solution simple, efficace et rentable pour l’utilisation de modèles d’ADN linéaire dans les systèmes sans cellules E. coli en utilisant simplement des extraits de cellules ΔrecBCD mutantes et un étalonnage spécifique pour l’ADN linéaire comme modèle.

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Protocol

1. Préparation des milieux et des tampons

  1. Préparation du milieu 2xYT+P (solide et liquide)
    1. Préparer les milieux liquides et solides comme décrit dans le tableau 1, puis stériliser à l’autoclavage.
      REMARQUE: Ce protocole nécessite une plaque de gélose 2xYT + P contenant du chloramphénicol (10 μg / mL). Le volume de milieu liquide est proportionnel au volume du lysat requis. Ici, un volume de départ de 5 L de média liquide 2xYT+P est utilisé. Cependant, le volume peut être ajusté au besoin, sachant que 1 L de la culture cellulaire donne 2 à 3 mL du lysat cellulaire final.
  2. Préparation de chloramphénicol (34 mg/mL)
    1. Peser 0,34 g de chloramphénicol, ajouter l’éthanol à 10 ml et dissoudre en mélangeant. Aliquote 1 mL chacun dans plusieurs tubes, et conserver à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
  3. Préparation du tampon S30A
    1. Préparer le tampon S30A conformément au tableau 2, en visant 2 L de ce tampon.
      NOTE: Encore une fois, le volume de ce tampon est proportionnel au volume du lysat requis.
    2. Avant l’autoclavage, ajuster le pH du tampon à 7,7 en utilisant de l’acide acétique glacial.
    3. Autoclave le tampon.
    4. Maintenir ce tampon à 4 °C après l’autoclavage.
    5. Avant utilisation, ajouter du DTT (filtré par un filtre à membrane de 0,22 μm) au tampon S30A pour atteindre une concentration finale de 2 mM (2 mL de DTT 1 M à 1 L de tampon S30A).
      NOTE: Encore une fois, le volume de ce tampon est proportionnel au volume du lysat requis.
  4. Préparation de la solution énergétique
    NOTE: Cette solution énergétique est basée sur l’article13 de Sun et al. (concentration stockée 14x). Le tableau 3 récapitule les composants nécessaires à la préparation du stock de solutions énergétiques, avec les numéros de catalogue de tous les produits chimiques utilisés dans ce protocole.
    1. Préparez les solutions mères conformément au tableau 3 et conservez-les sur la glace.
    2. Calibrer le pH comme demandé pour les composants indiqués, soit avec un tampon Tris 2 M (60,57 g de Tris base dans un volume de 250 mL d’eau stérile), soit KOH 15 % (15 g de KOH dans un volume de 100 mL d’eau stérile) comme indiqué dans le tableau 3.
    3. Dans un tube de 15 mL, ajouter le volume de chaque composant dans l’ordre indiqué au tableau 3.
    4. Aliquote la solution énergétique, 150 μL par tube.
    5. Congeler les aliquotes sur de la glace sèche et les conserver à -80 °C.
  5. Préparation d’une solution d’acides aminés (AA)
    REMARQUE: La solution d’acides aminés est préparée par le kit d’échantillonnage d’acides aminés RTS. Chacun des 20 acides aminés est fourni dans ce kit sous forme de volume de 1,5 mL à 168 mM, à l’exception de la leucine qui est à 140 mM. Ici, la solution mère préparée est concentrée 4x, plutôt que la solution de travail requise. La concentration finale de la solution d’acides aminés est de 6 mM pour tous les acides aminés, à l’exception de la leucine qui est à 5 mM.
    1. Décongeler les 20 tubes d’acides aminés par vortex et incuber à 37 °C jusqu’à dissolution complète.
      REMARQUE: Cys peut ne pas se dissoudre complètement.
    2. Dans un tube de 50 mL, ajouter 12 mL d’eau stérile et 1,5 mL chacun des acides aminés dans l’ordre indiqué au tableau 4.
    3. Vortex jusqu’à ce que la solution soit assez claire, en incubant à 37 °C si nécessaire.
      REMARQUE: Cys peut ne pas se dissoudre complètement.
    4. Aliquote 500 μL de la solution d’acides aminés par tube sur glace.
    5. Congeler les aliquotes sur de la glace sèche et les conserver à -80 °C.
  6. Préparation de solutions pour l’étalonnage du tampon
    1. Préparer la solution mère pour Mg-glu (100 mM) et K-glu (3 M) comme indiqué dans le tableau 5. Effectuer une dilution en série (en volume de 1 mL) à partir de ces stocks pour le Mg-glu (0 à 20 mM) et le K-glu (20 à 300 mM), comme indiqué dans le dossier supplémentaire 1 pour les étapes d’étalonnage.
      NOTE: Ces concentrations de stock sont pour l’étape d’étalonnage et peuvent devoir être modifiées lors de la configuration de l’expérience finale. Les concentrations les plus élevées des stocks testés pour ce protocole sont respectivement de 1 M et 4,5 M pour le Mg-glu et le K-glu.
  7. Préparation du stock de solution PEG8000
    1. Préparer 50 mL de solution de PEG8000 à 40 % (20 g de PEG8000 dans un volume de 50 mL d’eau stérile).

