Summary
Presentato qui è un protocollo per il campionamento del tessuto villous placenta umano seguito da isolamento di cytotrophoblasts per colture cellulari primarie. Trattamento del trofoblasto con TNFα ricapitola l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso e facilita la scoperta di bersagli molecolari regolati da infiammazione in placente con l'obesità materna.
Abstract
L'obesità materna è associata con un rischio aumentato di esiti perinatali negativi che sono probabilmente mediati da compromissione della funzione placentare che può essere attribuito, in parte, la disregolazione dell'autofagia. Aberrante cambiamenti nell'espressione di regolatori dell'autofagia in placente da gravidanze obese possono essere regolati tramite i processi infiammatori connessi con l'obesità e la gravidanza. Un protocollo per il campionamento del tessuto villous e isolamento di cytotrophoblasts dei villi della placenta umana a termine per colture cellulari primarie è descritto qui. Questa è seguita da un metodo per simulare il milieu infiammatorio nell'ambiente intrauterino obeso trattando trofoblasti primari da magre gravidanze con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF), una citochina proinflammatory che è elevata nell'obesità e nella gravidanza. Attraverso l'implementazione del protocollo descritto qui, è trovato che l'esposizione a esogeno TNFα regola l'espressione di Rubicon, un regolatore negativo dell'autofagia, nel trofoblasto da magre gravidanze con feti di sesso femminile. Mentre una varietà di fattori biologici nell'ambiente intrauterino obeso mantenere il potenziale di modulare le vie critiche nel trofoblasto, questo sistema ex vivo è particolarmente utile per determinare se espressione modelli osservata in vivo in placente umane con l'obesità materna sono un risultato diretto di TNFα segnalazione. In definitiva, questo approccio offre l'opportunità di analizzare le implicazioni normative e molecolare di infiammazione associata con l'obesità materna su autophagy e su altre vie cellulari critici nel trofoblasto che hanno il potenziale di impatto funzione placentare.
Introduction
L'obesità è uno stato infiammatorio caratterizzato da infiammazione cronica, derivante dal tessuto adiposo in eccesso e disponibilità di nutrienti. Nell'obesità, citochine proinfiammatorie sono elevate nei tessuti metabolici così come sistematicamente in circolazione. Un robusto corpo di prova ha dimostrato che TNFα è significativamente elevato nella regolazione dell'obesità con implicazioni in insulino-resistenza e disfunzione metabolica1. Attivazione di TNFα contribuisce alla patogenesi della malattia in condizioni come il cancro e l'autoimmunità, che lo rende un obiettivo terapeutico attraente2.
L'infiammazione nell'obesità è aggravata dalla gravidanza, inoltre, un stato proinflammatory3,4. Precedentemente è stato indicato che placentare TNFα contenuto aumenta con adiposità materna nelle gravidanze con feti di sesso femminile. Inoltre, il trattamento di TNFα inibisce la respirazione mitocondriale nelle cellule del trofoblasto femminile ma non male, suggerendo che il TNFα è coinvolto nella regolazione del metabolismo placenta in un modo sessualmente dimorphic5. L'obesità materna è associata con l'incidenza aumentata di una varietà di complicazioni durante la gravidanza, tra cui il feto nato morto, con feti maschi, essendo il più suscettibile3,6,7,8 . Dovuto il relativo ruolo chiave a livello di interfaccia materno-fetale, cambiamenti nella capacità funzionale della placenta nell'ambiente intrauterino obeso in risposta alla segnalazione infiammatoria possono svolgere un ruolo importante nel mediare gli esiti delle gravidanze obesi.
Cytotrophoblasts e syncytiotrophoblasts nel tessuto dei villi della placenta sono fondamentali per la segnalazione endocrina e scambio di nutrienti e ossigeno tra la madre e sviluppo feto9. Interruzioni nella capacità funzionale di villous cytotrophoblasts (in appresso denominato trofoblasto) possono compromettere lo sviluppo e la salute del feto. Questo protocollo descrive un metodo per il campionamento del tessuto dei villi della placenta umana a termine distanza dissezionando le piastre corioniche e basale insieme a una procedura ottimizzata per l'isolamento di trofoblasti per colture cellulari primarie. Questo protocollo è derivato da metodologie consolidate che coinvolgono digestione enzimatica del tessuto villous di rilasciare cellule dalla matrice extracellulare seguita da centrifugazione differenziale densità per isolare trofoblasti10, 11,12. Questo dettagli del protocollo un approccio in cui primari trofoblasti da placente da gravidanze magre sono trattati con mezzi di coltura completati con TNFα per simulare un componente del milieu infiammatorio associato con l'obesità materna. Infine, è descritta una procedura semplice per la raccolta lisati cellulari totali dal trofoblasto TNFα-trattati, seguita da Western blotting per rilevare i cambiamenti nell'espressione genica.
Mentre questo modello non ricapitolare obesogenico nell'utero ambiente nella sua interezza, esso fornisce un sistema controllato che permette di analizzare il contributo individuale di TNFα-mediata di infiammazione in risposta dei trofoblasti a obesità materna. Questo modello offre sia l'opportunità di scoprire o confermare bersagli molecolari direttamente disciplinate dal TNFα segnalazione nel trofoblasto, nonché permette di verificare se i cambiamenti nel pattern di espressione genica osservati in vivo in placente con materna l'obesità può essere un risultato di infiammazione TNFα-mediata.
