यहां प्रस्तुत मानव अपरा villous प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए cytotrophoblasts के अलगाव के बाद ऊतक के नमूने के लिए एक प्रोटोकॉल है । मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में TNFα recapitulates सूजन के साथ trophoblasts के उपचार और मातृ मोटापे के साथ अपरा में सूजन द्वारा विनियमित आणविक लक्ष्यों की खोज की सुविधा ।
मातृ मोटापा प्रतिकूल प्रसवकालीन परिणामों की संभावना है कि समझौता अपरा समारोह है कि करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता द्वारा मध्यस्थता कर रहे है के एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है, भाग में, autophagy के dysregulation । मोटापे और गर्भावस्था दोनों के साथ जुड़े भड़काऊ प्रक्रियाओं से विनियमित किया जा सकता है मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से अपरा में autophagy नियामकों की अभिव्यक्ति में ंयायपालिका परिवर्तन । यहां वर्णित villous ऊतक और प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए शब्द मानव अपरा से villous cytotrophoblasts के अलगाव के नमूने के लिए एक प्रोटोकॉल है । यह ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) के साथ दुबला गर्भधारण से प्राथमिक trophoblasts का इलाज करके मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में भड़काऊ वातावरण अनुकरण के लिए एक विधि के द्वारा पीछा किया है, एक भड़काऊ cytokine कि मोटापे में और ऊंचा है गर्भावस्था. प्रोटोकॉल के कार्यांवयन के माध्यम से यहां वर्णित है, यह पाया है कि exogenous TNFα के लिए जोखिम फ़ैसला की अभिव्यक्ति, autophagy का एक नकारात्मक नियामक, दुबला गर्भधारण से trophoblasts में महिला भ्रूण के साथ नियंत्रित करता है । जबकि मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में जैविक कारकों की एक किस्म trophoblasts में महत्वपूर्ण रास्ते मिलाना करने की क्षमता बनाए रखने के लिए, इस पूर्व vivo प्रणाली अभिव्यक्ति पैटर्न vivo में मनाया तो निर्धारित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है मातृ-मोटापे के साथ मानव अपरा में TNFα सिगनल का सीधा परिणाम है. अंततः, इस दृष्टिकोण से बाहर autophagy और अंय महत्वपूर्ण सेलुलर रास्ते पर मातृ मोटापा के साथ जुड़े सूजन के विनियामक और आणविक प्रभाव को पार्स करने का अवसर देता है कि प्रभाव की क्षमता है trophoblasts में अपरा लिहितो.
मोटापा एक भड़काऊ राज्य क्रोनिक कम ग्रेड सूजन की विशेषता है, अतिरिक्त वसा ऊतक और पोषक तत्वों की उपलब्धता से उपजी है । मोटापा में, भड़काऊ साइटोकिंस चयापचय ऊतकों में ऊंचा कर रहे हैं और साथ ही प्रणालीबद्ध संचलन में । सबूत के एक मजबूत शरीर से पता चला है कि TNFα काफी इंसुलिन प्रतिरोध और चयापचय रोग में निहितार्थ के साथ मोटापे की सेटिंग में ऊंचा है1. TNFα के सक्रियकरण भी इस तरह के कैंसर और प्रतिरक्षा के रूप में शर्तों में रोगजनन रोग के लिए योगदान देता है, यह एक आकर्षक चिकित्सकीय लक्ष्य2बना रही है ।
मोटापे में सूजन गर्भावस्था से जटिल है, यह भी एक भड़काऊ राज्य3,4. इसमें पहले दिखाया गया है कि महिला भ्रूण के साथ गर्भधारण में मातृ adiposity के साथ अपरा TNFα कंटेंट बढ़ जाता है । इसके अलावा, TNFα उपचार मादा लेकिन नहीं पुरुष trophoblast कोशिकाओं में mitochondrial श्वसन रोकता है, सुझाव है कि TNFα एक यौन अपरा तरीके से dimorphic चयापचय को विनियमित करने में शामिल है5. मातृ मोटापा गर्भावस्था के दौरान जटिलताओं की एक किस्म की वृद्धि हुई घटना के साथ जुड़ा हुआ है, मृतशिशु सहित, पुरुष भ्रूण के साथ सबसे अतिसंवेदनशील जा रहा है3,6,7,8 . मातृ-भ्रूण अंतरफलक में अपनी प्रमुख भूमिका के कारण, भड़काऊ संकेत के जवाब में मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में अपरा की कार्यात्मक क्षमता में परिवर्तन मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण के परिणामों मध्यस्थता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं ।
Cytotrophoblasts और syncytiotrophoblasts नाल के villous ऊतक में अंत-स्रावी संकेत और पोषक तत्वों और मां और विकासशील भ्रूण के बीच ऑक्सीजन विनिमय के लिए महत्वपूर्ण हैं9. villous cytotrophoblasts के कार्यात्मक क्षमता में व्यवधान (इसके बाद trophoblasts के रूप में निर्दिष्ट) भ्रूण स्वास्थ्य और विकास ख़तरे में डालना हो सकता है । इस प्रोटोकॉल villous ऊतक के मानव शब्द अपरा से दूर chorionic और बेसल प्लेट प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए trophoblasts के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया के साथ साथ विदारक द्वारा नमूने के लिए एक विधि का वर्णन करता है । इस प्रोटोकॉल स्थापित villous ऊतक के एंजाइमी पाचन को शामिल तरीके से extracellular मैट्रिक्स से कोशिकाओं को जारी करने के लिए अंतर घनत्व केंद्रापसारक के बाद trophoblasts को अलग करने के लिए10से व्युत्पंन है, 11,12. इस प्रोटोकॉल विवरण एक दृष्टिकोण है जो में दुबला गर्भधारण से अपरा से प्राथमिक trophoblasts संस्कृति मीडिया TNFα के साथ पूरक के लिए मातृ मोटापे से जुड़े भड़काऊ वातावरण के एक घटक अनुकरण के साथ इलाज कर रहे हैं । अंत में, पश्चिमी सोख्ता द्वारा जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के बाद TNFα-स्वास्थ्यकर्मी trophoblasts से कुल कोशिका lysates संचयन के लिए एक सरल प्रक्रिया बताई गई है.