2. Culture cellulaire et préparation du lysat (expérience de 4 jours)

  1. Jour 1
    1. Streak s’étirer de la souche BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (tableau 6) à partir d’un stock de glycérol à -80 °C sur une plaque de gélose 2xYT+P contenant 10 μg/mL de chloramphénicol. Alternativement, BL21 Rosetta2 ΔrecB (tableau 6) peut également être utilisé10.
    2. Incuber pendant une nuit à 37 °C.
  2. Jour 2
    1. Inoculer une seule colonie de la plaque de gélose ci-dessus dans 10 mL de 2xYT+P supplémentée de 10 μg/mL de chloramphénicol.
    2. Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant 200 tr/min.
  3. Jour 3
    1. Faire une sous-culture en diluant la culture de nuit 100 fois dans 4 L de milieu frais 2xYT+P contenant 10 μg/mL de chloramphénicol.
      REMARQUE : Par exemple, 40 mL de la culture de nuit sont ajoutés à 3960 mL de milieu frais. Après dilution, le milieu de 4 L est divisé en 4 flacons (volume de 5 L) de telle sorte que chaque fiole contienne 1 L.
    2. Incuber à 37 °C, 200 tr/min pendant environ 3 à 4 h de croissance pour atteindre un OD600 de 1,5-2,0. Diluer la culture de 4x si vous mesurez OD600 > 0,8.
      REMARQUE: Le temps d’incubation exact peut varier en fonction de la souche, de l’inoculum initial, du matériel de laboratoire et des instruments utilisés. Les souches knockout ΔrecB/ΔrecBCD ont des taux de croissance comparables à ceux du BL21 Rosetta2 parental (Figure supplémentaire 1).
    3. Mettez la culture sur la glace.
    4. Faire tourner les cellules à 5 000 x g pendant 12 min à 4 °C, puis jeter le surnageant par décantation.
    5. Remettez en suspension les granulés de la cellule dans 800 ml de S30A+DTT réfrigéré.
      REMARQUE: Le volume de S30A + DTT est 5x inférieur au volume de culture cellulaire d’origine. Par exemple, pour un volume de départ de 1 L de la culture cellulaire, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 200 mL de S30A+DTT. Il est également recommandé d’effectuer cette étape dans une chambre froide à 4 °C, ainsi que de garder tous les matériaux sur la glace.
    6. Faire tourner les cellules à 5 000 x g pendant 12 min à 4 °C, puis jeter le surnageant par décantation.
    7. Répétez les étapes 2.3.5 et 2.3.6.
    8. Resuspendre les granulés cellulaires dans 160 ml de S30A+DTT réfrigéré.
      REMARQUE: Cette fois, le volume de S30A + DTT est 25x inférieur au volume de culture cellulaire d’origine. Par exemple, pour un volume de départ de 1 L de la culture cellulaire, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 40 mL de S30A+DTT. Encore une fois, il est recommandé d’effectuer cette étape dans une chambre froide à 4 °C, ainsi que de garder les matériaux sur la glace.
    9. Transférer les cellules dans des tubes de 50 ml réfrigérés et prépesés.
    10. Faire tourner les cellules à 2 000 x g pendant 8 min à 4 °C, puis jeter le surnageant par décantation.
    11. Faire tourner les cellules à 2 000 x g pendant 4 min à 4 °C, puis retirer soigneusement le surnageant restant à l’aide d’une pipette.
    12. Remesurez le poids du tube pour calculer le poids de la pastille de cellule.
    13. Conserver les granulés de la cellule à -80 °C.
  4. Jour 4
    1. Prenez les granulés de la cellule à -80 °C et décongelez-les sur de la glace pendant 1-2 h.
    2. Remettez en suspension les pastilles de la cellule dans 0,9 mL de tampon S30A + DTT par gramme de poids des pastilles. Pipeter lentement pour remettre les cellules en suspension, en évitant autant que possible la mousse supérieure, le cas échéant.
    3. Placer 1 mL d’aliquotes des cellules en suspension dans des microtubes de 1,5 mL et les conserver sur de la glace ou un bloc froid pré-réfrigéré à 4 °C (il est préférable d’utiliser des blocs métalliques).
      REMARQUE: Si la dernière aliquote est bien inférieure à 1 mL, il est préférable de la jeter plutôt que de sonicer un volume sous-optimal. Le volume optimal (1 mL) pour la sonication a été déterminé pour cette configuration (tube, sonicateur et sonde) et peut varier pour une autre.
    4. Soniquez chaque tube dans un sonicateur (sonde de 3 mm, fréquence 20 kHz), avec une configuration de 20% d’amplitude pendant trois cycles (sonication 30 s, 1 min de pause).
      NOTE: L’énergie totale fournie au cours des trois cycles était de ~266 joules (~80-110 joules par cycle). Pendant cette étape, gardez les tubes sur le bloc froid qui est entouré de glace. Alternez entre deux blocs froids pour éviter la surchauffe de la sonde (le bloc froid de secours est également maintenu froid sur la glace). Les deux blocs froids ont été pré-refroidis dans le réfrigérateur la veille de la sonication.
    5. Faire tourner le lysat à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    6. Recueillir le surnageant (lysat cellulaire) à l’aide d’une pipette et le transférer dans un tube de 50 mL.
    7. Incuber le lysat cellulaire à 37 °C à 200 rpm en agitant pendant 80 min.
    8. Faire tourner le lysat à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    9. Recueillir le surnageant et l’aliquote de 30 μL chacun dans des microtubes prérefroidis de 1,5 mL, tout en gardant tous les tubes sur la glace.
    10. Surgeler les aliquotes du lysat sur de la glace sèche et conserver à -80 °C.