L'approccio qui descritto è stato implementato per testare l'effetto di infiammazione TNFα-mediata sulla regolazione dell'autofagia nel trofoblasto umano. Trofoblasto da obese gravidanze con feti di sesso maschile Mostra perturbato autofagica fatturato o autofagosoma maturazione13. Una proteina chiamata Rubicon (RUN dominio proteina d'interazione Beclin1 e ricche di cisteina contenente), che è localizzato per i lisosomi e late endosomes, recentemente è stata descritta come un "freno" nel processo di autofagia fatturato perché funziona come un negativo regolatore di autofagosoma maturazione14,15. Infatti, il Rubicon è un raro esempio di una proteina che trattiene l'autofagia, che lo rende un prezioso obiettivo terapeutico. Poche informazioni sono disponibili circa il significato patofisiologico di Rubicon, fatta eccezione per i suoi ruoli nella risposta immunitaria innata a microbials16,17 e del cardiomyocyte protezione18. Mediante il protocollo descritto qui, si è constatato che il Rubicon è upregulated nel trofoblasto femminile primario in risposta al trattamento con aumento delle concentrazioni di TNFα fino a 250 pg/mL. Il regolamento di Rubicon può svolgere un ruolo in come femmina feti tariffa migliore rispetto ai maschi nelle gravidanze con l'obesità materna. Ricapitolando l'infiammazione associata con l'obesità materna ex vivo esponendo trofoblasto umano di TNFα esogena fornisce una piattaforma per studiare l'impatto dell'ambiente intrauterino obeso sulla regolamentazione dei percorsi critici in trofoblasto e, per estensione, la funzione placentare.
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Protocol
placente sono stati raccolti dall'unità di consegna all'ospedale universitario e del lavoro nell'ambito di un protocollo approvato dall'istituzionale Review Board of Oregon Health and Science University a Portland, Oregon, con il consenso informato il pazienti.
1. raccolta di tessuto placentare
- preparazione
Nota: tutte le attrezzature che incontra il tessuto devono essere sterile.- L'apparecchiatura per dissezione di sterilizzare in autoclave per 60 min a 121 ° C.
- Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE): laboratorio cappotti/abiti/scrub, guanti e maschera con una visiera o occhiali di protezione.
- Disabilita il bagnomaria e insieme a 37 ° C.
- Caldo due provette coniche da 50 mL, ciascuna contenente 25 mL di completa per i media (Iscove ' s Modified Dulbecco ' s supplementato con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina, tabella 3) in bagnomaria a 37 ° C.
- Con consenso informato del paziente, ottenere una placenta subito dopo la consegna dalla sezione cesarean.
- Acquisire familiarità con la placenta. Il cordone ombelicale viene inserito sul lato fetale (piatto corionico) e vasi sanguigni può essere visto che si irradiano fuori dal sito per l'inserzione del cordone ombelicale. Sul lato opposto è il lato materno, o piastra basale. Esso comprende la decidua e strutture che contengono gli alberi di nave, chiamati cotiledoni.
- Campionamento del tessuto Villous
Nota: tessuto Villous deve essere campionato dalla placenta appena possibile dopo il parto, preferibilmente in 30 min o meno.- Con piatto corionico rivolto verso l'alto, asportare sezioni di pieno-spessore 2-3 (circa 2,5 cm x 2,5 cm nel formato) 2-3 cm dalla periferia della placenta a casuale, usando pinze e le forbici ( Figura 1A).
Nota: Evitare di parti della placenta che appaiono anormali (cioè bianche calcificazioni). - Tagliare via le piastre corioniche e basale e qualsiasi grandi vasi sanguigni.
- Posizionare il tessuto villous risultante ( Figura 1B, circa 80-120 g totale) in media completi caldi e iniziare isolamento trofoblasto entro 30 min di campionamento.
Nota: Alcuni saggi a valle e applicazioni sono interessate dalla lunghezza del periodo di latenza tra consegna, campionamento e l'isolamento di trofoblasto. Si consiglia di mantenere questi periodi più breve possibile e coerente tra isolamenti. - Utilizzando le tecniche descritte nei passaggi 1.2.1 - 1.2.2, campione 5 sezioni casuale 1 x 1 cm di tessuto villous da altro lato la placenta (tra cui il centro).
- Taglio ogni campione di tessuto villous di 1 x 1 cm in 4-5 piccoli pezzi (circa 30 mg ciascuna), posto in provette microcentrifuga da 2 mL e flash freeze liquido N 2. Conservare a-80 ° C per uso nelle analisi successive.
- Con piatto corionico rivolto verso l'alto, asportare sezioni di pieno-spessore 2-3 (circa 2,5 cm x 2,5 cm nel formato) 2-3 cm dalla periferia della placenta a casuale, usando pinze e le forbici ( Figura 1A).
2. Isolamento di trofoblasti da tessuto Villous
- preparazione
Nota: utilizzare attrezzature sterili ed eseguire procedure che coinvolgono le cellule in una cappa a flusso laminare.- Disgelo quattro gradienti di densità congelati (tabella 1, vedere la tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) a 4 ° C la notte prima la placenta arriva.
Nota: In alternativa, gradienti di densità possono essere fatta il giorno dell'isolamento. - Disabilita il centrifuga e insieme a 20 ° C.
Nota: Tutte le fasi di centrifugazione sono alla massima accelerazione e decelerazione se non specificato diversamente. - Preparare 1 x soluzione salina tamponata HEPES (HBSS) completati con Ca + 2 e Mg + 2 (tabella 3).
- Tripsina calda a 37 ° C.
- Dnasi diluire a circa 2720 kilounits/mL in sterile completati HBSS.
- Caldo 50 mL di siero di vitello appena nato (NCS) a 37 ° C.
- Caldo completa per i media a 37 ° C.
- Caldo media congelamento (90% FBS, 10% DMSO, tabella 3) a 37 ° C.
Attenzione: DMSO è tossico e deve essere maneggiato con guanti.
Buffer di - preparazione digestione (tabella 2 e 3) mescolando 308 mL di completati HBSS, 50 mL di tripsina (3751.7 BAEE unità/mL) e 0,5 mL di dnasi (379.4 kilounits/mL) in una bottiglia sterile.
