Summary
Här presenteras ett protokoll för beredning och buffertkalibrering av cellextrakt från exonukleas V knockout-stammar av Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD och ΔrecB). Detta är ett snabbt, enkelt och direkt tillvägagångssätt för uttryck i cellfria proteinsyntessystem med linjära DNA-mallar.
Abstract
Cellfri proteinsyntes (CFPS) har nyligen blivit mycket populär inom syntetisk biologi på grund av dess många fördelar. Att använda linjära DNA-mallar för CFPS kommer ytterligare att göra det möjligt för tekniken att nå sin fulla potential, vilket minskar experimenttiden genom att eliminera stegen för kloning, transformation och plasmidextraktion. Linjärt DNA kan snabbt och enkelt förstärkas med PCR för att erhålla höga koncentrationer av mallen, vilket undviker potentiell toxicitet i vivo-uttryck . Linjära DNA-mallar bryts dock snabbt ned av exonukleas som finns naturligt i cellextrakten. Det finns flera strategier som har föreslagits för att hantera detta problem, såsom att lägga till nukleashämmare eller kemisk modifiering av linjära DNA-ändar för skydd. Alla dessa strategier kostar extra tid och resurser och har ännu inte fått nästan plasmidnivåer av proteinuttryck. Ett detaljerat protokoll för en alternativ strategi presenteras här för att använda linjära DNA-mallar för CFPS. Genom att använda cellextrakt från exonukleasbristfälliga knockout-celler förblir linjära DNA-mallar intakta utan att kräva några slutmodifieringar. Vi presenterar beredningsstegen för celllysat från Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD stam genom ultraljudsbehandling lysis och buffertkalibrering för Mg-glutamat (Mg-glu) och K-glutamat (K-glu) specifikt för linjärt DNA. Denna metod kan uppnå proteinuttrycksnivåer som är jämförbara med det från plasmid-DNA i E. coli CFPS.
Introduction
Cellfria proteinsyntessystem (CFPS) används alltmer som en snabb, enkel och effektiv metod för biosensorteknik, decentraliserad tillverkning och prototyper av genetiska kretsar1. På grund av sin stora potential används CFPS-system regelbundet inom syntetisk biologi. Hittills är CFPS-system dock beroende av cirkulära plasmider som kan begränsa tekniken från att nå sin fulla potential. Förberedelse av plasmid-DNA beror på många tidskrävande steg under kloning och stora mängder DNA-isolering. Å andra sidan kan PCR-förstärkning från en plasmid, eller en syntetiserad DNA-mall, användas för att helt enkelt förbereda CFPS-mallar inom några timmar 2,3. Därför erbjuder applicering av linjärt DNA en lovande lösning för CFPS. Linjärt DNA bryts emellertid snabbt ned av exonukleaser som finns naturligt i cellulära extrakt4. Det finns lösningar som löser detta problem, såsom att använda λ-GamS-proteinet5 eller DNA som innehåller Chi-platser6 som skyddsmedel, eller direkt skydda det linjära DNA genom kemisk modifiering av dess ändar 2,7,8,9. Alla dessa metoder kräver tillskott till cellextraktet, som är kostsamma och tidskrävande. Det har länge varit känt att exonukleas V-komplexet (RecBCD) bryter ner linjärt DNA i celllysater4. Nyligen visade vi att linjärt DNA kan skyddas mycket bättre i lysater från celler som slås ut för exonukleasgener (recBCD)10.
I detta protokoll beskrivs steg för beredning av cellfria lysater från E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD stam genom ultraljudsbehandling lysis i detalj. Ultraljudsbehandling lys är en vanlig och prisvärd teknik som används av flera laboratorier11,12. Extrakten som produceras från denna stam behöver inte tillsättas någon extra komponent eller DNA-mallmodifiering för att stödja uttryck från linjära DNA-mallar. Metoden bygger på det väsentliga steget för buffertoptimering för cellextrakt specifikt för linjärt DNA-uttryck från infödda E. coli-promotorer. Det har visats att denna specifika buffertoptimering för linjärt DNA-uttryck är nyckeln för infödda σ70-promotorer att ge hög proteinproduktion utan GamS-protein eller Chi-DNA-tillskott, till och med undvika rening av PCR-produkterna10. Den optimala koncentrationen av Mg-glu för linjärt DNA-uttryck visade sig likna den för plasmid-DNA. Den optimala koncentrationen av K-glu visade emellertid en väsentlig skillnad mellan linjärt och plasmid-DNA, sannolikt på grund av en transkriptionsrelaterad mekanism10. Funktionaliteten hos proteiner som uttrycks med denna metod har visats för flera tillämpningar, såsom snabb screening av tåhållare och aktivitetsbedömning av enzymvarianter10.