3. Calibrage tampon sans cellules pour l’ADN linéaire

REMARQUE : Le tampon acellulaire a été étalonné pour déterminer les concentrations optimales de Mg-glu et de K-glu, comme décrit dans Sun et coll.13. Le fichier supplémentaire 1 est nécessaire pour les étapes d’étalonnage. Les réactions ont été réglées sur un volume final de 10,5 μL chacune. Les extraits ont été calibrés en utilisant 1 nM d’ADN linéaire (voir rubrique 4 ci-dessous) ou plasmidique. Les expériences peuvent être effectuées le jour même de la préparation des tampons, ou les tampons préparés peuvent être congelés à -80 °C pour effectuer l’expérience un autre jour. Pour toutes les étapes d’étalonnage, chaque composant a été décongelé sur de la glace avant d’être mélangé et pipeté dans une plaque de 384 puits.

  1. Préparer un mélange-maître, conformément à l’onglet « Préparation du tampon » du fichier Excel Fichier supplémentaire 1, contenant : (a) un extrait cellulaire (33 % du volume total de la réaction), (b) de l’ADN rapporteur (sous forme d’ADN linéaire et/ou plasmidique) à une concentration finale de 1 nM, (c) un tampon acellulaire (PEG8000, solution AA et solution énergétique), et (d) du K-glu jusqu’à une concentration finale de 80 mM.
  2. Pour un volume de réaction de 10,5 μL, prélever 1,05 μL (réaction totale de 10 %) de différentes concentrations de stocks concentrés de Mg-glu 10x (plages de concentration finales : 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 et 20 mM) et ajouter 9,45 μL (réaction totale à 90 %) du mélange maître. Mélanger délicatement.
    NOTE: Utiliser des tubes PCR à huit bandes pour préparer les dilutions et mélanger avec une pipette multicanal. Si nécessaire, une gamme différente de concentrations de Mg-glu peut être utilisée.
  3. Pipeter 10 μL des réactions ci-dessus dans une microplaque à fond carré de 384 puits, la recouvrir à l’aide d’un joint adhésif et mesurer l’expression des gènes en tant que sortie de fluorescence. Enregistrer les données de fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques (Ex: 485 nm; Em: 528 nm) à intervalles réguliers (par exemple, 5 min) pendant 8 h d’incubation à 30 °C avec agitation orbitale continue à 307 cpm.
    REMARQUE : Si nécessaire, faites tourner la microplaque à 384 puits (<2 500 x g, 1 min, température ambiante) avant de commencer l’acquisition des données. Des mesures du point final ont été utilisées pour comparer l’expression de la GFP dans les différentes compositions tampons. Les valeurs de fluorescence peuvent être converties en unités normalisées pour le tracé (voir ci-dessous).
  4. Identifiez la concentration de Mg-glu qui donne la valeur de fluorescence la plus élevée au point final.
    REMARQUE: Si vous n’êtes pas sûr de la concentration optimale de Mg-glu obtenue, répétez l’étape 3.2 avec des plages de concentration plus diverses.
  5. Avec la concentration optimisée de Mg-glu, procéder à l’étalonnage K-glu pour une gamme de concentrations (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 et 240 mM), en utilisant les mêmes volumes que ceux indiqués à l’étape 3.2. Exécutez l’expérience et identifiez la valeur de fluorescence la plus élevée parmi les concentrations de K-glu testées. Cela indique la composition tampon optimale pour Mg-glu et K-glu pour ce lysat.
    REMARQUE: Si vous n’êtes pas sûr de la concentration optimale de K-glu obtenue, répétez l’étape avec des plages de concentration plus diverses.
  6. Une fois les valeurs Mg-glu et K-glu établies, préparer des tubes mères de la composition tampon optimisée en fonction du volume de lot obtenu. Utilisez l’onglet « Préparation tampon » du dossier supplémentaire 1 pour calculer le nombre de tubes tampons nécessaires, soit 38 μL par tube, et stocker à -80 °C.

4. Préparation linéaire de l’ADN

REMARQUE: Pour l’étalonnage du lysat, le plasmide P70a-deGFP est utilisé. Ce plasmide a été maintenu dans E. coli KL740 cl857+ (tableau 6) pour la miniprep à l’aide du kit Plasmid Miniprep, ou la maxiprep à l’aide du kit Plasmid Maxiprep. Les fragments d’ADN linéaires utilisés comme modèles d’expression dans les réactions acellulaires ont été amplifiés par PCR à l’aide des amorces et des modèles énumérés dans les tableaux 7 et 8.

  1. La PCR amplifie à partir du plasmide P70a-deGFP à l’aide de l’ADN polymérase avec les oligo-amorces énumérées dans le tableau 7. Réglez les réactions PCR dans un volume de 50 μL, selon le protocole du fabricant, en utilisant le programme thermocycleur: [98 °C pendant 2 min; 40 cycles x (98 °C pendant 30 s → 66 °C pendant 30 s → 72 °C pendant 60 s); 72 °C pendant 10 min; 4 °C pendant ∞].
  2. Digérer l’ADN modèle dans les réactions de PCR en ajoutant 1 μL d’enzyme de restriction DpnI par réaction PCR de 50 μL et incuber à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, purifiez la réaction PCR à l’aide d’un kit de nettoyage PCR & ADN et éluez dans de l’eau sans nucléase.
  3. Vérifiez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% (1x TAE) avant utilisation.
  4. Quantifier les produits de PCR purifiés (ou les préparations plasmidiques) à l’aide de Nanodrop (ND-1 000).
    REMARQUE : Si vous utilisez une ADN polymérase/tampon directement compatible avec la réaction acellulaire en aval, l’étape de purification (étape 2) peut être complètement ignorée et la concentration d’ADN non purifié mesurée par un test fluorométrique avec un colorant liant l’ADN à la place (voir Batista et al.10).

5. Exécution expérimentale

REMARQUE : En plus d’utiliser le fichier supplémentaire 1 pour calibrer le stock tampon pour chaque lot de lysat préparé (ci-dessus), il est recommandé d’utiliser l’onglet « Préparation de réaction » dans le fichier pour configurer les réactions sans cellules suivantes. Comme précédemment, le volume des réactions est fixé à 10,5 μL par réaction, dont seulement 10 μL sont finalement pipetés dans la plaque de 384 puits pour l’acquisition de données. Ici, 5 nM de chaque modèle sont utilisés pour l’expression sans cellule. Il est important d’être cohérent lors du pipetage des réactions - utilisez la même pipette et le type de pointes. Distribuer soigneusement pour éviter toute bulle dans le puits ou tout liquide collé aux parois du puits. Si nécessaire, faire tourner la plaque (<2 500 x g, 1 min, température ambiante).

  1. Calculez les volumes à pipeter en entrant les descriptions d’échantillons et les répliques nécessaires par échantillon dans l’onglet « Préparation de la réaction » du dossier supplémentaire 1.
    REMARQUE : Si un volume de réaction autre que 10,5 μL est requis, il peut également être entré dans le dossier supplémentaire 1. Le fichier calculera le nombre de tubes de stocks tampons précédemment optimisés et les tubes d’extrait de cellules à décongeler sur glace.
  2. Étiqueter un microtube de 1,5 mL pour la préparation Optimal Master Mix (séparément pour l’ADN linéaire et plasmidique), ajouter les volumes corrects du tampon et du lysat, et mélanger doucement.
    REMARQUE: En raison des différences dans les concentrations optimales de K-glu dans leurs tampons, des copies de l’onglet « Préparation de la réaction » doivent être faites pour être utilisées séparément pour l’ADN linéaire et plasmidique.
  3. Pipeter d’abord les échantillons d’ADN, puis l’eau sans nucléase et enfin le mélange maître optimal (MM) de l’étape 5.2. Mélangez doucement la réaction acellulaire avec la pipette juste avant de l’ajouter au lecteur de plaques et évitez les bulles.
    REMARQUE: Utilisez un tube PCR à huit bandes pour mélanger le volume de réaction pour une répétition supplémentaire. Par exemple, si des triplicates techniques sont prévus, préparer un mélange pour quatre réactions et laisser un volume mort dans le tube afin de réduire les erreurs de pipetage lors de l’ajout des échantillons à la plaque.
  4. Configurer les réactions dans le lecteur de plaques (Ex 485 nm; Em 528 nm). Les essais cinétiques ont enregistré des données de fluorescence à intervalles réguliers (par exemple, 5 min) pendant 8 h d’incubation à 30 °C, avec agitation orbitale continue à 307 cpm.
    NOTA : Les mesures du point final ont été rapportées comme étant le point temporel de 8 heures. Les valeurs de fluorescence collectées sont en unités arbitraires (u.a.), mais elles peuvent être converties en unités normalisées pour le tracé (voir ci-dessous).

6. Quantification relative du FITC et du GFP

NOTE: L’expression GFP est exportée par le lecteur de plaques en unités de fluorescence arbitraires (u.a.). Cependant, il est recommandé d’utiliser des unités de mesure normalisées afin de comparer les valeurs de fluorescence entre différents paramètres (lots, équipement, utilisateurs et laboratoires). Les étapes détaillées pour convertir les valeurs de fluorescence (u.a.) en valeurs équivalentes FITC et eGFP (μM) sont présentées ici, en utilisant les courbes standard de NIST-FITC et eGFP recombinant. Conserver la solution mère NIST-FITC à 4 °C et conserver l’eGFP recombinant à -20 °C. S’assurer que la solution mère et les dilutions en série sont protégées de la lumière. Lors de l’accouchement, il est recommandé d’aliquoter l’eGFP recombinant en plus petits volumes pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel.