Nota: Il tempo approssimativo necessario per isolare le cellule dal tessuto villous è h. 7
- Disgelo quattro gradienti di densità congelati (tabella 1, vedere la tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) a 4 ° C la notte prima la placenta arriva.
- Elaborazione il tessuto Villous
- risciacquo ogni pezzo di tessuto villous in una provetta conica da 50 mL riempita con temperatura ambiente fosfato tampone salino (PBS). Ripetere e sostituire il PBS come necessario, fino a quando il sangue in eccesso viene rimosso (risciacquo PBS sarà rosso chiaro o rosa quando il tessuto è accuratamente sciacquato).
- Inserire il tessuto villous in una capsula di Petri sterile e rimuovere come molti vasi sanguigni possibili raschiando delicatamente fuori il morbido tessuto villous dai vasi utilizzando un vetrino da microscopio.
- Tritare finemente il tessuto villous risultante utilizzando forbici.
- Digestione del tessuto villous e grezzo isolamento di trofoblasti
- trasferire il tessuto villous macinato a un flacone sterile con soluzione di digestione secondo i volumi calcolati basata sull'attività specifiche della tripsina e dnasi (165 mL, tabella 2).
- Dopo 35 min di incubazione in un bagnomaria a 37 ° C con agitazione a 70 giri al minuto (rpm), inclinare la bottiglia di digestione di lato e lasciare i pezzi non digeriti del tessuto a stabilirsi nella parte inferiore della bottiglia. Redigere con cura il surnatante con una pipetta sierologica, evitando il tessuto depositato.
- Dispensare il surnatante attraverso un colino di cella di 100 µm equamente tra provette coniche da 50 mL.
Nota: Per risparmiare tempo, si consiglia di iniziare la seconda digestione con l'aggiunta di soluzione di digestione (110 mL, tabella 2) per i restanti si stabilirono tessuto e ripresa di incubazione come descritto al punto 2.3.2. - Delicatamente strato 3-5 mL di NCS sotto il surnatante filtrato sopprimendo lentamente da una pipetta sierologica nella parte inferiore del tubo. Un menisco tra la sforzata surnatante (contenente trofoblasti) e NCS dovrebbe essere visibile ( Figura 2A).
- Centrifugare i surnatanti sopra NCS a 1.250 x g per 15 min a 20 ° C. Il pellet risultante includerà globuli rossi nello strato inferiore più seguito da uno strato bianco che contiene le cellule del trofoblasto ( Figura 2B).
- Ripetere i passaggi 2.3.2 - 2.3.5 per ciascuna delle digestioni seconda e il terza (aggiunta di 110 mL e 83,5 m, rispettivamente, della soluzione di digestione alla bottiglia del tessuto, tabella 2).
- Una volta che tutti i surnatanti sono stati centrifugati, ogni risospendere in 5 mL di calda completa per i media e quindi riunire le sospensioni.
- Dividere la sospensione cellulare equamente tra due provette coniche da 50 mL e centrifugare a 1.250 x g per 15 min a 20 ° C.
- Delicatamente rimuovere il supernatante e risospendere ciascuno dei pellet cellulare in 6 mL di caldo complETE media.
- Densità centrifugazione
- dividere la sospensione cellulare ugualmente fra quattro gradienti di densità (3 mL ciascuno) da lentamente e con attenzione la sospensione cellulare nella parte superiore i gradienti di densità con una pipetta da trasferimento di stratificazione.
- Centrifugare i gradienti di densità a 1.250 x g per 20 min a 20 ° C con minimo accelerazione e decelerazione. Questo dovrebbe produrre distinguibili fasce delle cellule sedimentate (tabella 4).
- Lentamente e con attenzione rimuovere gli strati superiori dei media gradiente di densità (DGM) fino a raggiungere le bande opaco contenente cellule del trofoblasto (tra 35-50% DGM) (tabella 4).
- Trasferire le bande di trofoblasto in due provette coniche da 50 mL e riempire con caldi completi media.
- Capovolgere delicatamente le provette 3 - 6 volte per mescolare e centrifugare a 1.250 x g per 15 min a 20 ° C.
- Rimuovere il supernatante e risospendere ogni cellulare in 5 mL di calda completa per i media. Combinare le sospensioni cellulari e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e Trypan blu (o cella comodo metodo di conteggio).
- Contando le cellule con un emocitometro
- mescolare la sospensione delle cellule pipettando su e giù con una pipetta sierologica o capovolgendo delicatamente la provetta diverse volte.
- Combinare parti uguali di sospensione cellulare e Trypan blu (cioè 20 µ l ciascuna) in un tubo separato e mescolare delicatamente.
- Incubare per 1-2 min a temperatura ambiente.
- Delicatamente versare 15-20 µ l di cella-Trypan blu miscela tra il vetrino coprioggetto e l'emocitometro e permettono alle cellule di diffuso attraverso la griglia per capillarità.
- Contare cellule vitali (le cellule morte saranno colorate blu profondo) in ciascuno dei quadranti quattro 4x4 con un contatore di riscontro. Impiegare un sistema di conteggio per garantire le celle non sono conteggiate più di una volta (cioè non contare le celle che toccano il fondo o limiti sinistro).
Nota: Ciascun 4x4 quadrante dovrebbe contenere tra 50-150 cellule. Troppo poche o troppe cellule possono portare a un eccessivo o sottovalutazione del numero di cell. - Media cella totale conta da ciascuno dei 4x4 quadranti, moltiplicare per 10 4 e quindi moltiplicare per il fattore di diluizione (sospensione di cellule tripan blu) per calcolare il numero di cellule per mL.
- Moltiplicare il numero di cellule per mL per il volume totale della sospensione di cellule per calcolare il rendimento delle celle totale.