Detta protokoll ger en enkel, effektiv och kostnadseffektiv lösning för att använda linjära DNA-mallar i E. coli-cellfria system genom att helt enkelt använda mutanta ΔrecBCD-cellextrakt och specifik kalibrering för linjärt DNA som mall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av media och buffert
- Beredning av 2xYT + P-medium (fast och flytande)
- Förbered flytande och fasta medier enligt beskrivningen i tabell 1 och sterilisera sedan genom autoklavering.
OBS: Detta protokoll kräver en 2xYT + P agarplatta som innehåller kloramfenikol (10 μg / ml). Volymen flytande media är proportionell mot volymen av det lysat som krävs. Här används en startvolym på 5 L flytande 2xYT + P-media. Volymen kan dock justeras efter behov, med vetskap om att 1 liter av cellkulturen resulterar i 2 till 3 ml av det slutliga celllysatet.
- Förbered flytande och fasta medier enligt beskrivningen i tabell 1 och sterilisera sedan genom autoklavering.
- Beredning av kloramfenikol (34 mg/ml)
- Väg 0,34 g kloramfenikol, tillsätt etanol till 10 ml och lös upp genom blandning. Alikvotera 1 ml vardera i flera rör och förvara vid -20 °C för användning senare.
- Beredning av S30A-buffert
- Förbered S30A-buffert enligt tabell 2, med sikte på 2 L av denna buffert.
OBS: Återigen är volymen på denna buffert proportionell mot volymen av den lysat som krävs. - Innan autoklavering, justera buffertens pH till 7,7 med isättika.
- Autoklavera bufferten.
- Håll denna buffert vid 4 °C efter autoklavering.
- Före användning, tillsätt DTT (filtrerat med ett 0,22 μm membranfilter) till S30A-bufferten för att nå en slutlig koncentration på 2 mM (2 ml lager 1 M DTT till 1 liter S30A-buffert).
OBS: Återigen är volymen på denna buffert proportionell mot volymen av den lysat som krävs.
- Förbered S30A-buffert enligt tabell 2, med sikte på 2 L av denna buffert.
- Beredning av energilösning
OBS: Denna energilösning är baserad på Sun et al.- papper13 (14x lagerkoncentration). I tabell 3 sammanfattas de komponenter som behövs för beredningen av energilösningsbeståndet, med katalognummer för alla kemikalier som används i detta protokoll.- Förbered stamlösningarna enligt tabell 3 och förvara dem på is.
- Kalibrera pH-värdet enligt begäran för de angivna komponenterna, antingen med Tris-buffert 2 M (60,57 g Tris-bas i en 250 ml volym sterilt vatten) eller KOH 15% (15 g KOH i en volym på 100 ml sterilt vatten) enligt tabell 3.
- I ett rör på 15 ml tillsätt volymen för varje komponent i den ordning som anges i tabell 3.
- Alikvotera energilösningen, 150 μl per rör.
- Frys alikvoter med snabbfrysning på torris och förvaras vid -80 °C.
- Beredning av aminosyralösning (AA)
OBS: Aminosyralösning framställs av RTS Amino Acid Sampler-satsen. Var och en av de 20 aminosyrorna tillhandahålls i detta kit som en volym på 1,5 ml vid 168 mM, förutom leucin som är vid 140 mM. Här är den beredda stamlösningen 4x koncentrerad, snarare än den arbetslösning som krävs. Den slutliga koncentrationen av aminosyralösningen är 6 mM för alla aminosyror, utom leucin som är vid 5 mM.- Tina de 20 aminosyrarören genom virvlande och inkubera vid 37 °C tills de är helt upplösta.
OBS: Cys kanske inte upplöses helt. - Tillsätt 12 ml sterilt vatten och 1,5 ml vardera aminosyrorna i ett 50 ml rör i den ordning som anges i tabell 4.
- Virvel tills lösningen är ganska klar, inkubera vid behov vid 37 °C.