  1. Préparer une solution de borate de sodium de 100 mM, pH 9,5, et conserver à température ambiante ou à 4 °C.
  2. Préparer 12 dilutions (70 μL chacune) pour la courbe étalon, 2x par pas (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 et 0 μM) de l’étalon FITC traçable par le NIST à partir du stock de 50 μM en utilisant la solution de borate de sodium. Préparer la série de dilution en trois exemplaires.
  3. Comme à l’étape 6.2, préparer des dilutions en série (70 μL chacune) à partir du eGFP recombinant en utilisant la solution de borate de sodium (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 et 0 μM). Pour le calcul de la molarité, considérez la taille réelle de la protéine (28 kDa) et la concentration de l’eGFP purifié (1 g/L). Préparer la série de dilution en trois exemplaires.
  4. Ajouter 20 μL de chaque dilution (neuf puits chacun = trois séries de dilutions x trois répétitions techniques) dans une microplaque à fond carré de 384 puits, recouverte d’un joint de plaque adhésive, et incuber dans un lecteur de plaque pour la mesure.
    REMARQUE: Ici, les paramètres utilisés étaient Excitation: 485/20, Emission: 528/20, avec gain 50. Cependant, des combinaisons longueurs d’onde/gain supplémentaires peuvent également être utilisées pour calibrer d’autres molécules fluorescentes et/ou des réglages de gain. Pour calculer le facteur de conversion, les mêmes réglages de longueur d’onde et de gain sont nécessaires pour acquérir les données de fluorescence GFP des expériences sans cellule et les données de courbe standard.
  5. Utilisez la plage de signaux linéaire (ici, par exemple, [FITC] ≤ 0,781 μM) pour ajuster la pente [y = ax et R2] pour chaque condition.
    REMARQUE: La plage peut différer pour différentes machines et solutions standard utilisées.
  6. Enregistrez les données pour l’étalonnage FITC et eGFP afin de calculer les mesures relatives pour le laboratoire en suivant l’exemple du tableau 9. Diviser les valeurs obtenues en unités arbitraires de fluorescence (u.e.) par la valeur de pente de courbe « a » (y = ax) pour estimer la production de GFP en termes de FITC ou eGFP.

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Representative Results

Des résultats représentatifs sont présentés ici après calibration du lysat pour des niveaux optimaux de Mg-glutamate et de K-glutamate séparément pour l’ADN linéaire et plasmidique (Figure 1). La concentration optimale de Mg-glutamate est similaire dans les extraits de Δ recB et ΔrecBCD à 8 mM (Figure 1B). Cependant, la concentration optimale de K-glutamate pour l’ADN plasmidique est de 140 mM, tandis que la concentration optimale de K-glutamate pour l’ADN linéaire pour le même extrait est de 20 mM (Figure 1C). Dans une analyse comparative de l’expression de la GFP dans les extraits de cellulesrecBCD WT et Δ, il a été constaté que la composition tampon des extraits doit être spécifiquement calibrée pour une expression optimale à partir de l’ADN linéaire et plasmidique utilisé dans les extraits supprimés d’exonucléase V.

Après les étapes d’étalonnage, les niveaux d’expression de GFP ont été comparés à partir d’ADN linéaire et plasmidique (5 nM) dans l’extraitde recBCD WT et Δ (Figure 1D). L’expression de la GFP à partir de l’ADN linéaire a atteint 102% et 138% de l’expression de l’ADN plasmidique dans les extraits de souches ΔrecB et ΔrecBCD, respectivement. Ensemble, ces résultats montrent que l’expression de l’ADN linéaire, en utilisant un promoteur natif d’E. coli σ70, peut atteindre le même niveau que celle de l’expression plasmidique lorsque le lysat cellulaire est préparé à partir de tels mutants et que le tampon acellulaire est spécifiquement calibré pour l’ADN linéaire.