Nota: Sono attesi circa 100 milioni di cellule per isolamenti a partire con 80-120 g di tessuto villous.
- Cellule placcatura
- piastra 3 milioni di cellule/pozzetto (3,3 x 10 5 cellule per cm 2) in una piastra a 6 pozzetti (2 mL di sospensione per pozzetto) e delicatamente oscillare avanti e indietro e lato a altro per distribuire uniformemente le cellule.
Nota: Trophoblasts richiedono piastre di coltura del tessuto trattato di aderire correttamente. Un monostrato di cellule è necessaria per promuovere syncytialization. - Lasciare le cellule placcate nella cappa a flusso laminare per circa 30 minuti consentire alle cellule di distribuire uniformemente, stabilirsi e iniziare ad aderire al fondo dei pozzi prima di mettere nell'incubatore.
- Cellule di cultura per fino a 72 h (con variazioni giornaliere di media) in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e 95% di umidità.
Nota: Esaminare il trofoblasto con un microscopio a 10-20 x ogni 24 h di cultura. Trofoblasto non proliferano e non può essere attraversate. Nel corso di 72 ore di coltura, il rotondi trofoblasti individuali si fondono per formare un sincizio ( Figura 3A e B).
- piastra 3 milioni di cellule/pozzetto (3,3 x 10 5 cellule per cm 2) in una piastra a 6 pozzetti (2 mL di sospensione per pozzetto) e delicatamente oscillare avanti e indietro e lato a altro per distribuire uniformemente le cellule.
- Congelamento cellule
- Pellet le celle inutilizzate per centrifugazione a 1.250 x g per 10 min a 20 ° C.
- Aspirare tanto mezzi possibili dal pellet.
- Risospendere il pellet in congelamento media (tabella 3).
- Congelare le aliquote a-80 ° C in un contenitore di congelamento riempito con 100% isopropanolo. Trasferire le aliquote congelate al liquido N 2 il giorno seguente per immagazzinaggio a lungo termine.
Nota: Le cellule possono essere coltivate dopo congelamento.
- Scongelamento cellule
- rimuovere un'aliquota di cellule congelate e scongelare a bagnomaria a 37 ° C mentre vorticoso. Rimuovere l'aliquota dal bagno di acqua appena prima che esso sia completamente sciolto ad un liquido.
- Trasferire immediatamente le cellule scongelate un tubo conico di 15 ml. Inizio rallentamento in un primo momento, aggiungere 10 mL di multimediale completo con miscelazione intermittente.
- Capovolgere la provetta diverse volte per mescolare.
- Centrifugare a 200 x g per 10 min a 20 ° C.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 2-5 mL di caldi completi media.
- Contare le cellule e la piastra come descritto in precedenza.
3. Trattamento dei trofoblasti primario con TNFα, collezione di lisati cellulari e Western Blotting
- preparazione
- calda completa per i media a 37 ° C.
- Fare un magazzino di 10 µ g/mL di TNFα in media completi e conservare a-20 ° C fino a che pronto per l'uso.
- Fare un 1 µ g/mL lavoro magazzino di TNFα in completa per i media quando si è pronti per trattare le cellule. Serie diluire lo stock di lavoro TNFα 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL e 125 pg/mL in completa per i media.
Nota: La concentrazione di TNFα 10 4 pg/ml è moderatamente citotossica. Regolazione delle concentrazioni di TNFα testato dipenderà molto le specifiche delle applicazioni a valle desiderate.
- Trattando le celle con TNFα
- dopo 24 h di cultura, aspirare la coltura dalle cellule e sostituire con 2 mL di TNFα completati medias per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (almeno due pozzi al trattamento e veicolo controllo).
- Dopo 24 h di TNFα-esposizione (48 h della cultura), sostituire i medias TNFα completati con completi media.
- Raccolta di cellule e proteine totali
- dopo 72 h della cultura (24 h dopo rimozione del TNFα), aspirare media, sciacquare delicatamente le cellule con temperatura ambiente PBS e aggiungere 80 µ l di ghiaccio freddo Radioimmunoprecipitation Assay Tampone (RIPA) contenente appena aggiunto inibitori di proteasi e fosfatasi (tabella 3) direttamente a ciascun pozzetto.
- Rimuovere le celle dalla piastra con un raschietto di cella. Trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, pool di pozzi all'interno di gruppi di trattamento.
- Lisare le cellule nel Vortex i tubi in alto per almeno tre intervalli di 15 s.
- Incubare le cellule a 4 ° C con dondolo per 15 min.
Nota: in alternativa, dopo passaggio 3.3.3., le cellule possono essere incubate in ghiaccio per 15 minuti con agitazione intermittente, spostando il tubo, Vortex, o pipettaggio fino e doWN. - Ripetere il punto 3.3.3.
- Centrifugare le provette a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C a pellet detriti cellulari.
- Transfer il surnatante (contenente proteine cellulari) a un nuovo microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -80 ° C.
Nota: Il protocollo può essere fermato qui e ripreso in un secondo momento. Si consiglia di fare diverse aliquote di campioni di proteina cellulare da evitare più cicli di congelamento-scongelamento. - Determinare la concentrazione nella proteina totale con un metodo preferito, ad esempio, un saggio di acido bicinconinico (BCA, vedere tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare).
- SDS-PAGE e Western Blotting per Rubicon o proteina di interesse
Nota: Segui Western blotting protocolli secondo produttore ' s istruzioni utilizzando un sistema di laboratorio preferito. Gel- carico tra 20-40 µ g di proteine totali nel buffer del campione (tabella 3) per pozzetto su un 12% di acrilammide. Separare le proteine da SDS-PAGE in esecuzione di tampone (tabella 3).
- Wet-trasferimento le proteine dal gel su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) secondo produttore ' s istruzioni in tampone di trasferimento (tabella 3).