हालांकि इस मॉडल अपनी संपूर्णता में utero वातावरण में obesogenic दोहराऊंगा नहीं करता है, यह एक नियंत्रित प्रणाली है कि एक बाहर TNFα के व्यक्तिगत योगदान को पार्स करने की अनुमति देता है प्रदान करता है ‘ trophoblasts प्रतिक्रिया में मध्यस्थता सूजन मातृ मोटापा । इस मॉडल दोनों को खोजने के लिए या आणविक लक्ष्यों की पुष्टि सीधे trophoblasts में संकेत TNFα द्वारा विनियमित अवसर के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक अगर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन का परीक्षण करने की अनुमति देता है का मौका मातृ के साथ अपरा में vivo में मनाया मोटापा TNFα-मध्यस्थता सूजन का एक परिणाम हो सकता है ।
यहां वर्णित दृष्टिकोण मानव trophoblasts में autophagy के विनियमन पर TNFα-मध्यस्थता सूजन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया था । पुरुष भ्रूण प्रदर्शन के साथ मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से Trophoblasts बाधित autophagic कारोबार, या autophagosome परिपक्वता13। एक प्रोटीन फ़ैसला कहा जाता है (भागो डोमेन प्रोटीन Beclin1-बातचीत और cysteine संपंन युक्त), जो lysosomes और देर endosomes के लिए स्थानीय है, हाल ही में autophagic कारोबार की प्रक्रिया में एक “ब्रेक” के रूप में वर्णित है क्योंकि यह एक नकारात्मक के रूप में कार्य autophagosome परिपक्वता14,15के नियामक । वास्तव में, फ़ैसला एक प्रोटीन का एक दुर्लभ उदाहरण है जो autophagy को नियंत्रित करता है, जो इसे एक मूल्यवान चिकित्सीय लक्ष्य बनाता है । बहुत कम जानकारी के लिए निर्णय के pathophysiological महत्व के बारे में उपलब्ध है, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में अपनी भूमिकाओं के लिए छोड़कर माइक्रोबियल16,17 और cardiomyocyte संरक्षण18। प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, यह पाया है कि फ़ैसला महिला प्राथमिक trophoblasts में TNFα की बढ़ती सांद्रता के साथ उपचार के जवाब में अनियमित है २५० स्नातकोत्तर/ फ़ैसला के विनियमन कैसे महिला भ्रूण गर्भधारण में पुरुषों की तुलना में बेहतर मातृ मोटापे के साथ किराया में एक भूमिका निभा सकता है । Recapitulating सूजन मातृ मोटापा के साथ जुड़े पूर्व vivo मानव trophoblasts को उजागर द्वारा exogenous TNFα में महत्वपूर्ण रास्ते के विनियमन पर मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी पर्यावरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है trophoblasts और एक्सटेंशन द्वारा, अपरा फ़ंक्शन ।
अपरा विश्वविद्यालय अस्पताल में श्रम और प्रसव इकाई से एकत्र किए गए एक प्रोटोकॉल ओरेगन स्वास्थ्य और विज्ञान विश्वविद्यालय के पोर्टलैंड, ओरेगन में संस्थागत समीक्षा बोर्ड, से सूचित सहमति से अनुमोदित ?…
अपरा, भ्रूण के विकास को विनियमित करने के लिए जिंमेदार है, मोटापे से ग्रस्त पर्यावरण6में समारोह समझौता प्रदर्शन । trophoblasts के उच्च चयापचय की मांग के बावजूद, मातृ मोटापा प्रदर्शन बेकार mitochondrial श्वसन<sup c…
The authors have nothing to disclose.
लेखक उन महिलाओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस अध्ययन के लिए अपनी अपराि दान की । हम भी OHSU में श्रम और प्रसव विभाग और अपरा के संग्रह के समंवय के लिए मातृ और भ्रूण अनुसंधान टीम धंयवाद । हम एरिक वैंग, पीएच. डी., और केली कुओ, समर्थन और प्रयोगात्मक तरीकों और अनुकूलन के साथ मदद के लिए प्रबंध निदेशक के आभारी हैं ।
यह काम NIH HD076259A (am) और अहा GRNT29960007 (am) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
6 well plates | Corning | 353046 | |
Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |