Lesione neurale indotta da laser a due fotoni: un metodo per osservare la degenerazione e la rigenerazione dell'assone nelle larve di Drosophila

- Iniziare montando una larva pulita e anestetizzata sotto una copertura di vetro scivolare con la testa in alto. Successivamente, esporre l'area di interesse spingendo delicatamente lo scivolo di copertura per arrotolare la larva e regolarne la posizione. Utilizzare l'imaging confocale per localizzare le cellule neurali della larva. Identificare un assone specifico su una delle cellule neurali bersaglio come sito per lesioni.

Quindi esporre l'assone bersaglio a un laser a due fotoni a una potenza superiore a quella utilizzata per l'imaging per indurre danni. Un laser a due fotoni viene utilizzato grazie alla sua capacità di penetrare e localizzare con precisione i danni all'interno del tessuto vivo con danni minimi al tessuto circostante.

Interrompere immediatamente l'esposizione laser quando si verifica un danno al neurone bersaglio, con conseguente assotomia o taglio dell'assone. Infine, immagini il neurone ferito per visualizzarne la degenerazione e la successiva rigenerazione nei punti di tempo desiderati.

Nel protocollo di esempio, monteremo una larva per la microscopia, indurremo danni ai neuroni sensoriali larvali e monitoreremo la rigenerazione neurale.

- Iniziare con un anestetizzamento delle larve. In un cappuccio di fumi, posizionare una piastra di vetro di 60 millimetri in una piastra di petri di plastica di 15 centimetri. Quindi piegare un pezzo di carta velina e posizionarlo nella piastra di vetro. Posizionare il piatto di agar dell'uva sul tessuto dopo l'aggiunta dell'etere dietile.

Successivamente, su uno scivolo di vetro posizionare una goccia di olio di alocarbonio 27 al centro e posizionare una macchia di grasso sottovuoto su ciascuno dei quattro angoli. Quindi utilizzare le flessione per trasferire una larva sulla piastra di agar e coprire la piastra di vetro per anestetizzare la larva. Non appena la lava smette di muoversi, trasferirla con attenzione all'olio di alocarbonio con la testa in posizione verticale. Quindi posizionare una copertura scivolare sullo scivolo e premerla delicatamente fino a toccare la larva.

Successivamente, usate una forza delicata per far scorrere lo scivolo di copertura per far rotolare le cellule in modo che siano ablate dove il laser a due fotoni le colpirà più facilmente. La posizione varierà a seconda dei neuroni presi di mira. Ora fissare l'assieme sullo stadio del microscopio a due fotoni e concentrarsi sulle cellule di interesse utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio 40x.

Nel software passare alla modalità di scansione e caricare il protocollo salvato. Assicurarsi che il foro sia aperto fino in fondo. Quindi, in modalità live, ottenere una buona immagine della regione di interesse.

Arrestare quindi la scansione dal vivo in modo che il pulsante ritaglio diventi disponibile. Utilizzando la funzione di ritaglio, regolare la finestra di scansione per concentrare l'area di destinazione solo sul sito potenziale di lesione. Aprire una nuova finestra di imaging. Ridurre ora la velocità di scansione e aumentare l'intensità del laser. Quindi attivare o disattivare il pulsante continuo per avviare e interrompere la scansione. Guardare attentamente. Non appena si è registrato un drastico aumento della fluorescenza, terminare la scansione.

Quindi, torna alla finestra di imaging originale e seleziona la modalità live e trova l'area appena presa di mira regolando lo stato attivo.

- Una buona indicazione di lesioni di successo è la comparsa di un piccolo cratere, di una struttura ad anello o di detriti localizzati proprio sul sito della lesione. Se la potenza del laser fosse troppo alta, sarebbe visibile una grande area danneggiata, che può essere letale.

- Ora rimuovere con cura lo scivolo di copertura e trasferire la larva ferita su un nuovo piatto con pasta di lievito. Mettere il piatto in un piatto da 60 millimetri insieme a un tessuto imbevuto di acido propionico. Quindi riportare la piastra alla temperatura di coltura.

Per l'imaging successivo della larva, utilizzare la configurazione confocale salvata e raccogliere immagini z stack con un obiettivo 25x. Assicurarsi di includere il punto di normalizzazione in modo che la rigenerazione possa essere quantificata.