- Incubare la membrana in 5% latte in polvere in Buffered Saline con 0.1% Tween 20 (TBST, tabella 3) per almeno 1 h a temperatura ambiente con dondolo.
- Incubare la membrana in un anticorpo primario di Rubicon (Vedi tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) a 1: 500 a 1% latte in polvere in TBST durante la notte a 4 ° C con dondolo.
- Lavare delicatamente la membrana 3 x 5 min in TBST e 1 x 5 min in TBS a temperatura ambiente con dondolo.
- Incubare la membrana in 1: 2000 - 1: 5000 anticorpo secondario (HRP-collegato o preferito coniugato visibile, vedere tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) in 5% latte in polvere in TBST per almeno 1 h a temperatura ambiente con dondolo.
- Ripetere la procedura di lavaggio descritta nel passaggio 3.4.5 e visualizzare il blot con un substrato di visualizzazione appropriato (cioè chemiluminescente) su un sistema di imaging.
- Ripetere la procedura di lavaggio descritta nel passaggio 3.4.5 e sonda la membrana per β-actina o un controllo comodo caricamento secondo produttore ' istruzioni s.
- Il software di analisi di immagine preferita, analizzare l'espressione di Rubicon da manuale quantificazione dell'assorbanza (intensità di banda), sottrazione dell'assorbanza di fondo e la normalizzazione di carico corrispondente controllo intensità di banda. Eseguire analisi statistiche come appropriato per testare cambiamenti statisticamente significativi nei livelli della proteina.
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Representative Results
Termine le placente umane dal magro (pre-gravidanza massa corporea (BMI) < 25) le madri con gravidanze semplici che trasportano prole femminile sono stati raccolti e campionate entro 15 minuti di consegna dalla sezione cesarean (non lavoro). Le placente sono state esaminate per l'assenza di calcificazioni e sviluppo tipico: peso compreso tra 300-600 g con il cordone ombelicale e membrane rimosse, rotondo in forma, tra 15-25 cm di diametro e inserito nel mezzo del cordone ombelicale la placenta. Tessuto villous è stato dissecato lontano le piastre basali e la gonadotropina in 2-3 campioni da attraverso la placenta (Figura 1), ottenendo circa 100 g di tessuto villous come materiale di partenza per isolamento primario trofoblasto. In 20 minuti di campionamento tessuto villous, è stata avviata la procedura per isolare trofoblasti primari come descritto qui, producendo tra 0,8 - 1 x 108 cellule vitali. Le cellule sono state seminate in piastre di coltura 6 pozzetti ad una densità di 3 x 106 (3,3 x 105 cellule per cm2). Dopo 24 h di coltura, le cellule sono state esaminate al microscopio per allegato e morfologia corretta trofoblasto è stata confermata (singole cellule rotonde). Terreni di coltura è stato sostituito con multimediale completo contenente una serie di concentrazioni di TNFα tra 125-104 pg/mL, in modo che almeno due pozzi sono stati inclusi per concentrazione e controllo del veicolo (solo stampa completa).
Ventiquattro ore dopo TNFα-trattamento (48 h della cultura), tutti i media TNFα sono stati sostituiti con completa per i media. Dovuto il trattamento con TNFα a concentrazioni pari o inferiore a 103 pg/mL è stata osservata nessuna estesa morte cellulare. Il trattamento con 104 pg/mL TNFα era moderatamente citotossico e gli effetti citotossici di questa concentrazione di TNFα non persisté dopo i media è stato cambiato come evidenziato dalle analisi del lattato deidrogenasi (LDH) (dati non mostrati). A 72 h della coltura, le cellule sono state esaminate per syncytialization sotto un microscopio. Immunocytochemistry per syncytialization e contaminazione del fibroblasto ha rivelato relativamente puro isolamento del trofoblasto (Figura 3). Lisati cellulari sono state raccolte secondo il protocollo descritto qui, producendo tra 3-8 µ g / µ l di proteina totale per preparazione come determinato mediante un test BCA (dati non mostrati). Western blot analisi in lisati cellulari dal trofoblasto femmina trattati con TNFα ha mostrato un upregulation dell'espressione Rubicon in risposta alle concentrazioni di TNFα fino a 250 pg/mL e successive downregulation dell'espressione di Rubicon alle concentrazioni di TNFα maggiore di 250 pg/mL (Figura 4A e B, 104 pg/mL esclusi dall'analisi basata sugli effetti citotossici). Allo stesso modo, Rubicon è significativamente aumentata nelle biopsie di tessuto villous flash-congelato da placente da obese gravidanze con feti di sesso femminile rispetto ai comandi magri come evidenziato da analisi Western blot (Figura 4 e D, n = 6 Classe placente per BMI, ANOVA, P < 0.05).
| Concentrazione (%) | 90% DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | Spessore dello strato (ml) |
| gradiente di x 4 | gradiente di x 4 | Totale ml 34,5 | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4,67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (Marco 13,5 ml) |
| 40 | 5,33 | 6,67 | 3 |
| 35 | 4,67 | 7.33 | 3 (contrassegno 19,5 ml) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
Tabella 1. Specifiche per la fabbricazione di gradienti di densità per la centrifugazione di densità di trofoblasto primario.
Da sinistra a destra, colonna uno specifica supporto gradiente di densità (DGM, vedere tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) concentrazione espressi in percentuale della DGM in HBSS. Colonna due specifica il volume dei DGM, mentre la terza colonna specifica il volume di HBSS necessaria per fare la percentuale adeguata di soluzione DGM. Quarta colonna specifica il volume da aggiungere nella provetta conica 50 mL per costruire il gradiente, cominciando con lo strato più denso.
| Tripsina | HBSS | Dnasi | ||
| Digestione | (Totale attività; Unità BAEE) | volume (ml) | (Totale attività; Kunits) | Volume totale /digestion |
| 1 | 619037 (23,01 ml) | 141,76 ml | 62594 (0,230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15,34 ml) | 94,51 ml | 41729 (0,154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11,65 ml) | 71,74 ml | 31676 (0,116 ml) | 83,5 ml |
| Totale | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0,5 ml) | 358,5 ml |
Tabella 2. Specifiche per la preparazione della soluzione di digestione per l'isolamento primario Trophoblast basato sull'attività specifica della dnasi e la tripsina.