Figure 1
Figure 1 : Optimisation différentielle du tampon pour l’ADN linéaire et plasmidique dans les extraits de ΔrecB/ΔrecBCD. (A) Un amplicon d’ADN linéaire de 1361 bp a été amplifié à partir du plasmide p70a-deGFP et utilisé comme modèle pour l’expression génique pour l’étalonnage tampon. (B) Calibrage tampon mg-glutamate avec 1 nM de chaque type d’ADN en utilisant différentes concentrations de 0 à 20 mM (avec K-glutamate fixé à 80 mM). Les cases carrées indiquent les points de concentration choisis. P = ADN plasmidique, L = ADN linéaire. (C) Après avoir sélectionné la concentration optimale de Mg-glutamate pour chaque lysat, le K-glutamate a été titré de 20 à 240 mM. Les cases carrées indiquent les points de concentration choisis. P = ADN plasmidique, L = ADN linéaire. Les données indiquées dans les cartes thermiques (B) et (C) proviennent d’une seule expérience. (D) Après étalonnage tampon, des réactions acellulaires ont été effectuées avec 5 nM de chaque type d’ADN. L’extrait BL21 Rosetta2 ne prend pas en charge l’expression linéaire de l’ADN, tandis que les extraits différentiellement optimisés des souches ΔrecB et ΔrecBCD présentent une expression linéaire de l’ADN (vert) similaire aux niveaux d’ADN plasmidique (bleu). Les données sur les critères d’évaluation indiquées sont des moyennes ± écart-type pour trois répétitions effectuées le même jour et recueillies après 8 heures d’incubation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentation visuelle du protocole. Flux de travail pour la préparation du lysat cellulaire et l’optimisation du lysat pour l’ADN linéaire en tant que modèle dans la synthèse CFPS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des composants pour la préparation des milieux liquides et solides 2xYT+P. La quantité (en grammes) de chaque composant est spécifiée pour 1 L de milieu. Augmentez proportionnellement selon les besoins. Les supports doivent être autoclavés avant utilisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2: Liste des composants pour la préparation du tampon S30A+DTT. La quantité (en grammes) de chaque composant est spécifiée pour 1 L de tampon S30A. Augmentez proportionnellement selon les besoins. Le tampon S30A doit être autoclavé puis refroidi (4 °C) avant utilisation. Le tampon TNT doit être préparé et filtré séparément comme indiqué (dans un tube de 15 mL) et conservé à -20 °C. Juste avant d’utiliser le tampon S30A, ajoutez 2 ml de DTT (à partir de 1 M de stock) à 1 L de tampon S30A. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Liste des composants pour la préparation de la solution énergétique. La quantité (en grammes) ou le volume de chaque composant est spécifié (dans la colonne G) pour la préparation d’un volume spécifié (colonne H) de solutions mères pour la concentration indiquée (colonne F). Le pH de chaque composant doit être ajusté si nécessaire, comme indiqué (dans les colonnes I et J). Le stock de solution énergétique 14x est préparé en mélangeant le volume indiqué de chaque composant (dans la colonne K) dans l’ordre indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4: Liste des composants pour la préparation de la solution mère d’acides aminés. Pour la préparation de la solution mère d’acides aminés 4x, tous les acides aminés doivent être mélangés dans l’ordre indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5. Liste des composants pour la préparation des solutions d’étalonnage du lysat. La quantité (en grammes) de solutions mères de glutamate mg et de K-glutamate est spécifiée pour préparer 50 mL de la concentration indiquée de chaque tampon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Liste des souches bactériennes utilisées dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 7 : Liste des amorces utilisées dans le présent protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 8 : Plasmide utilisé dans ce protocole pour l’étalonnage du lysat et comme modèle pour l’amplification linéaire de l’ADN par PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 9 : Conversion FITC et eGFP. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Dossier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ici, nous montrons que le lysat cellulaire préparé à partir d’E. coli BL21 Rosetta2 avec un knockout génomique pour l’opéron recB ou recBCD soutient une expression protéique élevée à partir de modèles d’ADN linéaires. Ce protocole élabore une procédure d’étalonnage du lysat étape par étape spécifique pour les modèles d’ADN linéaire (Figure 2), qui est une étape critique qui conduit à l’expression élevée des promoteurs σ70 dans l’ADN linéaire, atteignant des niveaux proches du plasmide pour les concentrations d’ADN équimolaires. Ce protocole souligne l’importance de l’étalonnage tampon en fonction du type d’ADN (linéaire ou plasmidique) à utiliser dans l’application finale.

Le protocole peut aider à éviter le clonage plasmidique, ce qui permet des gains significatifs en temps et en argent. Les fragments d’ADN linéaires peuvent être synthétisés par des fournisseurs commerciaux et/ou amplifiés par PCR en laboratoire. Le même processus utilisant l’ADN plasmidique prendrait au moins 1 semaine de plus, en tenant compte du clonage, de la vérification de la séquence et des étapes de préparation de l’ADN10. Il est recommandé de préparer de grands volumes de l’extrait cellulaire et des modèles d’ADN linéaire afin de minimiser la variabilité d’un lot à l’autre entre les expériences14,15.