OBS: Cys kanske inte upplöses helt. - Alikvot 500 μl av aminosyralösningen per rör på is.
- Snabbfrys alikvoterna på torris och förvara vid -80 °C.
- Tina de 20 aminosyrarören genom virvlande och inkubera vid 37 °C tills de är helt upplösta.
- Beredning av lösningar för buffertkalibrering
- Bered stamlösningen för Mg-glu (100 mM) och K-glu (3 M) enligt tabell 5. Gör en seriell utspädning (i volym 1 ml) från dessa stamberedningar för Mg-glu (0 till 20 mM) och K-glu (20 till 300 mM) enligt anvisningarna i tilläggsfil 1 för kalibreringssteg.
OBS: Dessa stamkoncentrationer är för kalibreringssteget och kan behöva ändras när det slutliga experimentet inrättas. De högsta koncentrationerna av de stamberedningar som testats för detta protokoll är 1 M och 4,5 M för Mg-glu respektive K-glu.
- Bered stamlösningen för Mg-glu (100 mM) och K-glu (3 M) enligt tabell 5. Gör en seriell utspädning (i volym 1 ml) från dessa stamberedningar för Mg-glu (0 till 20 mM) och K-glu (20 till 300 mM) enligt anvisningarna i tilläggsfil 1 för kalibreringssteg.
- Beredning av PEG8000 lösningsstam
- Bered 50 ml 40% PEG8000-lösning (20 g PEG8000 i en 50 ml volym sterilt vatten).
2. Cellodling och lysatberedning (4 dagars experiment)
- Dag 1
- Stryk över stammen BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (tabell 6) från -80 °C glycerolbuljong på en 2xYT+P-agarplatta som innehåller 10 μg/ml kloramfenikol. Alternativt kan BL21 Rosetta2 ΔrecB (tabell 6) också användas10.
- Inkubera över natten vid 37 °C.
- Dag 2
- Inokulera en enda koloni från ovanstående agarplatta till 10 ml 2xYT+P kompletterat med 10 μg/ml kloramfenikol.
- Inkubera över natten vid 37 °C med 200 rpm skakning.
- Dag 3
- Gör en subkultur genom att späda ut nattkulturen 100 gånger i 4 liter färskt 2xYT+P-medium innehållande 10 μg/ml kloramfenikol.
OBS: Till exempel läggs 40 ml av nattkulturen till 3960 ml färska medier. Efter utspädning delas 4 L-mediet upp i 4 kolvar (5 L volym) så att varje kolv innehåller 1 liter. - Inkubera vid 37 °C, 200 rpm i cirka 3 till 4 timmars tillväxt för att nå en OD600 på 1,5-2,0. Späd kulturen med 4x om du mäter OD600 > 0,8.
OBS: Den exakta inkubationstiden kan variera beroende på stam, initial inokulum, labware och de instrument som används. ΔrecB/ΔrecBCD-knockoutstammarna har tillväxthastigheter som är jämförbara med BL21 Rosetta2-föräldern (kompletterande figur 1). - Lägg kulturen på is.
- Snurra ner cellerna vid 5 000 x g i 12 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten genom dekantering.
- Återsuspendera cellpelletsen i 800 ml kyld S30A + DTT.
OBS: Volymen av S30A + DTT är 5x mindre än den ursprungliga cellodlingsvolymen. Till exempel, för en startvolym på 1 liter av cellkulturen, återsuspendera cellpellets i 200 ml S30A + DTT. Det rekommenderas också att utföra detta steg i ett kylrum vid 4 °C, samt att hålla allt material på is. - Snurra ner cellerna vid 5 000 x g i 12 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten genom dekantering.
- Upprepa steg 2.3.5 och 2.3.6.
- Återsuspendera cellpellets i 160 ml kyld S30A + DTT.
OBS: Den här gången är volymen av S30A + DTT 25x mindre än den ursprungliga cellodlingsvolymen. Till exempel, för en startvolym på 1 liter av cellodlingen, återsuspendera cellpellets i 40 ml S30A + DTT. Återigen rekommenderas att utföra detta steg i ett kallt rum vid 4 ° C, samt att hålla materialen på is. - Överför cellerna till kylda och vägda 50 ml rör.
- Snurra ner cellerna vid 2 000 x g i 8 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten genom dekantering.
- Snurra ner cellerna vid 2 000 x g i 4 minuter vid 4 °C och ta sedan bort den återstående supernatanten försiktigt med hjälp av en pipett.
- Mät rörets vikt igen för att beräkna cellpelletens vikt.
- Håll cellpelletsen vid -80 °C.
- Gör en subkultur genom att späda ut nattkulturen 100 gånger i 4 liter färskt 2xYT+P-medium innehållande 10 μg/ml kloramfenikol.
- Dag 4
- Ta cellpelletsen från -80 °C och tina dem på is i 1-2 timmar.
- Återsuspendera cellpelletsen i 0,9 ml S30A+DTT-buffert per gram av pellets vikt. Pipettera långsamt för att återsuspendera cellerna och undvik toppskum så mycket som möjligt, om någon.
- Placera 1 ml alikvoter av de återsuspenderade cellerna i 1,5 ml mikrorör och förvara dem på is eller ett förkylt kallt block vid 4 ° C (det är att föredra att använda metallblock).
OBS: Om den sista alikvoten är mycket mindre än 1 ml är det bättre att kassera den än att sonikera en suboptimal volym. Den optimala volymen (1 ml) för ultraljudsbehandling bestämdes för denna inställning (rör, sonicator, och sond), och kan variera för en annan. - Sonicate varje rör i en sonicator (3 mm sond, frekvens 20 kHz), med en inställning av 20% amplitud för tre cykler (30 s ultraljudsbehandling, 1 min paus).
OBS: Den totala energin som levererades under de tre cyklerna var ~ 266 Joule (~ 80-110 Joule per cykel). Under detta steg, håll rören på det kalla blocket som är omgivet av is. Växla mellan två kalla block för att undvika överhettning av sonden (det kalla blocket i beredskap hålls också kallt på is). Båda de kalla blocken var förkylda i kylen dagen före ultraljudsbehandlingen. - Snurra ner lysatet vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Samla supernatanten (celllysat) med en pipett och överför till ett 50 ml rör.
- Inkubera celllysatet vid 37 °C vid omrörning om 200 rpm i 80 minuter.
- Snurra ner lysatet vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Samla supernatanten och alikvoten 30 μL vardera i förkylda 1,5 ml mikrorör, samtidigt som alla rör hålls på is.
- Snabbfrys lysatalikvoterna på torris och förvara vid -80 °C.
3. Cellfri buffertkalibrering för linjärt DNA
OBS: Cellfri buffert kalibrerades för optimala koncentrationer av Mg-glu och K-glu enligt beskrivningen i Sun et al.13. Kompletterande fil 1 behövs för kalibreringsstegen. Reaktionerna ställdes in på en slutlig volym på 10,5 μl vardera. Extrakten kalibrerades med hjälp av 1 nM linjärt (se avsnitt 4 nedan) eller plasmid-DNA. Experimenten kan utföras samma dag som buffertarna förbereds, eller så kan de beredda buffertarna frysas vid -80 °C för att utföra experimentet en annan dag. För alla kalibreringssteg tinades varje komponent på is innan den blandades och pipetterades till en 384-brunnsplatta.
- Förbered en mastermix, enligt fliken "Buffertberedning" i Excel-filens tilläggsfil 1, innehållande: (a) cellextrakt (33% av den totala reaktionsvolymen), (b) reporter-DNA (som linjärt och / eller plasmid-DNA) till en slutlig koncentration av 1 nM, (c) cellfri buffert (PEG8000, AA-lösning och energilösning) och (d) K-glu till en slutlig koncentration på 80 mM.
- För en reaktionsvolym på 10,5 μL, ta 1,05 μL (10% total reaktion) av olika koncentrationer av Mg-glu 10x koncentrerade beståndsdelar (slutliga koncentrationsintervall: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 och 20 mM) och tillsätt 9,45 μL (90% total reaktion) av Master Mix. Blanda försiktigt.
OBS: Använd PCR-rör med åtta remsor för att förbereda utspädningarna och blanda med en flerkanalig pipett. Vid behov kan ett annat intervall av Mg-glu-koncentrationer användas. - Pipettera 10 μL av ovanstående reaktioner till en 384-brunns mikroplatta med kvadratisk botten, täck den med en självhäftande platttätning och mät genuttryck som fluorescensutgång. Registrera fluorescensdata med en plattläsare (Ex: 485 nm; Em: 528 nm) med jämna mellanrum (t.ex. 5 min) under 8 timmars inkubation vid 30 °C med kontinuerlig omloppsskakning vid 307 cpm.
OBS: Om det behövs, snurra ner mikroplattan med 384 brunnar (<2 500 x g, 1 min, rumstemperatur) innan du börjar datainsamlingen. Slutpunktsmätningar användes för att jämföra GFP-uttryck i de olika buffertsammansättningarna. Fluorescensvärdena kan omvandlas till standardiserade enheter för plottning (se nedan). - Identifiera den Mg-glukoncentration som resulterar i det högsta fluorescensvärdet vid slutpunkten.
OBS: Om du är osäker på den optimala Mg-glukoncentrationen som erhållits, upprepa steg 3.2 med mer varierande koncentrationsintervall. - Med den optimerade Mg-glukoncentrationen, fortsätt till K-glu-kalibrering för ett koncentrationsintervall (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 och 240 mM), med samma volymer som anges i steg 3.2. Kör experimentet och identifiera det högsta fluorescensvärdet bland de testade K-glukoncentrationerna. Detta indikerar den optimala buffertkompositionen för Mg-glu och K-glu för detta lysat.
OBS: Om du är osäker på den optimala K-glu-koncentrationen som erhålls, upprepa steget med mer varierande koncentrationsintervall. - När Mg-glu- och K-glu-värdena har fastställts, förbered stamrör med den optimerade buffertkompositionen enligt den erhållna batchvolymen. Använd fliken "Buffertberedning" i tilläggsfil 1 för att beräkna antalet buffertrör som behövs, alikvot 38 μL per rör och förvaras vid -80 °C.
4. Linjär DNA-beredning
OBS: För lysatkalibrering används plasmid P70a-deGFP. Denna plasmid bibehölls i E. coli KL740 cl857+ (tabell 6) för miniprep med hjälp av Plasmid Miniprep Kit, eller maxiprep med Plasmid Maxiprep Kit. Linjära DNA-fragment som användes som uttrycksmallar i de cellfria reaktionerna PCR-förstärktes med hjälp av de primers och mallar som anges i tabell 7 och tabell 8.
- PCR förstärks från plasmid P70a-deGFP med DNA-polymeras med oligoprimrar som anges i tabell 7. Ställ in PCR-reaktionerna i en volym på 50 μl, enligt tillverkarens protokoll, med hjälp av termocyklernas program: [98 °C i 2 minuter; 40 cykler x (98 °C i 30 s → 66 °C i 30 s → 72 °C i 60 s); 72 °C i 10 minuter; 4 °C i ∞].
- Smält mall-DNA i PCR-reaktionerna genom att tillsätta 1 μL DpnI-restriktionsenzym per 50 μL PCR-reaktion och inkubera vid 37 °C i 1 timme. Rena sedan PCR-reaktionen med hjälp av ett PCR & DNA-rengöringssats och eluera i nukleasfritt vatten.
- Kontrollera PCR-produkterna på en 1% agarosgel (1x TAE) före användning.
- Kvantifiera de renade PCR-produkterna (eller plasmidförberedelserna) med Nanodrop (ND-1 000).
OBS: Om man använder ett DNA-polymeras/buffert som är direkt kompatibelt med den cellfria reaktionen nedströms, kan reningssteget (steg 2) hoppas över helt och koncentrationen av orenat DNA mäts med en fluorometrisk analys med DNA-bindande färgämne istället (se Batista et al.10).
5. Experimentellt utförande
OBS: Förutom att använda tilläggsfil 1 för att kalibrera buffertlagret för varje framställd lysatsats (ovan), rekommenderas att du använder fliken "Reaktionsberedning" i filen för att ställa in de efterföljande cellfria reaktionerna. Som tidigare är reaktionernas volym inställd på 10,5 μL per reaktion, varav endast 10 μL slutligen pipetteras in i 384-brunnsplattan för datainsamling. Här används 5 nM av varje mall för cellfritt uttryck. Det är viktigt att vara konsekvent när man pipetterar reaktionerna - använd samma pipett och typen av tips. Dosera försiktigt för att undvika bubblor i brunnen eller vätska som fastnar på brunnens väggar. Snurra vid behov ner plattan (<2 500 x g, 1 min, rumstemperatur).
- Beräkna volymerna till pipett genom att föra in de provbeskrivningar och replikat som behövs per prov på fliken "Reaktionsberedning" i tilläggsfil 1.
OBS: Om en annan reaktionsvolym än 10,5 μL krävs kan den också matas in i tilläggsfil 1. Filen kommer att beräkna antalet rör av tidigare optimerade buffertlager och cellextraktrören som ska tinas på is. - Märk ett 1,5 ml mikrorör för Optimal Master Mix-preparatet (separat för linjärt och plasmid-DNA), tillsätt rätt volymer av bufferten och lysatet och blanda försiktigt.
OBS: På grund av skillnader i optimala K-glukoncentrationer i deras buffertar bör kopior av fliken "Reaktionsberedning" göras för att användas separat för linjärt och plasmid-DNA. - Pipettera DNA-proverna först, följt av nukleasfritt vatten, och slutligen Optimal Master Mix (MM) från steg 5.2. Blanda den cellfria reaktionen försiktigt med pipetten precis innan du lägger till plattläsaren och undvik bubblor.
OBS: Använd ett PCR-rör med åtta remsor för att blanda reaktionsvolymen för ytterligare ett replikat. Till exempel, om tekniska triplikat är avsedda, förbered en blandning för fyra reaktioner och lämna en död volym i röret för att minska pipettfel medan proverna läggs till plattan. - Ställ in reaktionerna i plattläsaren (Ex 485 nm; Em 528 nm). Kinetiska körningar registrerade fluorescensdata med jämna mellanrum (t.ex. 5 min) under 8 timmars inkubation vid 30 °C, med kontinuerlig omloppsskakning vid 307 cpm.
OBS: Slutpunktsmätningar rapporterades som 8 timmars tidspunkt. De fluorescensvärden som samlas in finns i godtyckliga enheter (a.u.), men de kan omvandlas till standardiserade enheter för plottning (se nedan).
6. Relativ kvantifiering av FITC- och GFP-uppgifter
OBS: GFP-uttryck exporteras av plattläsaren i godtyckliga fluorescensenheter (a.u.). Det rekommenderas dock att använda standardiserade måttenheter för att jämföra fluorescensvärden mellan olika inställningar (satser, utrustning, användare och laboratorier). Här presenteras detaljerade steg för att konvertera fluorescensvärdena (a.u.) till FITC-ekvivalenta och eGFP-värden (μM), med hjälp av standardkurvor för NIST-FITC och rekombinant eGFP. Förvara NIST-FITC stamlösning vid 4 °C och förvara rekombinant eGFP vid -20 °C. Se till att stamlösningen och serieutspädningarna är skyddade mot ljus. Vid leverans rekommenderas att alikvotera den rekombinanta eGFP i mindre volymer för att undvika flera frys-upptiningscykler.
- Bered en lösning av 100 mM natriumborat, pH 9,5, och förvara vid rumstemperatur eller vid 4 °C.
- Bered 12 utspädningar (70 μl vardera) för standardkurvan, 2x per steg (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 och 0 μM) av NIST-spårbar FITC-standard från 50 μM-stamberedningen med natriumboratlösningen. Förbered utspädningsserien i tre exemplar.
- I likhet med steg 6.2, bereda seriella utspädningar (70 μl vardera) från den rekombinanta eGFP med natriumboratlösningen (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 och 0 μM). För molaritetsberäkning, beakta proteinets fulla storlek (28 kDa) och koncentrationen av den renade eGFP (1 g/L). Förbered utspädningsserien i tre exemplar.
- Tillsätt 20 μl av varje utspädning (nio brunnar vardera = tre utspädningsserier x tre tekniska replikat) i en mikroplatta med kvadratisk botten på 384 brunnar, täckt av en självhäftande platttätning, och inkubera i en plattläsare för mätning.
OBS: Här var de inställningar som användes Excitation: 485/20, Emission: 528/20, med vinst 50. Ytterligare våglängds-/förstärkningskombinationer kan dock också användas för att kalibrera för andra fluorescerande molekyler och/eller förstärkningsinställningar. För att beräkna omvandlingsfaktorn krävs samma våglängds- och förstärkningsinställningar för att erhålla GFP-fluorescensdata från de cellfria experimenten och standardkurvdata. - Använd det linjära signalområdet (här till exempel [FITC] ≤ 0,781 μM) för att passa lutningen [y = ax och R2] för varje tillstånd.