Da sinistra a destra, la prima colonna specifica il numero delle digestioni, seconda colonna specifica l'attività della tripsina necessaria per la digestione, la terza colonna specifica il volume totale di HBSS completati da aggiungere per la digestione appropriata, la quarta colonna specifica l'attività di dnasi necessaria per la digestione e la colonna finale specifica il volume della soluzione di digestione per essereaggiunto al tessuto placenta per la digestione appropriata.
| HBSS (completati con Ca+ 2 e Mg+ 2) | Tampone del campione |
| 10% 10 x HBSS | 90% 4 X Laemmli tintura |
| 1.26 mM CaCl2 (anidro). | 10% di 2-mercaptoetanolo |
| 0.80 mM MgSO4 (anidro). | |
| 20,77 mM HEPES | |
| pH a 7.4 con NaOH 10N Rendere il volume fino a 1 L con ddH2O sterile Filtro sterile in una bottiglia sterile |
|
| Completa per i Media | Buffer in esecuzione |
| Rimuovere 11% v/v IMDM | 25 mM Tris Base |
| Aggiungere 10% v/v FBS | 190mm glicina |
| Aggiungere 1% 10.000 U/mL di penicillina/streptomicina (100 U/mL finale) | 0,1% SDS |
| pH a 8,3 | |
| Media di congelamento | |
| 90% v/v FBS | Buffer di trasferimento |
| 10% v/v DMSO | 25 mM Tris |
| 190mm glicina | |
| Buffer di digestione | 20% metanolo |
| 50 mL di tripsina (26.900 BAEE unità/mL) | pH a 8,3 |
| 0,5 mL dnasi (272.000 K unità/mL) | |
| Portare a ml 358,5 in HBSS completati | TBS |
| 20 mM Tris | |
| Buffer RIPA | 150 mM NaCl |
| 25 mM Tris-HCl | pH a 7.6 |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| 0,1% SDS | TBS con 0.1% Tween 20 |
| 0,5% sodio desossicolato | |
| 1% Triton X-100 | |
| 1 compressa di inibitore di proteasi/fosfatasi per 10ml RIPA Buffer |
Tabella 3. Soluzioni necessarie per l'isolamento e coltura di trofoblasto primaria seguita mediante Western Blotting.
| % DGM | Contrassegno di ml | Tipo di cella |
| 10 | 31,5-34,5 | Detriti |
| 20 | 28,5-31.5 | |
| 30 | 22.5-28.5 | |
| 35 | 19,5-22.5 | Trofoblasto |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13.5-16.5 | |
| 50 | 10.5-13.5 | Linfociti |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4,5-7,5 | Globuli rossi |
| 70 | Inferiore a 4,5 |
Tabella 4. Sedimentazione di trofoblasto mediante centrifugazione di densità.
Da sinistra a destra, la prima colonna indica la percentuale di DGM (tabella 1), la seconda colonna specifica il marchio mL dove la percentuale corrispondente di DGM è trovata su una provetta conica da 50 mL, e la terza colonna specifica quali sedimenti di tipo cellulare presso il percentuale corrispondente del marchio DGM e mL in una provetta conica da 50 mL. Sedimento di trofoblasto tra 50-35% DGM, formando distinte bande opache. Raccolta DGM sopra o sotto questa gamma si tradurrà nella contaminazione di detriti cellulari e altri tipi di cellule quali linfociti.
Figura 1. Tessuto villous è isolato da Placenta umana a termine rimuovendo i villi e piastre basali.
A) con piatto corionico (lato fetale) rivolto verso l'alto, un campione di spessore completo è asportato dalla placenta. B) un campione di tessuto villous è ottenuto rimuovendo la placca corionica e basale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Centrifugazione delle cellule in soluzione di digestione nel siero di vitello neonato si traduce in un Pellet cellulare multistrato.
A) siero di vitello appena nato (NCS) è a strati sotto la sospensione cellulare in soluzione di digerire in una provetta conica da 50 mL. B) centrifugazione di (A) si traduce in un pellet di celle multistrato. Lo strato più basso è profondo nel colore rosso ed è costituito da globuli rossi. Livello superiore include trofoblasto ed è bianco o color beige. Sopra il trofoblasto strato è NCS seguita da digestione soluzione (surnatante) alla parte superiore del tubo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Immunocytological analisi dei Syncytialization e dei fibroblasti contenuti in colture primarie di trofoblasto umano.
A) immagine rappresentativa di Cytokeratin-7 (rosso) in cytotrophoblasts dopo 24 h di cultura. B) immagine rappresentativa di Cytokeratin-7 (rosso) in syncytiotrophoblasts dopo 72 h della cultura Mostra multinucleated le masse di cellule che si sono fusi. C) immagine rappresentativa di vimentina (rosso) in syncytiotrophoblasts dopo 72 h della cultura. Le immagini sono state acquisite su un microscopio a fluorescenza con colorante di contrasto nucleare DAPI (blu). Visualizzato all'ingrandimento 10x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Regolazione dell'espressione di Rubicon in risposta al TNFα-trattamento nel trofoblasto femminile e l'espressione endogena Rubicon in tessuto Villous da Lean Versus Obese gravidanze con feti di sesso femminile.
