2光子レーザー誘発神経損傷:ショ ウジョウバエ の軸索変性と再生を観察する方法

- 頭を上げてガラスカバースリップの下にきれいな麻酔幼虫を取り付けることから始めなさい。次に、カバースリップを軽く押して幼虫を転がして位置を調整して関心のある領域を露出させます。

その後、損傷を誘発するイメージングに使用されるよりも高いパワーでターゲット軸索を2光子レーザーに露出させる。周囲の組織への損傷を最小限に抑え、生組織内の損傷を貫通し、正確に局地化する能力のために2光子レーザーが使用される。

標的ニューロンに損傷があったときにレーザー露光を直ちに停止し、その結果、軸索の脱像、または切断が生じる。

このプロトコル例では、顕微鏡用の幼虫を取り付け、幼虫感覚ニューロンへの損傷を誘発し、神経再生を追跡します。

-幼虫を麻酔から始める。ヒュームフードに60ミリメートルのガラス皿を15センチプラスチックペトリ皿に入れ、ティッシュペーパーを折ってガラス皿に入れる。

次に、ガラススライドの中央にハロカーボン27オイルを1滴置き、4つのコーナーのそれぞれに真空グリースのスポットを置きます。その後、鉗子を使用して寒天プレートに1匹の幼虫を移し、ガラス皿を覆って幼虫を麻酔します。

次に、カバースリップをスライドさせて、2光子レーザーが最も簡単に当たる場所に細胞を転がします。場所はどのニューロンが標的にされているかによって異なります。

ソフトウェアでは、スキャンモードに切り替えて保存したプロトコルをロードします。ピンホールがずっと開いてるのを確認してください。

次に、クロップボタンが利用可能になるようにライブスキャンを停止します。作物機能を使用して、スキャンウィンドウを調整して怪我の可能性のある部位にターゲット領域を集中させます。

次に、元のイメージングウィンドウに戻り、ライブモードを選択し、フォーカスを調整することでターゲットとなった領域を見つけます。

- 怪我の成功の良い兆候は、損傷現場の小さなクレーター、リング状の構造、または局所的な破片の出現です。レーザーパワーが高すぎると、大きな損傷を受けた領域が見え、致死的になる可能性があります。

- カバースリップを慎重に取り外し、負傷した幼虫を酵母ペーストで新しいプレートに移します。プロピオン酸浸しのティッシュと一緒にプレートを60ミリメートル皿に入れてください。

幼虫の後のイメージングでは、保存された共焦点セットアップを利用し、25倍の目的でzスタック画像を収集します。