Cette méthode s’est avérée robuste et utilisée dans tous les laboratoires10. Les résultats de ces extraits ont été cohérents entre les répétitions biologiques, les différents lots d’extraits, ainsi que les différents milieux de souches10. La robustesse du protocole a également été testée sur différents paramètres expérimentaux: méthodes de lyse cellulaire, températures, modèles d’ADN et différentes concentrations d’ADN. La méthode a déjà été utilisée pour le criblage rapide et la caractérisation des constructions génétiques pour deux applications pertinentes: la caractérisation de la bibliothèque d’interrupteurs et le criblage de l’activité enzymatique10.

Bien que des niveaux d’expression élevés aient été obtenus dans cette étude à partir d’ADN linéaire dans des extraits de ΔrecB/ΔrecBCD de la souche parentale très productive E. coli BL21 Rosetta2, la méthodologie nécessiterait une ingénierie génomique pour une nouvelle souche d’intérêt. En revanche, la supplémentation en agents protecteurs pour l’ADN linéaire, comme GamS5 ou Chi DNA6, est plus facile à appliquer pour une nouvelle souche, mais plus coûteuse et prend plus de temps.

Le protocole fourni ici facilitera l’utilisation de modèles d’ADN linéaires dans les systèmes acellulaires et accélérera les cycles de conception-construction-test pour la communauté de la biologie synthétique. Une expression plus facile sans cellules à partir de modèles d’ADN linéaires dans des extraits de ΔrecB/ΔrecBCD peut être déployée pour la production de petites molécules d’intérêt, de biosimilaires et d’autres applications à la demande au point de service.

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Disclosures

Aucun

Acknowledgments

ACB et JLF reconnaissent le soutien financier de la subvention ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF et JB saluent le soutien financier de la subvention ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA et JLF reconnaissent le soutien financier de la subvention ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB remercie le CER du soutien apporté au lancement de « COMPUCELL » (numéro de subvention 657579). Le Centre de Biochimie Structurale salue le soutien de l’Infrastructure Français de Biologie Structurale Intégrée (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK remercie le soutien financier du département MICA de l’INRAe, de l’Université Paris-Saclay, du DIM-RFSI de la région Ile-de-France (IdF) et de l’ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Ces travaux ont été financés par le biais du Consolidator Award (865973 au CLB) du Conseil européen de la recherche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-YT Broth Invitrogen 22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate Thermo Scientific Nunc 142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) Sigma-Aldrich P8877
adhesive plate seal Thermo Scientific Nunc 232701
Agar Invitrogen 30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A8937
BL21 Rosetta2 Merck Millipore 71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB Addgene 176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Addgene 176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) Sigma-Aldrich  A9501
Chloramphenicol  Sigma-Aldrich C0378
CoA (Coenzyme A hydrate) Sigma-Aldrich C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile Corning 430790 15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile Corning 430828 50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) Alfa Aesar  J62238
DpnI NEB R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol) Sigma-Aldrich D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) Sigma-Aldrich F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt) Sigma-Aldrich 371701
HEPES Sigma-Aldrich  H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4) Carl Roth 231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P) Sigma-Aldrich P5655
K-glutamate Alfa Aesar A17232
Mg-glutamate  Sigma-Aldrich 49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone Merck Millipore SLGP033RB membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit NEB T1030S PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)  Sigma-Aldrich  N6522
NIST-traceable FITC standard Invitrogen F36915 NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit Macherey-Nagel 740414.1 Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
plate reader Biotek  Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein Chromotek egfp-250 recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0492S DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492L DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Q32850 fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801
Spermidine Sigma-Aldrich 85558
Sterile water Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base Life Science products Cytiva 17-1321-01 
tRNA Roche 10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 SONICS VC505 sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) Acros Organics  226310010
Water, nuclease-free Thermo R0581 nuclease-free water

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References

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Bioengineering numéro 186
Synthèse de protéines acellulaires à partir d’extraits cellulaires déficients en exonucléase utilisant des modèles d’ADN linéaires
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