Trofoblasto primario da placente a termine dalle madri magre con le gravidanze sane che trasportano un feto femminile sono stati isolati e trattati con 125, 250, 500,3, 10 e 104 pg/mL TNFα (o controllo del veicolo). A) rappresentante Western blot per Rubicon nei lisati di trofoblasto femmina trattati con TNFα. Β-actina è stato usato come un controllo di carico. B) Rubicon espressione in risposta al TNFα-trattamento nel trofoblasto femminile è stato quantificato da Western blot e normalizzato per β-actina. I valori sono media Rubicon espressione per TNFα concentrazione ± S.E. in n = 3 placente. C) macchie occidentali per Rubicon nei lisati di intero tessuto da flash congelati biopsie di tessuto villous da magra contro obese gravidanze con feti di sesso femminile (F1-F12). Lattato deidrogenasi A (LDHA) è stato usato come un controllo di carico. D) Rubicon espressione in Western blots da (C) è stato quantificato e normalizzato a LDHA. I valori sono media Rubicon espressione al BMI classificazione ± S.E. a n = 6 placente per classe BMI (ANOVA, * P < 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La placenta, responsabile della regolazione della crescita del feto, esibisce funzione compromessa in obesi ambiente6. Nonostante le elevate esigenze metaboliche di trofoblasto, placente con l'obesità materna esibiscono disfunzionali respirazione mitocondriale6,19. Cambiamenti nel metabolismo placenta possono contribuire all'aumento di incidenza di complicanze e i risultati fetali avversi osservati in gravidanze obesi3,6,7. L'autofagia è compromessa anche in placente con l'obesità materna. Placente da obese gravidanze con feti maschi mostrano flusso autofagico disfunzionale come evidenziato dall'accumulo di autofagosomi13. Mantenere ottima flusso autofagico è fondamentale per l'omeostasi cellulare e difettoso autofagia in placente con l'obesità materna può svolgere un ruolo importante nel mediare i risultati avversi associati alle gravidanze obese.
La causa precisa della funzione placenta compromessa hanno esibito nell'obesità materna non è ben compresi e può avere le loro origini nella segnalazione infiammatoria. L'obesità e la gravidanza sono stati di proinflammatory che sono caratterizzati da livelli elevati di circolazione TNFα1,4,20,21. TNFα è un attivatore di autofagia22,23e può mediare i cambiamenti nel flusso autofagico in placente da gravidanze obese. TNFα è comunemente usato per studiare gli effetti di infiammazione in cellule, soprattutto nel contesto di cancro2. Il protocollo qui presentato si adatta questo approccio per studiare gli effetti di infiammazione obesità sulla capacità funzionale della placenta trattando trofoblasti primari con TNFα esogeno nella cultura.
Questo protocollo è costituito da quattro componenti principali: campionamento del tessuto dei villi della placenta, isolamento di trofoblasti primari da tessuto villous, cultura del trofoblasto primaria seguita dal TNFα trattamento e raccolta dei lisati cellulari totali, seguita da Western blot analisi per misurare l'espressione di una proteina di interesse. Per isolare il trofoblasto puro, è fondamentale che le piastre corioniche e basali sono accuratamente dissecate dal tessuto villous durante il campionamento della placenta (Figura 1B). È anche indispensabile che tessuto villous viene elaborato in modo tempestivo (vale a dire entro 30 minuti dalla consegna). Questo protocollo dettaglia l'uso di tre passaggi di digestione, ciascuna della durata di 35 minuti, per rilasciare il trofoblasto dalla matrice extracellulare del tessuto villous. Digestioni lunghe rischiano di danneggiare le cellule di trypsinization delle proteine di superficie delle cellule. Aumentando il numero di digest non aumenta sensibilmente la resa finale del trofoblasto praticabile. Tuttavia, diminuendo il tempo e il numero di digestioni si tradurrà in diminuzione delle cellule rese (Simon, Bucher e Maloyan, dati non pubblicati). Questo protocollo affidabile produce circa 100 milioni di cellule da 80-120 grammi di tessuto villous.
Non c'è variabilità del numero di bande di trofoblasto distinguibili osservato sui gradienti di densità tra isolamenti. Per evitare contaminazioni da altri tipi di cellule, è importante raccogliere rigorosamente le bande contenente trofoblasti su gradiente di densità (tabella 4). Il protocollo dettagliato qui è ottimizzato da metodi precedentemente stabiliti che producono relativamente puro trofoblasto con meno di 5% contaminazione da altri cell tipi10,11,12. Ulteriore purificazione può essere ottenuto da selezione positiva o negativa24. Tuttavia, questo approccio rischia di ridurre il rendimento del trofoblasto praticabile. Analisi di immunocytochemical di Cytokeratin-7 in primari trofoblasti isolati utilizzando la procedura presentata dopo 24 contro 72 h di tempo della coltura ha confermato che le cellule hanno subito syncytialization come testimoniano la presenza di masse di cellule multinucleate a 72 h, un evento di marchio di garanzia della durata di un trofoblasto (Figura 3A e B). Inoltre, l'analisi di immunocytochemical di vimentina in primaria trophoblasts coltivati per 72 h ha rivelato pochissimi fibroblasti contaminanti (Figura 3). Per scopi di routine, la purezza del trofoblasto può essere monitorata in cultura di valutazione morfologica semplice. A 24 ore di tempo della coltura, tondo individuali cytotrophoblasts dominano la cultura. Cytotrophoblasts subiscono syncytialization dopo 72 h di cultura, conseguente grumi di cellule fuse. Il tipo di cella contaminanti più comune trovato in questa cultura è il fibroblasto o delle cellule endoteliali, che sono allungate e poligonali in forma, rispettivamente. Queste caratteristiche possono essere monitorate in approssimativamente utilizzando un microscopio luminoso.
Il trattamento primario trofoblasto con TNFα fornisce un sistema controllato che permette di misurare l'effetto di TNFα segnalazione sulla regolamentazione dei percorsi critici nel trofoblasto. Naturalmente, ci sono fattori diversi dal TNFα nel ambiente materno obesi in vivo che può essere responsabile di modulazione della funzione del trofoblasto. Questi includono ma non sono limitati a segnali ormonali, iperlipidemia e una miriade di altri fattori di proinflammatory25. Combinazioni di diversi trattamenti saranno ulteriormente ricapitolare l' ambiente intrauterino obesi ex vivo in un modo più fisiologicamente esatto. Le concentrazioni di TNFα esogeno usato per trattare il trofoblasto in questo protocollo di gran lunga superino a quelli in genere che circolano in vivo. Le concentrazioni nel siero sono stati segnalati per raggiungere 20 ng/mL o superiore in determinate circostanze infiammatorie26. Per ottenere una risposta misurabile con i metodi correnti del laboratorio (cioè Western blotting), è necessario amplificare le concentrazioni di TNFα per rivelare i cambiamenti nell'espressione genica e percorsi di interesse. Queste risposte possono esistere in vivo in misura minore. Tuttavia, essi potrebbero comunque un impatto significativo la funzione del trofoblasto. Esponendo il trofoblasto ad alte concentrazioni di TNFα corre il rischio di produrre manufatti in espressione genica ed analisi di percorso che possono essere radicate in effetti citotossici. Citotossicità moderata è stata osservata nel trofoblasto esposti a 104 media TNFα completati pg/mL per 24 h, come testimoniano i saggi di citotossicità LDH (dati non mostrati). Tuttavia, le concentrazioni pari o inferiore a 103 pg/mL TNFα non hanno prodotto alcun estesa morte cellulare.
Test di concentrazioni di TNFα a intervalli più piccoli e/o che sono inferiori rispetto a quelli descritti qui può essere meglio seguita da quantitativareazione a catena della polimerasi (qPCR) per analisi di espressione genica, una tecnica adatta per la rilevazione di piccoli cambiamenti nell'espressione genica. Mentre qPCR specificamente test per i livelli di espressione genica a livello trascrizionale, Western blotting rileva i livelli finali di prodotti proteici che sono presumibilmente disponibili per eseguire le loro attività cellulari. Utilizzando entrambe le tecniche analitiche in combinazione è un approccio potente per determinare l'impatto del trattamento di TNFα sulla regolamentazione dei livelli di espressione genica in pure come per determinare se i cambiamenti nei livelli di espressione sono il risultato di transcriptional, regolazione post-trascrizionale o post-traduzionali. Stress infiammatorio può avere un impatto syncytialization, morfologia e comportamento di trofoblasto. Comprese le valutazioni morfologiche (cioè immunocitochimica) oltre agli approcci analitici molecolari fornirà un'analisi più completa degli effetti dell'esposizione TNFα sulla salute di trofoblasto. Regolazione dei TNFα concentrazioni testati e a valle saggi secondo esigenze sperimentali è consigliabile.
Implementando il protocollo descritto qui, infiammazione TNFα-mediata si trova a sovraregolare l'espressione di Rubicon nel trofoblasto umano da magre gravidanze con feti di sesso femminile. Western blotting per Rubicon nel trofoblasto lisati ha rivelato due fasce distinte vicino e sopra il peso molecolare previsto di 140 kDa (Figura 4A). Ci è prova per suggerire che la banda inferiore è aspecifica (PD047 anti-Rubicon pAb, scheda tecnica MBL, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Il trofoblasto delle femmine ha dimostrato la capacità di aumentare l'espressione di Rubicon in risposta al trattamento di TNFα delle concentrazioni fino a 250 pg/mL. A concentrazioni superiori a questa, espressione di Rubicon livelli in diminuzione all'indietro verso la linea di base (controllo non trattato) e anche di sotto (Figura 4B, n = 3). Dato che trattare trofoblasti da magre gravidanze con TNFα simula l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso, questo risultato è complementare alla constatazione che Rubicon è significativamente aumentata in biopsie di tessuto villous flash-frozen placente da obese gravidanze con feti di sesso femminile rispetto ai comandi magri (Figura 4 e D, ANOVA, n = 6 per classe BMI, P < 0.05).
Mentre autofagica flusso non sembra differire in trofoblasti da obesi gravidanze con feti di sesso femminile rispetto ai comandi magri, trofoblasto da obese gravidanze con feti maschi esibiscono l'attivazione della formazione e accumulo di autofagosomi 13. Rubicon è un regolatore negativo dell'autofagia, dove agisce per fermare autofagosoma-lisosoma fusione27. Trofoblasto femminile può aumentano l'espressione di Rubicon come un meccanismo compensativo o protettivo contro l'infiammazione TNFα-mediata, che può attivare l'autofagia22, permettendo loro di mantenere il flusso autofagico lean-come nella regolazione del obesità materna. Questa risposta nella placenta può svolgere un ruolo in come femmina feti tariffa migliore rispetto ai maschi nell'ambiente intrauterino obeso. Il milieu infiammatorio associato con l'obesità materna ex vivo attraverso il trattamento primario trofoblasto umano con TNFα di modellazione fornisce una piattaforma per studiare gli effetti dell'ambiente intrauterino obeso sulla regolamentazione dei percorsi critici in trofoblasto. Che modifica il presente protocollo con combinatoriale e nuovi trattamenti mirati a ricapitolare l'ambiente materno obeso fornirà un viale emozionante per studiare gli effetti dell'obesità materna sulla funzione placenta.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano le donne che hanno donato loro placente per questo studio. Ringraziamo anche il dipartimento di consegna al OHSU e materno e fetale Team di ricerca e lavoro per coordinare la raccolta di placente. Siamo grati a Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD per supporto e aiuto con metodi sperimentali e ottimizzazione.
Questo lavoro è stato finanziato da NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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