OBS: Utbudet kan variera för olika maskiner och standardlösningar som används. - Spara data för FITC- och eGFP-kalibrering för att beräkna relativa mätningar för labbet genom att följa exemplet i tabell 9. Dividera de värden som erhålls i godtyckliga fluorescensenheter (a.u.) med kurvlutningens "a"-värde (y = ax) för att uppskatta GFP-produktionen i termer av FITC eller eGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat visas här efter kalibrering av lysatet för optimala Mg-glutamat- och K-glutamatnivåer separat för linjärt och plasmid-DNA (figur 1). Den optimala koncentrationen av Mg-glutamat är liknande över Δ recB- och ΔrecBCD-extrakt vid 8 mM (figur 1B). Den optimala K-glutamatkoncentrationen för plasmid-DNA är emellertid 140 mM, medan den optimala K-glutamatkoncentrationen för linjärt DNA för samma extrakt är 20 mM (figur 1C). I en jämförande analys av GFP-uttryck i extrakt från WT- och ΔrecBCD-celler sågs att buffertsammansättningen av extrakt måste kalibreras specifikt för optimalt uttryck från linjärt och plasmid-DNA som används i exonukleas V-raderade extrakt.
Efter kalibreringssteg jämfördes nivåerna av GFP-uttryck från linjärt och plasmid-DNA (5 nM) i WT- och ΔrecBCD-extraktet (figur 1D). GFP-uttryck från linjärt DNA nådde 102% och 138% av uttrycket från plasmid-DNA i extrakt från ΔrecB- respektive ΔrecBCD-stammar. Tillsammans visar dessa resultat att uttryck från linjärt DNA, med hjälp av en inbyggd E. coli σ70-promotor, kan nå samma nivå som från plasmiduttryck när celllysatet framställs från sådana mutanter och den cellfria bufferten är specifikt kalibrerad för linjärt DNA.
Figur 1: Differentiell buffertoptimering för linjärt och plasmid-DNA i ΔrecB/ΔrecBCD-extrakt. (A) En 1361 bp linjär DNA-amplicon förstärktes från plasmid p70a-deGFP och användes som mall för genuttryck för buffertkalibrering. B) Kalibrering av mg-glutamatbuffert med 1 nM av varje DNA-typ med olika koncentrationer från 0 till 20 mM (med K-glutamat fixerat till 80 mM). Fyrkantiga rutor anger valda koncentrationspunkter. P = plasmid-DNA, L = linjärt DNA. (C) Efter att ha valt den optimala Mg-glutamatkoncentrationen för varje lysat titrerades K-glutamat från 20 till 240 mM. Fyrkantiga rutor anger valda koncentrationspunkter. P = plasmid-DNA, L = linjärt DNA. Data som visas i värmekartorna (B) och (C) kommer från ett enda experiment. (D) Efter buffertkalibrering utfördes cellfria reaktioner med 5 nM av varje DNA-typ. Extrakt BL21 Rosetta2 stöder inte linjärt DNA-uttryck, medan differentiellt optimerade extrakt från ΔrecB- och ΔrecBCD-stammar uppvisar linjärt DNA (grönt) uttryck som liknar plasmid-DNA (blå) nivåer. Slutpunktsdata som visas är medelvärdet ± SD för tre replikat som görs samma dag och samlas in efter 8 timmars inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Visuell representation av protokollet. Arbetsflöde för celllysatberedning och lysatoptimering för linjärt DNA som mall i CFPS-syntes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Lista över komponenter för beredning av flytande och fasta 2xYT + P-medier. Mängden (i gram) av varje komponent anges för 1 liter media. Skala upp proportionellt efter behov. Media måste autoklaveras före användning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Förteckning över komponenter för beredning av buffert S30A+DTT. Mängden (i gram) av varje komponent anges för 1 liter buffert S30A. Skala upp proportionellt efter behov. S30A-bufferten skall autoklaveras och sedan kylas (4 °C) före användning. DTT-bufferten måste beredas och filtreras separat enligt anvisningarna (i 15 ml rör) och förvaras i -20 °C. Precis innan du använder buffert S30A, tillsätt 2 ml DTT (från 1 M-lager) till 1 L S30A-buffert. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 3: Förteckning över komponenter för beredning av energilösningar. Mängden (i gram) eller volymen av varje komponent specificeras (i kolumn G) för beredning av en specificerad volym (i kolumn H) stamlösningar för den angivna koncentrationen (i kolumn F). pH-värdet för varje komponent måste justeras vid behov, enligt vad som anges (i kolumn I och J). 14x energilösningslager framställs genom att blanda den angivna volymen för varje komponent (i kolumn K) i den angivna ordningen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 4: Förteckning över komponenter för beredning av aminosyrastamlösning. För beredning av 4x aminosyrastamlösningen måste alla aminosyror blandas i den ordning som anges. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 5. Förteckning över komponenter för beredning av lysatkalibreringslösningar. Mängden (i gram) Mg-glutamat och K-glutamat stamlösningar specificeras för att bereda 50 ml av den angivna koncentrationen av varje buffert. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 6: Lista över bakteriestammar som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 7: Lista över primers som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 8: Plasmid som används i detta protokoll för lysatkalibrering och som mall för linjär DNA-förstärkning med PCR. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 9: Konvertering av FITC- och eGFP. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi att celllysat framställt från E. coli BL21 Rosetta2 med en genomisk knockout för antingen recB- eller recBCD-operon stöder högproteinuttryck från linjära DNA-mallar. Detta protokoll utarbetar ett steg-för-steg-lysatkalibreringsförfarande som är specifikt för linjära DNA-mallar (figur 2), vilket är ett kritiskt steg som leder till det höga uttrycket från σ70-promotorer i linjärt DNA och når nära plasmidnivåer för ekvimolära DNA-koncentrationer. Detta protokoll belyser vikten av buffertkalibrering beroende på vilken typ av DNA (linjär eller plasmid) som ska användas i den slutliga applikationen.
Protokollet kan hjälpa till att undvika plasmidkloning, vilket ger betydande vinster i tid och kostnad. Linjära DNA-fragment kan syntetiseras av kommersiella leverantörer och / eller förstärkas av PCR i laboratoriet. Samma process med plasmid-DNA skulle ta minst 1 vecka längre, med hänsyn till kloning, sekvensverifiering och DNA-förberedelsesteg10. Det rekommenderas att förbereda stora volymer av cellextraktet och linjära DNA-mallar för att minimera batch-till-batch-variabilitet mellan experiment14,15.
Denna metod har visat sig vara robust och används i laboratorier10. Resultaten från dessa extrakt har varit konsekventa över biologiska replikat, olika extrakt satser, samt över olika stam bakgrunder10. Protokollets robusthet har också testats över olika experimentella parametrar: celllysmetoder, temperaturer, DNA-mallar och olika DNA-koncentrationer. Metoden har redan använts för snabb screening och karakterisering av genetiska konstruktioner för två relevanta tillämpningar: toehold switch library characterization och enzyme activity screening10.
Även om höga uttrycksnivåer erhölls i denna studie från linjärt DNA i ΔrecB / ΔrecBCD-extrakt från den mycket produktiva föräldrastammen E. coli BL21 Rosetta2, skulle metoden kräva genomteknik för en ny stam av intresse. Däremot är tillskott med skyddsmedel för linjärt DNA, som GamS5 eller Chi DNA6, lättare att applicera för en ny stam, men dyrare och mer tidskrävande.
Protokollet som tillhandahålls här kommer att underlätta användningen av linjära DNA-mallar i cellfria system och påskynda design-build-testcyklerna för det syntetiska biologisamhället. Enklare cellfritt uttryck från linjära DNA-mallar i ΔrecB/ΔrecBCD-extrakt kan användas för produktion av små molekyler av intresse, biosimilarer och andra on-demand point-of-care-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
ACB och JLF erkänner finansieringsstöd från ANR SINAPUV-bidraget (ANR-17-CE07-0046). JLF och JB erkänner finansieringsstöd från ANR SynBioDiag-bidraget (ANR-18-CE33-0015). MSA och JLF erkänner finansieringsstöd från ANR iCFree-bidraget (ANR-20-BiopNSE). JB erkänner stöd från EFR som startar "COMPUCELL" (bidragsnummer 657579). Centre de Biochimie Structurale erkänner stöd från den franska infrastrukturen för integrerad strukturbiologi (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK erkänner finansieringsstöd från INRAe: s MICA-avdelning, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) regionens DIM-RFSI och ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Detta arbete stöddes genom finansiering genom European Research Council Consolidator Award (865973 till CLB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5?-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
